UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN SETOR DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BSICA CURSO DE MEDICINA

(BP335)

MANUAL TERICOTERICO-PRTICO DE PROCEDIMENTOS BSICOS EM MICROBIOLOGIA MDICA

3 EDIO

REALIZAO REALIZAO Professora Professora: Professora: Professora: Professora: Professora: Acadmico: Acadmico: Dr Cristina Leise Bastos Monteiro (Coordenadora) Dr Laura Lcia Cogo Dr Izabel Galarda Fernando Carlos Bortolozzi Filho

CURITIBA 2010

SUMRIO

A SEGURANA DOS ALUNOS NAS AULAS PRTICAS DE BACTERIOLOGIA E MICOLOGIA............................................................................... 3 INTRODUO ............................................................................................................ 5 CAPTULO 1: CONTROLE DE MICRORGANISMOS .............................................. 13 CAPTULO 2: TIPOS MORFOLGICOS DE BACTRIAS E GRUPAMENTOS BACTERIANOS............................................................................ 29 CAPTULO 3: MORFOLOGIA COLONIAL................................................................ 35 CAPTULO 4: VERIFICAO DA PRESENA DE BACTRIAS NO AR E SUA CONTAGEM ATRAVS DE CULTIVO.............................................. 37 CAPTULO 5: PREPARAES MICROSCPICAS ................................................ 39 CAPTULO 6: MEIOS DE CULTURA........................................................................ 52 CAPTULO 7: ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS ........................................... 55 CAPTULO 8: PROVAS BIOQUMICAS DIFERENCIAIS ......................................... 58 CAPTULO 9: MICROBIOTA NORMAL DO ORGANISMO HUMANO...................... 69 CAPTULO 10: DIAGNSTICO LABORATORIAL ATRAVS DO ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE AGENTES ETIOLGICOS .................... 79 - PORES SUPERFICIAIS E PROFUNDAS.......................................................... 79 - OROFARINGE ........................................................................................................ 88 - TRATO GNITO URINRIO ................................................................................. 106 - INTESTINAIS ........................................................................................................ 113 - FEBRE TIFIDE E PARATIFIDE ....................................................................... 126 - TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBITICOS .............................................. 131 CAPTULO 11: DOENAS SEXUALMENTE TRANSMISSVEIS........................... 136 CAPTULO 12: MICOBACTERIOSES .................................................................... 152 CAPTULO 13: LEPTOSPIROSE ........................................................................... 170 CAPTULO 14: OS FUNGOS E AS MICOSES ....................................................... 178 CAPTULO 15: HERPES-VRUS ............................................................................ 199 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................ 204 2

A SEGURANA DOS ALUNOS NAS AULAS PRTICAS DE BACTERIOLOGIA E MICOLOGIA

A segurana de todos depende dos cuidados individuais dos alunos e dos professores. Seguem-se as orientaes para os alunos executarem as tarefas dentro dos parmetros de biosegurana mdica: 1. 2. 3. 4. 5. 6. obrigatrio o uso de avental (ou jaleco, guarda-p, etc.) fechado na frente e de mangas compridas, para proteger a roupa e a pele dos braos. expressamente proibido comer, beber ou fumar dentro do laboratrio. No usar anis e pulseiras. Prender o cabelo comprido. Lavar as mos antes e depois dos procedimentos. Aps a lavagem das mos utilizar lcool 70% para otimizar a desinfeco. Evitar o contato da pele e mucosas com materiais clnicos tais como sangue, pus, escarro, fezes, urina, outras secrees e exsudatos. Tratar sempre todas as amostras como potencialmente infectantes, sendo que os maiores perigos esto relacionados com o vrus da hepatite B, HIV, bacilos da tuberculose e salmonelas. Observao: cada mL de sangue pode conter 100 milhes de vrus de hepatite B e uma s partcula provoca a hepatite. Caso ocorram respingos pelo material contaminado sobre a pele, fazer imediatamente a antissepsia do local. O avental respingado deve ser colocado em cartucho plstico para no contaminar outros objetos. 7. 8. No trabalhar nas proximidades de cadernos, mochilas e livros. As mochilas devem ser colocadas no fundo dos laboratrios no incio das aulas prticas. S utilizar pipeta quando esta tiver mecha de algodo no bocal. A mecha tem dois objetivos: proteger o operador do risco de contaminao com material patolgico ou culturas de microrganismos e preservar o material manipulado da contaminao pela saliva do operador (aerossis). 9. Jamais colocar o tampo de algodo dos tubos ou frascos sobre a mesa. Durante os procedimentos o tampo deve ser segurado com o dedo mnimo.

10.

Jamais colocar a pipeta usada sobre a bancada ou mesa de trabalho. Ela deve ser colocada em recipientes que contm desinfetantes (Lisoform, hipoclorito de sdio a 2%, etc.), bem como algodo para vidro (para no quebrar a ponta da pipeta) disponvel em cada mesa.

11.

Evitar a formao de aerossis, que so micropartculas que contm uma quantidade extremamente pequena de lquido (gua, saliva, etc.) e algumas partculas infectantes (vrus, esporos bacterianos, etc.). Estes aerossis podem cair sobre a mesa contaminando-a, ou ainda ficarem suspensos no ar e serem inalados, promovendo um possvel ciclo de infeco. Tais partculas podem se formar em procedimentos como flambagem da ala metlica, flambagem de pinas, abertura brusca de tubos ou frascos com tampa de presso, agitao de tubos com as mos, centrifugao de tubos abertos, manipulao incorreta de seringas, homogeneizadores, etc.

12. a) b)

Ao trmino do trabalho: Desinfetar a bancada com um desinfetante disponvel (hipoclorito, lcool 70%, clorexedine, lcool iodado, etc.). Lavar as mos e antebraos com gua e sabonete lquido. Em seguida utilizar, de preferncia, soluo degermante base de polivinilpirrolidona-iodo (PVPI) a 10%. Enxugar com toalha descartvel. Em seguida aplicar lcool 70% nas mos para dar continuidade desinfeco.

Observao: em caso de acidente, como de pipetas contaminadas, placas e frascos com material patolgico ou cultura de microrganismos obrigatrio: a) b) c) Derramar sobre o material quebrado um desinfetante (por exemplo lcool 70% ou clorexedine). Cobrir com toalha de papel. Deixar em contato, no mnimo, por uma hora antes de remover o vidro com uma pina e com a mo enluvada absorver o lquido com papel toalha, acondicionar em sacos apropriados e a seguir autoclavar.

ESTE MANUAL NO TEM FINS LUCRATIVOS USO PARA FINS ACADMICOS DENTRO DA UNIVERSIDADE
(Concentrado de obras que no esto disponveis nas bibliotecas da Universidade, por isso esse texto disponibilizado aos alunos).

INTRODUO

Micrbio: termo usado em 1878 por Charles Emmanocl Sedillot (cirurgio francs). Microbiologia: a cincia que estuda os microrganismos (seres pequenos, geralmente microscpicos) e suas atividades. So os protozorios, fungos, algas, vrus e bactrias. Os microrganismos constituem um grande grupo heterogneo, apresentando caractersticas variadas, tendo, no entanto, em comum o fato de conservarem ao longo do curso de evoluo biolgica, uma estrutura simples e indiferenciada, ou seja, possuem estrutura primitiva no apresentando tecidos ou rgos especializados. O estudo dos microrganismos compreende o conhecimento de suas formas, estruturas, reproduo, metabolismo e identificao. Trata ainda da sua distribuio na natureza e as relaes entre si e com os demais seres vivos. Estudam-se tambm as transformaes fsicas e qumicas exercidas nos seus habitats, das quais resultam efeitos prejudiciais ou proveitosos para outros seres vivos. Em ltima anlise os fenmenos chamados doenas infecciosas, do ponto de vista biolgico, so simplesmente interaes destrutivas entre vegetais e animais. A microbiologia pode ser estudada como cincia autnoma, mas tambm como instrumento de outras reas biolgicas. Foram os microrganismos que serviram, e servem cada vez mais, de modelos para as cincias modernas como: bioqumica, gentica, biologia molecular, engenharia gentica, etc. Para o estudo destas cincias preciso estar familiarizado com os microrganismos. Os microrganismos possuem muitas caractersticas que os tornam seres ideais para a investigao dos fenmenos biolgicos. Pode-se cultivlos facilmente em tubos (recipientes pequenos) o que requer menor espao para manuteno do que plantas e animais. Crescem rapidamente e se reproduzem a um ritmo extraordinariamente elevado. Algumas espcies bacterianas produzem cerca de 100 geraes num perodo de 24 horas. A cada 15 minutos surge uma nova gerao e de cada clula resultam 2 clulas filhas em uma progresso geomtrica sendo que no final de 24 horas teremos milhes de descendentes, o que no acontece com animais e plantas.

reas de aplicao da microbiologia O microbilogo, de uma maneira geral, pode se especializar no estudo de certos microrganismos. Estritamente falando, bacteriologia o estudo das bactrias (muitas vezes o termo usado como sinnimo de microbiologia), micologia estuda os fungos, virologia estuda os vrus e ficologia estuda as algas. freqente a especializao em algum aspecto da microbiologia: citologia bacteriana, gentica bacteriana, fisiologia dos fungos, etc. Existem numerosas reas onde a Microbiologia aplicada tem grande significado. Microbiologia mdica: os microrganismos muito estudados so os que causam doenas em humanos e so chamados de patognicos. Este ramo da microbiologia tambm estuda a preveno e controle de doenas, imunizao, imunologia e os mtodos diagnsticos. O microbilogo tambm busca estudar os microrganismos em ambientes particulares: solo, ar, gua, esgotos, etc. A educao de um microbilogo abrange um conhecimento geral da maioria das subdivises. Entretanto devido ao tremendo acmulo de informaes em cada especializao, o microbilogo deve se limitar a um ou poucos ramos selecionados da microbiologia.

Distribuio na natureza (habitat) Os microrganismos so encontrados praticamente em todos os ambientes, desde o solo e as massas de gua (mares, rios), ar, at as superfcies internas e externas de humanos e outros animais, bem como de plantas. Aparecem em maior abundncia onde encontram condies favorveis, como substncias nutritivas, umidade e temperatura adequada ao seu desenvolvimento. Os microrganismos, que so favorecidos pelas mesmas condies que a populao humana, podem produzir modificaes devido ao seu metabolismo, o que os torna patognicos para o homem. Felizmente a maioria incua e habita a superfcie do nosso corpo, trato digestrio, boca, nariz, e outras cavidades naturais. Dispomos de meios para resistir invaso daqueles que so potencialmente patognicos.

Posio entre os seres vivos Aps a descoberta dos microrganismos, ficou claro que eles mostravam todas as combinaes possveis das propriedades dos vegetais e animais, os dois reinos de seres vivos admitidos na poca, aparecendo vrios absurdos como por exemplo, os fungos foram classificados como vegetais porque eram imveis, quase no apresentando outras propriedades dos mesmos sendo tambm que nenhum fungo possui clorofila. Para evitar a distribuio arbitrria dos grupos intermedirios (entre plantas e animais), o cientista alemo Ernest Haeckel, discpulo de Charles Darwin em 1866, props o estabelecimento de um terceiro reino, para eliminar a confuso existente em relao posio dos microrganismos e para lhes proporcionar uma posio no mundo vivente. Este terceiro reino foi chamado Protista (da palavra grega que significa primitivo ou primeiro). O Reino Protista compreendeu as algas, protozorios, fungos e bactrias. .Algumas vezes os seres classificados em protistas eram denominados Protistas superiores e Protistas inferiores fundamentando-se em sua estrutura celular. Os superiores possuem clula eucaritica, como os protozorios, fungos e algas, com exceo das algas azulesverdeadas. Os protistas inferiores so procariticos: 'bactrias e algas azul-esverdeadas. Desde o conceito original deste terceiro reino de seres vivos tm sido desenvolvidos numerosos critrios para determinar mais adequadamente onde classificar estas microvidas. Uma abordagem a respeito da classificao microbiana foi oferecida por Stanier e Van Niel em 1941. Eles propuseram outra designao para outro reino chamado Monera, que deveria conter algas azul-esverdeadas e as bactrias. As outras algas e protozorios deveriam permanecer como pertencentes ao reino Protista. Os vrus, no entanto, ainda permaneciam como um enigma. Em 1969 foi proposto por Whittaker um outro sistema classificatrio de seres vivos, compatvel com os recentes estudos ultraestruturais, bioqumicos, genticos e os principais modos de nutrio: fotossntese, absoro e ingesto. Os cinco reinos de Whittaker so: Plantae, Fungi, Animmalia, Protista e Monera. Os microrganismos so encontrados em trs dos reinos: Monera (bactrias e algas azuis esverdeadas); Protistas (outras algas e protozorios); Fungi (fungos: leveduras e bolores).

Classificao dos microrganismos A classificao dos seres vivos serve a vrios propsitos, entre eles a de estabelecer critrios necessrios para a identificao e acima de tudo, eliminar confuses. A classificao dos microrganismos apresenta problemas peculiares podendo se basear em muitas caractersticas. De uma maneira geral as classificaes podem ser: Naturais ou Filogenticas e Artificiais ou Chaves. Nas Chaves as caractersticas descritivas so organizadas de tal forma que um organismo em estudo ser prontamente identificado. Os organismos agrupados numa chave no precisam necessariamente apresentar relao filogentica; eles so listados juntos porque apresentam algumas caractersticas em comum, facilmente identificveis. Ser perfeitamente razovel, por exemplo, colocar numa chave um grupo de bactrias formadoras de pigmento vermelho, tais como Serraria marcescens e as Sulfobactrias prpuras. Todavia, este agrupamento ser de muita utilidade, pois um pesquisador com a responsabilidade de identificar uma cultura com pigmento vermelho, imediatamente ter seu trabalho reduzido a poucos tipos bacterianos. Na classificao filogentica, agrupa-se tipos aparentados, isto , aqueles que tem um ancestral em comum. Durante os 100 anos da microbiologia como cincia, tm surgido muitas classificaes. Infelizmente no existe um sistema classificatrio inteiramente aceitvel para todos os microrganismos, principalmente para as bactrias. Dependendo da autoridade consultada, so observadas vrias inconsistncias. De tempos em tempos so propostos novos sistemas no aceitos em sua totalidade internacionalmente.

Classificao atual dos microrganismos Uma classificao proposta atualmente poderia ser a seguinte: 1. Monera: clulas procariticas. a) Bactrias b) Cianobactrias c) Arqueobactrias 2. Protistas: Deve-se utilizar a terminologia moderna e mais amplamente aceita. O termo protista atualmente empregado apenas para microrganismos eucariticos.

a) Algas b) Protozorios c) Fungos Elementos diferenciais entre as clulas

1. NCLEO Membrana Nuclear Cromossomos Aparelho mittico Histonas Genes

Procariticos Ausente Um, circular Ausente Ausente Agrupados

Eucariticos Presente Um ou mais, lineares Presentes Presentes No agrupados

2. NATUREZA E ESTRUTURA CITOPLASMTICA Correntes citoplasmticas Pinocitose Mesossomos Ausentes Ausente Presentes Dispersos no citoplasma Ausentes Ausentes Ausentes Ausentes Presentes Presentes Ausentes Dispostos em membranas, Ribossomos retculos endoplasmticos e cloroplastos Mitocndrias Cloroplastos Complexo de Golgi Vacolos limitados por membranas Presentes Podem estar presentes Presentes Presentes Procariticos Eucariticos

3. ESTRUTURAS CELULARES EXTERNAS

Procariticos Possui parte da

Eucariticos No desenvolve atividade respiratria ou fotossntese. Ausente Multifibrilas com microtbulos Presente em alguns

Membrana plasmtica

maquinaria respiratria e fotossntese

Parede celular de Peptdeoglicano Organelas locomotoras Pseudpodos * ausente em Mycoplasma sp.

Presente * Fibrilas simples Ausentes

4. RELAO GUANINA + CITOSINA Mols de Guanina e Citosina

Procariticos

Eucariticos

28 a 73

Cerca de 40

Bactrias O termo bactria, derivado do grego "gotinhas" foi introduzido em 1828 pelo alemo C. G. Ehrenberg como nome genrico de alguns tipos bacterianos caractersticos. Bactrias so organismos microscpicos, unicelulares e procariticos.

Taxonomia bacteriana geral Desde a primeira tentativa conhecida de classificao das bactrias, realizada por Mller, em 1773, um grande esforo foi empregado na taxonomia bacteriana, mas at agora nenhum dos numerosos esquemas propostos recebeu aprovao universal. H falta de concordncia nas classificaes, mas havendo um interesse em evitar confuso generalizada preciso aceitar e permitir a evoluo de algum plano razoavelmente exeqvel acompanhando naturalmente o progresso dos novos conhecimentos. Uma das classificaes foi proposta pela Sociedade Americana de Microbiologia atravs de seu

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Bergey' s Manual of Detenninative Bacteriology ao longo de muitas edies. A 9 edio do manual de Bergey tem como ttulo: "Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology". O manual de Bergey representa mais de 70 anos de evoluo, sendo mais aceito que qualquer outro sistema. Devido s incertas relaes filogenticas das bactrias, o manual admite que sua principal aplicao seja determinativa, isto , permitir aos pesquisadores determinar se ce11o microrganismo corresponde a uma espcie descrita. A 1 edio data de 1923, j tendo alcanado a 9 edio. Em cada edio subseqente, tm sido feito vrios avanos significativos, inclusive o acrscimo de novas espcies e excluindo outras. Atualmente um dos esquemas da classificao semi-oficial disponvel o que foi publicado na 9 edio do Bergey's manual de 1984. amplamente utilizada como padro de referncia na taxonomia bacteriana. Ele reconhece o reino Monera de Whittaker, chamando-o, no entanto, de Procaryotae, em virtude da natureza procaritica de suas clulas. Novos conhecimentos causaro uma grande diferena nas futuras publicaes a respeito da classificao microbiana. Nos ltimos anos o sistema gentico das bactrias foi estudado ao nvel molecular a fim de determinar a homologia entre o DNA das clulas. O parmetro empregado com mais freqncia a porcentagem de molculas de guanina mais citosina no contedo total de DNA. A composio das bases do DNA uma caracterstica constante de uma determinada espcie e expressa em porcentagem de guanina mais citosina sobre o total de mols das bases. Se dois organismos tm propores muito diferentes de bases, obviamente no so muito relacionados. Centenas de espcies tm sido caracterizadas desta maneira modernamente. Em 1980 o Comit Internacional sobre Sistemtica Bacteriolgica, publicou uma lista de aproximadamente 2500 espcies, substituindo uma lista anterior de 30000. Desde 1 de janeiro de 1980 apenas a nova lista de nomes considerada vlida. A substituio das denominaes abandonadas, o acrscimo de novas ou quaisquer outras alteraes, exigem publicaes no International Journal of Systematic Bacteriology. Bactrias: Uma chave classificatria para bactrias estabelece 4 grupos bacterianos, em funo do metabolismo de movimentao e das caractersticas da parede celular.

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Vrus: Complexo molecular vivo, possuindo DNA ou RNA. *Os dados citados foram compilados de textos dados em aula.

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CAPTULO 1: 1: CONTROLE DOS MICRORGANISMOS

indispensvel o conhecimento do controle das populaes microbianas para todos os profissionais da sade. A medicina progredia medida que surgiam novos conhecimentos sobre o domnio dos microrganismos, reduzindo infeces e a transmisso de doenas contagiosas, executando cirurgias asspticas, etc. Os microbiologistas conseguiram estudar as espcies bacterianas, aps as aplicaes artificiais de condies desfavorveis sua multiplicao. Atravs dos processos de esterilizao dos objetos utilizados, meios de cultura estreis e tcnicas de assepsia, obtiveram populaes bacterianas puras e, estas sim, puderam ser estudadas em todos os detalhes: morfolgicos, estruturais, fisiolgicos, obter dados sobre seus fatores de virulncia e outros. O uso de materiais esterilizados condio indispensvel para o desempenho dos trabalhos microbiolgicos. Antes de iniciar o estudo dos mtodos de controle dos germes, importante conceituar vrios deles, tais como: esterilizao, desinfeco (desinfetantes), anti-sepsia (anti-spticos), assepsia, saneamento e sanitizao. Esterilizao: deve resultar na destruio total de todas as formas de vida presentes no material submetido ao processo em questo. Desinfeco: o processo que remove a maioria dos microrganismos viveis, reduzindo a bioburden (carga de organismos viveis). A desinfeco, na maior parte das vezes, conseguida pelo uso de substncias qumicas chamadas desinfetantes, destinadas a destruir os germes potencialmente patognicos, mas que so ineficientes contra a maioria dos esporulados. O calor em temperaturas de 60 a 100oC tambm tem ao desinfetante, pois no destri todos os esporos. Anti-sepsia: o conjunto de meios usados para evitar a proliferao de germes, inativando ou destrudo-os. O termo anti-sepsia geralmente usado referindo-se aos tecidos vivos, como anti-sepsia da pele, anti-sepsia de feridas, etc., reservando-se o termo desinfeco para objetos inanimados. A anti-sepsia obtida pela ao de substncias qumicas chamadas anti-spticos. Assepsia: conjunto de procedimentos que impede a penetrao de microrganismos em local que no os contenha. Saneamento: mantm a microbiota dentro dos valores populacionais previamente estabelecidos por instituies de sade.

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Sanitizao: usada em restaurantes e indstrias de alimentos, refere-se eliminao dos microrganismos em utenslios e equipamentos para impedir a deteriorao ou transmisso de infeces pelos produtos alimentares.

ESTERILIZAO

importante o conhecimento das diferentes tcnicas de esterilizao, para saber qual delas aplica-se melhor, para casos especficos, e que cause dano mnimo ao material envolvido. Para pessoas da rea de sade, indispensvel tambm conhecer os efeitos que alguns agentes esterilizantes (agentes qumicos, radiaes) exercem sobre o corpo humano. Os meios mais utilizados para esterilizao so os meios fsicos, tais como temperaturas elevadas e as radiaes. Alm destes, possvel eliminar a microbiota presente em um lquido ou gs, por processos mecnicos, como a filtrao. Como agentes qumicos podem ser usados muitos compostos. A escolha dos agentes e dos diferentes mtodos, depende do resultado que se deseja e do material ou local em que o processo vai ser aplicado. Segue-se o esquema e a descrio de alguns processos. Esterilizao e Desinfeco por Meios Fsicos Calor - Calor Seco Flambagem Forno de Pasteur (estufa) Incinerao

- Calor mido Pasteurizao Tyndallizao ou Tindalizao gua Fervente Autoclavao

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Filtrao - Velas Chamberland porcelana porosa Berkefeld infusrios

- Discos Vidro Amianto Seitz

- Membranas Acetato de celulose: Millipore e HEPA Nitrato de celulose

- Algodo para gases (ar)

Radiaes - Ultravioleta (UV) NO IONIZANTES - Gama () - IONIZANTES

Esterilizao e Desinfeco por Agentes Qumicos Agentes Qumicos: - Lquidos lcoois, detergentes, lcalis, glutaraldedo. - Gasosos brometo de metila, xido de etileno, formaldedo. - Slidos pastilhas de formalina.

Esterilizao e Desinfeco por Meios Fsicos A ao letal do calor uma relao tempo-temperatura afetada por numerosos fatores que devem ser levados em considerao, na seleo da intensidade trmica e na durao da exposio, para reduzir a populao bacteriana ao nvel desejado.

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CALOR SECO

a)

Flambagem a exposio do objeto chama de bico de Bunsen ou lamparina. Na tcnica bacteriolgica utiliza-se a flambagem para esterilizar a ala de platina pelo aquecimento at o rubro. As pinas, as pipetas, as bocas dos tubos e bales em que se faz a semeadura so aquecidos na chama (chamuscadas) sem, no entanto, levlas ao rubro.

b)

Ar Quente Forno de Pasteur O Forno de Pasteur moderno uma estufa de forma retangular de paredes duplas, isolada termicamente e aquecida por eletricidade. A temperatura desejada regulada e mantida por um termostato. Em seu interior existem prateleiras mveis. Na poro superior possui orifcios para ventilao e colocao de termmetro graduado em 200oC. Observao: o aparelho e seu funcionamento sero mostrados em aula. A exposio ao ar quente constitui mtodo usado correntemente em bacteriologia, para a esterilizao de materiais secos, tais como: tubos, ampolas, placa, provetas, objetos metlicos, leo mineral, vaselina slida, parafina, talco, areia, etc. A vidraria seca ser esterilizada no forno a 170 180oC por uma hora. O papel que protege o material e os tampes de algodo adquire cor parda, porm no devem escurecer demais ou tornarem-se quebradios. Deixar o forno esfriar espontaneamente. A destruio dos microrganismos ocorre por desidratao e oxidao dos constituintes celulares. Limitaes: no se pode esterilizar a seco a vidraria fina como bales volumtricos e pipetas graduadas de preciso, lquidos diversos, meios de cultura, borracha, etc.

c)

Incinerao O mtodo de incinerao, do ponto de vista microbiolgico, consiste em destruir os microrganismos junto com os materiais orgnicos onde eles se localizam. So materiais removidos dos curativos, peas anatmicas, animais de experincia infectados e mortos, etc., (h os incineradores usados na queima de lixo no hospitalar). Os incineradores que possuem uma s cmara de combusto so ineficazes e inadequados. Isto porque os materiais no so destrudos por completo, contaminando a atmosfera por microrganismos e substncias txicas. O incinerador

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deve ter, alm da cmara de combusto principal, uma cmara de combusto secundria. Ideal quando a 1a cmara est a 800oC e a segunda aquecida no mnimo a 1000oC. A incinerao tem-se tornado um problema social e poltico em muitas comunidades, principalmente europias. Isto porque, a queima em altas temperaturas de matria orgnica e plstico, gera substncias altamente txicas, tais como as dioxinas. Incineradores, na verdade, so indstrias de ultragifte ultravenenos expresso cunhada pela comunidade cientfica para designar dioxinas e furanos. Observao: o criminoso Agente Laranja usado na Guerra do Vietn era rico em dioxinas (Fonte: Proteo no 11 vol. 03).

CALOR MIDO

a)

Pasteurizao Ato de pasteurizar. Processo pelo qual um determinado material (o leite, por exemplo), aquecido a uma temperatura no elevada (62,8oC por 30 minutos ou 71,7oC por 15 minutos) e a seguir submetido a resfriamento brusco (em torno de 4oC), obtendo-se assim a morte dos germes patognicos, no caso do leite: Salmonella, brucelas, estreptococos, bacilos da tuberculose, mas no a eliminao total dos germes contaminantes (bactrias esporuladas). um processo de desinfeco.

b)

Tyndallizao ou Tindalizao uma esterilizao fracionada. Tyndall, o idealizador do processo, verificou que o aquecimento descontnuo, ou seja, aquecimento a 100oC, durante 1 hora, em 3 dias consecutivos, intercalados por perodos de incubao em temperatura ambiente, conseguia esterilizar a soluo em estudo. Os esporos resistentes germinam durante o tempo de incubao e so destrudos nas subseqentes exposies ao calor. A temperatura de tindalizao varia de acordo com o material a esterilizar. Alguns meios de cultura bacteriolgicos, solues de carboidratos, solues de vitaminas ou enzimas, etc., sero aquecidas temperatura que no altere as suas propriedades.

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c)

gua em Ebulio Os materiais ou objetos contaminados no podem ser esterilizados com segurana pela simples exposio gua em ebulio. Embora as clulas vegetativas das bactrias possam ser destrudas em poucos minutos, alguns esporos resistiro durante muitas horas. A imerso em gua fervente quando usada para esterilizao de instrumentos cirrgicos, seringas de injeo, etc., oferece o risco de contaminao por esporulados. S deve ser usada em circunstncias emergenciais. Pela fervura do material mergulhado em gua ou exposto ao vapor em autoclave com vlvula aberta (vapor fluente) s se consegue uma desinfeco e no esterilizao.

d)

Autoclave (temperatura superior a 100oC) um mtodo em que se utiliza vapor dgua sob alta presso, de tal modo que o meio mais prtico, rpido e barato de esterilizao. O aparelho que utiliza-se nesse procedimento chama-se autoclave. H vrios modelos: horizontais, verticais, aquecidas a gs ou eletricidade, ou ainda, alimentadas por vapor gerado em caldeiras separadas. Autoclave de Chamberland: caldeira de paredes resistentes, tampa com borracha apertada por parafusos. Orifcios para o manmetro, vlvula de segurana e torneira. Autoclave usa vapor dgua sob presso regulada. uma cmara de vapor saturado equipada com dispositivos que permitem a manuteno do vapor em determinada temperatura e presso por quaisquer perodos de tempo, dependendo da natureza do material a esterilizar, do tipo do continente e de seus volumes. Por exemplo: tubos de ensaio com meios lquidos podem ser esterilizados em 10 a 15 minutos a 121oC. Os mesmos lquidos em bales de 10 litros requerem 1 hora ou mais sob a mesma temperatura e presso. Materiais utilizados em Biologia Molecular necessitam de 40 minutos de autoclavao (para agir no DNA). Modo de proceder: o material a esterilizar embrulhado em papel ou sacos plsticos (como os de microondas) formando pacotes. Os pacotes so colocados dentro de uma cesta metlica, esta repousa sobre um suporte, evitando o contato com gua do fundo da autoclave. Iniciar o aquecimento com torneira aberta. Quando a gua comear a ferver, h emisso de um jato intermitente de vapor e ar. Quando todo o ar for expulso, comea a sair um jato contnuo de vapor, neste momento fecha-se a

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torneira. Com a continuao do aquecimento, haver aumento de presso acusado pelo manmetro. Ao ser atingida a temperatura desejada, 120oC por exemplo, marca-se o tempo. Aps esse perodo desliga-se a corrente eltrica. Para abrir a autoclave, espera-se at que o manmetro abaixe para zero. S ento se abre a torneira. O material sai da autoclave impregnado de umidade. Deve-se coloc-lo na estufa 60oC para a secagem. H autoclaves mais modernas em que o material j sai seco, como a que existe no departamento de Bioqumica da UFPR. Observao: a autoclave e seu funcionamento sero mostrados em seminrios, acompanhando os processos de preparao de material para a esterilizao. Desvantagens e Limitaes: alguns materiais no miscveis na gua, como gorduras, leos, vaselina lquida e slida e parafina, que consequentemente no podem ser autoclavados. Tais materiais no so atingidos pelo vapor, e os microrganismos podero sobreviver. Algumas substncias so alteradas (metais que oxidam) ou destrudas. O talco e a areia umedecidos so difceis de secar. Vantagens: 1. Aquecimento rpido. 2. Grande poder de penetrao em material denso. 3. Maior condutibilidade. 4. No deixa resduos txicos. 5. Mais econmico. 6. Termocoagulao das protenas, catalisada pela gua. O calor mido desnatura protenas, quebrando ligaes qumicas envolvidas na manuteno da conformao espacial das protenas, causando sua coagulao.

Grau de Umidade (%) 50 25 18 06 00

Temperatura de Coagulao da Ovoalbumina 56 80 90 145 170

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Eficincia Comparativa do Calor Seco e do Calor mido como Esterilizantes O calor mido tem um poder de penetrao superior. A penetrao do calor seco menor, sendo necessrio, portanto, esterilizar o equipamento e utenslios a temperaturas mais elevadas e por perodos mais longos. Esta diferena de poder de penetrao do calor em estado seco ou mido exemplificada pela verificao de que, em um fardo de flanela exposto ao calor seco a 150oC durante 4 horas, a temperatura atingida no centro sobre apenas a 83oC, ao passo que, temperatura de 120oC em autoclave durante 1 hora e meia, a temperatura central chega a 117oC.

Fardo de Flanela Calor Seco 150oC 4 horas Calor mido 120oC 1 hora e meia

Temperatura Central 83oC 117oC

Microrganismo Clostridium botulinum Bacillus anthracis

Calor mido 120oC 20 minutos 15 minutos

Calor Seco 120oC 120 minutos 120 minutos (150oC)

Calor mido (tempo em minutos para vrias temperaturas) Microrganismos Bacillus subtilis Clostridium botulinum Bactrias do solo Anaerbios putrefao Bactrias termfilas 780 400 100oC 300 530 420 105oC 115oC 40 20 30 06 11 120oC

Testes para Controle de Eficincia da Autoclave Em geral, necessrio fazer o controle de esterilidade enquanto a autoclave est em operao, em vez de tentar reconhecer falhas, atravs do isolamento de microrganismos no material processado.

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Embora a temperatura e a presso sejam indicadas pelo termo-manmetro, todos os laboratrios microbiolgicos fazem testes confirmatrios de esterilidade do material processado. Para tanto se pode recorrer a mtodos fsicos e biolgicos. Nos mtodos fsicos usa-se: 1. Indicadores que tm por base a reao de um composto qumico quando expostos a um parmetro necessrio esterilizao. Geralmente vm em forma de fitas ou selos que mudam de cor na temperatura estabelecida. 2. Substncias qumicas em p (acondicionadas em ampolas de vidro) cujo ponto de fuso conhecido. Aps a autoclavao, observar a substncia que deve aparecer fundida. Observao: para cada mtodo de esterilizao existem indicadores qumicos especficos. No mtodo biolgico usam-se esporos bacterianos altamente resistentes como os do Bacillus stearothermophillus. Os esporos podem vir acondicionados em frascos com meio de cultura ou impregnados em tiras de papel de filtro seco, numa concentrao de 106 esporos em ambos os casos. Os esporos do Bacillus stearothermophillus morrem quando submetidos a 121oC por 15 minutos. Colocar os esporos na autoclave em pontos crticos, centro e fundo da cesta, pontos em que a temperatura desejada obtida com maior dificuldade. Aps a autoclavao, incubar a 55 a 57oC os esporos em caldo (ou no caso de usar as tiras, transferi-las para um caldo) durante 24 a 48 horas. Caso haja turvao, indica que o bacilo proliferou e que a autoclavao foi insatisfatria. Os bioindicadores existem no comrcio sob o nome de Esporofars, Steritest e outros.

FILTRAO

A filtrao o mtodo de escolha para esterilizar solues contendo substncias termossensveis como o soro sanguneo, plasma, soluo de vitaminas, soluo de enzimas, soluo de alguns carboidratos, fluidos para inoculao, colrios, etc. Lquidos injetveis so primeiramente filtrados e depois autoclavados para evitar pirognios. Estes so componentes termoestveis da degradao das bactrias.

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As tcnicas de filtrao so tambm usadas para recuperar pequenas quantidades de bactrias presentes em grandes volumes de lquido, como, por exemplo, gua. Nestes casos, aps a filtrao, a membrana colocada em meio de cultura adequado, as bactrias vo proliferar dando colnias que podem ser quantificadas, estudadas e identificadas. A filtrao pode ser aplicada na descontaminao de gases como o ar. O exemplo disto dado pelo uso de tampes de algodo que obturam a boca de tubos, bales vazios ou contendo meio de cultura. O algodo suficientemente poroso para permitir a entrada de ar e impedir a entrada de germes. Outro exemplo a filtrao do ar nas cmaras asspticas, salas de cirurgia, etc. Numerosos so os dispositivos e materiais usados na tcnica da filtrao, como por exemplo: a) b) c) VELAS DISCOS MEMBRANAS - Chamberland: porcelana. - Berkefeld: terra infusrios. - Vidro. - Amianto. Acetato de celulose, tambm chamados de filtros moleculares. Exemplo: Millipore. Atualmente so as mais usadas nas tcnicas de filtrao. Elas apresentam a vantagem de poder ser autoclavadas. H as descartveis. Podem filtrar diversos lquidos: gua, lcool, ter, toluol, xilol, metano, etano, acetileno, parafina, naftalina, terpeno, etc., sem sofrer degradao. Tamanho dos poros: 0,05 a 10 m (micrmetros). Cada cm2 contm milhes de poros, 80% da membrana espao aberto e 20% de material slido, com isto o fluxo em torno de 40 vezes mais rpido que pelos demais filtros.

Ultrafiltrao Elford coldio membrana Gradocol (de nitrato de celulose). Poros: 10 a 10.000 m (para determinar o tamanho do vrus).

