Microbiologia 01

Programa de Educao
Continuada a Distncia

Curso de
Microbiologia Geral

Aluno:

EAD - Educao a Distncia
Parceria entre Portal Educao e Sites Associados

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Este material deve ser utilizado apenas como parmetro de estudo deste Programa. Os crditos deste contedo so dados aos seus respectivos autores.

Curso de
Microbiologia Geral

MDULO I

Ateno: O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos para
este Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao do
mesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autores
descritos nas Referncias Bibliogrficas.

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SUMRIO

MDULO I
1. Introduo
2. Requisitos Bsicos para Instalao e Funcionamento de um Laboratrio de
Microbiologia
2.1. Boas Prticas de Laboratrio
2.2. Regras Bsicas das Boas Prticas Laboratoriais
2.3. Gerenciamento das Boas Prticas
2.4. A Rotina nos Laboratrios
2.4.1. Desinfeco
2.4.2. Esterilizao
2.5 Normas de Segurana nos Laboratrios
2.5.1. Risco Fsico
2.5.2. Risco Qumico
2.5.3. Risco Biolgico
2.5.4. Risco Ambiental
2.5.5. Risco Ergonmico
2.5.6. Proteo Contra Incndio
2.6. Sinalizao de Segurana
3. Coleta de Amostras
4. Transporte de produtos biolgicos
5. Recepo de Amostras e Observaes Preliminares
5.1. Critrios de Rejeio das Amostras
6. Cultivo de Micro-organismos
6.1. Preparo do Meio de Cultura
6.2. Isolamento e Obteno de Cultura Pura
7. Microscopia
8. Principais Mtodos de Colorao
8.1. A Fresco
8.1.1. Entre Lmina e Lamnula

4
8.1.1.1 Salina
8.1.1.2. Hidrxido de Potssio (KOH)
8.1.1.3. Exame de Campo Escuro
8.1.1.4. Tinta da China (nanquim)
8.2. Fixados e Corados
8.2.1. Colorao Azul de Metileno de Loeffler
8.2.2. Colorao de Wright Giemsa
8.2.3. Colorao de Gram
8.2.4. Colorao de Ziehl-Neelsen
9. Controle de Qualidade
10. Biossegurana

MDULO II
1. As Bactrias
1.1. Estrutura
1.2. Taxonomia: classificao, nomenclatura e identificao das bactrias
1.3. Morfologia
1.4. Crescimento
1.5. Fisiologia
1.6. Colorao
1.7. Esporos
1.8. Sorologia
1.9. Metabolismo
1.10. Patogenicidade
2. Estafilococos
2.1. Staphylococcus aureus
2.2. Staphylococcus epidermidis
2.3. Staphylococcus saprophyticus
3. Estreptococos
3.1. Estreptococos beta-hemolticos
3.1.1. Streptococcus pyogenes

5
3.1.2. Streptococcus agalactiae
3.2. Estreptococos alfa-hemolticos
3.2.1. Estreptococcus pneumoniae
3.3. Estreptococos gama-hemolticos (no hemolticos)
3.3.1. Estreptococcus viridans
4. Enterococos
5. Neisserias
6. Bacilos
6.1. Gnero Corynebacterium
6.2. Gnero Bacillus
6.2.1. Bacillus anthracis
6.2.2. Bacillus cereus
6.2.3. Bacillus subtilis
6.3. Gnero Clostridium
6.3.1. Clostridium perfringens
6.3.2. Clostridium tetani
6.3.3. Clostridium botulinium
6.3.4. Clostridium difficile
6.4. Gnero Listeria
6.5. Gnero Mycobacterium
6.6. Gnero Actinomyces
6.7. Gnero Nocardia
7. Enterobacteriaceae
7.1. Gnero Escherichia
7.2. Gnero Proteus
7.3. Gneros Klebisiela, Serratia e Enterobacter
8. Salmonela, Shigela e Pseudomonas
8.1. Gnero Salmonella
8.2. Gnero Shigella
8.3. Gnero Pseudomonas
9. Bacilos gram-negativos curvos

6
9.1. Gnero Vibrio
9.2. Gnero Campylobacter
10. Outras bactrias gram-negativas anaerbias
10.1. Gnero Bacterioides
10.2. Gnero Haemophilus
10.3. Gnero Bordetela
10.4. Gnero Brucella
10.5. Genero Legionella
11. Bactrias Espiraladas
11.1. Gnero Treponema
11.2. Gnero Leptospira
11.3. Gnero Borrelia
12. Micoplasmas
13. Rickettsiae

MDULO III
1. Cultura Bacteriana
1.1. Interpretao de Resultados e Laudos
1.2. Identificao Bacteriana Presuntiva
1.3. Prova de Sensibilidade a Antimicrobianos
1.3.1. Mtodo do Disco
1.3.2. Mtodo da Fita
1.3.3. Diluio em Caldo
1.3.4. Diluio em Agar
1.3.5. Interpretao dos Resultados do Antibiograma
1.3.6. Mtodos Automatizados
1.4. Anlise Microbiolgica
1.5. Algumas Sugestes Importantes
2. Os Vrus
2.1. Estrutura Viral
2.2. Classificao Viral

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2.3. Cultivo e Quantificao Viral
3. Parvovrus
4. Papilomavrus
5. Herpesvrus
6. Adenovrus
7. Hepadnavrus
8. Poxvrus
9. Picornavrus
10. Orthomyxovrus
11. Paramyxovrus
12. Togavrus
13. Retrovrus
14. Rhabdovrus
15. Arenavrus
16. Reovrus
17. Coronavrus
18. Prons (Scrapie)

MDULO IV
1. Os Fungos
1.1. Estrutura e Crescimento
1.1.1. Bolores
1.1.2. Leveduras
1.2. Citologia
1.3. Parede Celular
1.4. Reproduo
1.4.1. Reproduo Assexuada
1.4.2. Reproduo Sexuada
1.4.3. Dimorfismo
1.5. Fatores de Crescimento
1.6. Metabolismo