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Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) de Acetato de Celulose Utilizados para produo de fluxo de ar estril em cmaras bacteriolgicas asspticas, salas de cirurgia, etc. H produo de fluxo de ar no turbulento ou laminar. Eficincia = 99,97%

RADIAES NO IONIZANTES (U.V.)

As radiaes na forma de luz ultravioleta tm sua atividade melhor na faixa de 250260 m, comprimento de onda de absoro mxima pelas bases pricas e pirimdicas do DNA, formando dmeros, inibindo a replicao do DNA. comum seu emprego para esterilizao do ar em hospitais e tambm em laboratrios de microbiologia, nas cmaras asspticas, onde as condies de assepsia devem se manter rigorosamente controladas. Emprega-se esse tipo de radiao para reduzir a populao microbiana da superfcie dos equipamentos ou do ar. O seu poder de penetrao mnimo. Uma camada fina de vidro ou gua pode impedir a ao da luz U.V. O uso de raios U.V., em medicina, limitado por danificar a crnea e a pele. Raios Gama e Raios X Os raios gama so atualmente muito usados para esterilizar grandes quantidades de itens de pequeno porte tais como agulhas, seringas, equipamentos endovenosos, cateteres e luvas. O material esterilizado j acondicionado na sua embalagem final. O processo 100% eficiente e ininterrupto. No uma tcnica aplicvel para uso descontnuo, pois no possvel ligar ou desligar. Os raios gama e os raios X criam radicais livres ativos (OH- e H+) pela hidrlise da gua. Estes radicais altamente reativos quebram as ligaes covalentes do DNA, alterando as estruturas do DNA e das protenas. Vantagens Desvantagens - esterilizao fria (indstria alimentcia e farmacutica); - alto poder de penetrao. - alto custo; - operadores altamente especializados;

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- acarreta srios danos sade, tais como: a) alteraes celulares (neoplasias malignas, como a leucemia); b) leses de gnadas (alteraes cromossmicas).

ESTERILIZAO E DESINFECO POR AGENTES QUMICOS

A esterilizao por produtos qumicos indicada apenas para os materiais que no podem ser submetidos ao calor. A escolha de um agente qumico depender da finalidade do uso. No existe uma substncia ideal capaz de agir em todos os casos. Alguns so muito ativos, mas txicos para os tecidos vivos, portanto usados apenas em objetos inanimados. Outros apresentam instabilidade quando em soluo. Alguns so rapidamente inativados em contato com matria orgnica. A maioria dos agentes qumicos age como desinfetante ou anti-sptico, somente alguns so capazes de esterilizar, embora se saiba que os produtos qumicos podem agir como bacteriostticos ou esterilizantes dependendo da concentrao e do tempo de ao. cido fnico em soluo de 0,2% age como bacteriosttico e a 5% esterilizante. Alguns produtos qumicos so mais utilizados que outros devido a vrios fatores: facilidade de obteno, menor custo, maior estabilidade quando em soluo e seu poder germicida. Assim temos: Produto Qumico Deve ter - Atividade antimicrobiana de largo espectro. - Estabilidade e homogeneidade quando em soluo. - Inocuidade para o homem. - Boa solubilidade. Deve no ser - Corrosivo. - Irritante. Deve - No deixar resduos.

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- No alterar materiais como borracha, plstico, etc. Na aplicao de qualquer agente qumico necessrio observar-se as seguintes variveis: a) Concentrao; b) Tempo; c) Temperatura; d) pH; e) Limpeza.

AGENTES QUMICOS Agentes qumicos so comumente empregados para a esterilizao ou desinfeco de equipamentos: Lquidos: cidos e lcalis fortes, glutaraldedo, compostos fenlicos, lcoois e compostos quaternrios de amnio. Gasosos: oznio, brometo de metila, -propionalactona, xido de etileno, xido de propileno e formaldedo. Slidos: pastilhas de formalina.

xido de Etileno um gs incolor, no corrosivo e que se liquefaz a 10,9oC, sendo o lquido bastante solvel em gs e solventes orgnicos. Concentraes acima de 100 mg/L so txicas ao ser humano, causando irritaes dos olhos e pulmes; nuseas, edema pulmonar e danos pele. O gs altamente inflamvel e explosivo, no se podendo trabalhar em temperaturas elevadas, no mximo 60oC. Aplicaes industriais so baseadas no uso de misturas contendo 10% de xido de etileno e 90% de CO2 ou 50% de xido de etileno e 50% de formato de metila. O gs tem elevado poder de penetrao em material orgnico, incluindo plsticos, borrachas, madeira, papel, tecidos (l), couro, produtos desidratados, equipamentos de

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anestesia e seringas sem danific-los, o que recomenda muito o seu emprego. Pode ainda ser utilizado em metais, vidros e materiais eltricos. O uso de xido de etileno requer equipamentos adequados de alto custo. O aparelho esterilizador a ETO formado de um conjunto de trs unidades: Uma autoclave (cmara grande) tendo o gs ETO e vapor dgua. Um painel de controle onde est conectado o cilindro de mistura de gases. Uma cmara secadora onde o material, aps a esterilizao, obrigatoriamente submetido aerao, que consiste na circulao de ar filtrado. O ar passando pelos materiais faz a remoo dos resduos de gs retido nos mesmo. Tendo condies adequadas de temperatura, presso de vapor dgua, tempo e concentrao do gs, o ETO muito eficiente. Condies: Temperatura entre 49 e 60oC; Tempo de exposio de 2 a 12 horas; Concentrao do gs 450 mg/L; Umidade de 20 a 40%.

xido de Etileno Vantagens a) Bactericida, viricida, esporicida; b) Temperatura baixa 47-60 C; c) Grande variedade de materiais; d) Equipamento anestesia, seringa. O xido de etileno atua como alquilante, inativando as enzimas e outras protenas que tm tomos de H lbeis, como em grupos sulfidrila. O anel da molcula do xido de etileno se rompe para formar CH2 CH2O que se insere entre tomos de enxofre e hidrognio do grupo sulfidrila:
o

Desvantagens a) Alto custo; b) Txico; c) Inflamvel.

H2C O

H2C

R.SH (enzima ativa)

R.SCH2.CH2.OH (enzima inativa)

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Formaldedo O formaldedo, de estrutura simples (HCOH), estvel em altas concentraes e temperaturas elevadas, mas extremamente txico, seus vapores so irritantes s mucosas. Em temperatura ambiente o formaldedo polimeriza-se, formando uma substncia slida, incolor paraformaldedo que libera formaldedo pelo aquecimento. Formalina a soluo aquosa de formaldedo (37 a 40%), forma em que comercializado. O formaldedo utilizado na forma gasosa para esterilizar reas fechadas, como quartos de doentes contagiosos, aps a desocupao. A umidade e temperatura tm grande influncia sobre sua ao antimicrobiana, temperatura ideal de 22oC e umidade de 60 a 80%. Tem a desvantagem do baixo poder de penetrao. A sua ao com os grupos amino, hidroxila, carboxila e sulfidrila, introduzindo um radical (CH2), alterando a estrutura das protenas e cidos nuclicos.

Glutaraldedo Age de modo semelhante ao formaldedo, mas menos txico e dez vezes mais eficiente. Age lentamente porm efetivamente. Usado na desinfeco de endoscpios e equipamentos de terapia respiratria.

Outras substncias de interesse na prtica mdica lcoois: os mais usados so o lcool etlico e o isoproplico. O lcool etlico muito usado na degermao da pele e desinfeco de superfcies, algumas vezes em combinao com iodo. Requer presena de gua (lcool a 70%) para sua atividade mxima. O lcool desestrutura os lipdios da membrana celular e desnatura as protenas bacterianas. cidos e lcalis: a variao acentuada de pH pode resultar em cessao do metabolismo e morte do microrganismo. A ao dos cidos depende do seu grau de ionizao: da concentrao hidrogeninica no caso dos cidos minerais ou da natureza de suas molculas no caso dos cidos orgnicos. A ao dos lcalis depende do seu grau de

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dissociao, da concentrao de ons hidroxila e do on metlico do lcali. O hidrxido de clcio um deles. de alto poder desinfetante, usado em quartos de doentes, excretas, vages, etc. Oxidantes: inativam as clulas oxidando os grupos sulfidrila livres. So: perxido de hidrognio, iodo, cloro e compostos que liberam lentamente o cloro (cal clorada). O iodo anti-sptico muito utilizado nas prticas mdicas. de efeito imediato. encontrado em duas formas: Tintura de Iodo e iodforos. Os iodforos so complexos de iodo com detergentes ou outras molculas carreadoras. Os iodforos liberam iodo lentamente, no irritam a pele, no tem odor irritante e no tingem os tecidos. O iodo reage especificamente com resduos de tirosina das protenas e inativa as enzimas que contm pontes de dissulfeto. Detergentes: so agentes surfactantes ativos e podem ser aninicos ou catinicos. a) Detergentes aninicos tm hidrocarboneto de cadeia longa de carga eltrica negativa, por exemplo: os sabes e produtos sintticos semelhantes aos sabes. Os produtos sintticos so mais solveis e mais baratos que os sabes convencionais. b) Detergentes catinicos de carga eltrica positiva. Os mais usados so os detergentes de compostos quaternrios de amnio. Estes compostos tm amplo espectro bactericida e bacteriosttico mesmo em altas diluies contra bactrias Gram positivas e Gram negativas. Os detergentes agem sobre os lipdeos da membrana celular alterando sua funo ou desintegrando-a. tambm desnaturam as protenas. Os compostos quaternrios de amnio so muito solveis em gua, so pouco txicos e no corrosivos, como o cloreto de benzalcnio, muito utilizado na anti-sepsia da pele. Metais Pesados: os mais usados so mercrio e prata. Ambos possuem boa atividade antimicrobiana. O mercrio quando combinado a outras substncias, apresenta-se menos txico ao organismo humano que o prprio metal. Por exemplo: mercrio cromo, Mertiolato. A prata combinada com protenas antissptico de mucosas do nariz e garganta: Argirol, Protargol. Estes metais agem inativando as enzimas bacterianas atravs do grupo sulfidrila.

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CAPTULO 2: 2: TIPOS MORFOLGICOS DE BACTRIAS E GRUPAMENTOS BACTERIANOS

Objetivos a. Observar e comparar a morfologia das diversas bactrias em lminas focalizadas. b. Identificar nas preparaes microscpicas focalizadas a forma da clula e o grupamento. c. Verificar se nos grupamentos h ou no arranjos sempre com o mesmo nmero de clulas. d. Observar estruturas bacterianas no interior das clulas (esporos, granulaes).

Tipos Morfolgicos Embora existam milhares de espcies bacterianas, as suas clulas podem agruparse em trs tipos morfolgicos fundamentais: a) Arredondada; b) Alongada; c) Ondulada.

COCOS

Forma arredondada (perfeitamente esfricas, elpticas, em chama de vela e riniformes. * VER PRANCHAS DE MORFOLOGIA NAS AULAS PRTICAS

Esfrico: Completamente arredondado. Exemplo: Staphylococcus aureus.

Coco-oval (alongado) Exemplo: Streptococcus pyogenes.

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Pneumococo (em forma de gota, chama de vela) Exemplo: Streptococcus pneumoniae.

Fonte: Fernando Bortolozzi

Gonococo

Meningococo:

Forma

riniforme (em forma de feijo ou rim) Exemplos: Neisseria gonorrhoeae (G) Neisseria meningitidis (M).

BACILOS
Forma alongada ou cilndrica. Bastonetes. (variaes: quanto ao comprimento, espessura e forma das extremidades). Obs: Os bacilos eram tambm denominados bastonetes at alguns anos atrs. No entanto, a denominao bastonete de uso mais aconselhvel para os neutrfilos imaturos que saem da medula ssea mielide e vo para a corrente sangunea suprir necessidades fisiolgicas durante uma infeco (desvio esquerda, como ser visto nas aulas de Patologia Mdica Molecular BP337). Portanto para bactrias alongadas, prefere-se o termo BACILO. VARIAES BACILARES:

Finos e curtos: tm extremidades arredondadas. Exemplo: Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas, Mycobacterium.

Finos e longos (forma filamentosa). Parece um fio de cabelo. Exemplo: Leptotrix buccalis, Lactobacillus sp.

Curtos, espessos e extremidades rombadas. Exemplo: Bacillus. Finas longas e extremidades agudas.

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Exemplo: Fusobacterium nucleatum. Curta e arredondada (cocobacilo). Exemplo: Brucella, Haemophilus sp. * VER PRANCHAS DE MORFOLOGIA NAS AULAS PRTICAS Nos bacilos, sempre o comprimento predomina sobre a espessura no mnimo uma vez e meia, ao contrrio dos cocos, nos quais essas dimenses permanecem quase iguais.

FORMAS ONDULADAS

Forma ondulada, espiralada ou helicoidal. Compreende: a) Espirilos b) Espiroquetas c) Vibries

a) Espirilo: possui corpo rgido, movendo-se custa de flagelos.

Exemplo: Spirillum

b) Espiroqueta: corpo flexvel e mvel com o auxlio de filamentos axiais presentes sob a camada externa.

Exemplo: Treponema pallidum

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c) Vibrio: em forma de vrgula, apenas um seguimento de espiral.

Exemplo: Vibrio cholerae

Imagens: Tortora, 2005

Outros: Entre espirilos e espiroquetas aparecem diferenas notveis de comprimento, espessura, nmero e amplitude de espiras.

Algumas possuem pequeno nmero de espiras, abertas e irregulares. Exemplo: Borrelia.

Outras tm espiras numerosas, regulares e apertadas semelhana de dentes de serra. Treponema pallidum Leptospira interrogans

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GRUPAMENTOS BACTERIANOS

Ao lado da forma da clula, importante o conhecimento das diferentes disposies que as bactrias apresentam, chamadas de grupamentos, pelos quais podem-se diferenciar gneros bacterianos. Estas multiplicao. Podem ocorrer os seguintes arranjos:
Imagens: Fernando Bortolozzi e Tortora, 2005 h

associaes

so

explicadas

por

peculiaridades

dos

processos

de

NOMENCLATURA DO GRUPAMENTO Diplococos (dois a dois) 1

FORMATO

EXEMPLOS 1. Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitis (GONOCOCO e MENINGOCOCO) 2. Streptococcus pneumoniae (PNEUMOCOCO) Streptococcus pyogenes

2 Estreptococos (cadeias)

Estafilococos (irregular ou cacho de uva) Staphylococcus aureus

Ttrades (cocos de 4 em 4 elementos, simetricamente)

Micrococcus

Sarcina (8 elementos, formando cubos simetricamente)

Sarcina (no visvel no plano do MO)

Quanto s clulas alongadas, os grupamentos no apresentam tanta importncia: 1. Diplobacilos (dois a dois):

2. Estreptobacilos (em cadeia): (Geralmente esporulam)

Imagens: Tortora, 2005

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3. Alguns bacilos podem agrupar-se em paliada, quando o movimento psdivisional de deslizamento: Mycobacterium tuberculosis (PALIADA)

4. Globias: bacililos agrupados em formas concntricas que se assemelham a um globo. Mycobacterium leprae (GLOBIA)

Imagens: Fernando Bortolozzi

5. Um outro movimento ps-divisional em dobra, onde as clulas formam ngulo semelhana de letras e o conjunto lembra letras chinesas: Corynebacterium diphteriae 6. As formas onduladas apresentam-se individuais, no formando grupamentos. Observao: em uma preparao microscpica, observar a morfologia celular e o grupamento predominante. Formas de Involuo e Pleomrficas Pleomrficas: so bactrias sem parede e justamente por isso no tm forma definida ORIGINALMENTE (no se enquadram em cocos, bacilos, espirilos etc., uma vez que nunca tiveram forma definida). Independe das condies do meio. Exemplos: Haemophilus, Mycoplasma, Proteus, Chlamydia e o bacilo diftrico. Involutivas: Bactrias em degenerao, aberrantes ou intumescidas. Quando em meio inadequado (pH, O2, toxinas, composio do meio, produtos txicos vindos do prprio metabolismo bacteriano, etc.), esses microrganismos perdem sua forma original. Um dia foram cocos, bacilos, etc. As clulas deste tipo mostram aspectos de intumescimento, aberrantes e em degenerao, como por exemplo, a Yersinia pestis.

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CAPTULO 3: 3: MORFOLOGIA COLONIAL

Objetivos 1. Identificar as principais caractersticas culturais de bactrias; 2. Avaliar a importncia destes dados na sistemtica bacteriana, facilitando a caracterizao e a identificao das bactrias. Introduo Fornecendo as mesmas condies de cultivo relacionadas composio do meio de cultura, atmosfera, temperatura, pH, etc, as bactrias apresentam uma notvel constncia de caracteres. Podem-se considerar as seguintes caractersticas coloniais pela variao de: tamanho, cor, forma, tipos de bordas, elevao, superfcie, consistncia, transparncia, brilho, cromognese (pigmento solvel ou no). Definio Colnia o crescimento dos microrganismos em meio slido. Em condies ideais, a colnia representa a descendncia de uma nica clula. Caractersticas das Colnias

Tamanho: puntiformes (menores que 0.5mm) at alguns centmetros de dimetro.

Cor: amarelo ouro, amarela citrina, amarela clara, vermelha, rosada, branca, castanha, alaranjada, etc., com pigmento difusvel ou no.

Forma: Circular Irregular Rizide ou arborescente

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Bordas: Lisa Denteadas

Lobadas

Onduladas

Elevao: Convexa alta Convexa baixa

Acuminada

Espraiada

Centro-saliente

Umbilicada

Centro-deprimida

Papiliforme

Superfcie: Lisa, rugosa, pregueada, raiada

Com crculos concntricos Consistncia: Cremosa, viscosa, granulosa, seca Transparncia: Opaca, translcida, transparente Brilho: Fosca, brilhante

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CAPTULO 4: 4: VERIFICAO DA PRESENA DE BACTRIAS NO AR E SUA CONTAGEM ATRAVS DE CULTIVO

Observao A partir deste captulo as aulas prticas sero participativas ou demonstrativas dependendo da disponibilidade de material para sua execuo (meios de cultura, material patolgico, soros aglutinantes, placas, pipetas, etc.) Objetivos 1) Avaliar o ambiente quanto presena e nmero de bactrias viveis no exigentes, aerbias e mesfilas, para justificar a necessidade de assepsia nos trabalhos bacteriolgicos. 2) Preveno de contaminao em salas de curativos, cirurgias, etc.. 3) Estudar as diferentes caractersticas coloniais. Contagem Meio de cultivo: gar simples (ASI) distribudo em placas de Petri de 10 cm de dimetro. Tcnica 1. Expor contaminao, pelo ar, as placas abertas em diversos locais da sala de aula por 30 minutos (por exemplo); 2. Fechar e incubar a 36oC durante 48h; 3. Contar as colnias desenvolvidas; 4. Calcular a quantidade de bactrias por m2 de acordo com os seguintes dados:

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a. rea da placa de 10 cm de dimetro = 0,007854 m2. b. Tempo de exposio: 30 minutos. Exemplo: 10 UFC 0,007854 m2 x x = 1.273 UFC/m2 em uma hora: 1.273 0,5 hora x 1 hora x = 2.546 UFC/m2/h UFC = Unidades Formadoras de Colnia 1 m2

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CAPTULO 5: 5: PREPARAES MICROSCPICAS

Objetivos Familiarizar o aluno com as tcnicas de preparaes microscpicas, visando observao dos microrganismos. Pelas caractersticas vistas, iniciar a identificao das bactrias. Introduo Existem muitos tipos de preparaes microscpicas, variando com a necessidade de obter dados como: mobilidade, estruturas celulares, propriedades tintoriais, etc,... A bacterioscopia pode ser feita com o objetivo de observar bactrias: 1. Vivas: pelos exames a fresco. 2. Mortas: em preparaes coradas. Preparaes a Fresco

Campo Claro - Entre lmina e lamnula. - Gota pendente.

Campo Escuro - Entre lmina e lamnula.

Servem para observar a mobilidade e/ou presena de bactrias. Preparaes Coradas

Colorao Negativa usando contraste. Colorao Simples um corante. Colorao Composta ou Diferencial dois ou mais corantes diferentes.

A colorao negativa e a colorao simples so usadas para observar a presena de bactrias e sua morfologia. A colorao composta usada para evidenciar estruturas celulares e as propriedades tintoriais.

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Preparaes a Fresco Nas preparaes a fresco os materiais lquidos como urina, exsudatos, LCR, meios de cultivo lquidos, podem ser examinados tais como se apresentam ou centrifugados e examinando-se o sedimento. Quando se tem material espesso (patolgico ou de cultivo), deve-se dilu-lo em soro fisiolgico estril. Podem-se examinar as bactrias ao natural, com pouca luminosidade, mas como as suas clulas tm um ndice de refrao prximo ao da gua, algumas vezes torna-se difcil observ-las. Nesses casos recorre-se aos corantes vitais, atxicos (para no prejudicar a mobilidade). Os mais usados so: azul de metileno, vermelho neutro, azul de Nilo, entre outros, em soluo aquosa a 1%.

1) Sobre uma lmina colocar uma ou duas gotas do lquido a examinar; 2) Cobrir com lamnula. Observar ao microscpio com quantidade reduzida de luz e objetiva de pequeno aumento (10x) para uma viso Tcnica de preparao entre lmina e lamnula panormica. Em seguida passar para 40x aumentando convenientemente a intensidade da luz. Observao: para evitar a dessecao do material, pode-se cercar as gotas com Vaspar (mistura de vaselina e parafina). A lamnula colocada ficar aderida ao Vaspar, fechando a preparao. Na falta de Vaspar pode-se utilizar vaselina slida ou lanolina.

Usa-se para esta tcnica a lmina escavada de Koch (lmina com 3 mm de espessura com concavidade central). 1. Untar as bordas da concavidade com Vaspar. 2. Sobre uma lamnula colocar uma pequena quantidade do Tcnica de preparao em gota pendente lquido a ser examinado. 3. Inverter a lmina escavada sobre a lamnula e pression-la levemente para aderir ao Vaspar. 4. Voltar rapidamente a lmina sua posio normal.

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VISTA DE CIMA Lmina Vaspar

CORTE TRANSVERSAL (APS A MONTAGEM) Lmina Lamnula Vaspar

Gota Pendente Escavao (concavidade)

Preparao a fresco em campo escuro Serve para a mesma finalidade que as tcnicas precedentes, mas especialmente usada para observar bactrias muito delgadas, que so invisveis em campo claro. Utilizada para observar a presena de espiroquetas em materiais como serosidade de cancro sifiltico (Treponema pallidum) ou urina suspeita de conter Leptospira (urina recm emitida e centrifugada, utilizar o sedimento). O campo escuro ao microscpio obtido usando-se um condensador especial (como o cardiide) que impede a penetrao de raios diretos de luz sobre o material examinado. As bactrias so iluminadas lateralmente, contrastando com o fundo escuro. A tcnica de montagem da preparao a mesma que entre lmina e lamnula.

Preparaes Microscpicas Coradas So as mais usadas em bacteriologia, onde as bactrias esto mortas e artificialmente coradas. Este tipo de preparao, que compreende a colorao de Gram, muito importante na identificao presuntiva de microrganismos. A morfologia da clula, sua disposio e propriedades tintoriais so freqentemente suficientes para definir o gnero. Etapas das preparaes coradas: 1) Esfregao 2) Fixao (a quente ou a frio) 3) Colorao

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1. Esfregao: consiste em depositar o material a examinar no centro de uma lmina e espalh-lo numa espessura apropriada. Deixar secar espontaneamente ou numa estufa a 37oC. Se o material a examinar pela bacterioscopia for muito espesso (patolgico ou cultivo), deve ser diludo em salina ou gua estril. Se for material lquido e pobre em microrganismos, deve ser centrifugado (urina, por exemplo); derrama-se o sobrenadante e examina-se o sedimento. 2. Fixao: tem por objetivo fixar o material lmina para que no se desprenda durante os procedimentos ulteriores. A fixao pode ser feita a quente ou a frio. Em ambos os casos h coagulao de clula bacteriana que a faz aderir lmina. A Quente Pode ser feita serrando com a lmina a chama da lmpada ou bico de Bunsen, duas a trs vezes, com a face que contm o material voltada para cima, para no ter contato direto com a chama. Derrama-se lcool sobre a preparao e inflama-se.

Observao: a exposio excessiva ao calor deforma a morfologia da bactria e com aquecimento insuficiente haver desprendimento do material. A Frio Para no alterar muito a morfologia bacteriana ou quando h interesse de observar o aspecto citolgico do material, como exsudatos, sangue, lquor, etc., usa-se fixao a frio, cobrindo o esfregao com substncias qumicas: - Mistura de lcool e acetona. - Formol. - Soluo de cloreto de mercrio, etc.

3. Colorao propriamente dita: seguir as instrues do mtodo de colorao a ser usado. Nos casos em que se queira observar apenas a presena de bactrias ou conhecer a sua morfologia ou grupamento, recorre-se COLORAO SIMPLES, onde se usa um corante qualquer: azul de metileno, fucsina, violeta de genciana, etc.

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Colorao Simples Tcnica 1. Cobrir o esfregao com o corante e deixar agir um minuto; 2. Lavar com gua; 3. Secar. Examinar no MO com a objetiva de 100x em imerso.

Colorao Composta ou Diferencial Nestas coloraes participam fundamentalmente quatro componentes, cuja natureza qumica varia com o mtodo escolhido. 1. Corante principal: o primeiro a ser empregado determinando a caracterstica tintorial (como por exemplo, violeta de genciana na colorao Gram). 2. Mordente: a substncia que refora a ao do corante principal (iodo no Gram). 3. Diferenciador: o elemento que descora seletivamente as bactrias (lcool no Gram). 4. Corante secundrio ou de fundo: o que cora os elementos descorados pelo diferenciador (fucsina no Gram). O corante de fundo tem que ter cor contrastante com o corante principal. A colorao diferencial universalmente aceita, e usada em todos os laboratrios de bacteriologia, a colorao de Gram, que separa as bactrias em dois grandes grupos: 1) Gram positivas. 2) Gram negativa.

A propriedade tintorial revelada pelo Gram est relacionada composio qumica da parede celular bacteriana.

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COLORAO DE GRAM

Tcnica 1. Cobrir o esfregao com Violeta de Genciana e deixar agir. (1 minuto) 2. Derramar o corante e cobrir com lugol. (1 minuto) 3. Lavar com gua. 4. Descorar pelo lcool (tempo crtico) - (15 segundos) 5. Lavar com gua. 6. Cobrir com fucsina de Ziehl diluda 1:10. (30 segundos) 7. Lavar com gua. 8. Secar. Observao: existem diversas modificaes do mtodo de Gram. Alguns laboratrios substituem a Violeta de Genciana (penta e hexametil pararosanilina) por Cristal Violeta (hexametilpararosanilina) que tem poder corante superior. As bactrias submetidas ao mtodo de Gram comportam-se da seguinte maneira:
(Fonte: Tortora, 2005)

Etapa At a 3a etapa Aps a 5a etapa Aps a 7a etapa

Gram POSITIVA Violeta Violeta Violeta

Gram NEGATIVA Violeta Incolor Vermelha

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GRAM Microscopia: Rosa Possui uma parede celular mais diversificada, sem lipoteicoato 1-2 camadas de peptidoglicano (5-10%) (+ FINAS) Mais lipdeo (20%) e muitos aa Possui uma 2 membrana ancorada s camadas de peptidoglicano (chamada membrana externa) externa parede celular Formam ESFEROPLASTOS: quando a bactria perde a parece celular. Quando restam partes da PC, em local e condies adequadas, essa PC pode ser refazer. Mais polissacardeos e presena de lipdeo A formando os lipopolissacardeos (LPS***)

GRAM + Microscopia: Roxo Possui filamentos de teicoato, ligados muranato 15 a 20 camadas de peptidoglicano (90%) (+ ESPESSAS) Tem pouco lipdeo (2%) e poucos aa Tem adjacente membrana plasmtica uma parede celular Formam PROTOPLASTOS: a membrana de uma bactria gram +. Se perd-la, no consegue refaz-la. Porm sobrevive s com o protoplasto. Menos polissacardeos

CORRELAES CLNICAS:

Fonte: Robbins, 2005

*** LPS: so pirognios exgenos (geram calor) No organismo humano, podem ser produtores de febre. Quando os macrfagos fagocitam os produtos bacterianos, produzem altas concentraes de fator de necrose tumoral. O TNF estimula a produo de Interleucina 1 (IL-1) por outros macrfagos e alguns leuccitos. Esses mediadores estimulam a expresso de receptores no endotlio para que os neutrfilos migrem, via rolamento, para o tecido conjuntivo em combate s bactrias patognicas. Alm disso, a IL-1 e o TNF estimulam a produo de PGE-2 (prostaglandina E2) no hipotlamo, que controla a temperatura corporal via AMPc. Com o aumento da temperatura corporal, protenas do choque trmico so expressar e ativam a resposta e a atividade linfocitria. Ou seja, a elevao da temperatura corporal melhora a resposta imune do indivduo frente a bactrias patognicas. Outros efeitos do TNF e da IL-1 (quando elevados) so a sonolncia e a inapetncia, o que explica porque o paciente geralmente fica acamado durante uma infeco. Detalhes sero vistos na disciplina de Patologia Mdica Molecular (BP337). * Espao periplsmico: o espao entre as camadas de peptidoglicano. um importante local de produo de enzimas, entre elas a -LACTAMASE. Uma enzima muito importante, pois ela influencia na teraputica antibitica. -lactmicos so uma classe de antibiticos, diga-se de passagem, os antibiticos mais utilizados no tratamento de infeces (leia-se penicilinas, cefalosporinas, carbapenmicos, etc). Esses antibiticos so assim chamados porque em sua composio tm um anel beta-lactmico. Essas bactrias que produzem -

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lactamases, so capazes de destruir esse anel dos antibiticos por hidrlise, deixando o mecanismo de ao antimicrobiano inativo. Ou seja, UM IMPORTANTE MECANISMO DE RESISTNCIA AOS ANTIBITICOS! As principais bactrias que a produzem so os estafilococos (Staphylococcus aureus principalmente), Haemophilus influenzae, Moraxella e a maioria dos BGNs intestinais como a Escherichia coli. Estreptococos geralmente no so capazes de produzir -lactamases. No entanto, em uma infeco tipo tonsilite por Streptococcus pyogenes (Estreptococo beta hemoltico do grupo A de Lancefield produtor de estreptolisina), por exemplo: esta bactria no produz -lactamases, mas algumas bactrias da microbiota residente as produzem. Essas enzimas degradam o frmaco que iria matar a bactria causadora da infeco e o medicamento acaba falhando. Por isso, muitas vezes, mesmo para infeces estreptocccicas, deve ser prescrever um antibitico JUNTO COM UM INIBIDOR DAS BETA LACTAMASES. At porque clinicamente no se sabe se trata-se de uma infeco por estafilococos, estreptococos, Haemophilus, Moraxella, etc. Prescreve-se um antibitico -lactmico com um inibidor de -lactamases que faz inibio enzimtica e deixa essas penicilinases sem atividade cataltica. Ex: Clavulanato, Sulbactam, etc. Eles inibem as -lactamases e deixam o antibitico agir (penicilina). Alm disso, muitas vezes, a prpria bactria causadora da infeco pode ser produtora dessas enzimas. Medicamentos com inibidores de -lactamases: Amoxicilina + Clavulanato de Potssio (Clavulin). Antibitico de primeira escolha para infeces de vias areas superiores. O clavulanato inibe as -lactamases e a amoxicilina, uma vez que no ser destruda pela ao dessas enzimas, dar cabo das bactrias. H vrios esquemas de posologia que sero vistos nas disciplinas clnicas. Amoxicilina + Sulbactam (Trifamox IBL) Mecanismo de ao dos -lactmicos: Inibio da sntese de peptideoglicano. Existem enzimas responsveis pela sntese de peptideoglicano, as PBP (Penicillium Binding Proteins), so transpeptidases e carboxipeptidases, protenas fixadoras de penicilina. O mecanismo simples, esses antibiticos inibem essas enzimas (que geralmente se localizam na superfcie externa da MP), deixando a parede celular frouxa. Mas, alm disso, esses antimicrobianos fazem a inativao dos inibidores das enzimas autolticas na PC.

Exemplos de bactrias Gram positivas e Gram negativas mais comuns: Cocos Gram positivos Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Enterococcus, Sarcina Cocos Gram negativos Bacilos Gram positivos Bacilos Gram negativos Neisseria (gonorrhoeae e meningitidis), Moraxella, Veillonella Bacillus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Listeria Enterobacteriaceae (Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Proteus, etc), Bordetella, Brucella, Pseudomonas, Alcaligenes O comportamento tintorial frente ao Gram est relacionado intimamente a outras propriedades das bactrias. De tal modo que, ao verificarmos a Gram positividade ou Gram negatividade, teremos informaes referentes natureza qumica da parede celular e do seu comportamento frente aos agentes antimicrobianos (antibiticos, corantes, etc.).

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COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN: A Evidenciao de Bacilos lcool-cido Resistentes (BAARs)

Certas bactrias, como o bacilo da tuberculose e da hansenase, dificilmente tomam as cores da anilina, mas uma vez coradas por tcnicas apropriadas fixam fortemente o corante, a ponto de resistir ao de descorantes como o lcool e cidos minerais fortes e diludos. Da o uso corrente do mtodo de Ziehl-Neelsen ou de suas numerosas modificaes para identificao das bactrias, que assim se comportam e por isso so chamadas Bacilos lcool-cido Resistentes (BAAR). Para vencer a resistncia colorao, aumenta-se a concentrao do cido fnico (mordente) da soluo corante, prolonga-se a exposio ao corante (5 a 10 minutos) e aplica-se o calor (aquecimento) durante o tempo de colorao. No descoramento so usados o lcool e solues de cidos minerais, tais como o cido ntrico, sulfrico ou clordrico. O fenmeno de cido-lcool resistncia atribudo presena de um alto teor de lipdeos, sobretudo na parede celular, que se ope penetrao do corante. Composio dos Reativos Usados no Ziehl-Neelsen

Fucsina fenicada Fucsina bsica lcool 95

o

0,3 g 10 mL 5 mL 95 mL

Fenol fundido gua destilada

Observao: em outras coloraes usa-se o fenol aproximadamente em quantidade 5 vezes maior.

Diferenciador lcool etlico 95o cido clordrico 99 mL 1 mL

Corante de fundo Soluo de azul de metileno.

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Tcnica 1. Fixar o esfregao pelo calor. 2. Cobrir com fucsina de Ziehl e aquecer at o desprendimento de vapores, a partir deste momento, contar 5 minutos. No ferver nem deixar secar. Quando cessar a emisso de vapores, aquecer a lmina novamente. 3. Lavar com gua. 4. Descorar com lcool cido, at no sair mais o corante. 5. Lavar com gua. 6. Corar com azul de metileno, 1 minuto. 7. Lavar, secar. Os bacilos lcool-cido resistentes aparecem em cor vermelha, cor da fucsina, e os outros elementos coram-se em azul, cor do azul de metileno (no caso do escarro: cocos, outros bacilos, leuccitos, clulas epiteliais, filamentos de muco, etc.).

COLORAES DE ESPIROQUETAS

Os espiroquetas so microrganismos muito delgados (a maioria tem cerca de 0,2 m de espessura), helicoidais, de corpo flexuoso e deformvel durante o movimento. A maior parte cora-se com dificuldade, devido natureza lipdica das estruturas mais superficiais: so microrganismos delicados que perdem a morfologia se forem fixados pelo calor numa preparao microscpica. Por estas razes, para observ-los, as tcnicas mais comuns so as seguintes: 1. Exame a fresco em campo escuro. 2. Colorao negativa com tinta-da-China (mtodo de Burri). 3. Mtodos de impregnao pela prata: Fontana-Tribondeau, Morosov, etc. 4. Mtodo de Giemsa.