8
1.7. Classificao
2. Estudo Visual dos Fungos
2.1. Estudo Macroscpico
2.2. Estudo Microscpico
3. Identificao e Isolamento dos Fungos
4. Micoses Superfciais
5. Micoses Profundas
5.1. Aspergillus
5.2. Blastomyces
5.3. Candida
5.4. Coccidioides
5.5. Histoplasma
6. Pneumocystis Carinii
7. Protozorios
7.1. Classificao
8. Cryptosporidium Parvum
9. Entamoeba Histolytica
10. Giardia Lamblia
11. Leishmania
12. Plasmodium
13. Toxoplasma Gondii
14. Trichomonas Vaginalis
15. Trypanosoma
16. Consideraes Finais
17. Glossrio
18. Referncias Bibliogrficas

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MDULO I

1. INTRODUO

A microbiologia definida como a biologia dos organismos microscpicos
que relaciona os organismos invisveis a olho nu, pelo seu tamanho, com as
principais doenas infecciosas do homem e de seus animais domsticos.
Os micro-organismos so encontrados em todos os ambientes, incluindo
solo, gua, ar e participam de todas as funes vitais. Embora no possam existir
dvidas de que bactrias e vrus sejam os patgenos mais numerosos e
importantes, o estudo da microbiologia tambm est ligado micologia e
parasitologia.
A relao entre o hospedeiro e o micro-organismo pode se estabelecer de
diversas maneiras. Esta associao ou simbiose (viver juntos) pode ter uma
conotao de benefcio ou prejuzo para o hospedeiro. Tentando categorizar
especificamente estas associaes, os pesquisadores conseguiram por
convenincia identificar trs categorias, que foram nomeadas como: comensalismo
(uma espcie utiliza a outra como seu ambiente fsico; por exemplo, microbiota),
mutualismo (as duas espcies se beneficiam; por exemplo, bactrias entricas de
ruminantes) e parasitismo (apenas uma espcie se beneficia, trazendo prejuzo ao
hospedeiro; por exemplo, vrus da raiva).
Estamos, agora, diante da oportunidade de ampliar e aprofundar temas
considerados essenciais dentro do estudo da microbiologia. Nossa expectativa de
que os usurios desta apostila de Microbiologia Geral possam assimilar e alcanar
novos nveis de complexidade laboratorial. No tivemos a pretenso de alcanar o
contedo e a profundidade dos livros-texto de microbiologia tradicionalmente
consultados e que tambm nos serviram de referncia, mas sim, de incluir apenas
uma pequena parte de uma explosiva base de dados que se expande em forma
exponencial, concernente ao nmero e classes de micro-organismos e s
propriedades que lhes permite causar doenas.

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O material apresentado aqui apenas um instantneo da microbiologia
atual, com respeitosa mesura aos avanos cientficos dos anos passados e com a
viso de que as novas tecnologias descritas neste e nos prximos mdulos j
revolucionaram as prticas laboratoriais e continuaro a afetar as abordagens atuais
e futuras da arte e da cincia da microbiologia.
Esta apostila foi programada em quatro mdulos, abrangendo os seguintes
temas:
Mdulo I Introduo; Requisitos bsicos para instalao e funcionamento
de um laboratrio de microbiologia; Coleta e transporte de materiais clnicos;
Recepo de amostras e observaes preliminares; Preparo de meios de cultura;
Exames microscpicos; Colorao; Controle de qualidade; Biossegurana.
Mdulo II Bacteriologia; Propriedades gerais das bactrias; Identificao
de Estafilococos; Identificao dos estreptococos; Identificao de outras bactrias
de interesse mdico; Interpretao de resultados.
Mdulo III Virologia; Propriedades gerais dos vrus; Patogenia e
identificao de doenas virais.
Mdulo IV Micologia; Classificao das micoses humanas; Identificao
de fungos isolados em cultivos; Parasitologia; Riscos e prevenes de doenas
parasitrias; Identificao e diferenciao de parasitas.
O primeiro passo para o conhecimento dos micro-organismos o mesmo
que se deve seguir para conhecer uma pessoa; necessrio saber seu nome. No
estudo do mundo dos micro-organismos como agentes de doenas no homem,
primeiramente importante assimilar como as bactrias e outros micro-organismos
so denominados. Isto a cincia da taxonomia.

11
2. REQUISITOS BSICOS PARA INSTALAO E FUNCIONAMENTO DE
UM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

Os requisitos bsicos para um laboratrio de microbiologia pretendem
elaborar e viabilizar boas prticas, normas para coleta, conservao e transporte de
material de interesse clnico. Alm de estabelecer e executar rotinas microbiolgicas,
dentro dos padres tcnico-cientficos vigentes, que permitam o isolamento e
identificao dos principais agentes infecciosos de importncia clnica, por gnero e,
se possvel, por espcie.
O laboratrio ainda precisa determinar a sensibilidade s drogas
antimicrobianas, efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos
de esterilizao, alm de divulgar e implementar normas de biossegurana.
Os equipamentos mnimos para funcionamento de um laboratrio de
microbiologia consistem em: estufa bacteriolgica, forno de Pasteur, autoclave,
microscpio binocular, centrfuga de baixa rotao, homogeneizador, banho-maria
de pequena dimenso, destilador para gua, balana para tarar tubos, balana
comum com uma ou duas casas decimais, bico de Bunsen, geladeira e capela de
fluxo laminar.
Alm desses equipamentos, o laboratrio poder contar com outros
aparelhos, como: microscpio estereoscpico, congelador (-20
o
C ou -70
o
C), bomba
de vcuo para filtrao com membranas, potencimetro e balana analtica.

2.1. BOAS PRTICAS DE LABORATRIO

O trabalho laboratorial executado de forma adequada e bem planejado
previne a exposio indevida a agentes considerados de risco sade e sem dvida
evita acidentes.
Manipulao de agentes considerados contaminantes regida por leis
federais, estaduais e municipais. A manipulao, armazenamento e transporte de
agentes de risco requerem licenas especiais que so controladas por rgos
federais.O Regulamento Tcnico de Funcionamento do Laboratrio Clnico foi

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elaborado a partir de trabalho conjunto de tcnicos da ANVISA, com o grupo de
trabalho institudo pela Portaria n 864, de 30 de setembro de 2003. Este grupo de
trabalho foi composto por tcnicos da ANVISA, secretaria de ateno sade
(SAS/MS), secretaria de vigilncia sade (SVS/MS), vigilncias sanitrias
estaduais, laboratrio de sade pblica, sociedade brasileira de patologia
clnica/medicina laboratorial, sociedade brasileira de anlises clnicas, provedores de
ensaio de proficincia e um consultor tcnico com experincia na rea.
A proposta de Regulamento Tcnico elaborado pelo grupo de trabalho foi
publicada como consulta pblica n 50, em 6 de agosto de 2004. As sugestes
recebidas foram consolidadas pelos tcnicos da gerncia geral de tecnologia em
servios de sade (GGTES/ANVISA), pelos componentes do grupo de trabalho
juntamente com o consultor. Aps discusses, as sugestes pertinentes foram
incorporadas ao texto do Regulamento Tcnico, sendo produzido o documento final
consensual sobre o assunto.
Este Regulamento Tcnico discriminado na resoluo da diretoria colegiada
- RDC n 302, de 13 de outubro de 2005, regulamenta:
A Diretoria Colegiada da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, no uso
da atribuio que lhe confere o art.11, inciso IV, do Regulamento da ANVISA
aprovado pelo Decreto n 3.029, de 16 de abril de 1999, c/c o 1 do art.111 do
Regimento Interno aprovado pela Portaria n 593, de 25 de agosto de 2000,
republicada no D.O.U. de 22 de dezembro de 2000, em reunio realizada em 10 de
outubro de 2005; considerando as disposies constitucionais e a Lei Federal n
8080, de 19 de setembro de 1990, que trata das condies para a promoo,
proteo e recuperao da sade, como direito fundamental do ser humano;
considerando a necessidade de normalizao do funcionamento do Laboratrio
Clnico e Posto de Coleta Laboratorial; considerando a relevncia da qualidade dos
exames laboratoriais para apoio ao diagnstico eficaz, adota a seguinte Resoluo
da Diretoria Colegiada e eu, Diretor-Presidente substituto, determino a sua
publicao:

13
Art. 1 - Aprovar o Regulamento Tcnico para funcionamento dos servios
que realizam atividades laboratoriais, tais como Laboratrio Clnico, e Posto de
Coleta Laboratorial, em anexo.
Art. 2 - Estabelecer que a construo, reforma ou adaptao na estrutura
fsica do laboratrio clnico e posto de coleta laboratorial deve ser precedida de
aprovao do projeto junto autoridade sanitria local em conformidade com a
RDC/ANVISA n 50, de 21 de fevereiro de 2002, e RDC/ANVISA n 189, de 18 de
julho de 2003, suas atualizaes ou instrumento legal que venha a substitu-las.
Art. 3 - As Secretarias de Sade Estaduais, Municipais e do Distrito
Federal devem implementar os procedimentos para adoo do Regulamento
Tcnico estabelecido por esta RDC, podendo adotar normas de carter suplementar,
com a finalidade de adequ-lo s especificidades locais.
Art. 4 - O descumprimento das determinaes deste Regulamento
Tcnico constitui infrao de natureza sanitria sujeitando o infrator a processo e
penalidades previstas na Lei n 6437, de 20 de agosto de 1977, suas atualizaes,
ou instrumento legal que venha a substitu-la, sem prejuzo das responsabilidades
penal e civil cabveis.
Art. 5 - Esta Resoluo entra em vigor na data de sua publicao.

necessrio que os profissionais sejam previamente conscientizados sobre
os riscos, assim como as medidas de controle e proteo adotadas para a
manuteno e respeito s normas de segurana. E o cuidado tomado pelos
administradores deve ser maior e mais rigoroso, para prevenir ou reduzir o risco de
desenvolver alguma doena profissional por exposio. A organizao das
atividades e o respeito s normas de segurana um aspecto fundamental para
segurana de todos os usurios e para a garantia da qualidade e dos resultados
precisos.

14
As medidas de controle e proteo laboratorial so divididas em medidas
coletivas (descarte e remoo de lixo, extintores de incndio, lavador de olhos e
sinalizao) como mostra a Figura 1.

A B
C D
A B
C D

Materiais relacionados com as MEDIDAS
COLETIVAS de controle e proteo laboratorial.
(A) Remoo do lixo, (B) lavador de olhos, (C)
Descarte de materiais perfurocortantes e (D)
Extintor de incndio.
Fig. 1. Materiais relacionados com as MEDIDAS
COLETIVAS de controle e proteo laboratorial.
(A) Remoo do lixo, (B) lavador de olhos, (C)
Descarte de materiais perfurocortantes e (D)
Extintor de incndio.
Fig. 1.

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As medidas individuais referem-se ao emprego de equipamentos de
proteo individual - EPIs (luvas, mscara, avental de manga comprida, pr-ps,
culos de proteo) como so mostradas na Figura 2.

E
D
B
C
A
D
E
E
D
B
C
A
D
E

Fig. 2. Materiais relacionados com as MEDIDAS INDIVIDUAIS de
controle e proteo laboratorial. (A) culos; (B) mscara;
(C) avental, (D) luvas e (E) pro-ps.

difcil quantificar o risco no trabalho em laboratrios, com relao aos
agentes infecciosos. Tem-se por base, porm, que o risco individual aumenta com a
frequncia e com os nveis de contato com o agente infeccioso. O primeiro cuidado a
ser tomado no laboratrio que trabalha com espcimes clnicas com o risco de
exposio infeco. Por outro lado, deve-se considerar que os riscos so
influenciados por uma relao varivel entre o agente infectante, o hospedeiro e a
atividade desempenhada. Fatores aplicveis ao agente incluem a virulncia, a carga
infectante, o ciclo e a toxigenicidade. As principais variveis que influem no risco do

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hospedeiro so: idade, sexo, etnia, gravidez, uso de antimicrobianos, imunidade
(vacinao prvia), e o uso de drogas imunossupressoras. Finalmente, a natureza
da atividade laboratorial (por exemplo: diagnstico, produo, pesquisa) pode afetar
significativamente o risco pessoal em razo do tipo, quantidade e concentrao dos
agentes empregados, a manipulao dos agentes e a eficcia primria e secundria
dos equipamentos de proteo e prticas de laboratrio.