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Colorao Negativa (Mtodo de Burri)

So preparaes com tinta-da-China (Nanquim) ou Nigrosina. Usada para evidenciar: espiroquetas, bacilo diftrico, associao fuso-espiralar ou cpsulas bacterianas. Uma das maneiras de preparar a lmina para colorao negativa segue esta tcnica: 1. Colocar o material a examinar sobre a lmina; 2. Gotejar tinta-da-China; 3. Usando outra lmina (no esborcinada), reunir os dois materiais e inclinando-a num ngulo de 40o, estender sobre a primeira lmina, maneira de esfregaos de sangue. 4. Deixar secar. Examinar em imerso. Os elementos (bactrias) aparecero como se apresentam em natureza, isto , hialinas, incolores, contrastando com o fundo escuro formado pela tinta-da-China. um mtodo que deforma em menor grau a clula bacteriana, uma vez que no usa fixao pelo calor, corantes, diferenciadores, etc., que possam desidrat-la ou deform-la.

Fontana-Tribondeau (Impregnao pela Prata)

Mtodo tradicional para a identificao de espiroquetas como o Treponema palidum. Composio dos reativos no mtodo de Fontana: Fixador (Lquido de Ruge) cido actico 1 mL Formalina 2 mL gua destilada 100 mL Mordente Tanino 5g gua fenicada a 1% 100 mL Soluo impregnadora Nitrato de prata amoniacal

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Processo 1. Secar o esfregao ao ar. 2. Cobrir com lquido de Ruge e deixar agir por 1 minuto. 3. Lavar com gua. 4. Cobrir com soluo de tanino fenicado, aquecendo a lmina at a emisso de vapores, durante 1 minuto. 5. Lavar com gua. 6. Cobrir com soluo de nitrato de prata e aquecer at a emisso de vapores durante minuto. 7. Lavar e secar ao ar. As bactrias aparecem de cor marrom e o fundo da lmina amarelo.

COLORAO DE GRANULAES METACROMTICAS

As granulaes metacromticas so as que tratadas por certos corantes, apresentam o fenmeno de metacromasia, isto , tomam uma cor diferente da do corante. So tambm chamadas de granulaes de volutina ou de Babes-Ernst; so encontradas em determinadas bactrias como: Spirillum volutans, bacilo diftrico, difteride e lactobacilo. Para evidenci-las, usam-se mtodos de colorao especiais. Exemplo: mtodo de Neisser, mtodo de Albert Laybourn, os quais empregam corantes metacromticos.

Mtodo de Albert Laybourn

Reativos da Colorao de Laybourn Soluo de Laybourn Azul de toluidina Verde malaquita cido actico glacial lcool a 95% gua destilada Mordente Lugol forte

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Tcnica 1. Fixar o esfregao pelo calor. 2. Corar com soluo de Laybourn por 3 a 5 minutos. 3. Derramar o corante e cobrir com lugol por 1 minuto. 4. Lavar com gua. 5. Secar. Examinar em imerso. As bactrias aparecem coradas de verde-claro e as granulaes ficam escuras (quase negras). Observao: o corante metacromtico, neste mtodo, o azul de toluidina.

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CAPTULO 6: 6: MEIOS DE CULTURA

O conjunto de substncias nutritivas em que se cultivam os microrganismos em laboratrio chama-se meio de cultura. A composio varia ao infinito. Os meios de cultura microbiolgicos consistem em uma mistura de substncias nutrientes mais ou menos complexa, dependendo das exigncias nutritivas da espcie em estudo. As exigncias so decorrentes do maior ou menor poder de sntese da espcie. Alguns meios compem-se apenas de solues de sais inorgnicos, outros se preparam com ingredientes complexos como extratos de tecidos ou rgos de animais. Outros consistem em tecidos vivos (cultivo de tecidos) usados para Rickettsia e vrus. Os meios de cultura podem ser divididos em diversos grupos de acordo com a procedncia, consistncia, composio e finalidade.

QUANTO PROCEDNCIA Naturais So usadas substncias assim como elas se apresentam na natureza ou apenas com pequenas modificaes, como coco. Exemplos: suco de tomate, batata, leite. Artificiais So preparados no laboratrio, pela mistura de diversas substncias. Exemplos: caldo simples, gua peptonada.

QUANTO CONSISTNCIA Slidos Semi-slidos Xaroposos Lquidos A solidificao geralmente feita acrescentando o gar aos meios lquidos. Aumentando ou diminudo a porcentagem do gar, obtemos a variao da consistncia de acordo com a necessidade. O gar extrado de algas marinhas (gnero Gelidium uma delas) de natureza qumica polissacardica (D-galactose e L-galactose). um solidificante ideal porque:

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1. No metabolizado pelas bactrias de interesse mdico (apenas algumas espcies marinhas o digerem). 2. Uma vez na consistncia de gel, s se liquefaz temperatura de 100oC (prprio at para o cultivo de termfilas = 65oC a 70oC). 3. uma vez liquefeito, vai solidificar apenas ao redor de 45oC, fato que se aproveita para cultivar bactrias incorporadas ao meio de cultura a esta temperatura. Em seguida deixa-se solidificar (semeadura de Pour-Plate). Outras substncias usadas para solidificar os meios de cultura so: a) Gelatina. b) Slica-gel. a) A gelatina obtida a partir de ossena, uma protena rica em aminocidos. Apresenta a desvantagem de ser hidrolisada por algumas bactrias, com o que perde sua qualidade de gel. Tambm porque temperatura de 36oC (temperatura prpria para o cultivo da maioria das bactrias de interesse mdico) ela apresenta-se lquida. b) A slica-gel obtida pela ao de HCl sobre silicato de sdio, formando cido silcico. Tem a vantagem de apresentar composio qumica definida, no possuir nenhum elemento nutritivo, ideal para solidificar os meios sintticos.

QUANTO COMPOSIO Simples So destinados ao cultivo de germes pouco exigentes ou servem de base para outros meios. Exemplos: soluo aquosa de sais minerais, caldo simples, gua peptonada, gelose simples. Enriquecidos So meios adicionados de substncias altamente nutritivas, como protenas termocoagulveis (sangue, plasma sanguneo, lquido de ascite), aminocidos, extratos de rgos de mamferos, protena da soja, etc. Exemplos: gar sangue e gar soro. Usados no cultivo de bactrias exigentes.

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QUANTO FINALIDADE Seletivos A adio de certas substncias qumicas, ao meio de cultura, inibe o crescimento de algumas bactrias, possibilitando o desenvolvimento de outras. O cristal violeta na concentrao de 1:20.000, inibe a proliferao de germes Gram positivos, sem afetar os Gram negativos. A penicilina e outros antibiticos so usados com a mesma finalidade. Os meios seletivos so slidos. Diferenciais So aqueles que permitem a diferenciao dos germes que neles crescem, pela mudana da cor das colnias ou do meio de cultura, pela reao com produtos do metabolismo. Seletivos-Diferenciais So os que simultaneamente selecionam e diferenciam as espcies. Exemplo: meio de Teague, MacConckey, Chapmann e SS. De Enriquecimento So os meios lquidos ou xaroposos que favorecem a proliferao dos germes, facilitando o seu posterior isolamento em meio slido. So usados quando as bactrias que se deseja isolar, estejam em quantidade muito pequena ou quando a microbiota de acompanhamento seja muito rica. Neste ltimo caso, costuma-se adicionar substncias impedientes ao meio, de modo que na cultura prevalecer o germe que se deseja isolar. Meios Sintticos So meios de composio qumica bem definida, constitudos de soluo de sais minerais ou orgnicos, aminocidos, hidratos de carbono e vitaminas. Sobre a composio, preparo e ajuste de pH de meios de cultura, consultar Diagnstico Microbiolgico (6a edio) 2001, de Konemann e colaboradores.

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CAPTULO 7: 7: ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

Tcnicas asspticas de semeaduras para o isolamento e estudo das bactrias. Objetivos 1. Treinar o aluno na manipulao dos meios de cultura, em condies de assepsia. 2. Executar semeaduras em meios slidos e lquidos. 3. Semear o material em estudo (patolgico ou no) para obter o isolamento da bactria em cultura pura, cujas propriedades serviro para caracterizao e posterior identificao. Introduo Em microbiologia nada pode ser feito antes de isolar a bactria em cultura pura, ou seja, a cultura deve ser de uma nica espcie. S ento que se pode caracteriz-la. O cultivo de bactrias requer tcnicas asspticas adequadas, para evitar contaminaes. Para isso devem ser observados os seguintes cuidados: Os tubos e placas estreis ou com material em estudo somente devem ser abertos prximos a uma chama onde se forma uma rea estril (ou se usar cmara assptica). Os procedimentos devem ser feitos de preferncia por trs da chama. As alas ou agulhas devem ser flambadas imediatamente antes e aps o uso (aps o uso, evitar o aquecimento brusco para evitar os aerossis). As alas devem ser levadas ao rubro em posio vertical em relao chama de gs ou lmpada de lcool. As bocas de tubos, frascos, pipetas, etc., so flambadas ligeiramente antes e aps a transferncia de material. Nunca abrir os tubos ou frascos na posio vertical. Para semeadura em meios lquidos, inclinar o tubo em um ngulo de aproximadamente 40o. O tubo com meio slido, deixar na horizontal.

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Isolamento em Placas O isolamento em placas o mais usado para obter cultura pura de amostras que contenham populao mista. Com semeadura por esgotamento (para descarregar a ala), fazem-se estrias superficiais de lado a lado da placa.

1. Ocupar toda a superfcie do meio de cultura; 2. No passar 2 vezes no mesmo local (salvo em semeaduras que Cuidados sero explicadas a seguir); 3. As estrias no devem ser muito prximas nem muito distantes uma da outra (o objetivo conseguir colnias isoladas).

Uma das maneiras corretas de semear Crescimento confluente

Maneiras incorretas de semear Desperdcio de meio de cultura sem

conseguir culturas isoladas

Estrias muito apertadas que resultam em Colnias isoladas crescimento confluente. Quando se tem material muito rico em bactrias (verificar pela bacterioscopia), podese fazer estrias em quadrantes, flambando a ala na ltima estria do quadrante anteriormente semeado. Esgotamento Ponto de recarregamento

Na semeadura por estrias haver crescimento confluente na rea de esgotamento e nas primeiras estrias. Em seguida aparece um grande nmero de colnias isoladas, muito

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prximas umas das outras e de tamanho pequeno. S no final haver espaamento maior entre as colnias e estas tero o tamanho caracterstico da espcie. Inicialmente o crescimento exponencial em relao ao tempo. Logo aps, entretanto, a ordem de crescimento se torna muito complexa, devido proximidade das clulas acumuladas. Esta proximidade cria uma situao que pode ser chamada aglomerao fisiolgica na qual as clulas competem entre si pelos nutrientes disponveis e afetam-se mutuamente pelo acmulo de produtos residuais. O crescimento em colnias afetado no s pelas interaes celulares dentro de cada colnia, mas tambm por interaes entre colnias vizinhas, conforme explicado anteriormente. Para a prxima etapa de identificao, vai se preferir as colnias bem separadas, presumindo-se que so formadas por descendentes de uma nica clula, portanto constituindo cultura pura. Existem diversas maneiras de fazer estrias, dependendo da preferncia ou habilidade do laboratorista. O importante que no final se consiga colnias isoladas. Observao: cultura pura a condio indispensvel para caracterizao e identificao de bactrias.

Identificao de Bactrias Objetivos 1. Familiarizar o aluno com a seqncia de etapas para conseguir caracterizar e identificar a bactria para fins de diagnstico. 2. Conhecer os princpios das provas bioqumicas diferenciais utilizadas na caracterizao. 3. Executar tcnicas e interpretar resultados. A identificao fundamenta-se na observao de um complexo conjunto de caracteres. necessria a anlise de todos os aspectos: morfologia celular, morfologia colonial, atividades fisiolgicas relacionadas com os diversos metabolismos de carboidratos, protenas, etc. (so as provas bioqumicas) e estrutura antignica (reao antgenoanticorpo). A investigao de somente um tipo dessas caractersticas raramente suficiente para identificar a espcie.

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CAPTULO 8: 8: PROVAS BIOQUMICAS DIFERENCIAIS

Atravs das provas bioqumicas verificam-se as transformaes que ocorrem num substrato conhecido, pela ao das enzimas bacterianas. Cada microrganismo possui um sistema enzimtico especfico. Com auxlio de indicadores observa-se se o substrato foi degradado, de que maneira ou se no o foi. As provas bioqumicas baseiam-se no metabolismo de: 1) Carboidratos (fermentao de glicose, lactose, etc.). 2) Nitrogenados proticos (indol). 3) Nitrogenados no proticos (urease). Entre outras. Para realizar as provas bioqumicas usam-se meios de cultura contendo meio nutritivo bsico, acrescido do substrato a ser ensaiado. Mesmo que a bactria no utilize o substrato testado, ela crescer a custa do meio bsico. Os sistemas de provas bioqumicas tornaram-se cada vez mais sofisticados na atualidade. A quantidade de provas depende da espcie a caracterizar. Algumas so caracterizadas com menos de 10 provas, outras exigem dezenas delas. As provas bioqumicas que vo ser executadas em sala de aula prtica so: provas de fermentao da glicose, lactose, sacarose e manitol; prova do indol, citratase, gs sulfdrico (H2S), urease, vermelho de metila, Voges-Proskauer, gelatinase, nitratase e mobilidade.

Provas de Fermentao Fermentao da Glicose Fermentao da Lactose Fermentao da Sacarose Fermentao do Manitol A aparncia dos 4 tubos igual, levam a identificao das letras, G, L, S e M, respectivamente. Cada um destes substratos misturado a meio nutritivo bsico, de acordo com a seguinte frmula:

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Caldo simples 1000 mL Soluo de carboidrato a 10% 100 mL Vermelho de fenol (indicador de pH) 2 mg Dentro do tubo com meio de cultura h um tubo pequeno, de boca para baixo (tubinho de Durham) que vai servir para captar os gases que se formam na decomposio do carboidrato, em casos que a bactria elaborar a enzima formiase e que vai desdobrar o cido frmico (metanico) em H2 e CO2. O HC OH Os seguintes casos podem ser observados: 1) Cor vermelha (inicial) = reao negativa. 2) Cor amarela = reao positiva. 3) Cor amarela com gs = reao positiva com gs. A notao usada para reaes: Reao negativa = - ou 0 (zero). Reao positiva = + ou A (cido). Reao positiva com gs = + ou AG (cido e gs). FORMIASE H2 + CO2

PROVA DO INDOL (Derivados Proticos)

Meio de cultivo: gua peptonada de frmula: Peptona (triptofano) 10g gua 1000 mL O triptofano quando metabolizado por desamimao pela enzima triptofanase, libera indol livre (benzil pirrol), cido pirvico e NH3. Uma das tcnicas de verificar a presena do indol extra-lo da fase aquosa por meio de ter e evidenci-lo por meio do reativo de Ehrlich.

TRIPTOFANASE TRIPTOFANO INDOL + NH4+ +

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Tcnica 1) Agitar a cultura com ter (na proporo de 3:1). 2) Deixar em repouso para estratificar as camadas. 3) Pelas paredes do tubo inclinado, gotejar o reativo de Ehrlich at formar camada visvel. Resultado Cor vermelha imediata: prova + Cor amarela: prova POSITIVO NEGATIVO

O princpio ativo do reativo de Ehrlich : paradimetilaminobenzaldeido.

PROVA DA CITRATASE (Bactrias que usam Citrato como fonte de Carbono)

O meio de cultura usado o de Kirsh-Koser, cuja frmula : Fosfato de sdio amoniacal Fosfato monopotssico Sulfato de magnsio Citrato de sdio gua Nota-se, pela composio, que a nica fonte de C o citrato. Os outros componentes so sais inorgnicos. S vai proliferar a bactria que produzir a enzima citratase, que degrada o citrato, liberando o C. Resultado Turbidez: prova positiva Limpidez: prova negativa

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PROVA DO GS SULFDRICO H2S

O meio de cultivo para esta prova contm composto sulfurado (cistena, metionina ou tiossulfato) e um indicador de reao (sal de metal pesado: ferro, chumbo, etc.). O substrato sulfurado vai ser hidrolisado pela enzima dessulfidrilase, liberando S na forma de H2S. A seqncia de etapas que conduzem produo e deteco do H2S a seguinte: 1. Liberao do S a partir do composto sulfurado; 2. Acoplamento do S (S-2) com o on H (H+) para formar H2S; 3. Deteco do H2S pelos sais de metais pesados na forma de sulfeto do metal pesado que preto. Prova positiva = meio de cultivo enegrecido.

PROVA DA UREASE
O meio de cultura contm, alm da uria, um indicador de pH, azul de bromotimol. A urease uma enzima que desdobra a uria com liberao de amnia e dixido de carbono. A uria uma diamida do cido carbnico cuja frmula :

Uria A urease hidrolisa a uria de acordo com a reao:

A amnia reage em soluo para formar carbonato de amnio, resultando a alcalinizao do meio observada pelo indicador de pH. Prova positiva = cor azul intensa. O gnero Proteus hidrolisa rapidamente a uria de 1 a 2h ou at 24h. O gnero Klebsiella urease tardia, pode demorar de 3 a 4 dias para positivar.

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PROVA DE VM (VERMELHO DE METILA) E VP (VOGES-PROSKAUER)

Ambas so realizadas no meio de Clark-Lubs, cujo substrato a testar a glicose. Por estas provas evidenciamos duas maneiras de decomposio da glicose: 1) A partir do cido pirvico h formao de cidos orgnicos fortes (cido actico, cido lctico, cido frmico) provocando uma queda acentuada do pH do meio (<4,5). 2) cido pirvico decomposto em acetil-metil-carbinol ou acetona e pequena quantidade de cidos orgnicos fortes. A acetona neutra e os cidos formados no baixam muito o pH, ficando em torno de 6 a 6,5. A acidez forte do primeiro caso verificada pela prova de VM. A presena de acetil-metil-carbinol detectada pela prova de VP. Glicose Succinato cido frmico Acetil-CoA H2 + CO2

PIRUVATO

Acetato

Lactato

acetil-metil-carbinol

Muitas bactrias (incluindo todas as enterobactrias) produzem a fermentao cida mista, com produo de diferentes quantidades e tipos de cido de acordo com a composio enzimtica da bactria. Exemplo: Escherichia coli produz grandes quantidades de cidos. Enterobacter produz grande quantidade de acetona e pequena quantidade de cidos. Tcnica de VM No meio cultivado Clark-Lubs colocar 5 gotas do vermelho de metila. Interpretao: colorao vermelha = positiva; colorao amarela = negativa. Observao: o vermelho de metila um indicador de pH com a zona de viragem entre 6 e 4,4 (6 amarelo; 4,4 vermelho).

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Tcnica de VP Ao Clark-Lubs juntar o reativo de Barrit: d) Alfa-naftol a 5% em lcool absoluto. e) Soluo aquosa de KOH a 40%. Colocar 6 gotas de alfa-naftol e 4 gotas de KOH. Agitar para expor o meio de cultura ao contato com o O2 do ar. Observao: o alfa-naftol catalisador. A reao se processa assim:

acetona + O2 + KOH + alfa-naftol

diacetila + O2 + KOH complexo colorido vermelho

A reao lenta, de algumas horas. acelerada pelo catalisador alfa-naftol que se acrescenta reao, dando resultado em 10 minutos. Resultado: Colorao vermelha = prova positiva.

PROVA DA GELATINASE
O meio de cultura usado acrescido de gelatina. Algumas bactrias decompem a gelatina, que perde a qualidade de gel. Aps o cultivo, ao tirar da estufa a 37oC o meio de cultivo apresenta-se lquido. Para saber se a gelatina foi hidrolisada, coloca-se o tubo na geladeira por alguns minutos. Se o meio solidificou porque a gelatina est intacta. Se permanecer lquido sinal de degradao da gelatina. Resultado: Meio liquefeito = prova positiva; Meio solidificado = prova negativa.

PROVA DA NITRATASE OU REDUO DO NITRATO (NO3-)

O termo reduo de nitratos inclui todos os processos pelos quais o nitrato desaparece do meio de cultura, pela ao das enzimas bacterianas, aparecendo o nitrognio sob forma menos oxidada.

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Na maioria das espcies essa reduo no prossegue alm do estgio de nitritos:

NO3 + 2e + 2H

NO2 + H2O

s vezes, no entanto, a reduo progride at a formao de amnia e nitrognio molecular. Os nitratos so aceptores de H.

NO3

NO2

NO

NH3

Reativos usados: reativo de Griess-Ilosva A e B. f) A soluo de cido sulfanlico. Observao: o reativo de Griess-Ilosva s produz colorao vermelha em presena de nitritos. Tcnica 1) Colocar no meio cultivado 5 gotas da soluo A; 2) Colocar 5 gotas da soluo B. Observao: no agitar, a cor fugaz. Resultados 1) Cor vermelha = prova positiva. A cor vermelha produzida pelo diaznio vermelho: p-sulfobenzeno-azo-alfa-naftilamina; 2) Cor inalterada = prova positiva ou negativa. Neste caso faz-se a contra prova que consiste em colocar uma pitada de Zn metlico em p. Agitar. O p de Zn reduz rapidamente o NO3 a NO2. Se aps o Zn aparecer colorao vermelha, a prova da nitratase negativa. g) B soluo de alfa-naftil-amina.

RESUMO 1a etapa Cor vermelha Incolor Prova positiva Prova positiva ou negativa

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2a etapa (aps o Zn)

Cor vermelha Incolor

Prova negativa Prova positiva

PROVA DA MOBILIDADE
A mobilidade bacteriana, alm de preparaes a fresco, pode ser observada atravs de cultivo. Meio de cultura: gelose semi-slida distribuda em tubo (coluna alta). Semeadura: picada superficial (cerca de 1mm). Resultado: as bactrias mveis do crescimento difuso para dentro do meio de cultura. As imveis tero crescimento confinado ao ponto de inoculao.

Esquema da Prova da Mobilidade (Vista Lateral)

Prova positiva

Prova negativa

Na pgina 66, consta uma tabela parcial, simplificada, com algumas provas bioqumicas e respectivos resultados para bacilos Gram negativos.

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Estas so algumas das provas feitas com o substrato colocado separadamente em tubos de cultivo individuais. Existem, no entanto, meios que so compostos por diversos substratos num nico tubo: 1) gar ferro Kligler (KIA) = glicose, lactose, H2S. 2) gar trplice acar (TSI) = glicose, sacarose, lactose e H2S. 3) Baracchini = glicose, lactose, sacarose, uria e H2S. 4) Rugai modificado (IAL) = indol, sacarose, fenilalanina, glicose, H2S, uria, lisina, motilidade. Detalhes de composio e interpretao dos resultados do meio Baracchini sero dados no diagnstico das infeces intestinais. Alm das provas bioqumicas, descritas acima, existem inmeras outras e a escolha vai depender do microrganismo a identificar e da disponibilidade de meios de cultura no laboratrio. Tambm sero levados em considerao os seus custos e a complexidade dos testes. Observao: existem disponveis no comrcio os chamados Sistemas Compactos de identificao de bactrias. As vantagens destes sistemas so: 1. Longo prazo de validez dos meios de cultura, at um ano, o que no ocorre com os meios convencionais. 2. Precisam de pouco espao para armazenamento e incubao. 3. Caractersticas de crescimento facilmente observadas. 4. Com o registro dos resultados e programas de computao, a identificao tornase fcil e precisa. Entre as desvantagens podem-se citar os custos elevados quando forem necessrias dez ou mais provas diferenciais. Alm disso, alguns microbiologistas empregam um nmero mnimo de provas na identificao de certas bactrias que apresentam aspectos coloniais e bacterioscpicos altamente caractersticos, j no isolamento primrio. Por exemplo: alguns bacilos Gram negativos fermentadores de lactose podem ser identificados com poucas provas bioqumicas, como a Escherichia coli. Ademais, uma identificao correta no depende, algumas vezes, apenas das provas bioqumicas diferenciais (como nos Sistemas Compactos). Estas devem somar-se s caractersticas das colnias, quanto ao tamanho, cor, textura, formato, reao hemoltica, etc., propriedade tintorial pelo Gram, morfologia da clula bacteriana e grupamento e s reaes sorolgicas, para a identificao final confivel, como por exemplo, na identificao da Salmonella.

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Aparelhos automatizados. Os laboratrios de grande porte onde, por exemplo, so feitos, em mdia, 150 culturas de urina por dia, tm o seu trabalho facilitado pelos aparelhos automatizados. Estes podem revelar, em algumas horas (6 12h), o biotipo da bactria isolada e o antibiograma, saindo o resultado no impresso computadorizado. Longe de desaprovar os progressos da tecnologia moderna, que prtica e indispensvel atualmente, e no fazendo apologia das tcnicas convencionais, precisamos admitir que os futuros bacteriologistas no tenham a satisfao de conhecer o mago da bactria, as caractersticas de seus componentes celulares, variando com as condies que se lhe oferece. As suas mutaes, as surpresas com o surgimento de resistncia a um antibitico. Conhecero apenas os biotipos das bactrias, fornecidas pelos clculos eletrnicos e impressos computadorizados. Fleming, ao observar a ao inibidora de um fungo contaminante sobre os estafilococos em isolamento numa singela placa de Petri, descobriu a penicilina que revolucionou a medicina. No a teria descoberto, talvez, se estivesse usando os mtodos sofisticados e apenas apertando os botes de um computador.

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CAPTULO 9: 9: MICROBIOTA NORMAL DO ORGANISMO HUMANO

Objetivos 1. Demonstrar a presena de bactrias de diversas espcies, existentes sobre a pele e na fossa nasal; 2. Alertar para a necessidade dos cuidados higinicos para evitar a propagao de bactrias, principalmente em ambientes hospitalares; 3. Atentar para os dados do exame laboratorial bacteriolgico, em cujo resultado possa constar a presena de microbiota normal, para no incorrer em erros de interpretao. Introduo O termo microbiota normal refere-se aos microrganismos presentes regularmente em determinados locais do corpo. Se removidos, prontamente se recompe. a tambm chamada microbiota residente. De 10 a 20% das pessoas normais da comunidade extrahospitalar, so portadoras de Staphylococcus aureus, em concentrao elevada, na nasofaringe. Esse estado de portador assintomtico que pode ser persistente, intermitente ou transitrio, pode alcanar 60 a 90% das pessoas em atividades hospitalares. Os surtos ocasionais devidos ao Staphylococcus aureus, principalmente em enfermarias re recm natos, podem ser rastreados e relacionados com a pele e fossas nasais das pessoas que trabalham nestes locais. H tambm a microbiota transitria, que pode ser constituda por microrganismos no patognicos (de baixo potencial patognico) ou alto potencial patognico e que habitam a pele e mucosas por horas, dias ou semanas. A microbiota residente benfica quando evita a colonizao pelas patognicas, por diversos mecanismos: competio por substncias nutritivas, inibio por produtos metablicos txicos, competio por receptores das clulas do hospedeiro, etc. A microbiota normal tambm pode provocar doenas nos seguintes casos: 1. Quando deslocada do seu ambiente para outros rgos ou tecidos. Exemplo: Streptococcus do grupo viridans incuo na orofaringe, causa endocardite quando se instala no corao. 2. Provocando enfermidades em pessoas debilitadas ou imunodeprimidas.

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A PELE
A pele possui uma microbiota residente bem definida. Porm, pela sua exposio ao meio ambiente, tem facilidade de apresentar a microbiota transitria. O microrganismo predominante o Staphylococcus epidermidis, com cerca de 103 a 104/cm2 de pele. A maioria est localizada no extrato crneo, outros habitam folculos pilosos e atuam como reservatrio para restabelecimento aps a lavagem.

MICROBIOTA NORMAL DA PELE Staphylococcus epidermidis Corynebacterium sp. Pseudomonas aeruginosa Micrococcus Streptococcus do grupo viridans Enterococcus Staphylococcus aureus Mycobacterium no patognico" (em regies ricas em secrees sebceas)

TRATO RESPIRATRIO
Grande nmero de bactrias coloniza as fossas nasais, garganta e boca. Mas os brnquios inferiores e os alvolos contm poucos ou nenhuns microrganismos.

OROFARINGE
Cerca de 50% da microbiota da garganta constituda por ESTREPTOCOCOS: Streptococcus do grupo viridans (Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans) e o Streptococcus pyogenes, Neisseria sp. no patognica ou patognica, Haemophilus influenzae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, fusobactrias, lactobacilos, formas onduladas, etc.

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A cavidade bucal apresenta uma das mais concentradas e variadas populaes microbianas (29 espcies) e cuja localizao principal est no dorso da lngua, sulco gengival e placa dentria. A contagem bacteriana em material da lngua apresenta nmeros que variam de 43 milhes a 5,5 bilhes por ml de saliva. Do sulco gengival e da placa a quantidade pelo menos 100 vezes maior, aproximadamente 200 bilhes por grama. Os estreptococos constituem o grupo mais numeroso, a metade das viveis. (Microbiologia Oral, Burnet, Sherp, Schuster 4a edio).

MUCOSA NASAL
A mucosa nasal habitada por estreptococos e estafilococos, destes o mais importante o Staphylococcus aureus. O Staphylococcus aureus pode ser disseminado causando doenas em hospitais: em enfermarias de recm-nascidos, de queimados, de imunodeprimidos e dos submetidos cirurgia.

MICROBIOTA NORMAL DA MUCOSA NASAL Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Streptococcus do grupo viridans Neisseria sp. Haemophilus sp.

TRATO GASTROINTESTINAL (TGI)

No estmago existem poucos microrganismos devido ao baixo pH. Em situaes patognicas se encontra o Helicobacter pylori. O intestino delgado alberga pequeno nmero de estreptococos, lactobacilos e Candida albicans. O clon possui grande quantidade de bactrias, cerca de 1011/g, aproximadamente 20% das fezes constitudo por bactrias, com predominncia de anaerbios. As bactrias mais numerosas so: Bacteroides fragilis, coliformes, estreptococos, lactobacilos, clostrdeos, Pseudomonas, etc.

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TRATO GNITO-URINRIO (TGU)

Microbiota

vaginal:

lactobacilos

menos

freqentemente

Escherichia

coli,

Enterobacter, Streptococcus agalactiae. Bexiga: a urina na bexiga estril em pessoas ss, mas ao passar pela poro final da uretra, pode se contaminar com Staphylococcus epidermidis, coliformes, difterides e estreptococos no hemolticos. * Staphylococcus saprophyticus faz infeco em TGU inferior em mulheres jovens. A rea em torno da uretra masculina e feminina pode apresentar Mycobacterium smegmatis (BAAR). A candidase torna-se uma das doenas que mais acomente mulheres em idade frtil no mundo atual. A vagina uma regio favorvel ao crescimento de microrganismos, como a Candida albicans, o Thichomonas vaginalis e os bacilos de Doderlin (gram positivos). PRTICA Evidenciao da presena de bactrias na pele e mucosa nasal. O meio de cultura, usado para o isolamento primrio em nossa aula prtica, ser o gar-sangue em placas de Petri. 1o dia Para coletar o material da pele do queixo, da testa, aba do nariz e fossa nasal. Usar swab ou zaragatoa, atritando a rea em estudo (individualmente em cada rea). Em seguida deslizar o swab em estrias na superfcie do meio de cultura, ocupando toda a rea da placa. Mos Com um pincel, dividir o fundo da placa em 4 partes. Marcar as partes com letras para identificar a rea semeada: S = sujo. L = lavado. E = escovado. D = com degermante.

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1. Com o dedo indicador (sem lavar) fazer estrias diretamente sobre o meio na parte S. 2. Em seguida, lavar as mos com sabo normalmente. No enxugar. Com o mesmo dedo fazer estrias na parte L. 3. Ensaboar as mos e escovar os dedos. Enxaguar. No enxugar e passar na parte E. 4. A seguir passar um anti-sptico disponvel. Enxaguar. Fazer estrias sobre a parte D. Colocar as placas semeadas na estufa a 37oC. Representao esquemtica da lavagem das mos

Lavagem com gua e sabo

Escovao Degermante e gua

Recolonizao

Recolonizao (aps horas)

2o dia 1. Retirar as placas da estufa e observar o crescimento. Verificar a quantidade de colnias em cada rea. Anotar. 2. Estudar as caractersticas das colnias. Anotar. 3. Fazer bacterioscopia pelo mtodo de Gram dos diferentes tipos de colnias. Anotar. Na placa semeada com os dedos notar onde houver maior crescimento de bactrias. Justificar. 4. Comparar com o resultado dos colegas e fazer um levantamento da bactria predominante.

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5. Se houver crescimento de colnias com caractersticas de estafilococos, ou seja: de 1 a 3 mm de dimetro, brancas ou amarelas, opacas, brilhantes, convexas altas, circulares, bordas lisas e superfcie lisa, prosseguir com a caracterizao utilizando as provas de Identificao Presuntiva dos estafilococos de interesse clnico.

3o dia: dia: Identificao Presuntiva de Estafilococos da Pele e Mucosa Nasal

Sabemos que microscopia ptica simples, na maioria das vezes no conseguimos fazer o diagnstico da espcie da bactria. No mximo determina-se o gnero e muitas vezes apenas o tipo bacteriano (ex: BGN). No caso dos estafilococos, microscopia ptica damos o diagnstico de Staphylococcus sp apenas. A partir disso as provas bioqumicas devem ser aplicadas para diferenciar a espcie em questo. Para ter certeza de que estamos trabalhando com uma colnia de estafilococos da placa de gar (sem fazer microscopia) faremos a prova da catalase.

1 PROVA: CATALASE Os estafilococos tm a capacidade de degradar perxido de hidrognio, pois eles produzem a enzima catalase. H2O2 H2O + O2 (via catalase processo enzimtico)

A prova simples: em uma lmina, pingamos gua oxigenada a 3% (que contm H2O2 e gua comum) em cima da colnia que foi coletada. Se borbulhar (liberar O2) porque a colnia produz catalase, enzima que estreptococo NO produz.

Fonte: Google

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Esta prova diferencia os estafilococos de outros cocos Gram positivos, como os estreptococos. CATALASE + CATALASE ESTAFILO ESTREPTO ou outro tipo de coco.

2 PROVA: PLASMOCOAGULASE Usaremos agora s as colnias CATALASE +, para seguirmos na identificao de estafilococos. Em tubo de ensaio com plasma de coelho, mergulharemos as colnias das amostras. Se ocorrer um precipitado "coagulado", dizemos que a prova coagulase positiva. Mas por que isso acontece? O Staphylococcus aureus produz uma enzima chamada coagulase. Ele converte o fibrinognio em fibrina no final da cascata da coagulao, a fim de fazer uma cpsula fibrosa em torno das colnias no nosso organismo (ele usa fibrinognio do plasma). Digamos que seria uma colnia encapsulada, que estaria mais protegida contra as defesas do nosso corpo e os antibiticos. Esses so os chamados abscessos. So galerias de bactrias e exsudato, colees de infeco e inflamao aguda, geralmente no tecido subcutneo.

Fonte: Google

Dentre o grupo dos estafilococos de interesse mdico, quem a produz coagulase somente o S. aureus. Por isso precisamos saber se nossa colnia em questo produz fibrina. Como no plasma de coelho tambm h fibrinognio, a reao que ocorrer a mesma. Portanto, basta semear a colnia no plasma de coelho e encubar 37C. Depois de 24h veremos se h precipitado ou no.

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CORRELAES CLNICAS: Quando se evidencia a presena de um abscesso em um paciente, que bactria sempre devemos incluir no grupo de agentes etiolgicos suspeitos? H bactrias que produzem enzimas semelhantes coagulase e que tambm podem ser agentes etiolgicos de ABSCESSOS ABSCESSOS NO SO EXCLUSIVOS DE S. aureus

Procedimentos Num tubo estril colocar: 0,5 mL de plasma sanguneo diludo a 1:5. Coletar a colnia em estudo e emulsionar no plasma. Incubar em estufa a 37oC.

Observar a formao de cogulo de meia em meia hora durante as primeiras 4 horas. Se no houver formao de cogulo, deixar na estufa at 24h para fazer a leitura. Observao: algumas tcnicas recomendam usar o plasma sem diluio. Neste caso o cogulo formado mais consistente. Resultados PLASMOCOAGULASE + PLASMOCOAGULASE Staphylococcus aureus (DIAGNSTICO DEFINITIVO) ENPC (Estafilococos no produtores de coagulase)

3 PROVA: NOVOBIOCINA um antibitico. Ele vai testar a sensibilidade dos ENPC para fazer a diferenciao via halo de inibio. Semeia-se a colnia de ENPC em uma nova placa de gar sangue e coloca-se um disco de novobiocina no centro. Incuba-se. Se houver um halo de inibio (menor que 14mm), dizemos que a bactria sensvel novobiocina. Se no houver, ela resistente. Atualmente so conhecidas outras espcies de ENPC que tambm so resistentes novobiocina, mas no de interesse mdico to importante. Resultados RESISTENTE: Staphylococcus saprophyticus SENSVEL: Staphylococcus epidermidis

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Fonte: Google

RESUMO: Catalase + estafilo Plasmocoagulase + Plasmocoagulase Catalase estrepto ou outro coco Staphylococcus aureus ENPC Novobiocina S R S. epidermidis S. saprophyticus

PROVA DO MANITOL (ALTERNATIVA) Semear o estafilococo em tubo (caldo) ou placa (gar) com manitol e indicador de pH vermelho de fenol. Colocar na estufa a 36oC. Aps 24h fazer a leitura. A decomposio do manitol acidifica o meio de cultura, produzindo a mudana da cor do indicador de vermelho para amarelo. Cultura amarela = positiva. Cultura vermelha = negativa.

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Para diferenciar as trs principais espcies, pode se utilizar o seguinte esquema: DIFERENCIAO DAS TRS ESPCIES DE Staphylococcus Coagulase Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus v = 11 a 89% positivos. + Manitol + - (v) Novobiocina Sensvel Sensvel Resistente

GAR SANGUE
Meio diferencial e no selietivo (muito enriquecido, uma vez que possui protenas e outros substratos provenientes do sangue). A bactria que crescer pode apresentar hemlise do sangue ou no. No caso de hemlise total, vai haver destruio dos glbulos vermelhos aparecendo um halo claro ao redor das colnias. Composio do ASA: gelose simples acrescida de 5 a 10% de sangue desfibrinado de carneiro.

MEIO DE MANITOL-HIPERTNICO (CHAPMAN)

Extrato de carne Peptona NaCl Manitol gar Vermelho de fenol gua

1g 10 g 75 g 10 g 15 g 0,025 g 1000 mL

um meio seletivo e diferencial. Seletivo: pela concentrao de 7,5% de NaCl permitindo o crescimento de poucas bactrias, entre elas o estafilococo (os meios comuns contm em geral 0,5% de NaCl).

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CAPTULO 10: 10: DIAGNSTICO LABORATORIAL ATRAVS DO ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DOS AGENTES ETIOLGICOS DAS INFECES
Neste captulo abordaremos os possveis tipos de microrganismos que podem ser agentes etiolgicos das mais diversas infeces. Para isto, dividiremos o contedo didaticamente de acordo com os locais de acometimento mais comuns no ser humano.

PORES SUPERFICIAIS E PROFUNDAS Estafilococos, Estreptococos e Pseudomonas sp.

Objetivos 1) Familiarizar o aluno com as tcnicas da coleta adequada do material patolgico, a fim de evitar contaminantes, facilitando o isolamento do agente efetivo da infeco. 2) No futuro, como clnico solicitante do exame laboratorial, dever orientar o paciente quanto maneira correta de coletar a amostra, de conserv-la e transport-la ao laboratrio de anlises. O mdico deve dominar os conhecimentos que lhe permitam escolher e indicar a realizao de exames complementares especficos, relativos hiptese diagnstica formulada a partir de dados epidemiolgicos, clnicos e laboratoriais inespecficos. Cabe-lhe tambm orientar a colheita dos materiais adequados para o exame e saber interpretar com rigor e segurana os resultados fornecidos pelo laboratrio. (Dr. Paulo Kiyoshi e Dr. Luis Parellada Ruiz, Doenas Transmissveis, captulo 10 pg. 115). 3) Acompanhar a seqncia dos exames laboratoriais bacteriolgicos necessrios na identificao do agente para fins de diagnstico e tratamento.

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Introduo Algumas doenas bacterianas podem ser diagnosticadas presuntivamente, lanando mo de dados epidemiolgicos e clnicos (como sinais e sintomas tpicos ou patognomnicos) que podem por si s, algumas vezes, fazer o diagnstico sem necessitar do exame microbiolgico. Exemplos disso so: o ttano, a difteria, a coqueluche, a amidalite purulenta bacteriana, escarlatina e furunculose. No entanto, existe um nmero grande de doenas que necessitam exames laboratoriais para confirmar a suspeita clnica. As infeces so causadas por diversas bactrias. As mais comuns so estafilococos e estreptococos, bactrias cuja ao promove a formao de exsudato ou derrame inflamatrio que contm grandes quantidades de componentes celulares do hospedeiro. Esse exsudato descrito como purulento. No processo patolgico desenvolvido, identificado como infeco bacteriana piognica, o tipo celular predominante de clulas NEUTRFILO (devido liberao de quimiocinas, IL-1 e TNF pelos macrfagos, ativando as integrinas dos neutrfilos circulantes, caractersticas da inflamao aguda). Alm do Staphylococcus aureus e do Streptococcus pyogenes, as outras bactrias mais freqentemente encontradas nas infeces so: Enterococcus sp., Pseudomonas e Enterobactrias (Escherichia coli, Enterobacter, Proteus). Como j referido acima, o quadro clnico de determinadas infeces, como as piodermites causadas por estafilococos, no necessitam habitualmente de confirmao por exames laboratoriais. O exame laboratorial, no entanto, indispensvel quando houver necessidade da avaliao da resistncia do estafilococo aos antimicrobianos.

Fonte: Robbins, 2005

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CORRELAES CLNICAS: H dois tipos de secrees patolgicas: o exsudato e o transudato. Pus sinnimo de exsudato purulento. Ambos so secrees liberadas como resposta pelo nosso organismo. Exsudato: cor opaca, muitas protenas, muitos leuccitos, muita desidrogenase ltica (LDH, uma enzima que converte o lactato em piruvato e vice versa, alm de ser uma enzima gluconeognica). Uma caracterstica muito importante a presena de POUCA GLICOSE. Uma vez que h presena de bactrias, a glicose estar diminuda. Ela o principal carboidrato utilizado no metabolismo bacteriano, e uma das enzimas que participa desse processo a LDH. Os leuccitos presentes esto promovendo uma resposta imunolgica imediata frente aos microrganismos. O principal deles nesse caso o neutrfilo, que a primeira linha de defesa do organismo e vem da fase de rolamento sobre o endotlio capilar, como ser detalhado na disciplina de Patologia Mdica Molecular (BP337). Para caracterizar um exsudato tem que haver mais de 3g/dL de protena, mais de 103 leuccitos/L, mais de 200UI de LDH e menos de 45mg/dL de glicose. Transudato: geralmente so lquidos cavitrios (pleural, peritoneal, pericrdico, asctico, lquor), de caracterstica transparente, poucas protenas, poucas clulas, pouca LDH e TAXAS NORMAIS DE GLICOSE. Isso se deve ausncia de bactrias nesse lquido. Ocorre em abdome asctico (hepatopata), derrame pericrdico, pleural, edema agudo de pulmo e por a vai. Eles vm geralmente devido a uma obstruo no fluxo venoso. Quando h um lquido suspeito, vindo de uma cirurgia, de uma puno pleural, de cavidades diversas, para caracterizar se o lquido um exsudato ou um transudato o exame que feito no Brasil a CULTURA (nos mais diferentes meios slidos e lquidos), para pesquisar se h presena de microrganismos. Os exames bioqumicos como glicose e LDH so utilizados em secrees mais nobres, como o lquor (para caracterizar uma meningite, por exemplo). Alm da microbiologia, os lquidos de cavidades devem ser encaminhados Anatomia Patolgica para averiguar a presena de clulas neoplsicas por exame de citologia onctica (o lquido pode ter se acumulado devido a uma metstase).

Coleta do material A coleta correta do material a etapa mais importante para o estudo do agente etiolgico e deve ser precedida dos seguintes cuidados: a) Uma quantidade insuficiente de material dificulta os procedimentos laboratoriais, prejudicando a identificao. b) O isolamento de contaminante pode levar a uma terapia incorreta, ou mesmo prejudicial, porque ele pode apresentar um padro diferente de sensibilidade aos antimicrobianos do que o agente efetivo da infeco. c) A coleta deve ser feita antes da antibioticoterapia. Nas infeces, a coleta varia com a forma clnica e a localizao do processo, que pode ser superficial ou profundo.

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Em localizao profunda esto a osteomielite, meningite, sinusite, promiosite, infeces nas articulaes e outras colees fechadas de pus. Nestes recorre-se puno aspirativa do exsudato purulento com seringa e agulha estreis. O local da puno deve ser rigorosamente descontaminado com sabo cirrgico ou outro anti-sptico adequado. Nas endocardites e septicemia coleta-se o sangue para hemocultura.

Leses superficiais
As infeces de pele geralmente causadas pelos estafilococos so: a foliculite, a furunculose e o impetigo. A foliculite uma pstula mais superficial (em cabea de prego), de caracterstica purulenta, que acomete o folculo piloso. A furunculose uma infeco mais profunda na derme, envolvendo o folculo piloso, que muitas vezes adquire a caracterstica nodular com muita hiperemia ativa (pstula interna). O estafilococo estabelece-se em um folculo piloso, produzindo necrose tecidual com acmulo de clulas inflamatrias. A bactria elabora a enzima coagulase que forma cogulo (fibrina) em torno da leso e dentro dos linfticos, resultando numa parede que delimita o processo. No centro da leso ocorre liquefao do tecido necrtico e o abscesso aponta na direo de menor resistncia. A parede de fibrina evita a propagao dos estafilococos e no deve ser rompida por manipulao ou trauma, sob o risco de disseminar a infeco (por analogia, evitar espremer espinha). Se por um lado a parede de fibrina evita a disseminao do estafilococo, por outro lado dificulta o acesso de antibiticos e elementos sanguneos de defesa. Observao: uma vez drenado o pus, a leso cicatriza rapidamente. Coleta em leses superficiais Nas formas superficiais, tais como furnculo (ou outras piodermites: impetigo, ectima, etc.) segue-se o seguinte esquema, observando rigorosa assepsia: 1) Descontaminar a superfcie do abscesso com o auxlio de uma gaze estril, embebida em anti-sptico ou salina estril. 2) Secar com gaze estril. 3) Com um objeto perfurocortante (agulha, lanceta, etc., estreis) levantar a afastar a pelcula ou crosta superficial.

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4) Coletar o material purulento da profundidade da leso com swab (ou aspirar com seringa) tendo o cuidado de no tocar as bordas da pele adjacente. Observao: em caso de leses abertas, remover a secreo superficial com gaze estril com salina, para eliminar os contaminantes. Exame laboratorial O material enviado ao laboratrio ser submetido aos seguintes procedimentos: 1) Bacterioscopia. 2) Cultivo. 3) Identificao. 4) Teste de Sensibilidade aos Antibiticos (TSA). Observao: o mdico deve comunicar ao laboratrio atravs da requisio dos exames, se suspeita de microrganismos menos freqentes, que exijam tcnicas prprias de microscopia e cultivo. Bacterioscopia Rotineiramente a bacterioscopia feita pelo mtodo de Gram (triagem), revelando a presena, o tipo morfolgico e propriedade tintorial da bactria.

Cultivo Na nossa aula prtica o cultivo feito em dois meios e visando apenas as bactrias aerbias e anaerbias facultativas. 1) gar-sangue. 2) Teague (EMB) ou MacConkey. Onde vamos cercar as possibilidades de isolar estafilococo, estreptococo e qualquer bacilo Gram negativo pouco exigente (Pseudomonas, enterobactrias) ou exigente como o Haemophilus. No gar-sangue: Vo crescer estafilococos, estreptococos e bacilos (exigentes e no exigentes). No Teague/MacConkey: Vo crescer bacilos Gram negativos (BGN) pouco exigentes.

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Procedimentos Dia Teague ou MacConkey 1o dia Semear por estrias na superfcie do meio. Meios de cultivo gar-sangue Semear por estrias na superfcie do meio. 1. Fazer Gram. 2. Fazer catalase. 1. Fazer Gram 2o dia 2. Repicar para gelose inclinada, em tubos separados as L+ e L3. Incubar a 35oC 1oC. a) Se a catalase por positiva, repicar para tubo contendo plasma de coelho. Incubar a 35oC 1oC. b) Se a catalase for negativa, proceder a identificao para estreptococos, segundo o tipo de hemlise observada. a) Interpretar a coagulase. Se negativa, 3o dia Semear em diversos meios para provas bioqumicas. prosseguir a identificao de outras espcies de estafilococos. b) Realizar provas de identificao para estreptococos. Interpretar as provas bioqumicas e 4o dia consultar tabelas para identificao Interpretar provas adicionais para ENPC. do bacilo Gram negativo (BGN).

Pseudomonas sp. (Bacilo Piocinico)

freqente o encontro de Pseudomonas sp. em infeces. Cerca de 70% destas so produzidas por Pseudomonas aeruginosa. As espcies (mais de 100) so diferenciadas por provas bioqumicas (pois um bacilo gram negativo que no se diferencia dos demais BGNs microscopia simples). A caracterstica marcante da Pseudomonas aeruginosa (88% delas) a produo de pigmento azul-esverdeado, chamado piocianina, deixando os meios de cultura claros e o pus com esta colorao. A cultura geralmente apresenta odor perfumado de essncia barata de uva (trimetilamina). Em geral, o odor do material infectado muito ftido e ruim.

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A Pseudomonas aeruginosa ubiquitria: cresce em solo, gua, vegetais e, obviamente, em tecidos orgnicos. O homem alberga na pele, garganta (5% de pessoas normais) e fezes. Ela to pouco exigente que cresce at em gua mineral. uma bactria oportunista, podendo causar vrias doenas. So freqentes as infeces em queimaduras e feridas cirrgicas. Faz uma leso em pele chamada de ectima gangrenosa (de odor muito ftido). Aps procedimentos com cateteres urinrios, punes lombares, cirurgias oculares, cardacas, etc. Pode causar infeces graves, especialmente e em pessoas hospitalizadas, onde a mortalidade pode chegar a 50%. Imunocomprometidos tambm so alvos preferenciais. Entre os fatores de virulncia destaca-se a toxina A, que bloqueia a sntese protica das clulas do hospedeiro ( semelhana da exotoxina do bacilo diftrico). Nas infeces por Pseudomonas, o clnico sempre pede antibiograma, visto que ela apresenta resistncia a muitos antibiticos, tais como: vrios -lactmicos, cloranfenicol e tetraciclinas. sensvel apenas polimixina, gentamicina, amicacina e algumas penicilinas semisintticas (carbenicilina). Com exceo da polimixina, a bactria pode adquirir resistncia aos antimicrobianos citados por mutao ou aquisio de plasmdios de resistncia. CORRELAES CLNICAS: Na clnica mdica de rotina, um agente que sempre deve ser considerado em infeces intestinais e do trato gnito urinrio feminino, alm de feridas cirrgicas. A droga de escolha mais adequada o ciprofloxacino, uma fluoroquinolona de 2 gerao. Este frmaco citado muitas vezes como quinolona anti-pseudomonas pelos livros de clnica mdica como Harrison, Tratado de Medicina Interna 2006, bem como nas publicaes mais atuais. Pode ser utilizado, inclusive, em pneumonias causadas por Pseudomonas aeruginosa (ps confirmao bioqumica), de acordo com os critrios adotados pelas disciplinas clnicas de Pneumologia e Otorrinolaringologia do ciclo profissionalizante do curso de Medicina desta instituio. * Ciprofloxacino NUNCA deve ser empregado como medicamento de primeira escolha (terapia emprica) para pneumonias, uma vez que uma droga pouco eficaz contra germes gram positivos como pneumococo (o agente etiolgico mais comum das pneumonias bacterianas). Fluoroquinolonas de 3 gerao em diante (levofloxacino, moxifloxacino e gemifloxacino) so drogas mais apropriadas para infeces bacterianas pulmonares.

Identificao dos Bacilos No Fermentadores BF Pacientes imunodeprimidos so muito suscetveis infeco por este grupo de bactrias. O isolamento de bacilo no fermentador de stios anatmicos originalmente estreis forte indicador de ser este o responsvel pela infeco.

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Nos casos de locais no estreis, como secreo de ferida cirrgica, pode ser apenas contaminante e no o causador da infeco. Os BF podem ser isolados de infeces urinrias, secrees de ferimentos e hemoculturas. Entre as bactrias no fermentadoras mais freqentemente isoladas das infeces esto: Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumanii Outras Pseudomonas 70-75% 25% 5%

As Pseudomonas utilizam os carboidratos por via oxidativa. Para verificar este tipo de metabolismo usa-se meios de cultura especiais. Hugh e Leifson foram os primeiros a idealizar um meio de cultivo que chamaram de Oxidao-Fermentao (O-F). O meio de O-F de Hugh e Leifson contm 0,2% de peptona para 1% do carboidrato testado, diferente da relao 2:1 dos meios usuais para fermentao. A acidez produzida pelas bactrias oxidativas muito pequena e no deve ser neutralizada pelos produtos de decomposio da peptona, razo da proporo 0,2% da peptona para 1% do carboidrato. A prova realizada em dois tubos para cada acar: um com leo mineral e outro sem leo na superfcie. Os bacilos oxidativos produzem cido somente no meio exposto ao ar. Os bacilos fermentadores produzem cido em ambos os tubos. Os bacilos no sacarolticos no produzem alterao em nenhum dos tubos. Exemplo: Pseudomonas = metabolismo oxidativo Alcalgenes = no sacaroltico
Para maiores detalhes da identificao dos bacilos oxidativos consultar: Diagnstico Microbiolgico, de Konemann e colaboradores.

Meios de cultura usados nesta aula prtica

gar sangue: Ver pgina 78

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Teague (EMB / HHT / TEA) Tambm chamado de Holt-Harris-Teague (HHT) ou gar eosina-azul de metileno = EMB (Eosin Methilene Blue). Alguns autores descrevem pequenas diferenas entre a composio do EMB e do TEA. No entanto, a finalidade desses meios no laboratrio a mesma. Composio: gar simples Lactose Soluo de eosina 2% Soluo de azul de metileno 0,5% 100 mL 10 mL 2 mL 2 mL

um meio seletivo-diferencial para Bacilos Gram negativos (BGN) no exigentes. Seletivo: pelos corantes que inibem o crescimento da maior parte das bactrias Gram positivas. Diferencial: pela decomposio ou no da lactose evidenciada pela cor das colnias (os corantes funcionam como identificadores de pH).

LACTOSE POSITIVA (L+) Os fermentadores de Lactose. Colnias: 1) Cor vermelha opaca; 2) Cor vermelha com ponto central preto; 3) Secas com brilho metlico. Observao: podem crescer colnias intermedirias destes tipos. LACTOSE NEGATIVA (L-) Os no fermentadores de Lactose. Colnias: Vermelhas claras transparentes.

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Observao: embora existam muitos meios de cultura seletivos e diferenciais para enterobactrias e mesmo havendo diferenas quanto capacidade de inibio de bactrias indesejveis, os bacteriologistas do preferncia queles que lhes oferecem dados mais visveis. Por exemplo, o brilho metlico das colnias no Teague, ajuda na identificao da Escherichia coli, apesar de no lhe ser especfico.

OROFARINGE Estreptococos, Haemophilus, Moraxella e Corynebacterium

A microbiota da orofaringe constituda principalmente por ESTREPTOCOCOS (50% da populao total bacteriana). Exemplos so os estreptococos do grupo viridante (Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis), Streptococcus pneumoniae (PNEUMOCOCO), Streptococcus pyogenes, Neisseria sp., Haemophilus sp., Staphylococcus epidermidis, bacilos pseudodiftricos (Corynebacterium pseudodiphetheriticum ou Corynebacterium hofmanni) e outros. Com isto chamando-se a ateno para dificuldade de isolamento do agente real da infeco da orofaringe como, por exemplo, pelo estreptococo e bacilo diftrico.

Faringite Estreptocccica
Quase 70% das dores de garganta agudas so causadas por vrus. A dor devido infeco demasiada da mucosa ou da prpria resposta inflamatria do organismo. Os principais vrus que podem causar faringites so os adenovrus (tipos 3, 4, 7, 14 e 21), rinovrus, coronavrus, influenza, parainfluenza, citomagalovrus (CMV), Esptain-Barr (EBV), Herpes vrus tipo 1 e coxsackie A. As infeces virais sero vistas mais adiante. Neste captulo, abordaremos as faringoamigdalites (faringites e tonsilites so os termos mais apropriados pela nmina anatmica atual) bacterianas. A infeco mais freqente do trato respiratrio superior manifesta-se sob a forma de faringite e tonsilite (amigdalite) causada por Streptococcus pyogenes (ESTREPTOCOCO BETA HEMOLTICO DO GRUPO A DE LANCEFIELD) = angina estreptoccica (90%). uma infeco que requer ateno especial, visto que, alm de disseminar-se a outros locais podendo causar sinusite, otite, mastoidite e vias areas inferiores provocando

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broncopneumonias, pneumonias e empiema (pus no espao pleural). Ainda podem ocorrer seqelas graves ps-estreptoccicas como Febre Reumtica e Glomerulonefrite Aguda. As caractersticas clnicas so semelhantes ao Haemophilus e Moraxella. Nas tonsilas palatinas existem as criptas amigdalianas, que so invaginaes da mucosa, aumentando a superfcie da tonsila, promovendo uma maior exposio de eptopos aos ndulos linfticos confuentes que existem subjacentes mucosa. Nessas criptas no h drenagem de ductos das glndulas salivares menores, portanto ali o acmulo de material facilitado. Durante uma tonsilite, alm da presena de febre na maioria dos casos, acumulase exsudato purulento nessas regies, dando o aspecto de placas amarelo-esbranquiadas sobre as tonsilas. Essas placas so facilmente removidas com swab e esse o material que se utiliza para fazer semeadura em gar sangue.

Fonte: Rubin, 2006

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CORRELAES CLNICAS: Streptococcus pyogenes, um mal que deve ser cortado pela raiz Na parte externa da parede celular de algumas cepas da espcie do estreptococo beta hemoltico, h uma protena chamada de protena M (uma protena que inclusive, degrada o fator C3b e no deixa a cascata do sistema complemento agir). O sistema imunolgico acaba por dar cabo da bactria produzindo anticorpos contra essa protena. Porm, essa protena muito parecida com protenas do organismo humano, que esto principalmente na membrana basal do glomrulo renal, nas vlvulas cardacas, etc. Uma vez desenvolvidos anticorpos pelos linfcitos B contra essas protenas dos estreptococos, o organismo entra em uma operao de auto-ataque, destruindo nossas prprias clulas e membranas (complexos imunes), causando cardiopatia reumtica e glomerulonefrite psestreptocccica, por exemplo. Muitas vezes o paciente necessita de prtese valvar (tamanho o estrago) nos casos de valvulopatia severa e transplante renal nos casos mais exacerbados de glomerulonefrite no tratada. Os aspectos morfolgicos destas leses sero abordados com detalhes na disciplina de Anatomia Patolgica (MP313). A esse fenmeno ps-estreptocccico d-se o nome de febre reumtica (cepas que produzem estreptolisina O). Por isso importante sempre tratar as faringoamigdalites com antibiticos mesmo dos casos mais brandos e silenciosos, antes do desenvolvimento destes anticorpos. At porque nunca se sabe ao certo qual a espcie de bactria envolvida na infeco, quanto mais a cepa (se resistente ou no). Enfim, as manifestaes ps estreptocccicas de uma infeco mal tratada fazem parte de uma doena reumtica, imunolgica, que ataca, depois de um tempo, tecidos sadios com complexos imunes (reao de hipersensibilidade tipo III). Esse assunto ser abordado com detalhes em seminrios promovidos pela disciplina de Imunologia Mdica (BP336). Alm disso, o Streptococcus pyogenes tem uma enzima chamada peptidase do C5a, que degrada o C5a, impedindo uma via do sistema complemento, e por conseqncia a quimiotaxia de neutrfilos. Tambm produz hialuronidase, uma enzima que destri o hialuronato do tecido conjuntivo e contribui para uma permeabilidade mais fcil nos tecidos sadios. Para diagnstico de febre reumtica, usam-se os critrios de Jones, como visto nas aulas tericas desta disciplina. Para a terapia antimicrobiana, o antibitico de escolha a amoxicilina. Pode ser administrada sozinha ou associada a um bloqueador de -lactamases, uma vez que vrias espcies da microbiota normal produzem tais enzimas. Alm disso, o quadro clnico se assemelha a infeces por Haemophilus influenzae e Moraxella catarrhalis, microrganismos potencialmente produtores dessas pelicilinases. Streptococcus pyogenes e as infeces hospitalares Alm de ser um potente causador de infeces do trato respiratrio, o estreptococo beta hemoltico ainda pode desencadear infeces hospitalares severas, de difcil controle que muitas vezes levam o paciente inevitavelmente ao bito. Um exemplo disso a Fasciite Necrotizante. Uma doena maligna que pode ocorrer em feridas cirrgicas. conhecida como doena da bactria carnvora, pois o paciente relata muitas vezes que sente que est sendo comido vivo. E o quadro clnico comprova isso, com muitas reas infectadas, necroses extensas, tecidos putrefados e exsudato intenso. A taxa de letalidade relativamente alta, uma vez que a carga bacteriana j est to elevada que os antibiticos, mesmo os de maior eficcia, no conseguem eliminar a infeco. Alm disso, os tecidos necrosados produzem muitas toxinas pelo

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metabolismo desorganizado, e quando esse material atinge o sangue pode gerar estragos bem maiores.

Os microrganismos mais comuns comumente encontrados nessas infeces so os vrus respiratrios. Entre as bactrias, o grande destaque o S. pyogenes. Outros estreptococos que podem fazer faringite, menos comumente so o S. anginosus e o S. dysagalactiae. O Haemophilus influenzae quase que exclusivamente peditrico. Coco-bacilo gram negativo, Haemophilus significa Gosta de sangue e o nome influenzae foi dado porque originalmente se pensava que causasse gripe, mas agora se sabe que um invasor secundrio do trato respiratrio, em especial o inferior. H seis sorotipos (a-f), distinguveis sorologicamente pela cpsula polissacardica, ou por PCR. O meio de cultura mais adequado o gar chocolate em microaerofilia (alta sensibilidade). No entanto, o meio especfico para o hemfilos o gar Mueller-Hinton (alta especifidade). O meio de Hitchens-Pike tambm pode ser utilizado. CORRELAES CLNICAS: As cepas no encapsuladas do Haemophilus influenzae geralmente fazem parte da microbiota normal da orofaringe. O tipo b (encapsulado) muito menos comum em microbiota normal e o principal sorogrupo causador de infeces. Acomete muito as crianas, principalmente lactentes e pr-escolares. Crianas at 2-3 anos de idade no so capazes de fabricar tais anticorpos, pois essa resposta depende de alguns linfcitos T que o timo ainda no foi capaz de fabricar. O H. influenzae um potente causador de pneumonias (2 agente mais comum), sinusites, otites, artrite sptica, bronquites, meningite (em casos mais severos quando h bacteremia), alm de ser o principal agente etiolgico da epiglotite. Faringites ocorrem em crianas com menos de 5 anos. No trato respiratrio superior em adultos causa sinusites e otites (cepas no-b). H vacina eficaz, ministrada obrigatoriamente pelo calendrio de vacianao brasileiro em trs doses, aos 2, 4 e 6 meses de idade. Sempre suspeitar de infeco por H. influenzae em crianas com sinais clnicos. 15 a 20% das cepas patognicas do Haemophilus influenzae produzem -lactamases, portanto a terapia sem bloqueador dessas enzimas pode ser ineficaz.

A Moraxella catarrhalis (originalmente denominada Branhamella catarrhalis) hoje considerada uma causa crescente de faringites e pneumonias, sobretudo em pacientes com carcinoma de pulmo ou doena pulmonar de base. No se sabe ao certo o porqu, mas epidemiologicamente, os pacientes mais acometidos por essa espcie so usurios crnicos de lcool. So diplococos gram negativos (s vezes chamadas de cocos ovais), oxidase positiva e catalase positiva. Apresentam bom crescimento em gar sangue e gar chocolate. H um meio com alta especificidade, o gar DNase (azul de toluidina).

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Outros tipos de Faringites

Angina de Vicent (Angina de Plaut-Vincent) Outra infeco na forma de tonsilite lcero-membranosa a chamada Angina de Plaut-Vincent. causada pela associao fusoespirilar (Treponema vincentii e Fusobacterium nucleatum). O quadro clnico, diferente das demais bactrias, sugere muito a origem etiolgica da infeco. As tonsilas palatinas e os pilares farngeos adquirem lceras em forma de verdadeiros buracos. Difteria Farngea A difteria que se caracteriza por inflamao da garganta (angina diftrica) onde as tonsilas palatinas, os pilares anteriores e a vula se recobrem com exsudato pseudomembranoso. uma infeco muito grave, mais comum entre o primeiro e o stimo ano de vida, causada por cepas do Corynebacterium diphteriae (tambm chamado de bacilo diftrico ou bacilo de Klebs-Loeffler). Esta bactria produz uma endotoxina (responsvel pelos fenmenos locais da doena) e uma exotoxina (extracelular) que se introduzir na corrente circulatria provocando febre (baixa), pulso rpido, palidez e adinamia (falta de disposio). Pode causar obstruo respiratria fatal (crupe), quando atinge a traquia (tosse estridante), com roquido e voz velada. A principal diferena para uma faringoamigdalite comum o aspecto de falsa membrana que recobre as tonsilas, diferente das infeces estreptocccicas onde h placas purulentas nas criptas. Essa pseudomembrana no facilmente removida com swab. O diagnstico confirmado pelo exame bacterioscpico direto e pela cultura dos exsudatos farngeos, ou at mesmo um fragmento da pseudomembrana. Alm da faringe, o bacilo diftrico pode colonizar a laringe, as fossas nasais, ouvidos e, ocasionalmente, o trato genital e a pele.

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Identificao Presuntiva dos Estreptococos

Classificao A classificao para um estudo preliminar dos estreptococos baseia-se no crescimento (comportamento) em placa gar-sangue, onde se diferenciam em quatro tipos, segundo a hemlise que produzem. a classificao de Schottmller-Brown. Ou seja, pelo PADRO DE HEMLISE EM GAR SANGUE.

1) Tipo (alfa)

produz em torno das colnias um halo verde de hemlise

parcial (transformao da hemoglobina em substncia semelhante biliverdina). Produzida por estreptococos conhecidos como do grupo viridans. 2) Tipo (beta) 4) Tipo (gama) produz um halo de hemlise total. intermedirio entre os precedentes, de difcil observao. ou inerte que no altera o sangue (espcies no hemolticas). 3) Tipo 1 (alfa-primo)

Fonte: Prof Alessandra Daur

Ao isolar cocos Gram positivos da leso, deve-se fazer a prova da catalase (que deve ser negativa) para o incio da caracterizao do estreptococo.

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Prova de Optoquina Aplica-se para as colnias alfa hemolticas. Se sensvel, o diagnstico de Streptococcus pneumoniae (pneumococo). Se resistente, devem-se fazer todos os testes para gama hemlise. Semear a bactria em gar-sangue e colocar um disco de optoquina. Incubar 24h em tenso de CO2. A bactria sensvel se apresentar um halo de inibio 14 mm.

Fonte: Profa Alessandra Daur

Prova de Bacitracina Ela diferencia as colnias beta hemolticas em grupo A e B de Lancefield. Se for sensvel, o diagnstico de Streptococcus pyogenes. Se for resistente, h necessidade de se fazer a prova de Camp Test. Semear a bactria em gar-sangue e colocar o disco de bacitracina (0,04 g). Incubar 24h a 35oC. A presena de halo de inibio de qualquer tamanho, indica sensibilidade. (para auxlio no diagnstico dos estreptococos -hemoltico pode se utilizar disco de Sulfametoxazol-trimetropim).

Fonte: Prof Alessandra Daur

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Prova de Camp-Test (C-T) Em linha, uma amostra semeada de Staphylococcus aureus tambm beta hemoltico. Semear linhas perpendiculares linha de S. aureus, porm sem contato fsico de uma linha com a outra. Se ocorrer hemlise intensificada em forma de flecha (hemlise intensificada), diagnostica-se Streptococcus agalactiae. A atividade hemoltica do estafilococo intensificada pelo fator extracelular do estreptococo do grupo B, denominado fator Camp. A zona de intensificao da lise assume forma semelhante ponta de flecha, na interseco das duas estrias.

Fonte: Google

Prova de tolerncia ao sal (MTS) Para Gama hemlise fazer prova de tolerncia ao sal. Se positivo Enterococcus sp. Se negativa, fazer a prova da Bile-escurina. Semear a bactria em caldo MTS (NaCl 6,5%). Incubar 24h a 35oC. a turvao do meio e/ou a viragem do indicador de pH para amarelo indica positividade prova (tolerncia do microrganismo alta concentrao de NaCl 6,5%).

Prova de Bile-esculina (Besc) Cultivar a bactria na superfcie do gar e incubar 24h a 35oC. Microrganismos Besc

positivos crescem em presena de 40% de bile e hidrolisam a esculina, formando um precipitado negro em 2/3 ou mais do gar inoculado.

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Bile esculina + Bile esculina -

Estreptococos do grupo D Estreptococos do grupo Viridans

CLASSIFICAO DE LANCEFIELD (Muito importante) A classificao de Lancefield baseada nas caractersticas antignicas de um polissacardeo, carboidrato C, localizado na parede celular. Nesta classificao os estreptococos so designados pelas letras maisculas do alfabeto: de A a V. O Streptococcus pyogenes do grupo A. Produz hemlise. O Streptococcus agalactiae do grupo B. Produz hemlise.

Pesquisa do estreptococo

Cuidados na Coleta 1. Cuidar para que as paredes laterais da boca, lngua e gengivas no sejam tocadas, com isto evitando a contaminao pela microbiota normal. Por exemplo, pelos estreptococos enverdescentes e ENPC. Em culturas da orofaringe o resultado positivo para estas bactrias no deve ser valorizado. Neste sentido, foi dada nfase especial no captulo que trata da microbiota normal do corpo humano, para no haver dificuldade na interpretao do exame bacteriolgico enviado pelo laboratrio. 2. Coletar as amostras antes da antibioticoterapia, evitando os resultados falsonegativos. 3. Caso haja demora entre a coleta do material e o seu processamento no laboratrio, indicada a utilizao de um meio de cultura de transporte, como por exemplo, o meio de Stuart. 4. Para facilitar o isolamento de Streptococcus pyogenes, usar meio de enriquecimento, como por exemplo, o meio de Hitchens-Pike. (A descrio destes dois meios encontra-se no final deste captulo).

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Coleta do material da garganta Orientar o paciente a abrir a boca e falar um aaaa demorado que abre a garganta e ergue a vula. Pressionar para imobilizar a lngua com um abaixador de lngua e com auxlio de um swab (zaragatoa), deslizar em movimentos suaves na faringe posterior, tonsilas ou fossa tonsilar, tocando os pontos de pus ou placas (alguns recomendam remov-las e coletar material que estava por baixo delas). Na falta destas leses, passar o swab nas partes hiperemiadas.

Exames Do material obtido procede-se ao exame: 1) Bacterioscpico (pelo Gram); 2) Cultivo em meios enriquecidos como gar-sangue. O estreptococo no cresce em meios simples.

Bacterioscopia Na bacterioscopia pelo Gram, observar a morfologia celular, grupamento tpico e a Gram positividade.

Cultivo 1o dia O cultivo feito em gar-sangue semeando com o swab numa pequena rea da placa (1/5). Em seguida, com o auxlio de ala metlica, tocar a rea semeada com swab e puxar vrias estrias. Desta maneira consegue-se melhor isolamento. Semeadura com swab

Stabs

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Ainda com a ala, fazer cortes curtos e profundos, os stabs, num ngulo aproximado de 40o para introduzir os estreptococos abaixo da superfcie do meio de cultura e evidenciar a hemlise pela estreptolisina O que oxignio instvel. Nos cortes cria-se atmosfera de relativa anaerobiose.

Observaes a respeito da hemlise O estreptococo produz duas hemolisinas: 1) Estreptolisina O = oxignio sensvel; 2) Estreptolisina S = oxignio estvel. Cerca de 2% do Streptococcus pyogenes produz apenas a estreptolisina O. Para surpreender estas linhagens fazem-se os stabs para obter hemlise em anaerobiose, pois em aerobiose no produzem hemlise, perdendo-se um diagnstico importante para Streptococcus pyogenes.