2.2. REGRAS BSICAS DAS BOAS PRTICAS LABORATORIAIS

As regras bsicas de segurana em laboratrio sero descritas na Figura 3.
Estes itens so inegociveis e devem ser respeitados rigorosamente sem exceo.

2.3. GERENCIAMENTO DAS BOAS PRTICAS

Uma organizao de gerenciamento das boas prticas, ou melhor, a garantia
da qualidade dentro do laboratrio se faz necessria para ajudar a manter a ordem
minimizando os riscos de contaminao, alm de elaborar planos de gerenciamento
de rejeitos qumicos. Esta organizao deve estar ligada Comisso Tcnica
Nacional de Biossegurana (CTNBio), segundo a Lei 8.974, de 5 e janeiro de 1995.
A CTNBio regulamenta os procedimentos de segurana por meio de
instrues normativas, conforme o grau de periculosidade, bem como estabelece os
nveis de concentrao e de tratamento dos resduos, a liberao planejada para o
ambiente, transporte, importao, comercializao de organismos geneticamente
modificados e intervenes genticas em humanos e animais.
As prticas de biossegurana baseiam-se na necessidade de proteo ao
operador, seus auxiliares e a comunidade local contra riscos que possam prejudicar
a sade.Embasado nestes itens a CTNBio se responsabiliza por todos os
procedimentos institucionais, onde inspecionar e fornecer licenas para reas de
nvel 1. E as solicitaes de licenas para nvel 2, 3 e 4 sero encaminhadas pela
Comisso Interna de Biossegurana para CTNBio e sero sujeitas as inspees
desta. As reas de nvel de laboratrio esto classificadas no sistema de grupo de

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risco dos micro-organismos, e est baseada na potncia de causarem doena em
seres humanos e contaminarem o ambiente.Os micro-organismos se dividem em
grupos quanto a patogenicidade para o homem, a virulncia, o modo de
transmisso, a endemicidade e a existncia de profilaxia e/ou de teraputica
eficazes. Segundo a Resoluo n
o
1, de 1998 do Conselho Nacional de Sade, Cap.
X, art. 64, os micro-organismos podem ser classificados em classes de risco de 1 a 4
por ordem crescente:
Classe 1 classificam-se os agentes que no apresentam riscos para o
manipulador, nem para a comunidade (ex.: Escherichia coli, Bacillus subtilis, vrus
adenoassociados).
Classe 2 classificam-se os agentes que apresentam risco moderado para
o manipulador, havendo sempre um tratamento preventivo (ex.: Clostridium tetani,
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus; Epstein-Barr Vrus - EBV,
Herpesvrus; Candida albicans; Plasmodium sp, Schistosoma sp).
Classe 3 classificam-se os agentes que apresentam risco grave para o
manipulador e moderado para a comunidade, sendo as leses ou sinais clnicos
graves e nem sempre h tratamento (ex.: Bacillus anthracis, Brucella sp, Chlamydia
psittaci, Mycobacterium tuberculosis; vrus da hepatite B, vrus da hepatite C, HTLV
1 e 2, HIV, flavivrus; Blastomyces dermatiolis, Histoplasma; Echinococcus sp,
Leishmania sp, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi);
Classe 4 classificam-se os agentes que apresentam risco grave para o
manipulador e para a comunidade, no existe tratamento e os riscos em caso de
propagao so bastante graves (ex.: arenavrus, certos arbovrus, vrus da
encefalite de St. Louis e Coxiella burnetii).

18

Boas prticas em laboratrio Fig. 3. Boas prticas em laboratrio Fig. 3.

19
2.4. A ROTINA NOS LABORATRIOS

Agora relacionaremos as rotinas que auxiliam na otimizao do servio dos
usurios:
a) Manter as bancadas sempre limpas e livres de materiais estranhos ao
trabalho.
b) Fazer uma limpeza prvia, com o solvente adequado, ao esvaziar um
frasco de reagente antes de coloc-lo para lavagem.
c) Rotular imediatamente qualquer reagente ou soluo preparada,
utilizando etiquetas adequadas.
d) Retirar da bancada os materiais, as amostras e os regentes aps o
trmino do trabalho.
e) J ogar papis e outros materiais dispensveis que no ofeream riscos,
em lixos especficos.
f) Usar pinas e materiais de tamanho adequado e em perfeito estado de
conservao.
g) Limpar, imediatamente, qualquer derramamento de produtos e reagentes
protegendo-se se necessrio, para fazer essa limpeza.
h) Tomar as seguintes providncias em caso de derramamento de lquidos
inflamveis, produtos txicos, biolgicos, txicos e/ou corrosivos - Interromper o
trabalho/advertir as pessoas prximas sobre o ocorrido/solicitar ou efetuar a limpeza
imediata/verificar e corrigir a causa do problema.

2.4.1. DESINFECO

A desinfeco definida como a eliminao parcial dos micro-organismos
presentes em um determinado ambiente. Os mtodos de desinfeco pretendem
principalmente destruir as formas microbianas patognicas ao homem, por meio da
utilizao de um agente desinfetante ou antimicrobiano.

20
Os diversos tipos de agentes antimicrobianos podem ser divididos em trs
grupos: agentes fsicos, qumicos e quimioterpicos. O grau de eficincia de cada
um deles dependente da concentrao ou intensidade, das condies do ambiente
e do estado das clulas.

2.4.2. ESTERILIZAO

A esterilizao um processo de eliminao completa de todas as formas
vivas de um material ou ambiente. Por meio da esterilizao dos meios de cultura e
do instrumental usado nos trabalhos, o isolamento e a manuteno das culturas
puras de micro-organismos se tornaram possveis.
A esterilizao pode ser feita por diferentes processos que empregam
mtodos fsicos (calor, atrito, radiao e filtrao) e mtodos qumicos. Normalmente
so utilizadas embalagens para acondicionar os materiais durante a esterilizao
para evitar contaminao posterior.
A eficcia da esterilizao monitorada pelo emprego de indicadores. A
maioria dos protocolos requer treinamento especial para adequada preparao dos
instrumentos com remoo de toda matria orgnica, o correto preenchimento da
cmara e operao do ciclo de esterilizao dentro de parmetros estritamente
definidos.
Os mtodos mais utilizados so: calor mido, que provoca a inativao ou
coagulao das protenas dos micro-organismos (autoclavagem e tindalizao) e o
calor seco, que provoca a eliminao dos micro-organismos pela oxidao e queima
das protenas (forno de Pasteur e chama).
Em microbiologia a autoclavagem utilizada na esterilizao de material
usado na preparao de meios de cultura e esterilizao em geral. O vapor dgua
sob presso e uma temperatura superior a 100
0
C destroem os micro-organismos e
seus esporos (quando produzidos) em um curto espao de tempo.
A tindalizao um processo de esterilizao fracionada, para substncias
que no podem ser aquecidas acima de 100
0
C. O processo consiste em aquecer o
material por trs vezes consecutivas, em intervalos de 24 horas.