2o dia No segundo dia, observar o crescimento no gar-sangue. O estreptococo cresce dando colnias pequenas, puntiformes, delimitadas, bordas lisas. Observar a hemlise: Fazer Gram das colnias hemolticas. Semear a colnia hemoltica para o teste da Bacitracina. Tcnica e recomendaes: 1. Testar apenas amostras hemolticas, visto que, alguns estreptococos alfahemolticos so tambm sensveis a 0,04 g. 2. Se o laboratrio usar apenas o teste da Bacitracina para identificar o Streptococcus pyogenes, isto deve constar no laudo enviado ao mdico: Streptococcus beta-hemoltico do grupo A, pelo teste da bacitracina. Portanto, a sensibilidade Bacitracina no um diagnstico definitivo do Streptococcus pyogenes. Teste definitivo a aglutinao com o soro especfico anticarboidrato C, numa reao Ag-Ac.

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3o dia Observar a sensibilidade Bacitracina. Qualquer halo de inibio d positividade. Cerca de 85% de Streptococcus pyogenes so sensveis a 0,04 g de bacitracina. Microbiologia Trabulsi 2a edio. Pg. 115. Dr. Luiz Rachid Trabulsi, Prof. Titular de Microbiologia da Escola Paulista de Medicina So Paulo. de importncia fundamental que tanto o bacteriologista como o clnico compreenda o pouco valor da identificao dos estreptococos, somente pela atividade hemoltica. Est bem demonstrado que os estreptococos beta-hemolticos (alm do Grupo A) podem ser isolados, com freqncia, da garganta, particularmente os dos grupos C, B e G. Conforme sabido, as infeces por estes estreptococos no so seguidas de febre reumtica e glomerulonefrite, no requerendo assim os cuidados teraputicos exigidos pelas infeces provocadas pelo Streptococcus pyogenes. Outro aspecto importante do diagnstico, refere-se ao fato de que 10 a 20% dos indivduos normais podem albergar Streptococcus pyogenes na garganta. Por esta razo, o isolamento de uma amostra de Streptococcus pyogenes de um paciente com faringite, poder ser mera coincidncia. A responsabilidade do germe pelo processo infeccioso ter que ser determinada tendo-se em conta as manifestaes clnicas do paciente e de maneira mais segura, pela pesquisa de anticorpos sricos 2 a 3 semanas aps o incio da doena. Observao: outros patgenos sero pesquisados, quando requisitado por mdico, por exemplo: Neisseria gonorrhoeae, em faringites em pacientes que praticam sexo oral sem preservativo, Haemophilus influenzae em laringites, etc.

Angina de Plaut-Vincent Esta angina pode ser diagnosticada com segurana pelo exame bacterioscpico. O exame bacterioscpico feito pelo mtodo de Gram ou Giemsa, revelando a presena de bacilos fusiformes e espiroquetas (associao fusoespirilar) que so o Fusobacterium nucleatum (fusiformes) e o Treponema vincentii, ambos Gram negativos. Fusiforme: 4 a 8 m de comprimento. Treponema: 10 a 20 m de comprimento. O cultivo, se necessrio, feito em anaerobiose.

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Difteria Coleta do material No caso da difteria da orofaringe, de acordo com o Manual de Procedimentos Bsicos, recomenda-se coletar o material com quatro swabs: dois da garganta (G1 e G2) e dois da regio nasofaringea (N1 e N2). Dois swabs, N1 e G1, so utilizados para exame bacterioscpico e outros dois destinados ao cultivo.

Bacterioscopia Os esfregaos so corados pelo Gram e Laybourn (bacilo verde claro). Gram: o bacilo diftrico aparece Gram positivo com extremidades dilatadas. Laybourn: revela as granulaes metacromticas (azuis) no interiordo bacilo. O bacilo diftrico tem tendncia ao pleomorfismo apresentando formas em clava, piriforme, fusiforme e em halter. Os agrupamentos dos bacilos so peculiares, seja formando paliada ou formando ngulos V, L, Y, que em conjunto tem aparncia de letras chinesas. A morfologia tpica observada melhor quando se usa a colorao negativa com tinta-da-china. A bacterioscopia tem pequeno valor diagnstico, sendo apenas um teste presuntivo. Visto que os bacilos pseudodiftricos (Corynebacterium hofmanii, tambm chamado Corynebacterium pseudodiphtheriticum) que fazem parte da microbiota normal da orofaringe, tm a mesma morfologia e a mesma propriedade tintorial. No diagnstico da difteria, o exame bacterioscpico de esfregaos corados pelo Gram ou por outros processos como os usados para granulaes metacromticas, no tm valor diagnstico. O bacilo diftrico tem as mesmas caractersticas que as outras corinebactrias que fazem parte da microbiota normal da garganta. Provavelmente as manifestaes clnicas apresentadas pelo paciente so mais teis para o diagnstico etiolgico do que um exame bacterioscpico. Infelizmente este conceito no suficientemente difundido e por esta razo freqente em nosso meio, o mdico solicitar uma bacterioscopia de secreo de garganta, quando suspeita de difteria. (Microbiologia Trabulsi. Dr. Luiz Rachid Trabulsi, 2a edio, pg. 129)

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O tratamento com antitoxina (soro antidiftrico) deve ser uma deciso clnica, to logo se suspeite de difteria com base nos sintomas apresentados. O diagnstico laboratorial completo ter valor retrospectivo na confirmao do diagnstico clnico e como ponto de partida s medidas profilticas, a fim de evitar a propagao da difteria aos familiares e comunidade (escola).

Cultivo O cultivo feito em meio de Loeffler (soro sanguneo coagulado). Neste meio o bacilo diftrico apresenta colnias aps um perodo curto de incubao, 8 a 10h. Outras bactrias como estafilococos, estreptococos, neisserias, cuja fase-lag mais demorada, no crescem com igual rapidez. Do cultivo feita nova bacterioscopia. Caso sejam encontrados caracteres morfotintoriais do bacilo diftrico ser, mesmo assim, um teste positivo de probabilidade. Para as provas seguintes: bioqumicas e de virulncia, recomenda-se reisolamento em placas. O diagnstico de certeza dado somente pelas provas da produo de toxina pelo bacilo diftrico. Observao: o bacilo diftrico somente produz toxina quando lisogenizado por bacterifagos contendo o gene TOX. O vrus integra o seu DNA ao cromossomo bacteriano e a toxina sintetizada. O Corynebacterium diphtheriae que no lisogenizado no produz toxina e no patognico, no mximo produz manifestaes clnicas discretas e localizadas. O teste de certeza pode ser realizado de duas maneiras: 1) In vitro. 2) In vivo.

In vitro Teste in vitro pode ser feito por imunodifuso radial = IDR (como recomendado pelo prof. Dr. Luiz Carlos Duarte Formiga Diviso Nacional de Laboratrios de Sade Pblica e utilizado no Lacen).

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Tcnica Em placas contendo meio de cultura acrescido de soro antidiftrico, semear a bactria suspeita isolada em forma de spots de aproximadamente 4mm de dimetro. Incubar. Se o bacilo produzir a toxina, ela se difundir no meio e reagir com o soro antidiftrico. Haver reao AgAc, que se manifesta como precipitao em torno da colnia. Outro mtodo o teste de Elek, fundamentando-se no mesmo princpio. Tcnica Numa placa com meio transparente colocar uma tira de papel de filtro impregnada com soro antidiftrico. Semear o bacilo suspeito perpendicularmente ao papel. Se houver produo de toxina, aps 48h desenvolve-se uma linha branca de precipitao na bissetriz do ngulo entre a tira e semeadura. Teste de IDR (hemodifuso radial Ag-Ac) Teste de Elek (tem anti-soro)

In vivo O teste de virulncia in vivo feito em cobaia inoculando o bacilo suspeito e observando a ao da toxina. Esses testes no so usados por questes bioticas. Resumo dos testes Segundo Otto Bier: 1) Diagnstico de possibilidade 2) Diagnstico de probabilidade 3) Diagnstico de certeza - pelo exame bacterioscpico; - cultura em meios adequados; - mais demorado, porm o nico seguro, que determina a virulncia (testes in vivo e in vitro).

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Meios de Cultura Meio de Stuart utilizado para transportar amostras para culturas de cocos Gram positivos e bacilos Gram negativos, mantendo as bactrias viveis por 24h (tempo de segurana) ou 48h, at que sejam semeadas em meios especficos para crescimento. O meio de Stuart pode ser lquido ou semi-slido. Frmula do meio de Stuart (semi-slido) Cloreto de sdio Cloreto de potssio Fosfato dissdico Fosfato monossdico Tioglicolato de sdio Cloreto de clcio 1% aquoso Cloreto de magnsio 10% aquoso gar gua destilada 3g 0,2 g 1,15 g 0,2 g 1g 10 g 10 g 4g 1L

uma soluo tampo, no contendo carboidratos, peptonas ou outras substncias nutritivas de crescimento. O meio apenas preserva a viabilidade das bactrias durante o transporte, sem multiplicao significativa dos microrganismos. O tioglicolato de sdio funciona como agente redutor, para melhorar o isolamento dos anaerbios e a pequena quantidade de gar fornece consistncia semi-slida, extravasamento durante o transporte. Meio de Hitchens-Pike Meio de enriquecimento para estreptococos consistncia xaroposa. Frmula Infuso de corao bovino Peptona NaCl gar Soluo aquosa de azida sdica, NaN (1:1.000) Soluo aquosa de cristal violeta (1:25.000) 1L 10 g 5g 1g 40 mL 12,5 mL evitando oxigenao e o

104

O cristal violeta impede o crescimento dos outros cocos Gram positivos e a azida sdica inibe a microbiota Gram negativa. O crescimento de estreptococos no meio Hitchens-Pike, tem semelhana com estalactites, formando filamentos que pendem da superfcie do meio.

CLASSIFICAO DAS PRINCIPAIS ESPCIES DE ESTREPTOCOCOS PATOGNICAS PARA O SER HUMANO

GRUPO PRINCIPAIS ESPCIES S. pyogenes PADRO DE HEMLISE Beta HABITAT Orofaringe Pele Nasofaringe TGU Nasofaringe Pele TGU e TGI Nasofaringe Pele TGU e TGI TGU e TGI TGI PRINCIPAIS DOENAS Faringites, tonsilites, piodermites, escarlatina. Sepse neonatal, meningites, infeco puerperal, ITU, etc. Infeces de pele, endocardites, faringites Infeces de pele, endocardites, faringites ITU, peritonite, endocardite ITU Endocardite

S. agalactiae

Beta (Alfa, Gama) Beta (Alfa, Gama) Beta (Alfa, Gama) Gama (Alfa, Beta) Beta (Alfa, Gama) Beta (Alfa, Gama) Alfa (Beta, Gama) Gama (Alfa) Alfa Alfa

S. anginosus S. dysgalactiae S. canis S. anginosus S. dysgalactiae Enterococos: E. faecalis E. faecium No enterococos: S. bovis S. anginosus S. sanguis S. salivaris Grupo Viridans: S. mitis S. mutans Outros: S. pneumoniae Vrios, inclundo o Peptostreptococo

F H K

Orofaringe, Sinusite TGU e TGI Meningite Orofaringe e Abscesso cerebral, TGI pneumonias Orofaringe Orofaringe Boca, faringe e traquia Orofaringe, TGU e TGI Endocardite Endocartite, crie Pneumonia, otite mdia, sinusite, endocardite. Sinusite, pneumonia, abscesso pulmonar e cerebral

NO GRUPAVEIS

ESTREPTOCOCOS ANAERBIOS

Gama (Beta, Alfa)

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TRATO GNITO URINRIO (TGU)

Os agentes etiolgicos mais freqentes das infeces do aparelho urinrio so:

1) Enterobactrias: Escherichia coli (90% dos casos)

Klebsiella Proteus

2) Pseudomonas aeruginosa 3) Enterococcus 4) Staphylococcus aureus 5) Staphylococcus saprophyticus (este considerado atualmente o principal agente
de infeco urinria em mulheres jovens). O material para o diagnstico laboratorial a urina. Amostras de urina so submetidas cultura, quando existe suspeita de infeco do trato urinrio, para controle de tratamento ou em pacientes assintomticos com alto risco de infeco. Coleta de urina De preferncia coletar a primeira urina da manh, em frasco estril, tampa de rosca e boca larga. Outras amostras tambm podem ser obtidas, desde que o paciente retenha a urina no mnimo por 2 a 3 horas antes da coleta. Aps a higienizao da regio genital, desprezar o 1o jato e coletar o jato mdio da urina. O restante da mico no deve ser utilizado. Em crianas com fraldas ou em pacientes que no tm controle de mico, devemse usar coletores prprios de urina, fornecidos pelo Laboratrio de Anlises Clnicas. Pode ser adquirido em farmcias. 1) Fazer anti-sepsia rigorosa do perneo, coxas, ndegas e abdmen. 2) Enxugar com gaze estril. 3) Aplicar o coletor autocolante. 4) A seguir observar se h quantidade suficiente de urina para o exame. Caso no houver mico em uma hora, trocar o coletor por um novo, fazendo uma nova assepsia.

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UROCULTURA um exame QUANTITATIVO. Para evitar a multiplicao das bactrias na urina coletada, o exame laboratorial deve ser feito o mais rapidamente possvel (dentro de uma hora aps a coleta), caso contrrio, pode se manter o material temperatura de geladeira, no mais que cinco horas. Diagnstico bacteriolgico Uma vez no laboratrio o exame segue as seguintes etapas: 1) Bacterioscopia (Gram) do sedimento. 2) Cultivo da urina. 3) Contagem de colnias (bactrias ou contagem de UFC = unidades formadoras de colnias). 4) Antibiograma. Descrio dos procedimentos 1o dia 1) Centrifugar a urina em um tubo coberto com cpsula de papel alumnio. 2) Derramar o sobrenadante e do sedimento, fazer colorao de Gram para observar a presena ou ausncia de leuccitos e bactrias. Cultivo da urina homogeneizada Mergulhar uma ala de platina na urina e semear por estriais superficiais em placa de Teague e gar sangue. Incubar a 37oC.

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Contagem bacteriana (contagem de colnias) UFC A tcnica de contagem em placa baseada no princpio de que cada clula bacteriana quando cultivada em meio slido ao se multiplicar forma uma massa macroscpica que a colnia. Somente serve para contagem de viveis. A contagem pode ser feita das seguintes maneiras: 1. Com ala calibrada. 2. Por diluies. 3. Lmino-cultivo.

Contagem com ala ( a mais utilizada) Para a contagem semiquantitativa usa-se ala metlica calibrada de 0,01 ou 0,001mL. 1) Imergir a ala, de forma vertical, em urina homogeneizada e semear uma nica estria central em placa de Teague e gar-sangue. 2) Em seguida, estria-se perpendicularmente primeira linha semeada, a fim de espalhar ao mximo o material.

Esquema da Contagem Bacteriana Com Ala

1. Esgotamento (Inoculao primria)

2. Estriamento

2o dia Do Teague (EMB). Observar as caractersticas coloniais. 1. Se for um bacilo L+, realizar o teste IMVIC. IMVIC uma srie bioqumica simplificada para caracterizar as bactrias do grupo coliforme. I = Indol M = Vermelho de Metila V = Voges-Proskauer C = Citratase

2. Se for um bacilo L-, fazer a srie completa de provas bioqumicas.

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I Escherichia coli Enterobacter Klebsiella Citrobacter + +

M + +

V + + -

C + + + mvel (urease tardia) imvel

Do crescimento em gar sangue fazer Gram. Se houver crescimento de estafilococos ou estreptococos, caracteriz-los como nos captulos precedentes. Contagem das colnias

Contagem de colnias (UFC) por ala calibrada.

O nmero de colnias multiplicado por 100 se a ala utilizada for de 0,01 e por 1.000 se a ala utilizada for de 0,001. Exemplo: colnias contadas = 40. 1) Ala 0,01 2) Ala 0,001 muitos zeros. Exemplos: 3o dia 90.000 9.000 100 45.000 100.000 = 9x104 col/mL ou UFC/mL = 9x103 col/mL ou UFC/mL = 102 col/mL ou UFC/mL = 4,5x104 col/mL ou UFC/mL = 105 col/mL ou UFC/mL 40 x 100 = 4.000 col/mL urina; 40 x 1.000 = 40.000 col/mL urina.

O resultado dado pelo laboratrio usando potenciao, para evitar os nmeros com

Mais de 100.000 = superior a 105 col/mL ou UFC/mL

Leitura do IMVIC e das provas bioqumicas do BGN, se lactose negativa (L-). Leitura das caractersticas do estafilococo e estreptococo.

O Esquema de Urocultura est apresentado na pgina 110.

109

110

Interpretao dos resultados das anlises de urina relacionados com sintomatologia clnica

Contagem bacteriana

Leuccitos Sintomas Como reportar o resultado A A No houve crescimento de MO.

Comentrios

No existe infeco urinria.

Sem crescimento

No houve crescimento de MO.

Piria assptica causada por desidratao / inflamao. Provvel uretrite ou paciente sob uso de antibiticos.

No houve crescimento de MO.

Identificao do MO. Provvel contaminao ou colonizao.

P < 10
5

Identificao do MO. Bacteriria assintomtica. Tratamento prvio com antibiticos.

UFC/mL P P Identificao do MO e antibiograma. A A Identificao do MO e antibiograma. *

Bacteriria sintomtica.

Bacteriria assintomtica (gravidez ou paciente idoso). Contaminao (crescimento de vrias espcies de MO).

> 105 UFC/mL

Identificao do MO e antibiograma. *

Cistite, pielonefrite. Bacteriria sem piria. Bacteriria assintomtica (gravidez ou paciente idoso). Cistite, pielonefrite.

Identificao do MO e antibiograma. *

Identificao do MO e antibiograma. *

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Legenda:

Sintomatologia Leuccitos

P = presena de disria e/ou freqncia urinria A = ausncia de disria e/ou freqncia urinria A = < 10/campo P = 10/campo

MO = microrganismo * = se houver crescimento de mais de uma espcie de MO, considerar a predominante.

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INTESTINAIS
Diversos so os agentes que podem causar doenas diarricas e entre eles as bactrias. As fezes devem ser coletadas no incio da diarria, para a pesquisa do patgeno. As diarrias agudas podem ser divididas em dois grupos: 1) Sanguinolenta. 2) Diarria no sanguinolenta. A diarria sanguinolenta causada por bactrias invasivas e produtoras de citotoxinas que invadem ou destroem as clulas epiteliais do intestino. As evacuaes so sanguinolentas e pouco volumosas. Ao exame microscpico observa-se a presena de muitos leuccitos. A diarria no sanguinolenta causada por bactrias produtoras de enterotoxinas. Estas bactrias aderem mucosa intestinal sem interferir na integridade das clulas epiteliais. As fezes ficam liquefeitas, de volume grande e evacuaes freqentes. H ausncia de leuccitos no exame microscpico das fezes. As bactrias enteropatognicas pesquisadas de rotina em coprocultura so: Salmonella, Shigella e Escherichia coli invasora e Escherichia coli enteropatognica clssica. Outras bactrias como a Yersinia enterocolitica, vibries (Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus e Campylobacter jejuni), Clostridium (Clostridium difficile e Clostridium perfringens) e Staphylococcus aureus so pesquisados somente em situaes especiais e quando solicitado pelo mdico.

Cultura de Fezes 1o dia 1) Semear uma alada de fezes ou swab anal, por estrias superficiais, em meio de Teague ou SS. 2) Semear 3 a 4 aladas das fezes em um caldo de enriquecimento (caldo GN, tetrationato ou selenito) 3) Incubar o Teague e SS (gar Salmonella-Shigella) a 35oC 1oC por 24 horas e caldo de enriquecimento a 35oC 1oC, sendo que o perodo de incubao varia de acordo com o caldo utilizado, sendo respectivamente:

113

GN 4 a 6 horas Selenito 8 a 12 horas Tetrationato 12 a 24 horas O enriquecimento necessrio para recuperao e isolamento da Shigella e Salmonella, pois quando estas bactrias esto presentes em pequena quantidade podem ser prejudicadas pela competio com a microbiota intestinal. 4) Repicar do caldo de enriquecimento para uma placa de SS ou XLD (Xilose, Lisina, Desoxicolato).

2o dia 1) Observar o crescimento nas placas de Teague. Repicar as colnias suspeitas do Teague e SS para os tubos contendo EPM e MILI, conforme esquema abaixo. A inoculao em EPM feita com agulha por picada profunda e, sem recarregar a agulha, fazer estriais superficiais na parte inclinada do meio. O meio de MILI deve ser semeado fazendo-se uma picada central prxima ao fundo do tubo.

Esquema da Inoculao Com Agulha Por Picada Profunda Vista Lateral Vista Anterior

EPM

EPM

114

3o dia 1) Realizar a leitura do EPM/MILI. 2) Se houver suspeita de algum patgeno significativo, realizar provas bioqumicas complementares (se necessrio) e soroaglutinao especfica. 3) Do SS, que veio do enriquecimento, semear as colnias claras no Baracchini. EPM Cor original: verde

Verde acastanhado LTD positivo Bolhas de ar gs positivo

6

Amarelo glicose positivo Azulado uria positiva Preto H2S positivo

MILI Cor original: roxa

Formao de anel vermelho ao adicionar o reativo de Kovacs indol positivo Formao de anel amarelo ao adicionar o reativo de Kovacs indol negativo Turvao ao redor da linha de inoculao motilidade positiva Amarelo lisina negativa Qualquer cor diferente do amarelo lisina positiva

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Enteropatgenos O fluxograma de triagem para enteropatgenos em Coprocultura aps o cultivo em MILI e EPM encontra-se demosntrado na pgina 123.

Teste de Identificao Sorolgica O teste feito por aglutinao rpida em lmina, misturando 1 gota do anti-soro e 1 gota da suspenso bacteriana a identificar. A Salmonella possui antgenos somticos O e antgenos flagelares H. Os antgenos flagelares podem pertencer a fase 1 ou fase 2 (Salmonelas difsicas). Uma primeira orientao obtida com misturas de soros O (polivalentes O) e soros H (polivalentes H), antes de utilizar os soros monoespecficos.

Tcnica 1. Sobre uma lmina colocar uma gota de soro polivalente O e 1 gota de suspenso bacteriana a identificar. 2. Misturar com ala at ficar com aparncia homognea. 3. Com movimentos basculantes contnuos, promover maior contato entre o soro e as bactrias. Caso haja especificidade, ocorre reao Ag-Ac que se manifesta pelo fenmeno da aglutinao. Em seguida repetir a mesma tcnica usando o soro polivalente H. Ambas as aglutinaes, O e H, tm que dar positivas. A aglutinao H forma flocos grandes e frouxos; a aglutinao O forma grumos midos e compactos. Em seguida fazer aglutinao com soros monoespecficos: somticos e flagelares. Iniciar com soros correspondentes s salmonelas que mais comumente se isolam na regio. No nosso meio, a mais freqente a Salmonella typhimurium. Caso haja aglutinao com todos os soros que correspondem frmula antignica de Salmonella typhimurium, fica comprovada a sua identificao.

116

Observao: a identificao sorolgica de todas as salmonelas (mais de 2200 sorotipos) s pode ser feita em Laboratrios de Referncia. Os laboratrios clnicos dispem apenas dos soros das salmonelas mais freqentemente isoladas. Grupo A B Sorotipo S. paratyphi A S. paratyphi B S. schwarzerngrund S. salinatis S. saint-paul S. reading S. kaapstad S. chester S. derby S. agona S. california S. typhimurium S. agama S. bredeney S. oslo S. paratyphi C S. cholerae-suis S. birkenhead S. livingstone S. norvich S. montevideo S. oranienburg S. thompson S. infantis S. inganda S. tennessee S. decatur S. belem S. muechen S. newport S. tokodari S. bonariensis S. lichtfield S. haardt S. kentucky S. eimsbuettel S. sendai S. typhi S. enteritidis S. dublin S. panama S. gallinarum S. butantan S. anatum S. maleagridis S. nchanga Antgeno O 1, 2, 12 1, 4, 5, 12 1, 4, 12, 27 4, 12 1, 4, 5, 12 1, 4, 5, 12 4, 12 1, 4, 5, 12 1, 4, 5, 12 1, 4, 12 4, 12 1, 4, 5, 12 4, 12 1, 4, 12, 27 6, 7 6, 7 (Vi) 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 8 6, 8 6, 8 6, 8 6, 8 6, 8 8 8, 20 6, 7, 14 1, 9, 12 9, 12 (Vi) 1, 9, 12 1, 9, 12 (Vi) 1, 9, 12 1, 9, 12 3, 10 3, 10 3, 10 3, 10 Fase 1 a b d d, e, h e, h e, h e, h e, h f, g f, g, s g, m, t i i l, v a c c c d e, h g, m, p, s m, t k r z10 z29 c c d e, h i i l, v k l d a d g, m g, p l, v b e, h e, h l, w Fase 2 1, 2 1, 7 d, e, n, z15 1, 2 1, 5 1, 7 e, n, x 1, 2 1, 2 1, 6 1, 7 1, 5 1, 5 1, 5 1, 6 1, w 1, 6 1, 5 1, 5 1, 5 1, 5 1, 5 e, n, x 1, 2 1, 2 1, 5 e, n, x 1, 2 1, 5 z6 1, w 1, 5 1, 7 1, 5 1, 5 1, 6 1, w 1, 2

C1

C2

C3 C4 D

117

Shigella Possui 4 espcies, cada espcie com diversos sorotipos. As espcies: Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei A Shigella imvel. caracterizada somente pelo antgeno O ( desprovida de antgenos H e K). Tcnica O teste de aglutinao segue a tcnica anterior. Escherichia coli A principal bactria da microbiota intestinal a Escherichia coli. H 167 sorogrupos e desde 60 existem em humanos: 25 microbiota normal; 35 patognicas. As no patognicas podem causar infeco urinria e meningite. As Escherichia coli patognicas so distribudas em 5 sorogrupos: EPEC enteropatognica clssica ETEC toxignica EIEC invasiva EHEC hemorrgica EAEC aderente EPEC no produz nenhuma toxina, mas destri microvilosidades (adeso-aplainamento) por fmbrias formadoras de feixes, intimina e seu receptor, uma protena translocase. ETEC possui fatores de colonizao (adesinas fimbriais) ligam a bactria a stios esfecificos na superfcie celular dos entercitos. Produzem poderosas enterotoxinas codificadas por plasmdeos LT (termolbil) ou ST (termoestvel). LT atua na adenilato ciclase e a ST na guanilato ciclase (aumenta assim aproduo de fluidos e causa diarria).

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EHEC - Hemorrgica. Produz uma toxina verotoxina (que idntica toxina Shigalike da Shigella). Ela se fixa na mucosa do intestino grosso pelo processo de adeso aplainamento, igual EPEC. A verotoxina atinge as clulas epiteliais e causa diarria. Duas conseqncias so: a colite hemorrgica e a sndrome hemoltica urmica. EIEC se liga especificamente mucosa do intestino grosso utiliza genes associados a plasmdeos, penetram nas clulas do epitlio intestinal por endocitose. No interior das clulas, lisam o vacolo endoctico, multiplicam-se e disseminam-se para as clulas adjacentes, provocando destruio tecidual, inflamao, necrose e ulcerao. Isso faz aparecer sangue e muco nas fezes. EAEC liga-se s clulas na cultura de tecido. Faz que nem tijolo empilhado. Atuam no intestino delgado e fazem diarria persistente, principalmente em crianas. Tem muitas fmbrias que foram transcritas a partir de genes plasmidianos. Produz toxinas termolbeis. * Testes especficos so necessrios para identificar cepas de E. coli patognicas Por fazer parte da microbiota normal intestinal, a bioqumica e a sorologia se fazem necessrias. PCR pode ser utilizada, mas uma tcnica muito cara (diagnstico molecular). * E. coli possui os antgenos O, K e H a partir deles fazemos a diferenciao das cepas de E. coli para fazer a diferenciao de qualquer cepa de Escherichia coli, utilizamos a sorologia por meio desses trs antgenos. Sorogrupos de Escherichia coli associados a infeces humanas

Infeco

Sorogrupo O 26, 55, 86, 111, 114, 119, 125, 126, 128, 142, 158 28, 29, 112, 124, 136,

Observaes EPEC (associados somente com diarria infantil) EIEC (associados com disenteria bacilar) ETEC

Intestinal

143, 144, 152, 164, 167 6, 8, 15, 20, 25, 63, 78, 115, 128, 148 26, 157

EHEC (associados com a colite hemorrgica)

119

Urinria

1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 22, 25, 62, 75 Membros da microbiota normal dos intestinos

Meningite do recm-nascido Bacteremia

1, 6, 7, 16, 18, 83 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 18, 22, 25, 76

A Escherichia coli possui antgenos O, K e H, existem 171 antgenos O, 100 antgenos K e 57 antgenos H. A frmula antignica da Escherichia coli representada por nmeros arbicos colocados aps as letras. Exemplo: O26:K60:H11. Aglutinao: as tcnicas de aglutinao so feitas como nas anteriormente citadas, geralmente aglutinando-se com o soro anti-O. Aps a concluso dos testes, o laboratrio envia ao mdico o resultado. Exemplos conforme o resultado obtido: 1. Coprocultura positiva para Salmonella sp. Ou citar o sorotipo quando efetuadas as tipagens sorolgicas completas. 2. Coprocultura positiva para Shigella flexnerii. 3. Coprocultura positiva para Escherichia coli enteropatognica clssica. 4. Coprocultura negativa para bactrias enteropatognicas (citar as bactrias pesquisadas) Observao final: as provas bioqumicas so insuficientes para a identificao das enterobactrias patognicas. A identificao s completa aps os testes sorolgicos.

Meios de cultura usados nesta prtica Meio SS Seletivo diferencial. SS iniciais de Salmonella e Shigella. Frmula: Lactose: diferencial; Vermelho neutro: indicador de pH; Verde brilhante: seletivo, inibe a maior parte das bactrias Gram positivas; Sais biliares: favorecem a Salmonella, inibem coliformes e Gram positivas; Hipossulfito de sdio: inibe outros Gram negativos;

120

Cloreto frrico; gar simples. O meio SS muito seletivo, a ponto de no ser aconselhado por microbiologistas de renome. formulado para prejudicar a maior parte das Gram negativas, inclusive os coliformes, pelas altas concentraes de sais biliares (8,5 g/L os outros meios tm 1,5 g/L) e altas concentraes de citrato de sdio.
PROCEDIMENTO DE IDENTIFICAO

MEIO DE CULTURA

FINALIDADE DO MEIO Isolamento de enterobactrias. Inibe CGPs. Crescem BGNs somente Isolamento de entero-

ASPECTO DAS COLNIAS SUSPEITAS Lactose negativa (transparente ou sem cor): suspeita de Salmonella spp., Shigella spp. e algumas E. coli invasoras. Lactose positiva (cor de rosa): suspeita de E. coli Transparentes ou roxo claro: suspeita de Salmonella spp. Roxo escuro com brilho metlico: suspeita de E. coli

MC

Rugai e sorotipagem

EBM TEA HHT

bactrias. Inibe CGPs. Crescem BGNs somente Seletivo para Salmonella e Shigella. Contm indicador da produo de H2S (cido sulfdrico) Seletivo para Salmonella spp. Pode inibir Shigella spp. Contm indicador da produo de H2S

Rugai e sorotipagem

Azul ou verde azulado: suspeita de Salmonella spp. (com ou sem centro negro), Shigella spp. Amarela: suspeita de E. coli Rugai e sorotipagem

HE

Incolor (com ou sem centro negro): suspeita de Salmonella spp. Incolor: suspeita de Shigella spp. Colnias negras: suspeita de Salmonella spp. Colnias cor de rosa: suspeita de E. coli Rugai e sorotipagem

SS

Seletivo para VB Salmonella spp.

Vermelha, rosa forte ou translcida circundadas de vermelho: suspeita de Salmonella spp. Amarela: suspeita de Klebsiella spp. Rugai e sorotipagem

Fonte: Opustil et al, 2002

121

EPM (Escola Paulista de Medicina) Este meio trata-se de uma modificao do meio de Rugai e Arajo pela retirada da sacarose e da prova do indol. Neste tubo pode ser lido: Desaminao do Ltriptofano. Fermentao da glicose. Produo de gs pela fermentao da glicose. Produo de H2S. Hidrlise da uria pela enzima urease.

MILI (Motilidade, Indol e Lisina) um meio semi-slido onde pode ser lido: Motilidade. Descarboxilao da lisina. Produo de indol a partir de triptofano.

GN Broth (Bacilo Gram Negativo Caldo) Triptose Dextrose D-manitol Citrato de sdio Desoxicolato de Na Fosfato de potssio Fosfato monopotssico NaCl P/ 1000mL de H2O. 20g 1g 2g 5g 0,5g 4g 1,5g 5g

122

123

MEIO BARACCHINI Este meio permite observar a decomposio de trs acares: glicose, lactose e sacarose, alm da produo ou no de urease, H2S, gs e indol. um meio que promove sete provas bioqumicas em uma s. 1) Extrato de carne 2) Triptose 3) NaCl 4) Tiossulfato de Sdio Composio deste meio de cultura 5) Sulfato Ferroso 6) Glicose, Lactose e Sacarose 7) Uria 8) Vermelho de Fenol 9) Azul de Timol 10) gar

importante estabelecer a proporo de glicose de 1:10 em relao a cada um dos demais carboidratos. O meio slido distribudo para apresentar uma base em coluna alta de aproximadamente 3cm de altura e o pice inclinado do mesmo comprimento que a base, em forma de bisel. As bactrias inoculadas no fundo vo ter uma relativa anaerobiose.

ASPECTO 1. Base amarela, sem gs, com enegrecimento e com o pice vermelho. 2. Base amarela, com gs, com enegrecimento e com o pice vermelho. 3. Base amarela, sem gs e pice vermelho. 4. Base violeta, com ou sem enegrecimento e com o pice violeta. 5. Base amarela, com gs, com ou sem enegrecimento e com o pice amarelo. 6. Base e pice vermelhos. 7. Base amarela, sem gs, pice amarelo ou amarelo avermelhado.

DIAGNSTICO Salmonella typhi Salmonella arizona, Salmonella sp. Citrobacter sp. Shigella sp. Proteus sp. Escherichia sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp. Pseudomonas aeruginosa Bactrias Gram Positivas

124

Resultados Relacionados apenas com a decomposio de acares (no considerando a urase e o H2S), temos trs resultados: CASO 1 CASO 2 Base cida pice cido Fermentadora de lactose e sacarose Inicial pice e base cidos No fermenta lactose Fermenta glicose CASO 3 Posterior Base cida (amarela) pice vermelho

Base alcalina pice alcalino No fermentadora

CASO 1: Quando a bactria incapaz de fermentar qualquer acar testado. A base e o pice conservam a cor vermelha inicial (pH alcalino). CASO 2: Quando a bactria fermentadora de glicose e sacarose ou lactose. H produo de cidos. A base e pice apresentam cor amarela (pH abaixo de 6,0). CASO 3: Ilustra o metabolismo inicial e a transformao posterior definitiva. Inicial: A base e o pice aparecem amarelos indicando acidificao (fermentao de glicose). Posterior: A superfcie do bisel gradualmente volve ao pH alcalino (meio vermelho inicial), ao transformarem aminas a partir da descarboxilao oxidativa do O2 do ar (no fundo do tubo, onde no existe o O2, a decomposio dos peptdeos quase nula). A bactria no fermentadora de lactose e fermentadora de glicose. A glicose em pequenas quantidades nesse meio (1:10) em relao aos outros carboidratos, produz pequenas quantidades de cidos, os quais so facilmente neutralizados pelas aminas alcalinas. Devido maior proporo, a lactose ou a sacarose, se fermentadas, produziriam pequenas quantidades de cidos, e que as aminas formadas no conseguiriam neutralizar.

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FEBRE TIFIDE E PARATIFIDE

A febre entrica adquirida atravs da ingesto de gua ou alimentos contaminados com material fecal. No prazo de 10 ou 14 dias aps a ingesto dos bacilos aparece febre, que aumenta gradualmente, com queixas inespecficas de cefalia, mialgias, mal-estar e anorexia. Estes sintomas persistem por uma semana ou mais e so seguidos de sintomas gastro-intestinais. Agente etiolgico: Febre Tifide Salmonella typhi Salmonella paratyphi A, Salmonella schottmuelleri (antiga Febre Paratifide

Salmonella paratyphi B) e Salmonella hirschfeldii. O diagnstico laboratorial feito por duas provas: 1) Hemocultura diagnstico direto; Reao de Widal (diagnstico indireto). 2) Reao de soro-aglutinao

Perodos da doena e as porcentagens de positividade Primeira semana = hemocultura (80 a 100% de positivo), Widal (10%). Segunda semana = hemocultura (75%), Widal (75%). Terceira semana = Reao de Widal (100%), hemocultura (40%). CORRELAES CLNICAS: Como quase sempre o paciente chega ao servio de sade logo na primeira semana, quase sempre o exame a ser feito a hemocultura. No entanto, pode haver casos isolados e ser a anamnese que nos guiar a qual exame dever ser feito. H quanto tempo o(a) senhor(a) est com essa febre? NA PRIMEIRA SEMANA: FAZER HEMOCULTURA NA SEGUNDA SEMANA: INDIFERENTE NA TERCEIRA SEMANA: FAZER WIDAL

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Incubao

Invaso ativa e Bacteremia

ACME

Fonte: Rubin, 2006

Observao: como nem sempre o paciente sabe especificar o incio da doena, alguns clnicos recomendam realizar ambas as provas simultaneamente, independente do perodo da infeco, para obter maior probabilidade diagnstica.

127

Quarta semana (fase de convalescena) = realiza-se a Coprocultura-Teste de libertao. A coprocultura no tem por objetivo o diagnstico da doena e sim para confirmar o estado de portador, em virtude da infeco crnica da vescula biliar em alguns pacientes. O portador elimina a Salmonella atravs das fezes podendo propagar a doena. Para comprovar que o paciente no alberga a Salmonella preciso fazer trs coproculturas de trs evacuaes consecutivas. As trs devem ser negativas. Muitos livros de microbiologia citam o caso de uma cozinheira americana que trabalhou para oito famlias durante oito anos e foi a fonte de contaminao de sete epidemias de Febre Tifide com mais de duzentos casos. Foi por isso chamada de Mary Typhoid.

Hemocultura o cultivo do sangue do paciente em meios adequados. No caso da Salmonella pode se usar o caldo bileado. O sangue obtido por puno da veia usando seringa e agulha. Extrado o sangue, trocar a agulha e inocular no frasco com meio de cultivo, perfurando a tampa de borracha (o diafragma de borracha, como nos frascos de penicilina). Pode-se usar tambm um sistema fechado, que consiste num frasco com meio de cultura e vcuo. Puncionar a veia com a agulha do prprio sistema e o sangue aspirado diretamente para o frasco. Em ambos os casos, o local da puno deve ser rigorosamente descontaminado. Recomenda-se fazer: 1) Lavagem com sabo medicinal. 2) Enxaguar com gua estril. 3) Aplicar lcool iodado a 1%. 4) Passar lcool 70% para retirar o iodo. Aps a anti-sepsia no palpar a veia com os dedos.

Perodo da coleta Recomenda-se a coleta de sangue imediatamente antes do pico febril, porque o perodo de maior concentrao de bactrias circulantes. Mas como o pico febril geralmente

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no pode ser previsto, aconselhada a coleta de duas amostras com uma hora de diferena. Normalmente recomenda-se colher 2 amostras em crianas, 3 em adultos que no estejam em tratamento e 4 a 6 amostras, na vigncia do tratamento com antibiticos. Nos casos de estado febril agudo em que haja a necessidade de terapia imediata, realizam-se duas coletas, uma em cada brao.

Volume do sangue a cultivar Para hemocultura de adultos, retira-se 10 mL de sangue, visto que o nmero de bactrias circulantes pequeno, de 10 a 20 bactrias por mL. Em crianas de at um ano, colher de 1 a 5 mL. Proporo: semear em meios de cultura guardando a proporo de 1 para 10, a diluio necessria para preservar, in vitro, um microrganismo da ao bactericida do sangue.

Uso de antibiticos Se o paciente estiver usando antibiticos, o fato deve constar na requisio do exame dando o nome do medicamento. Se for penicilina, neutraliza-se a sua ao, acrescentando penicilinase ao meio de cultura (50 u%). Se forem sulfamdicos, acrescentase cido p-amino-benzico (5 mg%). Alguns meios para hemocultura disponveis no comrcio contm anticoagulante polianetol-sulfonato de sdio (PSS) que, alm de evitar a coagulao do sangue, inibe a ao do complemento, lisozima, fagocitose e inativa aminoglicosidios. Observao: quando h suspeita de que a septicemia causada por Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis e Gardnerella vaginalis no se deve usar este anticoagulante, porque ele inibe o crescimento destes agentes. Cultivo Os frascos com o sangue devem ser incubados a 37oC e observados durante vrios dias (para Listeria, at 30 dias). Devido ao pequeno nmero de microrganismos, o

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crescimento lento. O crescimento percebido pela turvao do meio. Nesta ocasio, tirar uma pequena poro da cultura e fazer: Bacterioscopia pelo Gram. Isolamento em placas para caracterizao.

O resultado de Gram enviado ao clnico para orientao preliminar. Por exemplo: Hemocultura positiva para bacilos Gram negativos aps cinco dias de incubao. Caracterizao bioqumica em andamento. Um vez identificada a bactria, manda-se o resultado definitivo ao mdico.

Reao de Widal A Reao de Widal uma soro-aglutinao e pesquisa anticorpos anti-salmonela, no sangue do paciente, dirigida contra os antgenos O e antgenos H. Para que a Reao de Widal tenha valor diagnstico necessrio titular os anticorpos presentes, visto que eles existem em pequenas quantidades em sangue de pessoas normais. Para detalhes tcnicos e interpretao de resultados da Reao de Widal, consultar Microbiologia e Imunologia de Otto Bier, pg. 635 a 642, edio 1990.

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TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBITICOS (TSA)

So

testes

utilizados

para

observar

resistncia

ou

sensibilidade

aos

antimicrobianos de bactrias isoladas de amostras clnicas representativas de um processo infeccioso, cuja sensibilidade no previsvel. 1) Por diluio do antibitico 2) Por difuso do antibitico Diluio O teste da diluio em caldo empregado para determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM) que dada pela quantidade da droga no tubo onde no houver mais crescimento (a quantidade expressa em mcg/mL). Exemplo:

30 mcg/mL

15 mcg/mL

7,5 mcg/mL

3,75 mcg/mL 1,88 mcg/mL 0,94 mcg/mL

Nos tubos so colocadas quantidades conhecidas e decrescentes do antimicrobiano e quantidades fixas de bactrias em todos os tubos. Portanto temos: a) Quantidades variveis do antimicrobiano; b) Quantidades constantes de bactrias. Aps incubao, observar os tubos com crescimento revelado pela turbidez. No exemplo acima houve crescimento nos trs tubos da direita. J o tubo com 7,5 mcg no apresentou turbidez. O CIM deste antibitico = 7,5 mcg/mL. Este mtodo, fornecendo dados quantitativos, sempre usado em situaes onde o mtodo de difuso fornece dados inseguros. Tambm quando os pacientes no respondem

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a uma teraputica aparentemente adequada ou ento que apresentam recidivas no curso do tratamento.

Difuso O segundo mtodo, o Teste de Sensibilidade aos Antibiticos (TSA) ou antibiograma, baseia-se na capacidade, apresentada pelo antibitico, de se difundir no meio de cultura slido. As tcnicas variam, podendo-se usar: comprimidos, escavaes nas quais se coloca o antibitico, mas a mais usada em Laboratrios de Anlises Clnicas a tcnica de difuso do disco (confete) de papel de filtro, embebido em antibitico. o mtodo de Kirby-Bauer que prtico, seguro, barato e de fcil execuo. H vantagem tambm na apresentao do resultado em trs nveis: sensvel, intermedirio (ou pouco sensvel) e resistente, o que permite correlao com os dados de CIM e os nveis antimicrobianos a nvel de sangue e urina, com a dosagem habitual do antibitico prescrito. O mtodo de Kirby-Bauer foi padronizado para patgenos de crescimento rpido, como enterobactrias, Staphylococcus aureus e Pseudomonas. Para outros microrganismos ainda so feitas investigaes para efeito de padronizao. A padronizao requer os seguintes cuidados relacionados aos meios de cultura: 1) pH 7,3 a 7,4. 2) Espessura uniforme de 4 mm com superfcie perfeitamente plana. 3) As placas no devem ter umidade excessiva na superfcie do meio e na tampa. 4) O meio deve ser recente (no ressecado).

Cuidados com o inculo A suspenso bacteriana deve ter turvao idntica ao tubo no 5 do padro de sulfato de brio (escala de Mac Farland 0,5 mL de BaCl 1% + 99,5 mL de H2SO4 a 1%). A variao da concentrao do inculo pode resultar em erros superiores a 50%.

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Cuidados com os discos de papel de filtro 1) Devem ser conservados a 4oC (ou menos), em frascos originais. 2) Antes de usar, retirar da geladeira ou freezer e usar somente quando os frascos atingiram a temperatura ambiente, para evitar gotas de condensao.

1o dia Semeadura em placa 1) Mergulhar um swab estril no inculo a testar. Retirar o excesso do lquido pressionando-o contra a parede interna do tubo. 2) Deslizar o swab sobre a superfcie em todas as direes (semeadura em massa), observando que no fique nem uma rea sem semear.

Aplicao dos discos 1) Com cuidados de assepsia, os discos podem ser aplicados manualmente (com auxlio de pina estril) ou por dispositivos mecnicos simples ou mltiplos. Os discos podem ser individuais ou polidiscos. Os polidiscos so usados em laboratrios de rotina grande.

Ligaes inertes

Discos impregnados A placa de dimetro grande, de 15 cm aproximadamente.

133

H economia de tempo e trabalho visto que se coloca o polidisco de uma s vez. No exemplo acima o polidisco tem 13 antibiticos. No caso dos discos individuais deve se respeitar o espaamento entre eles de 3 cm e 2 cm entre o disco e a borda da placa. No centro da placa colocar os antibiticos com menor poder de difuso: polimixina, bacitracina e vancomicina. Usar um antibitico de cada grupo. So recomendados meios de cultura especiais para antibiticos pouco solveis em gua. 2) Aps colocar o disco, fazer uma presso leve com a pina para deix-lo aderido superfcie do meio. 3) Inverter a placa e incubar a 37oC.

2o dia 1) Observar o crescimento que deve ser semiconfluente. Colnias isoladas, muito separadas, indicam quantidade insuficiente de bactrias. 2) Medir com rgua milimetrada o dimetro da zona de inibio de crescimento ao redor do disco (inclusive o disco). 3) Crescimento de colnias isoladas dentro do halo indica presena de mutantes resistentes ou contaminantes (cultura mista). Observar a variao, na Tabela de Agentes Antimicrobianos Sugeridos para Uso Rotineiro em Antibiograma e Tabela de Interpretao de Dimetro dos Halos de Inibio, do halo de inibio em relao ao antimicrobiano e a bactria testada (as tabelas esto nas pginas seguintes).

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Interpretao do Dimetro dos Halos de Inibio Antimicrobiano Potncia do Dimetro do halo de inibio (mm) Resistente Intermedirio Sensvel disco Amicacina 30 mcg 14 15 16 17 Ampicilina (...) Gram-negativos entricos 10 mcg 11 12 13 14 28 29 (...) Estafilococos 10 mcg (...) Haemophilus sp. 10 mcg 19 30 (...) Enterococo 10 mcg 16 19 (...) Estreptococo (S. bovis) 10 mcg 21 22 29 30 (...) Listeria monocytogenes 10 mcg 19 20 Carbecilina 100 mcg 14 16 (...) Pseudomonas 13 17 17 18 22 23 (...) Gram-negativos entricos Cefotaxima 30 mcg 14 15 22 23 15 17 Cefoxitina 30 mcg 14 18 14 15 17 18 Ceftazidima 30 mcg Ceftriaxona 30 mcg 13 14 20 21 15 17 Cefalotina 30 mcg 14 18 13 17 12 18 Cloranfenicol 30 mcg 14 15 20 21 Clindamicina ou Lincomicina 2 mcg 13 14 22 23 Eritromicina 15 mcg 14 22 Fosfomicina 50 mcg 13 17 12 13 14 15 Gentamicina 10 mcg 14 15 13 16 Imipenem 10 mcg 12 13 14 15 Metilmicina 30 mcg Oxacilina 10 11 12 13 (...) Estafilococos 1 mcg (...) Pneumococos quando 1 mcg 19 20 sensveis penicilina G Penicilina G (...) Estafilococos 10 unidades 28 29 (...) N. gonorrhoae 10 unidades 19 20 (...) Enterococos (E. faecalis) 10 unidades 14 15 (...) L. monocytogenes 10 unidades 19 20 (...) S. bovis 10 unidades 19 20 27 28 Rifampicina 30 mcg 16 17 19 20 Tetraciclina 30 mcg 14 15 18 19 Tobramicina 10 mcg 12 13 14 15 Trimetoprim / sulfametoxazol 1,25/23,75 mcg 10 11 15 20 Vancomicina 30 mcg 9 10 11 28 Antimicrobianos especficos para infeces urinrias cido pipemdico 20 mcg 13 14 18 19 cido nalidixo 30 mcg 13 14 18 19 Nitrofurantona 300 mcg 14 15 16 17 12 13 16 17 Norfloxacina 10 mcg Sulmamdicos 250 a 300 mcg 12 13 16 17 Drogas para Germes Urinrios

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CAPTULO 11: 11: DOENAS SEXUALMENTE TRASMISSVEIS

PRINCIPAIS AGENTES ETIOLGICOS: Cancro mole/cancride Gonorria Haemophilus ducreyi Clamydia trachomatis

Neisseria gonorrhoeae

Linfogranuloma venreo (LGV) Sfilis Outras: Treponema pallidum vaginallis,

Gardnerella

Mycoplasma

hominis,

Ureoplasma

urealyticum,

Calymmatobacterium granulomatis, Candida albicans, Herpes vrus e o protozorio flagelado Trichomonas vaginalis, o qual vocs vero com detalhes na Parasitologia Mdica (BP331).

Atualmente o nmero de doenas transmitidas pelo contato sexual aumentou (ver tabela). H as que so causadas por vrus: Herpes, hepatites, AIDS. Infeces por bactrias: Salmonella, Shigella, Campylobacter. A Entamoeba histolytica, Giardia e Enterobius so transmitidos aps o contato bucolingual-anal. O aumento das DST foi devido a mudanas do comportamento sexual, ligado a diversos fatores, entre os quais: Maior liberdade sexual. Incio precoce da atividade sexual. Multiplicidade de parceiros. Maior expresso social feminina

Doenas infecciosas e infestaes transmitidas por contato sexual Tipo de Agente Agente Especfico Doena ou Sndrome Citomegalovrus Citomegalovirose Vrus da hepatite A Hepatite A Vrus da hepatite B Hepatite B Vrus do herpes simples tipo 2 Herpes simples genital Vrus Vrus da imunodeficincia AIDS humana Vrus do molusco contagioso Molusco contagioso Vrus do papiloma genital Condiloma acuminado

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Calymmatobacterium granulomatis Campylobacter sp. Chlamydia trachomatis

Granuloma inguinal ou donovanose Enterite e enterocolite Uretrite, epidimite, proctite e linfogranuloma venreo (no sexo masculino). Cervicite, endometrite, salpingite, bartolinite, sndrome uretral, proctite, peri-hepatite e linfogranuloma venreo (no sexo feminino) Vaginite Cancro mole ou cancride Salpingite, febre ps-abortamento, febre puerperal e pielonefrite Gonorria (uretrite e outras sndromes) Salmonelose Shigelose Sfilis Uretrite, uretroprostatite e corioamnionite Vulvovaginite e balanopostite Amebase intestinal Giardase Vulvovaginite e uretrite Enterobase Ptirase ou pediculose pubiana Escabiose

Bactrias

Gardnerella vaginalis Hemophilus ducreyi Mycoplasma hominis Neisseria gonorrhoeae Salmonella sp. Shigella sp. Treponema pallidum Ureaplasma urealyticum

Fungo Protozorios Helmintos Artrpodes

Candida albicans Entamoeba histolytica Giardia lamblia Trichomonas vaginalis Enterobius vermicularis Phthirus pubis Sarcoptes scabiei

SFILIS
Sfilis ou lues causada por Treponema pallidum, geralmente, transmitida sexualmente ou em relaes muito ntimas. Mais raramente pode ser adquirida por transfuso de sangue, acidentes de laboratrio ou por via placentria. O treponema penetra atravs de mucosas ntegras ou em efraes da pele. A umidade favorece a instalao. A sfilis uma doena de evoluo lenta e pode ser dividida em quatro fases:

Fase da Doena 1 Sfilis Primria 2 Sfilis Secundria 3 Sfilis Latente 4 Sfilis Terciria Cancro duro Rosolas

Caracterizao

Sem sintomas ou sinais Sfilis cardiovascular ou neurossfilis (demncia)

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1. Sfilis Primria Aparece de 2 a 6 semanas aps o contgio e se manifesta com o aparecimento de uma leso chamada cancro duro ou protosifiloma. uma leso de 1 a 2 cm de dimetro, geralmente circular e nica, bordas endurecidas (da o nome) e elevadas, indolor e de fundo liso com cor avermelhada. Cobre-se facilmente com secreo purulenta devido infeco por contaminantes. As localizaes mais freqentes so: pnis, vulva, parede vaginal, canal endocervical e em menor freqncia no nus, reto e na cavidade oral (faringe e tonsilas). O cancro duro cura espontaneamente ao fim de 1 a 3 meses.

Fonte: Netter, 2006

Fonte: Rubin, 2006

2. Sfilis Secundria O Treponema pallidum dissemina-se a partir da leso inicial e pode acometer vrios rgos e tecidos. Na pele aparecem manchas eritematosas chamadas rosolas sifilticas (principalmente no tronco). Na mucosa bucal a leso tem semelhana com a afta e rica em treponemas. Podem aparecer leses nas amgdalas, mucosa retal, vulva, prepcio e reao

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ganglionar. Alm destas leses, pode haver envolvimento de rgos internos (nefrite, hepatite, meningite, etc.). Em pacientes no tratados, as leses e os sintomas desaparecem aps 1 a 3 meses.

Fonte: Mims, 2005

3. Sfilis Latente Segue-se a sfilis latente que assintomtica, apenas revelada em provas sorolgicas. Esta fase pode durar de 1 a 30 anos. 4. Sfilis Terciria quando o carter de infeco j neurolgico e cardiovascular. Pode ocorrer aortite sifiltica, que um tipo de endarterite obliterante dos vasa vasorum (os microvasos que nutrem os leiomicitos da tnica mdia dos grandes vasos, como foi visto em Histologia I), pode ocorrer um aneurisma sifiltico e outras leses que sero discutidas na disciplina de Anatomia Patolgica (MP313). Alm disso, pode ocorrer neurossfilis lesando meninges, crtex cerebral, medula e pares cranianos, e a sfilis terciria benigna (surgimento de uma goma em qualquer rgo). 5. Sfilis congnita quando a sfilis transmitida intra utero, da me infectada para o feto, com disseminao nos tecidos fetais, havendo proliferao e posterior resposta inflamatria. Pode se apresentar de maneira assintomtica, ou sintomas inespecficos como rinite. Em alguns casos d-se origem trade de Hutchinson, que um diagnstico patognomnico da sfilis congnita.

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Trade de Hutchinson - queratite parenquimatosa com conseqente cegueira - hipocusia (surdez) vestibular (labirntica) - dentes ebtalhados semi lunarmente (o destista pode fazer o diagnstico)

Resumo:

Fonte: Rubin, 2006

Fonte: Robbins, 2005

Diagnstico Laboratorial O diagnstico laboratorial depende da fase da doena:

Sfilis Primria

Diagnstico direto bacterioscopia para revelar a presena do agente causador.

Secundria Sfilis Latente Terciria

Diagnstico

indireto

pela

pesquisa

de

anticorpos no sangue do paciente, atravs de provas sorolgicas.

Observao: em certas ocasies, os clnicos requisitam bacterioscopia de leses secundrias de sfilis, principalmente de mucosas e em material ganglionar. Como tambm alguns solicitam exame sorolgico em sfilis primria, visto que esta fase pode durar at 3 meses e j aps a segunda semana comeam a surgir anticorpos especficos.

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Coleta do material para bacterioscopia 1. Limpar a superfcie da leso com gaze embebida em soluo salina estril, para remover os contaminantes. 2. Secar com gaze estril. 3. Fazer presso leve na base endurecida e coletar a serosidade que poreja da leso, utilizando ala metlica, tubo capilar ou fazendo um imprint com a prpria lmina. A bacterioscopia pode ser feita por diversos mtodos:

a. Campo escuro (95% de positividade); b. Colorao negativa; c. Fontana-Tribondeau; d. Imunofluorescncia direta.

Campo escuro o mtodo de escolha, de grande sensibilidade e uma positividade ao redor de 95%. Tcnica Imediatamente aps coletar a serosidade, cobrir com lamnula e observar. Os treponemas medem de 6 a 10 m de comprimento e 0,2 m de espessura, apresentam espiras apertadas, regulares e numerosas (de 10 a 14). Em campo escuro aparecem apresentando grande mobilidade. Deve-se ter o cuidado de no confundir com outro espiroqueta, o Treponema refringens, habitante freqente da genitlia. Encontrado em leses sifilticas secundariamente infectadas e tambm em leses genitais no luticas. Com experincia percebem-se logo as diferenas: o Treponema refringens mais refringente (da o nome), mais calibroso, tem espiras mais abertas e menos numerosas. Em leses bucais, as formas espiraladas, como o Treponema microdentium, de morfologia muito semelhante ao Treponema pallidum pode ocasionar resultados falso-positivos. O uso de drogas antitreponmicas locais ou sistmicas ou o material coletado em leses antigas, podem dar resultados falso-negativos.

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Tcnica de Fontana-Tribondeau Apesar de menos sensvel e mais trabalhoso que a pesquisa direta em campo escuro, o mtodo de Fontana usado principalmente em laboratrios clnicos de pequeno porte que no dispem de microscpios de campo escuro. Observao: no se usa o Gram para evidenciar o Treponema pallidum por trs motivos: 1. Cora-se mal pelos corantes de anilina, devido a composio em lipdios. 2. Mesmo se corasse, no seria observado, pois seu calibre de 0,2 m, limite de visibilidade em MO. 3. muito frgil e no suportaria a fixao pelo calor usado no Gram. Imunofluorescncia Direta Na imunofluorescncia direta so usados anticorpos especficos conjugados com fluorescena. H formao de reao Ag-Ac, Ag (bactria) com anticorpo correspondente e o Treponema aparece fluorescente, quando observado ao microscpio de luz ultravileta. Reaes Sorolgicas A partir da fase secundria da sfilis, so feitos exames sorolgicos. O material o sangue do paciente. Aps a assepsia do local, coletar o sangue e deixar coagular. O soro sobrenadante submetido a diversos exames, visando encontrar anticorpos contra o treponema. O sorodiagnstico feito por dois tipos de reao: 1. Reaes com antgenos no-treponmicos; 2. Reaes com antgenos treponmicos. 1. O antgeno no treponmico a cardiolipina extrada de corao bovino. usado nas reaes de floculao: Kahn, Kline, VDRL e outras. usado tambm em reao de Wassermann, por Fixao de Complemento. Observao: os clnicos costumam solicitar a pesquisa de anticorpos sifilticos atravs de: Soro Lues. Neste caso o laboratrio clnico s far: Kahn, Kline e VDRL. Caso haja interesse em outros mtodos, deve constar na requisio. 2. O antgeno treponmico usado em vrias reaes, entre elas: TPI: Treponema pallidum Immobilization;

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FTA: Fluorescent Treponema Antibody. FTA-ABS: Fluorescent Treponema Antibody Absorved Test

Fonte: Mims, 2005

O TPI muito especfico, apresentando reao cruzada apenas com o Treponema pertenue (bouba) e Treponema carateum (pinta). Mas no muito utilizado em laboratrios clnicos por ser caro e de difcil execuo. H necessidade de manter o Treponema pallidum suficientemente patognico em inoculao em coelhos, que devem ser mantidos no biotrio em temperaturas prximas de 18oC. Atualmente cada vez mais usado em laboratrios clnicos o FTA-ABS, que de fcil execuo e de grande sensibilidade e especificidade, uma vez que o soro suspeito absorvido com antgenos de treponemas no patognicos (Treponema de Reiter). O Treponema pallidum e o Treponema reiterii tm antgenos em comum e geram a formao de anticorpos comuns. Mas cada um deles tem antgenos prprios. Absorvidos os anticorpos comuns, ficam somente aqueles do Treponema pallidum. O FTA-ABS consiste em dois sistemas Ag-Ac.

Treponema pallidum x Anticorpo

Anticorpo (gamaglobulina) x Soro antiglobulina humana (conjugado com fluorescena)

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Tcnica 1. Sobre uma lmina preparada com Treponema pallidum fixado colocado o soro suspeito absorvido. 2. Colocar o complexo soro antigamaglobulina humana + fluorescena. Caso haja anticorpos anti-sifilticos, a antigamaglobulina reagir com ele. Levada ao microscpio de luz U.V. aparecero os treponemas fluorescentes em caso positivo. Observao: o treponema pallidum no se cultiva em meios bacteriolgicos artificiais e nem em cultura de clulas. Soro suspeito com Ac

Treponema pallidum

Antigamablobulina com fluorescena

GONORRIA

Gonorria ou blenorragia causada pela Neisseria gonorrhoeae. A Neisseria um diplococo Gram negativo justaposto pela face plana ou cncava em forma de gro de caf ou dois rins justapostos. Fica alojado dentro de neutrfilos em secreo (ela consegue entrar no PMN graas protena Rmp). de transmisso pela relao sexual. Acontece com maior freqncia nos adolescentes e adultos jovens. A gonorria normalmente sintomtica em homens e geralmente assintomtica em mulheres. As infeces do trato genital, anal, do reto e da faringe atuam como fontes na propagao do gonococo. A manifestao na orofaringe aparece em indivduos que praticam sexo oral sem preservativo. Os recm nascidos podem ser contaminados durante o parto ao atravessarem o canal vaginal, e apresentar infeco ocular gonoccica, chamada oftalmia do neonato.

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Transmisso No-sexual

a) Oftalmia neonatal b) Vulvovaginite em crianas a) Cistite b) Pielite

Gonococo mucosas

Homens (uretrite)

c) Proctite d) Orquite e) Epididimite

Transmisso Sexual Mulheres (cervicite)

a) Salpingite: podendo esterilizar b) Metrite: podendo disseminar, causando peritonite ou proctite

Quadro clnico As manifestaes ocorrem aps 2 a 5 dias do contgio. Nos homens aparece fluxo mucoporulento uretral abundante. Nas mulheres somente 10 a 20% apresentam quadro clnico agudo, podendo aparecer vulvovaginite com secreo purulenta e abundante. Geralmente os casos so de endocervicite. Se a gonorria no for tratada nas 2 semanas iniciais, haver propagao da infeco em 50% dos casos masculinos, para glndulas anexas causando epididimite, orquite, e a mais freqente a prostatite. Em mulheres a propagao resultar em metrite e salpingite. Podem ocorrer manifestaes extragenitais como anorretite, artrite, meningite e endocardite.

Fonte: Netter, 2006

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Diagnstico laboratorial: Bacterioscopia e Cultura Coleta do material Em homens: O melhor material a secreo uretral. A coleta deve ser feita pela manh, antes da primeira mico: 1. Limpar a secreo externa com gaze estril embebida em salina. 2. Enxugar. 3. Introduzir um swab fino, 2 cm no canal uretral aps a fossa navicular e absorver a secreo. Observao: pode-se coletar outros materiais como: urina (1o jato miccional), esperma e lquido prosttico. Em mulheres: Dar preferncia secreo do canal endocervical. 1. Aps introduzir o especulo, limpar com gaze estril a secreo da vagina e do colo do tero. 2. Introduzir o swab no canal endocervical e absorver a secreo. 3. Retirar o swab com cuidado para no contaminar com bactrias da vagina. Bacterioscopia pelo Gram Tem valor diagnstico somente em uretrites gonoccicas masculinas e nas vulvovaginites agudas. Em todos os outros casos necessrio fazer a cultura de bactrias. Na bacterioscopia aparecero os gonococos na forma de diplococos Gram negativos, intra e extracelulares.

Fonte: Tortora, 2005

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Cultivo O cultivo feito de preferncia no meio de cultura de Thayer-Martin Modificado (TMM), que um gar chocolate acrescido de antibiticos: vancomicina, colistina, nistatina e trimetoprim. Pode ser utilizado o gar chocolate tambm. Tcnica (recomendada pelo Ministrio da Sade/PN-DST-AIDS) e seguida pelo Lacen: 1. Estriar o meio em forma de Z rolando o swab suavemente sobre a superfcie. 2. Com ala de platina fazer estrias em sentido transversal ao Z. 3. Colocar uma tampa para baixo em uma lata que possa ser fechada hermeticamente (lata de biscoitos). 4. No fundo da lata colocar uma mexa de algodo embebido em gua para preservar a umidade deste ambiente. 5. No fundo da lata ou sobre a placa, colocar uma vela e acend-la. 6. Fechar a tampa e segurar. 7. A vela apaga quando o O2 fica exaurido, deixando uma atmosfera de aproximadamente 5 a 10% de CO2, prpria para a proliferao do gonococo. 8. Incubar com a lata em estufa a 35oC durante 48h. O TMM especfico para cultura de gonococo. Aps a incubao examinar as colnias: gonococo cresce dando colnias brilhantes, mucides e acinzentadas de tamanho varivel. Fazer bacterioscopia pelo Gram: aps a cultura aparecero as formas de autlise: os gonococos vo aparecer em formas atpicas como cocos intumescidos com fraco contorno e palidamente coradas. A seguir realizar provas bioqumicas.

Liberao de Laudo Negativo: no foram encontrados diplococos Gram negativos no exame

bacterioscpico. Cultura: no houve crescimento de Neisseria gonorrhoeae em meio de Thayer-Martin aps 48h de incubao. Positivo: presena de numerosos (ou vrios, ou alguns, ou raros) diplococos Gram negativos intra e/ou extracelulares. Polimorfonucleares acima de 30 por campo; ou de 20 a 25 p/c; 5 a 10 p/c; abaixo de 5 p/c. Cultura: positiva para Neisseria gonorrhoeae.

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URETRITES NO GONOCCICAS
As uretrites no gonoccicas so causadas por Chlamydia trachomatis, Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealiticum, outras bactrias, protozorios e vrus. No ser humano a uretrite por Chlamydia a infeco mais comum. LGV (Linfogranuloma Venreo) Agente etiolgico: Clamydia trachomatis Ocorre mais em homens. Infeco sistmica acometendo tecido linftico. Primeiro forma-se uma ulcerao local formada por uma ppula ulcerada no local da inoculao. Pode haver febre, cefalia e mialgia. A Clamydia se oculta, mas forma infeces em linfonodos inguinais, causando edema. A partir da circulao linftica, ela pode se disseminar para outros rgos. Pode fazer hepatite, proctite (inflamao no nus), pneumonite, meningoencafalite, etc. Por via inguinal pode causar uretrite, epididimite, ccervicite (do crvix na mulher), bartolinite (uma inflamao nas glndulas de Barthollini, que fazem lubrificao na vagina), salpingite (salpingite de tubas UTERINAS, no tubas auditivas, salpingus vem de tuba) 15-20% dos pacientes que tem gonorria, tm a Clamydia tambm. a maior causa de uretrite no gonocccica. Lembrando que clamdias so intracelulares obrigatrias, portanto, temos que coletar a clula, no s a secreo. Tanto que se acreditava que as clamdias eram, na verdade, vrus. Para cultiv-las precisamos utilizar meios de cultura que tenham clulas eucariticas. As leses iniciais so mais freqentes em sulco blano prepucial e face interna dos pequenos lbios. Faz adenopatia inguinal unilateral. Abscessos (pontos de flutuao) fistulizam e disseminam para o resto do organismo via linftica. H material purulento espesso. No confundir com Dovanose (granuloma inguinal) causada pelo Calymmatobacterium granulomatis

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Fonte: Netter, 2006

Fonte: Mims, 2005

H 3 fases: Primria: Ppulas nos rgos genitais Secundria: Manifestaes sistmicas Terciria: Fibrose, drenagem linftica inapropriada. Alguns pesquisadores (Belle Grayston, 1986) afirmam que no sexo masculino, a uretrite por Chlamydia e 2,5 vezes mais freqente do que a uretrite gonoccica. Outros dados mais recentes apresentam a Chlamydia como responsvel por 50% das uretrites. Nos homens a uretrite por clamdia apresenta quadro clnico semelhante uretrite gonoccica, embora a secreo uretral seja mais moderada ou escassa e menos purulenta, sendo mais aquosa ou mucide. O perodo de incubao de duas a trs semanas, enquanto o do gonococo de 2 a 7 dias. As complicaes podem aparecer em tempo varivel, podendo ser graves. A mais importante no homem quando acomete a prstata e s vezes as vesculas seminais, levando infertilidade. Nas mulheres pode infectar tero, trompa e ovrios. As clamdias so organismos cocides, imveis, sendo parasitas intracelulares obrigatrios. Duplicam-se no citoplasma das clulas do hospedeiro, formando incluses caractersticas. Estas incluses podem ser observadas ao microscpio, utilizando colorao de Giemsa ou usando anticorpos especficos conjugados com fluorescena. Devido o seu parasitismo obrigatrio, no possvel cultiv-la em meios artificiais. S se cultivam em sistemas vivos: saco vitelino de ovos embrionados, cultura de tecidos, mas as mais usadas so as clulas Hela e clulas McCoy.

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CANCRO MOLE (CANCRIDE)

Agente etiolgico: Haemophilus ducreyi Meio de cultura: gar chocolate em microaerofilia, para a cultura feito o esfregao das clulas e/ou aspirado de linfonodos (onde o Haemophilus pode se alojar). Manifestam-se como lceras genitais DOLOROSAS. (o cancro da sfilis NO doloroso)

Fonte: Netter, 2006

Fonte: Google Imagens

VAGINOSE BACTERIANA
Esta doena, tambm conhecida como vaginite anaerbia, ainda no foi claramente definida. A sintomatologia tpica queixa de mau odor, muitas vezes associado ao aumento do fluido vaginal, freqentemente mais notado aps a menstruao ou coito. s vezes a paciente pode se queixar de prurido vulvar ou erupo perivulvar. O pH vaginal geralmente maior que 4,5. O principal agente etiolgico envolvido a Gardnerella vaginalis. Uma das caractersticas marcantes da secreo de vaginose bacteriana microscopia ptica a presena de clue cells (clulas epiteliais da vagina cobertas de bactrias).

Clue-cells

Fonte: Google Imagens

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Exame laboratorial A microscopia do exsudato vaginal pelo Gram, mostra clulas-chave (clulas epiteliais cobertas por um grande nmero de cocobacilos Gram-variveis) com pequeno nmero de leuccitos polimorfonucleares e nmero diminudo de lactobacilos. A cultura no muito utilizada. Patogenicidade A patogenicidade da Gardnerella vaginalis ainda no foi estabelecida. considerada por alguns pesquisadores como resultado do desequilbrio entre a microbiota vaginal normal, com a relao sinrgica entre o nmero aumentado de Gardnerella e anaerbios. O microrganismo raramente encontrado em homens.

CANDIDASE
A infeco por Candida albicans a infeco fngica mais comum na prtica genitourinria. A candidase pode ser transmitida ou exacerbada pela relao sexual, mas a maioria das infeces (particularmente em mulheres) resultam de auto-inoculao do reto. Os sintomas podem ser causados por hipersensibilidade ou infeco. No primeiro caso as manifestaes microbiolgicas so negativas. Na prtica mdica a doena pode se manifestar com sintomas em apenas um dos parceiros, mas essencial examinar e tratar o parceiro assintomtico para reduzir a chance de reinfeco. Mais detalhes: ver pginas 189 a 192.