21
Tanto o forno de Pasteur como as esterilizaes pela chama so processos
que requerem temperaturas elevadas por longos perodos.
Outros mtodos de esterilizao so utilizados, tais como:
a) Irradiao pela luz ultravioleta (<330nm de comprimento de onda). Este
mtodo utilizado em cmaras de segurana microbiolgica, em laboratrios, ou
tambm, pela radiao ionizante, por eltrons do cobalto-60 e ainda por um
acelerador linear para a esterilizao de artigos plsticos descartveis sensveis ao
calor.
b) Filtrao pela utilizao de diferentes tipos de filtros, incluindo asbesto,
cermica e vidro prensado. Atualmente, so mais utilizados os filtros de membrana
de nitro-celulose que so utilizadas para a esterilizao de lquidos sensveis ao
calor, incluindo soro e antibiticos.
c) Substncias Qumicas, o gs formaldedo, a formalina lquida, o
glutaraldedo e o xido de etileno que so esporicidas e viricidas e, por isso,
conseguem esterilizar materiais. No entanto, estas substncias so txicas e
irritantes e seu uso restrito.

2.5 NORMAS DE SEGURANA NOS LABORATRIOS

As normas de segurana so embasadas nos perigos e riscos que os
usurios podem sofrer durante o trabalho. Os perigos so divididos em risco fsico,
qumico, biolgico, ambiental e ergonmico.
As normas de segurana adotadas para preveno contra os acidentes
laboratoriais so:
a) Todo perigo e risco deve ser conhecido pelo manipulador, bem como o
respeito das regras gerais de biossegurana e ainda a execuo das medidas de
proteo individual.
b) Todo experimento dentro ou fora do expediente, que no tiver o
acompanhamento do interessado, dever ter uma ficha ao lado, com nome, horrio
de experimentao, reagentes envolvidos e medidas a serem adotadas em casos de
acidentes.

22
c) Todo experimento que envolver certo grau de periculosidade exigir a
obrigatoriedade da utilizao de indumentria adequada (luvas, culos, mscaras,
pinas, aventais, extintores de incndio).
d) Todo laboratrio ou sala de experimento dever possuir os seguintes
equipamentos - culos de segurana, mscara contra gases, um cobertor e um
chuveiro em funcionamento normal e caixas de primeiros socorros.
e) Todo e qualquer material que venha a prejudicar ou colocar em perigo a
vida ou a sade dos usurios do ambiente, ou que cause incmodo, dever ser
discutido ou comunicado ao responsvel do laboratrio, o qual sugerir e/ou
autorizar o evento sob certas condies como avisos, precaues e horrio que
deve ser feito.
f) Todo manuseio de produtos no deve ser feito sem o uso do equipamento
de segurana adequado, no faa improvisaes.
g) Todo e qualquer acidente ou irregularidade deve ser comunicado ao seu
superior e segurana.
h) Todo e qualquer produto qumico no deve ser cheirado, nem ser
guardado em lugares imprprios.
i) Todo produto qumico deve ser transportado de maneira segura.
j) Todo profissional deve ser e deve estar bem informado no que se refere
maneira como a contaminao pode ocorrer, o que implica no conhecimento amplo
do micro-organismo ou vetor com o qual se trabalha.
Os equipamentos de segurana relacionados a seguir devem estar ao
alcance de todos os funcionrios, como: extintores de incndio (p qumico e CO
2
),
chuveiros de emergncia, lavador de olhos, aventais e luvas de PVC contra produtos
corrosivos, mscaras e culos de segurana, luvas de amianto ou raspa de couro,
mscaras contra gases e mscara contra p (ex.: slica, asbesto).

2.5.1. RISCO FSICO

Consideram-se agentes de riscos fsicos os equipamentos que geram:
rudos, vibraes, presses anormais, radiaes ionizantes, radiaes no

23
ionizantes, ultrassom, materiais cortantes, materiais pontiagudos, calor, frio, chamas,
umidade, ultravioleta, infravermelha, raios laser, ondas de rdio, campo eltrico.

2.5.2. RISCO QUMICO

Consideram-se agentes de risco qumico: as substncias compostas ou
produtos que possam penetrar no organismo pela via respiratria nas formas de
poeiras, fumaas (incluindo cigarro), nvoas, neblinas, gases e vapores; ou que
possam penetrar no organismo por contato ou por absoro atravs da pele ou
ingesto nas formas de substncias txicas, substncias explosivas, irritantes,
oxidantes, corrosivas, volteis, inflamveis e cancergenas.

2.5.3. RISCO BIOLGICO

Consideram-se agentes de risco biolgico as bactrias, fungos, parasitos,
vrus, entre outros. Os agentes biolgicos apresentam um risco real ou potencial
para o homem e para o meio ambiente. Por essa razo, fundamental que se
prepare uma estrutura adequada para preveno dos riscos encontrados nos
laboratrios.

2.5.4. RISCO AMBIENTAL

Consideram-se agentes de risco ambiental os equipamentos de vidro,
instrumentos perfurantes, equipamentos com gs comprimido, equipamentos de
triturao, incndio, exploso, eletricidade.

2.5.5. RISCO ERGONMICO

Consideram-se agentes de risco ergonmico os assentos, a altura das
bancadas, entre outros que possam provocar leses por m postura.

24
2.5.6. PROTEO CONTRA INCNDIO

As regras bsicas em caso de incndio no laboratrio so:
a) Manter a calma.
b) Comear o combate imediatamente com os extintores de CO
2
(gs
carbnico). Afastar os inflamveis de perto.
c) Evacuar o local imediatamente caso a situao fuja ao seu controle.
d) Ligar o alarme (uma pequena caixa vermelha), quebrando o vidro para
acion-lo.
e) Evacuar o prdio.
f) Desligar a chave geral de eletricidade.
g) Ir at o telefone mais prximo e discar para o corpo de bombeiros 193.
h) Dar a exata localizao do fogo (ensinar como chegar l).
i) Informar a condio de risco do laboratrio para que os bombeiros saibam
como agir com rapidez e eficincia.
j) Tapar o frasco com uma rolha, toalha ou vidro de relgio de modo a
impedir a entrada de ar quando o fogo irromper em um bquer ou balo de reao.
k) Levar para o chuveiro quando o fogo atingir a roupa de uma pessoa, h
uma tendncia para que a pessoa corra, aumentando a combusto, neste caso,
deve-se derrub-la e rola-la no cho at que o fogo seja exterminado ou embrulh-la
rapidamente em um cobertor. E ainda, pode-se tambm usar o extintor de CO
2
, se
este for o meio mais rpido.
l) Usar extintor de CO
2
ou p qumico para apagar o fogo em um laboratrio.
Nunca utilize gua.
m) Usar extintor de p qumico quando o fogo atingir sdio, potssio ou ltio;
ou ainda os reagentes, carbonato de sdio (Na
2
CO
3
) ou cloreto de sdio (NaCl).

25
2.6. SINALIZAO DE SEGURANA (Figura 4)

Sinalizaes importantes para orientao Fig. 4. Sinalizaes importantes para orientao Fig. 4.

3. COLETA DE AMOSTRAS

possvel que a coleta apropriada de uma amostra para cultivo seja a etapa
mais importante na confirmao final de que um micro-organismo responsvel pelo
processo de enfermidade infecciosa. Assim, todo resultado liberado pelo laboratrio
de microbiologia consequncia da qualidade da amostra recebida.
O material colhido deve ser representativo do processo infeccioso
investigado, devendo ser eleito o melhor sitio da leso, evitando contaminao com
as reas adjacentes. Deve se estabelecer o momento timo para a coleta de

26
amostras com o objetivo de contar com a melhor possibilidade de isolar o micro-
organismo em questo. Deve-se obter quantidade suficiente de material para
permitir uma completa anlise microbiolgica. Caso a quantidade seja pequena,
priorizar os exames.
Portanto, a coleta inadequada pode ocasionar falhas no isolamento do
agente etiolgico e favorecer o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a
um tratamento no apropriado. Quem colhe o material deve ser devidamente
treinado e periodicamente reciclado nesta atividade. Deve saber que o material
dever ser destinado, o mais brevemente possvel, ao laboratrio. Deve conhecer ou
obter instrues sobre conservao e/ou transporte do material caso este no possa
ser realizado imediatamente.
Algumas consideraes so fundamentais na coleta de amostras, como:
colher amostras antes da antibioticoterapia (sempre que possvel); instruir
claramente o paciente sobre o procedimento; observar a assepsia na coleta de todos
os materiais clnicos. O pedido do exame deve conter, alm da identificao do
paciente, dados como idade, doena de base, indicao de antibiticos, data e hora
da coleta e as amostras devem ser coletadas em recipientes esterilizados.

4. TRANSPORTE DE PRODUTOS BIOLGICOS

Os regulamentos sobre o transporte de agentes biolgicos so definidos de
forma a assegurar proteo ao pblico e aos trabalhadores da rede de transporte
exposio a qualquer agente que possa estar presente na embalagem.
As substncias infecciosas e materiais orgnicos para diagnstico precisam
estar embalados em um recipiente impermevel gua (recipiente primrio), dentro
do qual se encontra a amostra. Este recipiente primrio dever estar dentro de um
segundo recipiente impermevel, de preferncia de metal, contendo quantidade
suficiente de material absorvente entre suas paredes. Os recipientes primrios e
secundrios devero conter uma etiqueta ou rtulo com a identificao da amostra e
devero ser introduzidos em uma embalagem externa de envio que tem a finalidade

27
de proteo contra fatores externos. A embalagem externa deve estar rotulada
adequadamente com o smbolo risco biolgico e outro rtulo com o endereo da
instituio (Figura 5).
Para evitar possveis acidentes durante o transporte de amostra biolgica,
dentro dos setores do laboratrio, necessrio transportar em recipiente
impermevel, resistente queda e o transporte de vidraria deve ser feito com o uso
de carrinhos para frascos de grande porte e bandejas para frascos de pequeno
porte.

Tcnica apropriada para embalar materiais biologicamente
perigosos.
Fig. 5. Tcnica apropriada para embalar materiais biologicamente
perigosos.
Fig. 5.

28
O objetivo primrio no transporte de amostras para diagnstico, seja dentro
de um hospital ou clnica, ou externamente por correio, para um laboratrio de
referncia distante, consiste em manter a amostra o mais prximo possvel de seu
estado original (Tabela 1), ou seja, com deteriorao mnima, e minimizar os riscos
para os transportadores das amostras. As amostras devem estar acondicionadas de
forma que resistam as condies ambientais.
Se for previsto um atraso prolongado antes que a amostra possa ser
processada, prefervel congelar a amostra a 70
o
C negativos. No entanto, se o
perodo de estocagem for breve pode ser utilizado um congelador a 20
o
C negativos.
Para a maioria das amostras pode ser utilizado um meio de manuteno ou
transporte, que consiste essencialmente de uma soluo tampo isento de
carboidratos, peptonas e outros nutrientes e fatores de crescimento formulado para
conservar a viabilidade das bactrias durante o transporte sem permitir a
multiplicao das mesmas.

Tempo crtico para entrega da amostra ao laboratrio e meios
de transporte
Tab. 1.Tempo crtico para entrega da amostra ao laboratrio e meios
de transporte
Tab. 1.