Exame laboratorial O exame laboratorial feito pela demonstrao do agente causador por microscopia pelo Gram ou Preparao a Fresco. A cultura pode ser feita no Meio de Sabouraud.

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CAPTULO 12: 12: MICOBACTERIOSES

Micobactrias so assim classificadas por terem sua parede celular diferente das demais bactrias. So bacilos retos ou um pouco curvados, imveis e dispostos na forma de paliada ou de globias. Sua classificao de bacilo pela forma e micobactria pela bioqumica da parede. O micolato o principal componente da parede celular, a qual denominada de "cerosa" pelo Robbins. Esse nion quem d a esses microrganismos a caracterstica de Bacilos lcool-cido Resistentes (BAAR). Ou seja, no se coram facilmente pelo Gram, uma vez que eles retm os corantes quando tratados com lcool e cido, tornandos-os fracamente positivos neste mtodo. Principais espcies de interesse mdico: Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae Outras espcies: Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium, etc.

TUBERCULOSE (TB)
A tuberculose uma doena extremamente contagiosa. Causa grande mortalidade no mundo inteiro, como trs milhes por ano. Registram-se atualmente cerca de 5 milhes de casos, sendo que este nmero tem crescido. A tuberculose um grave problema de

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sade pblica, visto que cada tuberculoso pode disseminar o bacilo no convvio familiar e social. Apesar de se conhecer o agente causador, a maneira de transmisso e o tratamento adequado, a tuberculose um problema preocupante. A tuberculose humana causada tambm pelo Mycobacterium bovis e outras espcies (ver tabela). Espcies de micobactrias de maior significado clnico Espcie M. ulcerans M. tuberculosis M. bovis M. marinum M. kansasii M. scrofulaceum M. xenopi M. avium M. intracellulare M. fortuitum M. smegmatis Transmisso: doena inflamatria infecciosa, de carter contagioso, que evolui por surtos, sendo o acometimento pulmonar a maior causa de morbidade e mortalidade . Contgio: aquisio de bacilos atravs do contato direto com os portadores da doena (perdigotos), atravs do uso de utenslios contaminados (fmites), tambm atravs de permanncia contnua e prolongada em meio ambiente contaminado. Aerossis respiratrios so a principal forma de disseminao, pois ela uma bactria aerbia e tem tropismo por alvolos. Desta forma, as pessoas cujo escarro possui BAARs visveis microscopia so consideradas portadoras da micobactria. Fatores predisponentes: doenas ou condies debilitantes. Essas pessoas so enquadradas dentro de grupos de risco: marginalizados, txico-dependentes, idosos, HIV+, transplantados, portadores de IRC, cncer, etilistas, diabticos, portadores de neoplasias, grupos socialmente desfavorecidos, desnutridos e emigrantes. H a TB gastrointestinal (Mycobacterium bovis), a aquisio do bacilo se faz pela ingesto de leite no-pasteurizado. IV (rpidos crescedores) Geralmente no-patognicas III (no-cromgenas) Geralmente patognicas II (escotocromgenas) Geralmente patognicas I (fotocromgenas) Geralmente patognicas Grupos de Runyon Significado clnico Sempre patognicas

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Fisiopatologia: Inalao do BAAR via aerossis ainda no tem resistncia). As micobactrias so fagocitadas pelos macrfagos alveolares.
Fonte: Fernando Bortolozzi Fonte: Netter, 2005 (Fisiologia)

alvolo

Primeiras semanas: a infeco primria ocorre no pulmo (lembre-se de que o hospedeiro

Macrfago alveolar Dentro dos macrfagos, os BAAR tm dois destinos: 1) Serem mortos e eliminados. 2) Continuarem resistentes e fazerem lise dos macrfagos. Os macrfagos liberam quimiocinas e fazem quimiotaxia de neutrfilos e moncitos circulantes (circulo vicioso). O Mycobacterium tuberculosis possui uma cpsula de composio lipoprotica que interfere na fuso deste microrganismo com os fagolisossomos dos macrfagos alveolares. Isso possibilita a sobrevida dos BAAR no interior destas clulas, se no houver o correto direcionamento da ao enzimtica dos macrfagos pelas linfocinas. As quimiciocinas se ligam na -hlice dos receptores transmembrnicos dos moncitos e neutrfilos. Isso ativa a cascata das integrinas e provocam alteraes no citoesqueleto, promovendo a migrao destas clulas para os tecidos.

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H Reao de Hipersensibilidade tipo IV (Tardia) formam o ganuloma (um tipo de inflamao crnica).

macrfagos cercam o bacilo e A Imunologia Mdica (BP336)

explicar os mecanismos imunolgicos da hipersensibilidade e a Patologia Mdica Molecular (BP337) mostra os mecanismos deste tipo de inflamao crnica. Tentemos entender: de um lado os macrfagos ativados esto tentando conter a infeco e do outro eles provocam dano tecidual nos rgos infectados (liberam EROs). EROs uma sigla que quer dizer espcies reativas de oxignio. So radicais livres. Geralmente so produzidos dentro de fagcitos como neutrfilos e macrfagos. Essas clulas os produzem no intuito de dar cabo das bactrias patognicas. Nos pulmes, esse processo leva a cavitaes e a disseminao de bactrias. Posteriormente h fibrose extensa e isso pode ser demonstrado em radiografias do trax. (Aspecto radiogrfico tpico da tuberculose, o pulmo "em cavernas" na radiografia que ser visto nas aulas de propedutica). O Mycobacterium tuberculosis promove a formao de um granuloma "imunolgico" (o termo imunolgico utilizado pela presena de linfcitos na leso). Clulas gigantes e clulas epiteliides so os tipos celulares mais comuns encontrados nesses granulomas. As mononucleadas, porm aumentadas so as epiteliides. Elas so derivadas de macrfagos ativados pelas citocinas. Estas clulas secretam continuamente TNF, fazendo com que o processo inflamatrio continue. As clulas polinucleadas so as clulas gigantes do tipo Langerhans (originadas pela fuso de vrios macrfagos). Clula gigante tpica de granulomas

Fonte: Junqueira, 2004 (Histologia Bsica)

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O Granuloma

Granuloma um tipo de inflamao crnica, que tenta conter a propagao de algo que o organismo no conseguiu dar cabo. Tambm o padro da resposta de hiperssensibilidade tipo IV. Esse tipo de resposta imune ser abordado nas aulas de Imunologia Mdica (BP336), bem como na aula terica da Microbiologia Mdica.

A Histologia de um Granuloma Tuberculoso Uma rea central de necrose caseosa (ncleo semi-slido macio), circundada por uma outra rea cheia de macrfagos, clulas epiteliides e clulas gigantes. Adjacente a essa coroa existe uma bainha de linfcitos T e mais externamente uma deposio fibrosa, com fibroblastos e formao de colgeno tipo I (est comeando a ser formada a trplice hlice do pr-colgeno. Uma vez empacotado pelo complexo de Golgi, esse colgeno fica mais denso e delimita os granulomas). Se a pessoa infectada for incapaz de produzir uma resposta imunolgica adequada, o granuloma bem menos organizado e pode consistir apenas em um agregado de macrfagos, sem arquitetura clssica das clulas gigantes. Ou seja, a anatomia patolgica pode sugerir por si s um quadro de imunocomprometimento (suspeitar de HIV e correlacionar sempre com a histria clnica do paciente).

Histologia do granuloma

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Necrose caseosa: a rea central necrosada adquire um aspecto de queijo branco (do latim caseum). Necrose a morte celular forada, quando a clula atinge o ponto de no-retorno. Quando uma clula no tem mais suprimento de O2, alimento, eletrlitos, substratos, etc. Isso ocorre nas isquemias prolongas, por exemplo. Isquemia o bloqueio na conduo do sangue para uma certa regio do corpo. Como no h suprimento sanguneo, tambm no haver mais oxignio nem suprimento para as clulas. Granulomas microscopia ptica (isso ser visto com detalhes na Anatomia Patolgica)
Fonte: Bogliolo, 2006 Fonte: Rubin, 2006

Complexo de Ghon Complexo de Ghon um nome que damos a um quadro na TB. E isso explica o porqu da imunidade na tuberculose do tipo celular. A prpria formao do granuloma explica que a imunidade celular.

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As clulas T sensibilizadas liberam linfocinas (linfocina uma citocina que recebe esse nome porque veio do linfcito). Na verdade o prprio granuloma explica isso, uma vez que o organismo no consegue dar conta de matar o BAAR. Resumo: Complexo de Ghon = granulomas no pulmo + linfonodos hilares e mediastnicos comprometidos.

Complexo de Ghon Formas clnicas: Tuberculose Primria: Complexo de Ghon Tuberculose Primria progressiva: Uma pequena poro de microrganismos fica vivel por anos. A tuberculose pulmonar primria progressiva uma evoluo alternativa menos comum, na qual a resposta imunolgica no consegue controlar a multiplicao dos BAAR da tuberculose. A infeco toma esse curso em menos de 10% dos adultos normais, mas comum nas crianas com menos de 5 anos de idade e em pacientes com imunidade suprimida ou prejudicada. O foco de Ghon no pulmo aumenta e pode mesmo erodir dentro da rvore brnquica. Os linfonodos hilares e mediastnicos acometidos tambm aumentam, s vezes comprimindo os brnquios a ponto de produzir atelectasias do pulmo distal; o colabamento do lobo mdio ("sndrome do lobo mdio") uma conseqncia comum dessa compresso.

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Em alguns casos, os linfonodos infectados erodem em uma via respiratria, disseminando microrganismo pelos pulmes (pneumonia tuberculosa).

Tuberculose Secundria: Esse estgio quando h reativao da TB pulmonar primria ou uma nova infeco em hospedeiro previamente sensibilizado por TB primria. Ocorre uma resposta imune celular aps um intervalo latente e essa resposta provoca a formao de muitos granulomas e necrose tissular extensa. Os segmentos apical e posterior dos lobos superiores so mais comumente acometidos. Desenvolve-se uma leso mal definida, fibrtica e difusa, que exibe reas focais de necrose caseosa. a TB cavitria. A parede da cavidade feita de uma membrana interna delgada, cinza, que compreende ncleos necrticos moles, uma zona mdia de tecido de granulao e uma borda colagenosa. A luz preenchida de material caseoso contendo BAAR. A cavidade tuberculosa em geral comunica-se livremente com um brnquio, e a liberao do material infeccioso para as vias areas serve para disseminar a infeco no pulmo. a reativao da regio de granulomas.

Disseminao bronquial Tuberculose Miliar: A infeco localiza-se em disseminadas regies produzindo leses nodulares amarelas (granulomas tuberculosos), pequenas e mltiplas em vrios rgos. O termo miliar usado porque tem aparncia amarela (como milho). Pulmes, linfonodos, rins, suprarenais, fgado, bao e medula ssea so locais comuns de leses miliares. Resulta da disseminao hematognica dos BAAR, em geral de TB pulmonar secundria, mas muitas vezes de TB pulmonar primria ou de outros locais. A leso progressiva pode atingir as meninges e provocar meningite tuberculosa.

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Disseminao hematognica e TB miliar

Fonte: Rubin, 2006

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Revisando:

Fonte: Robbins, 2005

A seqncia de eventos na tuberculose pulmonar primria, comeando com a inalao do M. tuberculosis e culminando com o desenvolvimento da imunidade adaptativa celular. A Eventos que ocorremnas primeiras trs semanas aps a exposio ao BAAR. B Eventos posteriores: o desenvolvimento da resistncia ao organismo acompanhado pelo aparecimento de um teste tuberculnico (PPD) positivo.

Exame Fsico da TB Pulmonar - Sibilos e Roncos - Diminui murmrio vesicular - Broncofonia (pelo derrame pleural) - Sopro anfrico - Hepatoesplenomegalia - Hemoptise (presente em 50% dos casos)

Diagnstico Laboratorial Material: de acordo com a localizao.

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Pulmonar:

1 Escarro. 2 Contedo gstrico. 3 Lavado gstrico. 4 Lavado brnquico.

Renal: Meningite: Observao:

Urina. Lquido cefalorraquiano.

ssea / ganglionar: Puno. Descontaminar: escarro, urina, pus de abscessos fistulizados. No precisa descontaminar: lquor, derrame peritoneal, derrame articular, lquido pleural (colheita assptica, frasco estril).

Diagnstico Laboratorial Direto (bacterioscopia) 1. Bacterioscopia: Ziehl-Neelsen, antes e aps homogeneizao. 2. Cultura: Lewenstein-Jensen (30 dias). 3. Inoculao: cobaia, coelho. Indireto 1. Sorolgico: hemaglutinao, fixao do complemento. 2. Alrgico: intradermorreao com PPD pela tcnica de Mantoux ou outras. A localizao mais freqente a tuberculose pulmonar. O material a coletar o escarro. Quando este resultar negativo, podem-se usar outros materiais conforme citado. Coleta do material 1. Recolher o escarro em frasco limpo. Orientar o paciente que recolha material da expectorao e no a saliva. 2. Levar ao laboratrio. No laboratrio o escarro ser submetido a uma bacterioscopia pelo mtodo de Ziehl-Neelsen.

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Tcnica 1. Depositar a parte do escarro de preferncia mais purulenta ou sanguinolenta e distribuir uniformemente. 2. Secar. 3. Fixar na chama. 4. Corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Em caso positivo, aparecero os BAAR em vermelho em maior ou menor quantidade.

BACILOSCOPIA DO ESCARRO A colocarao de rotina o Ziehl Neelsen. microscopia pica, apresentam-se como bacilos retos ou ligeiramente curvados, isolados ou dispostos em grupos irregulares ou paliada. Paliada uma disposio como se fosse um muro.
Fonte: Robbins 2005

Paliadas do Mycobacterium tuberculosis observadas ao MO.

Resultado Quantitativo No escarro necessrio usar a contagem de maneira sistemtica anotando-se o nmero de campos examinados e a quantidade de bactrias. Considerado como exame bsico obrigatrio em todos os laboratrios de anlises clnicas, que fazem rotina bacteriolgica para diagnstico e controle de tratamento. As lminas, mais de uma, devem ser examinadas exaustivamente; em caso de no aparecer os BAAR, examinar no mnimo 400 campos microscpicos em cada lmina (segundo a recomendao do Instituto Pasteur, referncia internacional em tuberculose).

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Segundo a OMS, temos os resultados da seguinte maneira: + ++ +++ Nenhum BAAR em 100 campos examinados. Menos de 1 BAAR por campo, em 100 campos examinados. De 1 a 10 BAAR por campo, em 50 campos examinados. Mais de 10 BAAR por campo, em 20 campos examinados. Com o resultado quantitativo, o clnico pode avaliar se o tratamento foi adequado. Um bom critrio averiguar se a carga bacilar do paciente est diminuindo. Em alguns casos h necessidade de mudar o esquema teraputico. Quando o resultado direto do escarro der negativo, pode se recorrer chamada homogeneizao. Existem diversos materiais usados para esta finalidade, como: tratar com KOH ou cidos diludos ou trifosfato de sdio, uns mais agressivos, outros menos. Estes produtos vo fluidificar o escarro dissolvendo a mucosidade. Centrifugado em seguida, concentra as bactrias antes presas na viscosidade do muco. Ao mesmo tempo serve para descontaminar o escarro, rico em microbiota contaminante. Do sedimento faz-se nova bacterioscopia pelo Ziehl-Neelsen, em caso negativo, utilizar o restante do sedimento para cultura. Persistindo suspeita clnica, solicitar novas amostras de escarro. Cultivo O cultivo feito em meios especiais como o de Lewenstein-Jensen enriquecido com lipdeos. Fechar o tubo com parafina para evitar a ressecao do meio que vai ficar incubado a 37oC de 30 a 60 dias. O bacilo da tuberculose de crescimento lento; o tempo de gerao de mais ou menos 20h. O clnico pode requisitar o antibiograma caso haja resistncia do bacilo aos medicamentos prescritos. Meio de cultura: Lowenstein-Jensen

Fonte: Prof Alessandra Daur

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O meio Bactec consegue promover crescimento do bacilo da tuberculose dentro de 15 dias e pode ser uma revoluo no cultivo desta espcie para diagnstico. Isso ser discutido na disciplina clnica de Pneumologia. 4) Teste PPD cutneo Para identificar M. tuberculosis quando a bacterioscopia deu negativa. TA (tuberculina antiga) CORRELAES CLNICAS: DIFERENCIAR HIPERSENSIBILIDADE TUBERCULNICA DE HIPERSENSIBILIDADE GRANULOMATOSA (BP336). Ser que o indivduo j no foi vacinado com a BCG? O PPD mais serve para ver como est a imunidade do paciente frente ao bacilo do que como um mtodo de diagnstico propriamente dito. bom lembrar que ele s dar positivo num perodo de 3 (s vezes at 6) semanas semanas aps a infeco do bacilo. feito uma inoculao do Mycobacterium bovis atenuado na pele, e aguarda-se 48-72h para ver se tem endurecimento local e eritema. reao cutnea em TB

Tratamento da Tuberculose: terapia RIP Rifampicina Isoniazida Pirazinamida

Fonte: Robbins, 2005

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HANSENASE (Mal de Hansen)

uma doena crnica conhecida desde a mais remota antiguidade. Estudada exaustivamente durante muito tempo, ainda assim pouco se sabe sobre o perodo de incubao e maneira de transmisso. O bacilo causador, Mycobacterium leprae, no cultivvel em meios bacteriolgicos ou culturas celulares. Ele um agente monoxeno. Outros mamferos tm o BAAR, mas no o manifestam. Em patogenicidade experimental em homens, as tentativas resultaram infrutferas. Em animais de laboratrio, h descries de multiplicao do bacilo de Hansen em camundongos, tatus e primatas. Transmisso: aglomeraes excessivas e falta de higiene. Contato direto e inoculao de aerossis. A exposio prolongada a uma fonte infectada necessria para ocorrer transmisso. Acredita-se que para contrair a doena tenha que se ter uma predisposio gentica. As caractersticas clnicas da hansenase dependem de resposta celular. O Mycobacterium leprae cresce dentro de outras clulas Especialmente histicitos (histicitos so aqueles macrfagos no ativados que residem no tecido conjuntivo e ficam esperando algo para algum dia fagocitar, bem como os macrfagos no ativados da pele chamam-se clulas de Langerhans, os do SNC de micrglia, os do fgado de clulas de Kupffer, os do tecido conjuntivo normal chamam-se histicitos. H dois tipos de Hansenase. Na verdade o agente etiolgico sempre o mesmo, o Mycobacterium leprae. Mas h dois tipos de manisfestaes clnicas, e sim, so detectveis clinicamente. Hansenase tuberculide (TT): leses eritematosas com reas anestesiadas na face, tronco e extremidades.. Espessamento palpvel dos nervos perifricos (o BAAR se multiplica nas bainhas dos nervos perifricos) O indivduo tem resposta alrgica exagerada

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e tem maior predisposio a outras infeces bacterianas. H intensa resposta da imunidade celular. H formao de granulomas na derme, por isso, tuberculide.

Fonte: Mims, 2005

Hansenase lepromatosa (LL): Tem envolvimente extenso da pele. H perda parcial das sobrancelhas (um sinal clnico importantssimo e muito sugestivo da hansenase, chama-se MADAROSE), espessamento e dilatao das narinas, orelhas e bochechas, resultando na aparncia tpica leonina. H destruio do septo nasal e a parede nasal fica rica em bactrias. Nessa fase, a resposta imune celular fraca. No exame, os BAAR tornam-se extracelulares e agrupam-se em globias. Com o tempo, pode haver destruio intensa das estruturas faciais, nervos perifricos, o que, pela conseqente falta de sensibilidade, leva a traumatismos repetitivos em mos e ps, com conseqente infeco bacteriana secundria. SECREES (PRINCIPALMENTE NASAIS) DE PACIECTES COM HANSENASE LEPROMATOSA SO INFECTANTES (H GLOBIAS).

Fonte: Prof Alessandra Daur

Fonte: Anatomia Patolgica do HC

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Diagnstico Laboratorial Mycobacterium leprae no cresce em nenhum meio de cultura. Cresce em temperaturas menores do que 37C, por isso sua preferncia por habitar a pele e a linfa (tecidos perifricos que tm temperaturas mais baixas). O crescimento lento, pode levar at anos para que ocorram as manifestaes clnicas. O diagnstico laboratorial feito praticamente pela bacterioscopia, por Ziehl-Neelsen em material coletado das leses ou da serosidade da pele; eventualmente podero ser usadas provas sorolgicas.

Tcnica de Wade (para coleta de linfa cutnea) Local da coleta: a) 2 lbulos da orelha; b) 2 cotovelos. 1. Fazer assepsia do local com lcool iodado. Fazer isquemia com auxlio de pina ou dedos para evitar o fluxo de sangue. 2. Com o bisturi, fazer cortes na pele, de aproximadamente de 5 mm de comprimento e 2 mm de profundidade e recolher a serosidade (linfa) sobre uma lmina nova. A linfa ser coletada dos quatro locais uma ao lado da outra sobre a mesma lmina. 3. Identificar os esfregaos e a lmina. 4. Secar os esfregaos ao ar. 5. Fixar na chama.

LD

LE

CD

CE

6. Corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Leitura: os bacilos aparecero em vermelho, isolados e formando grupamentos chamados globias, que so caractersticas do Mycobacterium leprae.

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 microscopia so vistos BAAR em forma de globias.

Fonte: Prof Alessandra Daur

Fernando Bortolozzi

Fonte: Tortora, 2005

Histologia dos Tipos Clnicos de Hansenase

Fonte: Rubin, 2006

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CAPTULO 13: LEPTOSPIROSE

AGENTES ETIOLGICOS
O gnero Leptospira, em meio ao mundo contemporneo das tcnicas de Biologia Molecular, j foi classificado em 18 genomoespcies (s distinguidas por PCR). Classicamente, esse gnero possua apenas duas espcies: a L. interrogans e a L. biflexa, distinguidas fenotipicamente. A espcie patognica era a Leptospira interrogans e a saprfita, a Leptospira biflexa. No entanto alguns conceitos esto mudando. As duas espcies juntas apresentam aproximadamente 260 sorovares (cepas aglutinao com soro anti-sorovares conhecidos). E estas cepas podem ser classificadas por biologia molecular (gentipo) e por sorologia (fentipo). Sorologicamente, estes sorovares se agrupam em aproximadamente 27 sorogrupos (24 sorogrupos patognicos e 3 sorogrupos saprfitas). Sorogrupos relacionam a relao antignica entre os sorovares. A Biologia Molecular classifica o gnero Leptospira em 16 a 18 espcies genmicas (no s as duas espcies clssicas da imunologia), h uma classificao mais detalhada). Destas 18 genomoespcies, dez so constitudas por sorovares patognicos, seis com sorovares saprofitas e duas com sorovares patognicos e saprfitas.

Fonte: Google Imagens

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Classificao Molecular: 18 espcies genmicas 10 com sorovares patognicos 06 com sorovares saprfitas 02 com patognicos e saprfitas

Classificao Sorolgica: 24 sorogrupos patognicos 03 sorogrupos saprfitas (+ de 260 sorovares)

No entanto, de uma maneira geral, os microbiologistas ainda denominam a Leptospira interrogans como agente etiolgico da leptospirose, uma vez que as tcnicas de PCR ainda so relativamente novas. Os microrganismos do gnero Leptospira so espiroquetas finas e mveis, muito espiraladas, com 5-20 m de comprimento. Apresentam um movimento rotacional ativo e possuem dois flagelos internos (periplasmticos), que se originam em cada extremidade da bactria (isto permite que ela escave tecidos do hospedeito). So aerbios obrigatrios e necessitam de cidos graxos de cadeia longa para sua nutrio. Eles no se coram adequadamente pelos corantes de rotina e necessitam de microscopia de campo escuro, ou impregnao pela prata (Fontana Trebondeau), para sua visualizao ao MO. As extremidades da Leptospira interrogans curvam-se no formato de um "ponto de interrogao", por isso seu nome.

171

Estas bactrias necessitam de condies e meios especiais (meio Fletcher) para que haja crescimento, podendo ser necessrias vrias semanas para que a cultura se torne positiva (o perodo de multiplicao de aproximadamente 12 horas). As espiroquetas morrem com exposio ao ressecamento, ao calor ou a detergentes e desinfetantes, mas permanecem viveis por vrias semanas na gua alcalina e no solo mido. Os meios de cultura utilizados so os meios de Fletcher.

EPIDEMIOLOGIA
A leptospirose uma (antropo)zoonose importante, de distribuio mundial. tambm uma doena infecciosa emergente que ocorre em surtos. A notificao ao Ministrio da Sade compulsria, no entanto, ela est entre as doenas comuns e disseminadas mais mal diagnosticadas que existem. O microrganismo acomete cerca de 160 espcies de mamferos. Os roedores, em particular os ratos, so os reservatrios naturais mais importantes. Outros animais silvestres, pecurios e domsticos tambm fazem parte dessa lista. A relao harmnica do tipo mutualismo, a Leptospira sobrevive por anos nos tbulos contorcidos proximais destes animais. No entanto, estes mamferos desenvolvem infeco renal crnica assintomtica (e no tem grande nmero de bactrias na urina).

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A Leptospira um ser euribionte, encontrado em todos os estados do Brasil, assim como na sia, Amrica Central, no restante da Amrica do Sul e nos EUA. Em 2006 no Brasil houve 4308 casos reportados (272 no Paran), dos quais 401 foram a bito (taxa de mortalidade de 0,093).

TRANSMISSO
importante lembrar que cada sorovar tem ser mamfero hospedeiro prprio, ou seja, o homem um hospedeiro acidental. Exemplos so os sorovares icterohaemorrhagiae/copenhageni de ratos, grippotyphosa de ratazanas, hardjo de bovinos, canicola de ces, pomona de porcos, etc. Os humanos so infectados pela ingesto ou exposio gua ou alimentos contaminados. As bactrias, auxiliadas por sua motilidade, penetram atravs de abrases da pele ou mucosas ntegras, de modo que a infeco pode ser adquirida quando o indivduo nada, trabalha ou brinca em gua contaminada. Portanto, mineradores, fazendeiros, etc., apresentam risco elevado de contaminao (isso tambm explica o porqu da maior prevalncia do sexo masculino, 87% do total de casos). Ou seja, ela pode, inclusive, ser considerada uma doena ocupacional, uma vez que a contaminao est ligada ao trabalho do paciente. Certos grupos ocupacionais correm risco particularmente elevado; nesses grupos esto includos veterinrios, agricultores, trabalhadores com gua de esgoto, empregados de abatedouros e trabalhadores da indstria pesqueira. Esses indivduos podem adquirir leptospirose por exposio direta ou contato com gua e solo contaminados. A contaminao pode suceder o contato direto com urina, sangue ou tecidos de um animal infectado, ou aps a exposio a um ambiente contaminado. A Leptospira excretada na urina humana, mas a transmisso interpessoal rara. No entanto, a bactria sobrevive por meses em gua doce, sendo esta um importante veculo de transmisso. As epidemias de leptospirose podem resultar da exposio prolongada a guas de enchentes contaminadas pela urina de animais, principalmente em grandes centros urbanos onde h esgoto a cu aberto, grande nmero de bueiros e outros habitats de roedores. No globo, a regio em que mais ocorre leptospirose entre os trpicos, prximo ao Equador. O clima e as precrias condies de higiene favorecem a sobrevida do patgeno. Em muitos pases em desenvolvimento, a leptospirose ainda representa um problema

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subestimado. Dados confiveis da morbidade e da mortalidade da leptospirose comearam gradualmente a aparecer. A leptospirose tambm foi reconhecida em cidades do interior semi-abandonadas, onde a populao de ratos est se expandindo. Alm disso, pessoas que praticam natao em rios, canoagem, windsurf, esqui aqutico, etc. Microgotculas de gua que contenham a bactria podem ser ingeridas ou a bactria entrar por escoriaes da pele. A leptospirose tambm pode ser enquadrada entre as "doenas do viajante", principalmente quando o destino so os pases tropicais. A maioria dos casos ocorre durante o vero e outono nos pases ocidentais e durante a estao chuvosa nos trpicos. Em resumo, a leptospirose uma patologia intimamente associada a condies scio-econmicas, de imensa importncia em sade pblica, pois est associada com higiene, maus hbitos de vida, etc.

FATORES DE PATOGENICIDADE
A Leptospira penetra em pele com abrases e nas membranas mucosas integras (principalmente conjuntiva e revestimentos da orofaringe e nasofaringe), uma vez que essa bactria possui dois flagelos periplasmticos em suas extremindades, que facilitam a sua introduo no hospedeiro (movimento "saca-rolha"). Ela ento se dissemina atravs da corrente sangnea (leptospiremia) e disseminao para todos os rgos. A multiplicao ocorre no sangue e nos tecidos e a bactria pode ser isolada no sangue e no LCR nos primeiros 4-10 dias da doena. Alm disso, esse microrganismo secreta hialuronidade, uma enzima que destri as molculas de cido hialurnico e outras glicosaminoglicanas da matriz intersticial do tecido conjuntivo da derme e de submucosas, facilitando a introduo do patgeno. Enzimas lipolticas tambm fazem parte do arsenal de patogenicidade da Leptospira, destruindo cidos graxos insaturados da epiderme.

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FISIOPATOLOGIA
O mecanismo ainda no est totalmente elucidado. A bactria pode penetrar por pele, mucosas, penetrao em boca, faringe e esfago durante a ingesto de gua, etc. importante salientar que quem causa o efeito patolgico so os anticorpos e a reao inflamatria, e no o microrganismo em si. Isso pode explicar porque algumas cepas no so patognicas. O sorovar patognico libera o antgeno de membrana na circulao desencadeando a reao inflamatria. As cepas saprfitas permanecem com os antgenos ligados parede celular bacteriana.

As leses causadas pela Leptospira so causadas em virtude de seus efeitos diretos, como motilidade, quimiotaxia e patogenicidade, mas principalmente da resposta imune do hospedeiro. Cepas virulentas exibem quimiotaxia, o que facilita a mobilidade e produz vrias enzimas citotxicas. A lipoprotena LipL32, por exemplo, causa hemlise, aumenta a expresso de quimiocinas e do fator NFkB. A protena de membrana OmpL1 e a esfingomielinase H so citotxicas, produzindo poros nas membranas celulares. Glicoprotenas, a protena LigA (immunoglobulin-like) e as protenas fibronectiba-ligantes auxiliam a invaso dos tecidos

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pela bactria, por facilitarem sua adeso com a pele e mucosas, ou dos neutrfilos com o endotlio. O papel da resposta imune do hospedeiro durante a infeco ainda obscuro. Alm de ser responsvel pela imunidade, essa resposta est envolvida na formao da uvete e talvez das leses pulmonares. A resposta humoral , sem dvidas, uma grande vil nesse quadro patolgico. No entanto, grandes bacteremias podem ocorrem mesmo quando haja um grande ttulo de anticorpos circulantes. A reao imunolgica acaba por ocasionar uma reao de hipersensibilidade tipo III, gerando complexos imunes. Esses complexos so responsveis pela leso endotelial e consequentemente pela hemorragia. A vasculite responsvel pelas manifestaes mais importantes da doena. Os rgos alvos preferenciais da leptospirose so os rins, o fgado e os pulmes.

SINTOMATOLOGIA
importante procurar obter uma histria de exposio a materiais contaminados. Obtm-se avidncias sorolgicas de infeco inaparente pregressa em 15-40% dos indivduos expostos, mas que no adoeceram. Ou seja, so assintomticos. Nos casos de quem apresenta sintomatologia, esta pode se apresentar de maneira leve (mais de 90% dos casos), s vezes grave e fatal em alguns casos (menos que 1%). A sintomatologia no est relacionada ao sorogrupo que o paciente esteja portando. O perodo de incubao varia de 2 a 20 dias, sendo a mais comum entre o 7 e o 14 dia ps-exposio. Tipicamente, a fase leptospirmica aguda seguida de uma fase leptospirrica imune. A distino entre a primeira e a segunda fase nem sempre clara, e os casos mais leves nem sempre incluem a segunda fase. Por esses achados, classificamos a leptospirose como uma doena bifsica. Na fase anictrica, a leptospirose pode se apresentar semelhantemente a uma gripe, com febre, calafrios, cefalia intensa, nuseas, vmitos e mialgia. A miagia afeta principalmente as panturrilhas, o dorso e o abdome. Em alguns casos pode haver irritao da garganta, exantema, comprometimento pulmonar com tosse, dor torcica e hemoptise. O achado clnico mais comum nessa fase a febre junto sufuso conjuntival. A maioria dos pacientes se torna assintomtica em aproximadamente uma semana. O incio da segunda fase, a imune, coincide com o surgimento dos anticorpos na circulao sangnea. Nessa fase, as mialgias e a febre tm intensidade menor. Pode ocorrer

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meningite assptica nessa fase, principalmente em crianas. Embora no mais que 15% dos pacientes exibam sinais e sintomas de meningite, muitos exibem pleocitose no LCR, o qual desaparece aps duas semanas. Irite, iridociclite e coriorretinite so complicaes tardias que podem ocorrer e persistir por vrios anos. Em alguns casos, podem ser perceptveis j na terceira semana da doena. A Sndrome de Weil a forma mais grave da leptospirose, sendo caracterizada por ictercia, disfuno renal, ditese hemorrgica e taxa de letalidade de 5 a 15%. O incio da doena semelhante ao da leptospirose de grau leve, no entanto, aps 4 a 9 dias, a ictercia surge junto vasculite a disfuno renal. A pele fica com uma tonalidade laranja e nesse estgio geralmente ocorre necrose heptica com hepatomegalia perceptvel palpao profunda do hipocndrio esquerdo. No rim, a hipovolemia e a diminuio da perfuso renal contribuem para o desenvolvimento de necrose tubular aguda, com oligria ou anria. s vezes a dilise se faz necessria. Com freqncia ocorre comprometimento pulmonar, com achados clnicos j relatados anteriormente. Observam-se manifestaes hemorrgicas na sndrome de Weil: epistaxe, petquias, prpuras e equimoses. Durante a leptospirose grave, descreveram-se rabdomilise, hemlise (pela lipoprotena LipL32), miocardite, pericardite, insuficincia cardaca congestiva, choque cardiognico, sndrome da agstia respiratria do adulto, pancreatite necrosante e falncia de mltiplos rgos.

TRATAMENTO
A terapia antimicrobiana indicada para as formas mais graves da doena. Na forma leve a teraputica ainda discutida. O tratamento pode, inclusive, ser iniciado aps os primeiros quatro dias da doena. Ainda h uma boa resposta dos indivduos tratados com beta lactmicos. Na forma leve, os antibiticos de escolha so a doxicilina e a ampicilina. Nos casos de leptospirose moderada a grave, usa-se amoxicilina via oral ou penicilina G intramuscular. No necessrio introduzir antibitico associado aos bloqueadores de beta lactamases, uma vez que a Leptospira interrogans no tem potencial para produo desta enzima.

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CAPTULO 14: 14: OS FUNGOS E AS MICOSES

CARACTERSTICAS GERAIS
So seres eucariontes, uni ou pluricelulares (99% so pluri) SEM CLOROFILA e HETERTROFOS FUNGOS NO FORMAM TECIDOS VERDADEIROS (no mximo formam hifas) Aproximam-se muito mais do Reino Animmalia do que do Reino Plantae: Armazenam GLICOGNIO Parede celular de QUITINA

A digesto pode ser extracorprea, por meio de enzimas no substrado. Seres UBIQUITRIOS: vivem em qualquer lugar que tenha matria orgnica em decomposio (ex: tecidos necrosados). Podem ser aerbios e anaerbios. Exemplos: Mofos, bolores, fermentos, levedos, leveduras, cogumentos, etc.

MODOS DE VIDA
Saprbios: obtem seus alimentos decompondo organismos mortos. Vivem sobre a matria orgnica. Mutualistas: sem grande importncia mdica. So os liquens (cianobactria + fungo) e micorrizas (fungo + raiz de fanergama). Predadores: capturam pequenos animais. Parasitas: obtm alimentos de organismos vivos. Ex: Candida albicans, Trycophyton sp.