29
5. RECEPO DE AMOSTRAS E OBSERVAES PRELIMINARES

Os laboratrios de microbiologia precisam ter uma rea especfica destinada
e reservada para a recepo de amostras para cultivo. E o manipulador deve usar os
equipamentos de proteo individual apropriados para manipulao da amostra.
O processamento das amostras inclui: o ingresso dos dados em um livro de
registro e/ou terminal de computador, exame visual e determinao de todos os
critrios para aceitao da amostra e exame microscpico de montagens midas ou
de esfregaos corados para o diagnstico presuntivo.

5.1. CRITRIOS DE REJEIO DAS AMOSTRAS

Em todos os laboratrios devem ser estabelecidos critrios para a rejeio
de amostras no adequadas para o cultivo. Devem ser controlados: formulrio do
pedido, etiqueta da amostra (nome, nmero de identificao, idade, sexo, domiclio,
nome do mdico, data, hora), origem da amostra e procedimentos solicitados. A
histria clnica do paciente tambm til, para saber se o exame solicitado
compatvel com o diagnstico.
Sempre que uma amostra for rejeitada, a pessoa que o enviou precisa ser
comunicada para explicar a natureza do problema. Como regra emprica, deve-se
fazer o possvel para no recusar amostras de difcil coleta (lavados brnquicos,
lquidos cefalorraquidianos, entre outros).

6. CULTIVO DE MICRO-ORGANISMOS

O estudo dos micro-organismos, sua identificao e avaliao de suas
populaes nos diferentes materiais e ambientes requerem seu cultivo nas
condies do laboratrio.

30
6.1. PREPARO DO MEIO DE CULTURA

Para preparar um meio de cultura necessrio conhecer as exigncias
nutricionais dos micro-organismos. So considerados componentes essenciais do
meio de cultura: fonte de energia, fonte de carbono, fonte de nitrognio, fatores de
crescimento, fonte de minerais e gua.
Alm dos nutrientes, o meio de cultura deve suprir algumas condies
ambientais, como: pH, atmosfera (presena de O
2
, CO
2
), presso osmtica.
O meio de cultura pode ser classificado quanto origem (naturais e
artificiais), quanto composio (complexos e sintticos), quanto ao estado fsico
(slido, semisslido e lquidos) e quanto finalidade (gerais ou bsicos,
enriquecidos, seletivos, indicadores ou diferenciais, dosagem, transporte, estocagem
ou manuteno).

6.2. ISOLAMENTO E OBTENO DE CULTURA PURA

A obteno de culturas puras (ou axnicas) a partir de culturas mistas,
tambm denominadas isolamento o primeiro passo para que se possa realizar o
diagnstico dos micro-organismos. Esta tcnica tambm necessria na indstria
para a fabricao de antibiticos. O segundo passo consiste na anlise do
crescimento em meio lquido, caldo nutriente, e correlao com as necessidades de
oxignio dos micro-organismos presentes.
O procedimento mais prtico para a obteno de colnias isoladas consiste
na semeadura em superfcie, no meio de cultura at o esgotamento do incuo.
Desta forma, o incuo diludo progressivamente de modo que se obtm, ao final,
clulas isoladas que daro origem a colnias puras (Figura 6).

31

7. MICROSCOPIA

O equipamento rotineiramente utilizado em laboratrios de microbiologia o
microscpio ptico composto. Seu princpio de funcionamento baseia-se no aumento
da imagem por um conjunto de lentes convergentes, associado a uma forte
iluminao do campo de observao, isto fornece uma imagem translcida dos
micro-organismos.
Com o passar dos anos a microscopia sofreu algumas modificaes, tanto
no microscpio como nas tcnicas de preparo das lminas, como por exemplo:
microscopia de campo escuro, microscopia de luz ultravioleta (fluorescncia e
imunofluorescncia), microscopia de contraste de fase e microscopia eletrnica.

Isolamento de colnias de bactrias em
meio slido
Fig. 6. Isolamento de colnias de bactrias em
meio slido
Fig. 6.

32
8. PRINCIPAIS MTODOS DE COLORAO

A perfeita visualizao dos micro-organismos e/ou das suas estruturas s
possvel se, alm da escolha do tipo mais eficiente de microscopia, a preparao
estiver adequada. A escolha do tipo de preparao depende da informao desejada
e do micro-organismo a ser avaliado. Duas tcnicas so empregadas: a fresco
(direto e sem colorao) e fixado e corado.
De uma maneira geral, as bactrias tm afinidade por um grande nmero de
corantes, principalmente aqueles do grupo dos derivados bsicos da anilina (azul de
metileno, cristal violeta e fucsina bsica). Dentre todos os mtodos existentes,
aqueles que tm mais importncia dentro do laboratrio de microbiologia so os
mtodos de Gram e de Ziehl-Neelsen.

8.1. A FRESCO

As preparaes deste tipo permitem o exame dos micro-organismos nas
condies normais de vida e so perfeitamente utilizadas nas seguintes situaes:
quando a morfologia fica distorcida em virtude dos processos de fixao e colorao,
durante a verificao da motilidade, durante os processos fisiolgicos (diviso
celular, produo de esporos) e durante a observao de corpsculos (vacolos e
material graxo).

8.1.1. ENTRE LMINA E LAMNULA

8.1.1.1 SALINA

Esta tcnica pode ser usada para avaliar bactrias cultivadas em meio
lquido e fungos. A tcnica consiste em gotejar com o auxlio de uma ala de platina,
esterilizada, no centro da lmina, uma gotcula da cultura a ser investigada. Ou um
fragmento da cultura em meio slido do fungo a ser analisado. Em seguida, cobrir
com lamnula e examinar ao microscpio.

33
8.1.1.2. HIDRXIDO DE POTSSIO (KOH)

Esta tcnica usada para pesquisa de fungos, proveniente de material
biolgico como muco, restos celulares, pelos e unhas. A tcnica consiste em colocar
uma pequena amostra do material biolgico a ser pesquisado no centro da lmina;
suspender o material com uma ou duas gotas de KOH, cobrir com uma lamnula e
aguardar 30 minutos ou aquecer ligeiramente a lmina para acelerar o clareamento.

8.1.1.3. EXAME DE CAMPO ESCURO

Esta tcnica empregada para observar a motilidade de bactrias
dificilmente observadas em microscopia a fresco com salina. A tcnica consiste em
atritar as bordas da leso suspeita com um swab ou ala bacteriolgica, colher o
exsudato com a prpria ala ou fazer um imprint com a lmina e cobrir com a
lamnula (utilizar uma gota de salina). Realizar a pesquisa rapidamente, ou, se o
material for lquido (urina recm-emitida), centrifugar e examinar o sedimento. A
microscopia em campo escuro realizada colocando-se leo de imerso.

8.1.1.4. TINTA DA CHINA (NANQUIM)

Esta tcnica empregada para pesquisa de fungos em lquido
cefalorraquidiano e outros materiais, permitindo destacar a cpsula deste fungo
contra um fundo negro. A tcnica consiste em pegar o lquido cefalorraquidiano
sedimentado ou uma amostra do meio de cultura lquido e ressuspender em uma
gota de tinta da china, fazendo um filme bem delgado entre lmina e lamnula.

34
8.2. FIXADOS E CORADOS

As preparaes fixadas e coradas so usadas para verificar as
caractersticas morfolgicas, sendo bastante utilizadas na identificao das
bactrias, pois tornam mais fcil a visualizao das formas e permitem a verificao
do comportamento tintorial do micro-organismo em relao s coloraes
diferenciais.

8.2.1. COLORAO AZUL DE METILENO DE LOEFFLER

Esta tcnica utilizada principalmente na avaliao da morfologia de
bactrias em esfregaos de lquido cefalorraquidiano, pois os danos causados s
clulas so menores em razo do menor nmero de manipulaes. Esta tcnica
consiste em colocar o corante sobre o esfregao previamente fixado deixando-se
corar por 3 a 5 minutos. Em seguida, escorre-se o corante, lava-se em gua corrente
e deixa-se secar para posterior observao ao microscpio.

8.2.2. COLORAO DE WRIGHT GIEMSA

Esta tcnica utilizada para corar os elementos celulares em esfregaos
sanguneos, para demonstrao de micro-organismos intracelulares e tambm para
demonstrar incluses intracelulares em esfregaos diretos, de pele ou mucosas.
Esta tcnica consiste em colocar o corante sobre o esfregao previamente fixado
deixando-se corar por 3 a 5 minutos. Em seguida, escorre-se o corante, lava-se em
gua corrente e deixa-se secar para posterior observao ao microscpio.

35
8.2.3. COLORAO DE GRAM

A colorao de Gram, descoberta h pouco mais de 100 anos por Hans
Christian J oaquim Gram, utilizada com muita frequncia para o exame
microscpico direto de amostras e subcultivos, para demonstrar as propriedades
tintoriais de todos os tipos de bactrias.
As bactrias coradas por esta tcnica pertencem a duas categorias distintas:
gram-positivas e gram-negativas. A diferena bsica entre os dois grupos
resultado da estrutura de suas paredes celulares. A tcnica consiste na aplicao de
um corante bsico, o cristal violeta e uma soluo de iodo e iodeto de potssio
(lugol), em um esfregao previamente fixado na chama. A preparao , ento,
tratada com um solvente orgnico (lcool ou acetona), com o objetivo de descolorir
as clulas.
As bactrias gram-positivas retm o corante ou o complexo cristal violeta e
iodo aps a descolorao e aparecem em azul escuro. As bactrias gram-negativas
no so capazes de reter o complexo cristal violeta e iodo aps a descolorao e
so contra coradas com um segundo corante (fucsina ou safranina), chamado
corante de contraste e adquirem a colorao vermelha.

8.2.4. COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN

Esta tcnica utilizada para corar os bacilos lcool-cido resistentes
(BAAR). Estes bacilos so assim denominados porque possuem um envoltrio creo
que resistente colorao. Para o corante penetrar na clula necessrio calor ou
detergente. Uma vez coradas as bactrias lcool-cido resistentes, estas resistem
descolorao, enquanto outras bactrias descoram com o lcool-cido. A tcnica
consiste em corar o esfregao previamente fixado com carbolfucsina (aquecer trs
vezes), descorar com lcool-cido a 3% e contra corar com o azul de metileno.

36
9. CONTROLE DE QUALIDADE

Em um sentido estrito, o controle de qualidade consistia em uma avaliao
contnua e sistemtica do trabalho em andamento, para assegurar que o produto
final se encontrava em grau aceitvel. Hoje, o controle de qualidade deve continuar
como antes, garantindo a qualidade do trabalho realizado. No entanto, os diretores e
supervisores do laboratrio devem compreender que o controle de qualidade
apenas uma das muitas facetas das certificaes de qualidade do manejo de risco.

10. BIOSSEGURANA

Biossegurana pode ser definida como o conjunto de medidas voltadas para
a preveno, minimizao ou eliminao de riscos inerentes s atividades de
pesquisa, produo, ensino, desenvolvimento tecnolgico e prestao de servios,
que podem comprometer a sade do homem, dos animais, do meio ambiente ou a
qualidade dos trabalhos desenvolvidos.
A segurana , antes de tudo, um direito e uma obrigao individual. A
Biossegurana laboratorial deve ser sustentada pelos planejamentos prvios das
atividades, avaliao dos riscos e adequao das instalaes.
A utilizao de normas de segurana requer atitude, bom senso e boa
conduta do profissional. Desta forma a preveno contra acidentes assegura os
resultados e a integridade das pessoas, instalaes e equipamentos.
Em um laboratrio, todos fazem parte de uma equipe, e a segurana
depende da ao dessa equipe, para avaliar os provveis riscos e determinar as
condies de segurana necessrias para o trabalho.
Os ambientes voltados prtica de atividades relacionadas sade podem
no parecer, para muitos, mas tambm so locais de trabalho que no esto livres
de acidentes.

37
O profissional de sade, como tambm pacientes, visitantes, pessoal de
apoio (limpeza e manuteno) e administrao est inserido em um grupo, que
diariamente est em contato direto com elementos geradores de riscos em potencial,
tais como equipamentos e substncias variadas utilizadas em processos de limpeza
e esterilizao.
Quando no so orientados devidamente, no tocante segurana, tornam-
se presas fceis desses elementos, que causam danos aos seus corpos, muitas
vezes de forma irreversvel.

----------- FIM MDULO I -----------

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