TIPOS BSICOS DE FUNGOS

1. BOLORES - Macroscopicamente aspecto pulvurulento, cotonoso (de cotton, algodo em ingls), plumoso. ASPECTO SECO Exemplos: Penicillium sp., Aspergillus sp.

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Fonte: Koneman, 2001

2. LEVEDURAS Formato esfrico, oval, tem parede dupla ao MO. Aspecto macroscpico cremoso, pastoso, gelatinoso. ASPECTO MIDO Exemplos: Cryptococcus neoformans, Candida albicans.

Fonte: Koneman, 2001

Fonte: Mims, 2005

3. DIMRFICOS podem ser bolores e leveduras, depende da condio do ambiente (umidade, temperatura). Causam doenas endmicas e so potentes patgenos em indivduos imunocomprometidos (principalmente doenas pulmonares). Ex: Histoplasma capsulatum, Paracocciodioides brasiliensis

Histoplasma capsulatum

Fonte: Google Imagens

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Fonte: Mims, 2005

HIFAS:

Nos

bolores,

encontramos

um

corpo

formado

por

HIFAS

(filamentos

multinucleados), no por tecidos. As hifas so pequenos filamentos secos que correspondem ao corpo do fungo, denominado MICLIO. Miclio o coletivo de hifas.

Fonte: Material didtico do Grupo Positivo

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H dois tipos de miclio: o vegetativo (hifas que adentram nos tecidos ou substrato em busca de alimento) e o reprodutivo, em que as hifas tm a funo de propagao e do origem aos esporos. O reprodutivo chama-se de corpo de frutificao e geralmente so os que ficam pra fora da pele nas leses cutneas.

Fonte: Grupo Positivo

REPRODUO DOS FUNGOS

A reproduo pode ser assexuada, por brotamento, como nas formas unicelulares (Candida albicans e Paracocciodioides brasiliensis quando se apresenta como levedura) ou por fragmentao do miclio nas pluricelulares (Aspergillus sp.). A reproduo sexuada envolve a unio de hifas gamticas com a formao do zigoto. O principal meio de reproduo a formao de ESPOROS. Podem ser mveis (zosporos) ou imveis (aplansporos) que so transportados pelo vento (fungos do ar). As estruturas que produzem os esporos so denominadas esporngios.

Fonte: Grupo Positivo

CONDIO = reproduo por brotamento ESPORO = reproduo sexuada

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CLASSIFICAO DOS FUNGOS

1) Mixomicetos: Fungos gelatinosos que habitam ambiente mido e sombrio. Em certas fases da vida se assemelham aos protozorios (emitem pseudpodos). Pode ser formado por clulas uninucleadas ou se assemelhar a um plasmdio (polinucleado). No possui parede celular, apenas uma membrana flexvel. Deslizam sobre o solo e englobam partculas orgnicas, alm de bactrias e outros fungos.

Fonte: Corel Shock Photos

2) Eumicetos: "fungos verdadeiros". Divididos em grupos: a) Zigomicetos ou ficomicetos: Fungos primitivos constitudos por hifas no septadas. Reproduzem-se por alternncia de geraes Geralmente so decompositores, no entanto algumas espcies podem parasitar plantas e animais. Ex: bolor preto do po (Mucor sp.) b) Oomicetos: Engloba fungos unicelulares at miclios filamentosos. Podem se

alimentar de matria orgnica em decomposio (Saprolegnia sp.). Alguns so parasitas de vegetais (Phytophthora infestans, que causa ferrugem ou requeima no tubrculo de batata). Reproduzem-se assexuadamente por zosporos flagelados e sexuadamente por gametas distintos. Podem ser formar em garrafas plsticas de gua mineral quando o recipiente for reutilizado diversas vezes. Prximo ao gargalo e tampa podem se formar colnias pretas de oomicetos. c) Ascomicetos: constitudos por hifas septadas. Seus esporos chamam-se

ascsporos e so produzidos por esporngios em forma de um pequeno saco, denominados ascos. Nos unicelulares, a reproduo pode ocorrer por brotamento. Ex: levdos, Penicillium sp., Aspergillus sp., Saccaromyces cervisiae (fermento da cerveja, do vinho e do po), Claviceps purpurea (Esporo do centeio, de onde vem a ergotamina). Os ascomicetos tambm so os fungos que se cultivam no interior dos

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guarda-roupas, principalmente no vesturio de inverno, causando o odor forte tpico, que em muitos casos pode desencadear asma alrgica por reao de hiperssensibilidade tipo I (anafiltica).

Fonte: Fernando Bortolozzi

Aspergillus sp.

Penicillium sp.

d) Basidiomicetos: So os fungos mais conhecidos (cogumelos) e os mais evoludos. So pluricelulares e constitudos por hifas septadas. Formam esporos (basidisporos) que se fixam externamente em estruturas chamadas basdios. O corpo de frutificao chama-se basidiocarpo (chapu). Podem ser encontrados em tronco de rvores, solos midos, plantas e em matria orgnica. Alguns so parasitas de vegetais. Exemplos: cogumelos e orelhas de pau, Agaricus campestris (champignon), Amanita muscarina.

Fonte: Google Imagens

e) Deuteromicetos: os fungos de maior importncia MDICA. Os chamados fungos "imperfeitos", no apresentam fase sexuada no ciclo reprodutivo. A maioria patognica ao ser humano. Ex: maioria das micoses, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Trycophyton sp. (que causa as frieiras). Fotos na seo de micoses. O maior organismo do planeta um fungo! Pertence ao gnero Armillariella e encontrado nos EUA, cobrindo uma rea de 1,5 x 105 m2.

183

CORRELAES CLNICAS: Ergotamina um alcalide. Alcalides so uma classe de medicamentos, utilizados nas crises agudas de enxaquecas, por inativar os receptores de dopamina. So agonistas -adrenrgicos nos vasos sangneos, que fazem vasocontrio. No entanto, em outros locais a ergotamina um antagonista parcial de serotonina a 5-hidroxitriptamina (5-HT). A ergotamina a matria prima do LSD. O Claviceps purpurea infecta plantaes de cereais e pode ser responsvel por casos ocasionais de envenenamento em seres humanos que consumiram aquele cereal. Essa espcie tambm produz outros alcalides como a ergometrina, que utilizada para evitar hemorragia ps-parto; a metisergida, que trata a sndrome carcinide; e a bromocriptina, que utilizada no Parkinson e em distrbios endcrinos. Fungos que produzem drogas alucingenas (possuem muitos alcalides): Amanita muscarina (age nos receptores muscarnicos), Conocybe sp. e Psilocybe sp. Podem gerar micotoxicose em humanos.

FUNGOS E MEDICINA

Aproximadamente 106 espcies patognicas. Os fungos patognicos podem ser classificados com base nas suas formas de crescimento ou no tipo de infeco que causam. Micotoxicose: NO sinnimo de micose. Micose infeco por fungo; micotoxicose ingesto e/ou inalao de fungo que produz produtos txicos ao organismo humano (ex: alcalides), gerando um quadro de intoxicao por substncias orgnicas. Doenas de Hipersensibilidade: Respostas alrgicas que certas pessoas tm quando vestem um casaco que estava h muito tempo guardado no armrio (ascomicetos), por exemplo. Neste caso, o fungo no se desenvolve nos tecidos. As manifestaes patolgicas ocorrem em virtude da produo de imunoglobulinas pelos linfcitos B sensibilizados. Essas reaes alrgicas por esporos fngicos (os imungenos em questo) se enquadram nas

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reaes de hipersensibilidade tipo I (anafilaxia), vistas na disciplina Imunologia Mdica (BP336). Exemplos de anafilaxia por fungos: renite alrgica, asma brnquica, alveolite, etc.

Tipos de Micoses

1) SUPERFICIAIS: Colonizam as camadas mais superficias da pele (crnea e lcida), incluindo os plos. Provocam alteraes de importncia esttica. a) Ptirase Versicolor: Seu agente etiolgico a Malassezia furfur. Caracteriza-se por leses acrmicas ou hiperpigmentadas, de bordos delimitados, localizadas no couro cabeludo, trax, abdome, pescoo e face, principalmente. O tratamento pode ser feito com sulfeto de selnio. b) Tinha Nigra: O agente etiolgico a Exophiala werneckii, um fungo dimrfico que produz melanina, conferindo uma colorao marrom leso. normalmente assintomtica, e as manifestaes clnicas, quando existem, consistem em leses maculares bem demarcadas (manchas pigmentadas na pele), que so elevadas acima da superfcie. As leses so observadas com maior freqncia em palmas das mos e plantas dos ps. c) Piedra: H dois tipos de Piedra a Piedra Branca e a Piedra Negra. A Piedra Negra uma infeco nodular dos fios de cabelo causada pela Piedraia hortae. A Piedra Branca decorrente da infeco por Trichosporon beigelii, manifesta-se na forma de ndulos amarelados, maiores e de consistncia mais mole nos plos (axilares, pbicos, barba e cabelos). O tratamento consiste na remoo dos plos e aplicao de antifngicos tpicos. Muitas vezes estas duas doenas esto associadas falta de higiene do paciente.

2) CUTNEAS: Localizam-se mais profundamente na epiderme (camada granulosa e basal), incluindo doenas invasivas de plos e unhas. So as DERMATOMICOSES, por isso, os fungos etiolgicos so denominados DERMATFITOS (que vivem s custas da queratina da pele e das unhas) e por espcies do gnero Candida.

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Dermatfitos: Pertencem principalmente a trs gneros.

GNEROS Trichophyton

ESPCIES T. rubrum T. mentagrophytes M. canis M. gypseum E. floccosum

Microsporum Epidermophyton

As manifestaes clnicas dos dermatfitos so tambm conhecidas como tinha ou tinea. O termo tinha (ou tinea) origina-se do Latim e significa verme ou traa. A adio do outro termo indica o local anatmico afestado. Tinha pedis: Micoses dos ps (frieiras, p-de-atleta). Tinha capitis: Micoses do couro cabeludo (pode causar alopecia). Tinha manus: Micoses nas mos. Tinha unguium: Micoses nas unhas (ONICOMICOSE). Crescem em baixo das unhas. Tinha corporis: Micoses generalizadas no corpo. O tratamento consiste na utilizao de derivaros imidazlicos como o cetoconazol, o miconazol, o fluconazol e principalmente o Itraconazol. b) Dermatomicoses por Candida sp.: Ocorrem principalmente pela contaminao com Candida albicans. Podem determinar leses de pele, plos, unhas e mucosas de indivduos que apresentam fatores predisponentes como obesidade, diabetes meliltus, uso prolongado de antibiticos ou glicocorticides e indivduos que manuseiam muita gua.

Fonte: Mims, 2005

Candida em pele

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As leses mais freqentes so em unhas e espaos interdigitais das mos. A leso que se encontra ao redor do leito ungueal (paroniquia) tambm comum. A paronquia uma tumefao anormal ao redor das unhas que pode ser causada por diversos agentes, como o Staphylococcus aureus. Isso ser visto na disciplina de Propedutica Mdica II. 3) SUBCUTNEAS: Os fungos que provocam micoses subcutneas normalmente residem no solo e na vegetao. Penetram na pele ou tecido subcutneo por inoculao traumtica com material contaminado. Em geral as leses tornam-se granulomatosas (reao de hipersensibilidade tipo IV) e propagam-se lentamente a partir da rea de implantao. So infeces que afetam a derme, tecidos subcutneos, msculos e fscias. Podem ser doenas ocupacionais por causa do tipo de trauma. Ex: cortadores de coco. TEM QUE HAVER TRAUMA CUTNEO PARA ATINGUIR A DERME (TECIDO CONJUNTIVO). a) Esporotricose: uma infeco crnica caracterizada por leses nodulares e ulcerativas (local correto para a coleta do material para exame microscpico) que se desenvolve ao longo dos vasos linfticos. Os ndulos amolecem, rompem-se e liberam exsudato purulento. tambm conhecida como Doena do Jardineiro e do Floricultor ( uma doena ocupacional). O agente etiolgico o fungo Sporothrix schenckii. um fungo saprfito encontrado no solo, nas roseiras, nos arbustos, em cascas de rvore e nas brifitas. A infeco acontece mediante a um traumatismo. Surge como uma pequena ppula ou ndulo subcutneo que se desenvolve entre 1 semana e 6 meses. Posteriormente atinge as cadeias linfticas. Outras formas raras de esporotricose incluem soluo saturada de iodeto de potssio, itraconazol e os demais derivados imidazlicos. Quando a infeco assume carter sistmico, o tratamento intrahospitalar com Anfotericina B.

Fonte: Mims, 2005

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b) Cromoblastomicose (cromomicose): Crescimento de ndulos verrucosos que aparecem nos locais de inoculao. Com o tempo assume o aspecto de couve flor. Os pontos enegrecidos so os locais certos para a coleta do material para exame. O agente etiolgico predominante no Brasil a Fonsecaea pedrosoi. Mas h outras espcies que podem provocar a cromoblastomicose: Phialophora verrucosa, Rhinocladiella aquaspersa, Fonsecaea compacta e Cladosporidium carrionii. Esses microrganismos habitam o solo e coletivamente so denomindos fungos dematiceos, com parede celular melaninizada. uma doena comum em trabalhadores rurais, principalmente nas reas descobertas do corpo. O tratamento consiste na cauterizao e na remoo cirrgica das leses inicias. J na doena avanada, torna-se necessrio o uso de quimioterpicos. Existem outras micoses subcutneas, porm de incidncia muito baixa, entre elas a Feo-Hifomicose, o Micetoma Eumictico, a Zigomicose, a Lobomicose e a Rinosporidiose.

4) SISTMICAS: Todos os fungos que causam infeces sistmicas so DIMRFICOS. Em meios de cultura simples (entre 24 e 28C) e na natureza formam colnias micelianas formadas por hifas (bolores). Nos tecidos e nos meios de cultura especiais (entre 35 e 37C), desenvolvem a forma de leveduras, que a forma parasitria. Localizam-se principalmente nos rgos internos e vsceras podendo abranger muitos tecidos diferentes. H preferncia pelos pulmes. a) Paracoccidioidomicose (blastomicose Sul-Americana ou Micose de Lutz-Splendore Almeida): O agente etiolgico o fungo dimrfico Paracoccidioides brasiliensis. Aspectos Clnicos: Aspecto radiogrfico do pulmo em asa de borboleta Presena de vesculas no sulco gengival (muitas vezes o diagnstico feito pelo cirurgio-dentista e o paciente chega ao mdico por encaminhamento) O 1 rgo de acometimento o pulmo; o 2 rgo a mucosa bucal. Muitas vezes leses na boca aparecem antes (at dois anos) das manifestaes pulmonares. a nica micose pulmonar que atinge o imunocompetente Na prtica clnica a paracoccidioidomicose chamada de PCM

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Alm do pulmo, pode fazer leso osteoltica, disseminar-se para o SNC, rgos genitais, TGI. s vezes o cirurgio encontra ao fazer uma laparotomia. A infeco pode resultar tanto da inoculao de estruturas do fungo consideradas infectantes, como a reativao de algum foco pr-existente. O nmero de homens afetados desproporcional ao nmero de mulheres (9:1). Esta diferena foi atribuda a fatores de alto risco, doena subjacente, desnutrio e diferenas hormonais. Pneumonia por Paracoccidioides brasiliensis muito difcil de tratar. O tratamento consiste no uso prolongado de Itraconazol, algumas vezes associado a Sulfametoxazol e Trimetropim (Bactrim).

5) OPORTUNISTAS: Nmeros fungos foram identificados como agnetes etiolgicos de infeces oportunistas. Muitas vezes ocorre em ambientes hospitalares. Pacientes transplantados, usurios crnicos de glicocorticides e HIV positivos merecem ateno especial nesses casos, uma vez que a cura torna-se muito dificultada. a) Candidase, candidose e Candida sp. A Candida sp. o patgeno fngico mais comum do paciente imunocompetente. uma levedura oportunista em uma variedade de pacientes e em vrios stios do corpo. No intestino ela atua como agente de microbiota normal. A espcie mais comum, epidemiologicamente, a Candida albicans. Essa levedura gera diversos tipos de quadros clnicos como candidase bucal e candidase vaginal. Hoje em dia estes termos no so mais utilizados pela nmina anatmica moderna. Usa-se o termo CANDIDOSE para manifestaes na cavidade bucal e o termo CANDIDASE para as demais infeces por Candida sp. Alm disso, pode provocar alteraes cutneas, gastrointestinais e endocardites, particularmente em usurios de drogas ilcitas.

Fonte: Koneman, 2001

Candida sp.

189

candidose

pode

ser

encontrada

em

uma

variedade

de

pacientes

imunocomprometidos, pessoas com uso de prteses odontolgicas mal adaptadas, portadores de diabetes mellitus, em tratamento com antibiticos de largo espectro, usurios crnicos de glicocorticides, xerostomia (hipoproduo de saliva) entre outros. A manifestao mais freqente se d por meio de placas esbranquiadas (forma pseudomembranosa) de fcil destaque com o auxlio de um algodo, principalmente em dorso de lngua e palato duro. H tambm a forma eritematosa, que se manifesta por meio de leses hiperemiadas. O tratamento pode ser feito com o uso tpico de nistatina, anfotericina e derivados imidazlicos. Se o paciente for imunocomprometido e/ou a infeco j tiver adquirido carter mais invasivo, deve se apelar para o uso de antifngicos sistmicos. * Causas comuns xerostomia: pacientes que fazem quimioterapia (que destri grndulas salivares colateralmente) e usurios de antidepressivos como inibidores da recaptao de serotonina (5-HT). Esses pacientes so fortes candidatos a possuiem candidose. Aspecto pseudomembranosos em palato duro Pseudohifas e leveduras

Fonte: Rubin, 2006

A candidase vaginal uma das doenas que mais comumente acometem mulheres jovens, principalmente em pases de clima tropical como o Brasil. Esta patologia pode, inclusive, ser enquadrada dentro do grupo das DSTs, uma vez que o contato sexual uma das formas mais comuns de contgio. O homem tem a Candida albicans na microbiota normal peniana, portanto uma atividade sexual sem preservativo faria com que a mulher

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entrasse em contato direto com a levedura. Se ela estiver em uma queda imunolgica pode desenvolver a doena, bem como cultiv-la, fazendo sexo repetidamente com o mesmo parceiro (portador). Salienta-se tambm que as pessoas que fazem sexo oral sem proteo esto sujeitas a contrarem candidose por entrarem em contato com a microbiota normal do pnis. imprescindvel que o tratamento seja feito com o casal, ambos devem prosseguir com a terapia at a erradicao das leveduras. Outra fonte de contgio so os fmites contaminados (toalhas, roupas ntimas, acessrios diversos, etc.). O compartilhamento deste tipo de material pode acarretar um intercmbio de espcies de Candida sp., ou mesmo de diferentes cepas de Candida albicans, geralndo infeces com mecanismos mais resistentes.

Fonte: Netter, 2006

A candidase mucocutnea uma manifestao rara e no invasiva, embora persistente, das membranas mucosas dos cabelos, da pele e das unhas. Em crianas, com defeito especfico de clulas T, podem se tornar alrgicoa Candida, tendo que fazer uso de antifngicos intermitentes. A candidase gastrointestinal encontrada em pacientes que passaram por cirurgia gstrica ou abdominal (ex: cirurgia de reduo de estmago), ou em pacientes que tm neoplasias. O microrganismo pode atravessar a parede intestinal e disseminar-se a partir de um foco gastrointestinal. O diagnstico in vivo difcil, e cerca de 25% dos pacientes no apresentam sintomas nos etgios iniciais da doena. Se ocorrer disseminao a partir do intestino, as hemoculturas podem se tornar positivas e antgenos de Candida podem ser detectveis no soro. A terapia fungicida deve ser iniciada precocemente em pacientes com suspeita de infeco, mas a doena disseminada frequentemente fatal.

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A candidase disseminada provavelmente adiquirida via TGI, mas tambm pode se originar de infeces relacionadas a cateteres intravasculares. Pacientes com linfomas e leucemia correm maior risco. A disseminao hematolgica alcana quase todos os rgos. Infeces nos olhos (endoftalmia) e da pele (leses mucocutneas nodulares) so importantes porque fornecem evidncias para o diagnstico, sem as quais os sintomas inespecficos de febre e choque sptico dificultam o diagnstico precoce. Pacientes imunocomprometidos, por vezes, recebem terapia antifngica emprica se apresentam febre e falham em responder aos agentes antibacterianos de largo espectro. Hoje em dia h aumento da resistncia aos antifngicos para tratar as espcies de cndidas. A Candida albicans responde bem aos derivados imidazlicos como o cetoconazol e fluconazol. No entanto, est aumentando gradativamente as infeces pelas Candida no-albicans, e estas espcies possuem mecanismos de defesa bem mais resistentes. O fluconazol apresenta atividade muito reduzida contra essas espcies, fazendo com que os pacientes sejam obrigados a usarem o Itraconazol via oral por longos perodos. A anfotericina B tambm um antifngico com boa atividade contra as cndidas, porm ela tem muitos efeitos colaterais e seu uso na prtica mdica mais reservado.

CORRELAES CLNICAS: A secreo da candidase diferente das demais secrees infecciosas da vagina. O aspecto pseudomembranoso da cndida se manifesta como placas brancas facilmente destacveis com auxlio de algodo, sem odor ftido. As demais secrees como a do Trichomonas vaginalis, das vaginites e vaginoses bacterianas so verde-amareladas (exsudato purulento), viscosas e geralmente de odor ftido.

Fonte: Netter, 2006

Colo uterino: Candida spp.

Colo uterino: Trichomonas vaginalis, gonococo, Gardnerella vaginalis e Chlamydia trachomatis

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b) Criptococose O agente etiolgico o Cryptococcus neoformans. Um fungo leveduriforme que possui uma cpsula espessa de polissacardeos complexos ao redor de sua parede celular. um microrganismo euribionte, uma vez que o criptococo transmitido pelas fezes dos pombos. Curitiba certamente uma cidade com uma populao densa dessas aves, portanto uma importante questo de sade pblica que merece ateno especial. No pombo o fungo inativo, pois a cpsula de carboidrato no se desenvolve no interior da ave. Quando a levedura chega ao organismo humano, a cpsula se desenvolve a partir dos carboidratos do nosso metabolismo ( um fator de patogenicidade, junto a produo de melanina e enzimas). Por fim, e o fungo adquire sua verdadeira forma ativa e infectante. A inoculao geralmente pulmonar e assintomtica. Esse fungo tem tropismo pelo SNC (vem dos pulmes por via hematognica). Pode fazer meningite criprocccica quando atinge as meninges. Acredita-se que o criptococo possa atravessar a barreira hematoenceflica via infeco de moncitos e/ou clulas endoteliais. Essa forma de meningite responsvel pela morte de muitos pacientes com AIDS e outros imunocomprometidos na imunidade celular. A resposta imunolgica do hospedeiro se faz pela ativao dos linfcitos CD4 e produo de IFN. No entanto alguns pacientes imunocompetentes so acometidos tambm, porm numa porcentagem bem menor e com sintomas mais brandos, alm de terem uma cura mais rpida e eficaz. Nos casos de meningite criptocccica, a levedura pode ser demonstrada no lquido crebro-espinhal. A identificao tambm pode ser feita pela deteco do antgeno no teste de aglutinao em ltex, usando ltex recoberto com anticorpos especficos. O tratamento engloba uma combinao entre anfotericina B e flucitosina, e pode ser monitorado pela queda na concentrao de antgenos no LCE. O prognstico varia muito de acordo com a doena de base do paciente; nos pacientes severamente imunocomprometidos, a mortalidade gira em torno de 50%. Nos pacientes com AIDS praticamente impossvel erradicar o microrganismo, mesmo com a terapia intensiva. Pacientes com leucemia, linfomas, LES, linfoma de Hodgkin ou sarcoidose merecem ateno especial tambm.

Inalao

pulmes

meningite via hematognica

SNC

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Fonte: Mims, 2005

Cryptococcus neoformans e a cpsula de carboidratos c) Histoplasmose: Doena das Cavernas, Doena dos Espelelogos O agente etiolgico o fungo dimrfico Histoplasma capsulatum. Este fungo cresce em reas contaminadas com excretas de morcegos e aves. Embora as aves no sejam infectadas, ocorre infeco natural nos morcegos. O fungo pode ser encontrado em pores, reas escuras, torre de igreja, etc A doena ocorre no mundo todo. Na maioria dos casos assintomtica. Nos casos sintomticos observam-se sintomas clnicos de pneumonia aguda, seguidos com menor freqncia de doena disseminada progressiva. Os esporos ou fragmentos de hifas so aspirados nos alvolos e estes so fagocitadas pelos macrfagos alveolares e em seguida convertidos em leveduras (so capazes de se replicar dentro dos macrfagos). Nos imunocompetentes os macrfagos controlam a infeco eliminando as hifas. No imunocomprometido a infeco prossegue. Com o tempo ocorre dissiminao linftica. Trata-se de um fungo altamente infeccioso que causa infeco pulmonar aguda, porm benigna em pessoas saudveis. Culturas de sangue, de medula, de escarro e de LCR podem conter Histoplasma no paciente suspeito, mas a bipsia e o exame histolgico da medula, fgado e de linfondos so, muitas vezes, necessrios para chegar a um diagnstico definitivo.

Fonte: Robbins, 2005

Histoplasma capsulatum colonizando linfonodo de paciente imunocomprometido

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CORRELAES CLNICAS: Alm do Histoplasma capsulatum, quais outros agentes etiolgicos de infeces tambm so parasitas intracelulares de macrfagos?

c) Aspergilose O Aspergillus sp. ubiquitrio no meio ambiente e faz parte da microbiota normal do organismo humano. Seus esporos so regularmente inalados sem conseqncias danosas. um gnero que contm vrias espcies, das quais a que merece maior destaque o Aspergillus fumigatus, que pode provocar diversas manifestaes patolgicas, tais como: - Aspergilose broncopulmonar alrgica, que, como seu nome sugere, uma resposta alrgica presena do antgeno. Aspergillus nos pulmes podem desencadear um processo de hipersensibilidade tipo I e culminar em asma brnquica. O mecanismo da asma ser abordado em seminrios da disciplina de Imunologia Mdica (BP336). - Aspergiloma em pacientes com cavidades pulmonares preexistentes (ex: seqela de TB) ou distrbios pulmonares crnicos. O fungo coloniza a cavidade e cresce para produzir uma massa de hifas em forma esfrica, a qual denominada aspergiloma. Esses fungos no invadem os tecidos pulmonares, porm o tamanho do aspergiloma pode desencadear dificuldade respiratria. - Doena disseminada no paciente imunocomprometido quando o fungo invade a partir dos pulmes. A aspergilose invasiva geralmente fatal no imunocomprometido, pois os pacientes so neutropnicos (com poucos neutrfilos circulantes). As hifas deste fungo, quando crescem, destroem alvolos e septos alveolares. O crescimento das hifas em ngulo de 45, o que acaba por destruir a arquitetura pulmonar.

Fonte: Mims, 2005

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d) Pneumocistose O Pneumocystis jiroveci (antigamente chamado de Pneumocystis carinii) um fungo atpico, comumente encontrado em seres humanos normais e roedores. A infeco transmitida por meio de gotculas respiratrias (aerossis). A doena ocorre em indivduos debilitados e imunodeficientes. Antes do advento da terapia antiretroviral altamente ativa, a terapia HAART (que ser discutida nos seminrios de Imunologia Mdica), uma alta proporo dos pacientes com AIDS desenvolvia pneumonia por pneumocistos, podendo ser fatal. Apenas causa doena sintomtica em pessoas com a imunidade celular deficiente. O Pneumocystis sp. ocorre em uma forma trfica, com at 5 m de dimetro, na forma de esporocistos e reservatrios de esporos. Os esporos so liberados quando estes reservatrios se rompem. A doena est associada a uma pneumonite instesticial, com infiltrao de plasmcitos. J foram relatadas infeces em locais diferentes que no o pulmo.

CORRELAES CLNICAS: Fazem pneumonia: Pneumocystis, Histoplasma, Aspergillus, Candida e Paracococcidioides, este ltimo, tambm em imunocompetentes. Para tratar, pneumonia fngica o pior tipo de pneumonia que existe. As bacterianas so infinitamente mais fceis de curar com os antimicrobianos. A classe de drogas de primeira escolha em pneumonia bacteria so as quinolonas de 3, 4 e 5a gerao (levofloxacino, moxifloxacino e gemifloxacino respectivamente). A tigeciclina uma alternativa em teste. Nos casos de pneumonias fngicas, os frmacos de escolha ainda so os derivados imidazlicos tradicionaos de grande abrangncia (Itraconazol). A anfotericina B pode ser uma arma de retaguarda. No entanto, a partir de 2007 surgiram novas drogas triazlicas no mercado farmacutico que prometem dar uma nova abordagem ao tratamento dessas pneumonias. O voriconazol e o posoconazol so exemplos delas. Todavia, o tratamento com esses antifngicos de custo muito elevado e no pode ser bancado pela grande maioria dos pacientes. Paciente portador de pneumonia fngica deve necessriamente ser submetido a exames para investigao de imunossupresso, incluindo o anti-HIV (ELISAWestern Blot). Pneumonia em paciente idoso: investigar infeco por fungos. Em especial o Aspergillus fumigatus. As drogas referidas como glicocorticides so a dexametasona, a betametasona, a prednisona, a mimetasona, a predinisolona, etc. Essas drogas mimetizam a atividade cataltica dos glicocorticosterides produzidos pelos espongicitos da camada fasciculada do crtex da glndula adrenal. So muito utilizados no tratamento das doenas auto-imunes. Seus efeitos so antiinflamatrios e imunossupressores. Antiinflamatrios por fazerem inibio da enzima fosfolipase A2, assim interferindo no metabolismo do cido aracdnico, como foi visto nas aulas de Patologia Mdica Molecular (BP337). E imunossupressores

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porque essas drogas interferem na ao do IFN nos macrfagos, suprimindo sua atividade como clula apresentadora de antgeno e silenciando a transcrio dos genes do MHC. Assim, toda a atividade imunolgica do indivduo estar comprometida enquanto ele estiver fazendo o uso deste medicamento. Haver uma aula terica dentro da disciplina de Imunologia Mdica (BP336) para abordar este tema. Para pensar: O tratamento das hepatites virais, como a hepatite B feito com altas doses de IFN (interferon). Na sua prtica clnica, chega a voc, mdico, um paciente portador de HBV com um quadro de esteatose avanada. Porm, ele portador de artrite reumatide (uma das doenas auto-imunes que tratada com glicocorticides). Com base no mecanismo de ao descrito acima e aprofundado nas aulas de Imunologia Mdica, voc prescreveria o uso prolongado de IFN para este paciente? Por qu?

Drogas Antifngicas

A base do tratamento delas inibir a sntese do esgosterol da membrana celular do fungo. Porm, esse ergosterol muito parecido com a nossa molcula do colesterol. Por sinal, ele tem a mesma funo do colesterol nas membranas celulares animais. A droga se confunde e destri ambos os lipdeos. Por isso dizemos que os antifngicos atingem tanto o hospedeiro como o fungo. Principais grupos de drogas:

1) Agentes polinicos Anfotericina B Mecanismo de ao: liga-se ao ergosterol da MP do fungo. Efeitos colaterais: hipotenso, dor abdominal, reaes alrgicas, anemias, leso renal. Padro ouro para cndida, ao lado do Itraconazol. Tambm usada no tratamento de Leishmanioses. CURIOSIDADE, MAS IMPORTANTSSIMO: Anfotericina B no pode, em hiptese alguma, ser administrada em pacientes que fazem uso de digitlicos cardacos (digoxina), pois potencializa a ao e pode causar intoxicao digitlica. NO MATEM SEUS PACIENTES! 2) Nistatina Mecanismo de ao: impede a ligao ao ergosterol da MP fngica.

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3) Flucitosina Mecanismo de ao: inibio da sntese de cidos nuclicos, porm sua toxicidade seletiva. Pode ser utilizada no tratamento da candidase sistmica. Efeitos colaterais: depresso da medula ssea, anemias e discrasias sangneas. 4) Derivados azlicos: Cetoconazol, Miconazol, Clotrimazol, Fluconazol, Itraconazol Mecanismo de ao: inibio da sntese de ergosterol 5) Novas drogas triazlicas: voriconazol e posaconazol (um dos antifngicos mais fortes que existem). So muito caros. Terapia para 5 dias: R$3.000,00 (em 2007).

CORRELAES CLNICAS: Efeito colateral dos antifngicos: quase todos eles deixam resduos metablicos na cavidade bucal, fazendo com que o paciente sinta um gosto amargo de metal durante o tratamento (o que s vezes dificulta a adeso ao mesmo). So medicamentos que em geral tm melhor absoro em pH cido. Portanto bom recomentar o paciente tomar o medicamento junto s refeies, ou com refrigerante do tipo cola. O que o trocisco?

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CAPTULO 15: HERPES-VRUS

HHV-1 ou HSV-1: Herpes Simplex Vrus 1 (Herpes bucal no oral) HHV-2 ou HSV-2: Herpes Simplex Vrus 2 (Herpes Genital - hoje em dia 1 e 2 esto em conflito no stio por causa do sexo oral). Pode fazer carcinoma genital. HHV-3 ou VZV: Varicela Zoster Vrus HHV-4 ou EBV: Epstein-Barr Vrus (Mononucleose infecciosa) HHV-5 ou CMV: Citomegalovrus (Mononucleose tambm, de maneira siminar) HHV-6: Causa rosola infanto HHV-7 HHV-8: Pode causar o Sarcoma de Kaposi EBV e CMV Muito comuns e importantes. Eles causam a mononucleose infecciosa (esse termo mais usado para o EBV), conhecida tambm como doena do beijo (tambm mais usado para o EBV). Ela transmitida beijando, via saliva. O CMV tambm pode ser transmitido pelo sangue, urina, smen e secrees cervicais. o maior herpes vrus humano e s tem um sorotipo. O nome refere-se a incluses intranucleares que so respostas caractersticas desse patgeno.

Fonte: Fernando Bortolozzi

Doena de incluso citomeglica em pulmo de perinato. Comparar o tamanho desta clula setada com as demais. CitoMEGALOvrus.

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A infeco pelo CMV geralmente assintomtica. Uma infeco muitas vezes silenciosa do trato respiratrio superior. Dissemina-se via linfcitos e moncitos (os MONOMORFONUCLEARES, MMN) e envolve linfonodos e bao (defesa secundria e terciria). O vrus condiciona-se a clulas epiteliais, glndulas salivares, tbulos renais, colo uterino, testculos e epiddimo. H febre e letargia. Esses vrus "escapam" das defesas imunolgicas. So alvos ruins para as clulas T citotxicas por interferirem no transporte de molculas do MHC-I e induzem a transcrio de genes que codificam receptores Fc, e estes so expressos nas clulas infectadas.

EBV Epstein Barr Vrus

- transmitido pela saliva. Conhecida como a DOENA DO BEIJO. - S tem um sorogrupo. Antigenicamente diferente do CMV. - Utilizados no diagnstico: o capsdeo viral (VCA), os antgenos precoces (EA) que so produzidos antes da sntese do DNA viral e os antgenos nucleares associados ao EBV (EBNA), que esto no ncleo das clulas infectadas.

ANTICORPOS HETEROFLOS O EBV se multiplica nos linfcitos B (eles tem na membrana um receptor, o C3d (CD21), que se liga ao vrus). Os linfcitos T respondem imunologicamente s clulas B infectadas (aumentanto cerca de 50 vezes em nmero) e aparecem no sangue perifrico como "linfcitos atpicos do EBV". Essa doena uma verdadeira "guerra civil imunolgica". Digamos que as clulas T no se habituam com as clulas B infectadas em fazem um confronto por meio de citocinas. E essas citocinas das clulas quem causam os sintomas da doena, semelhante aos estragos que as armas blicas fazem numa regio onde est tendo uma guerra. Os linfcitos T em guerra so denominados de clulas de Downey. Esses linfcitos B infectados so estimulados a diferenciar-se e produzir anticorpos (ativao policlonal das clulas B, O QUE RESPONSVEL PELA FORMAO DOS ANTICORPOS HETERFILOS DO EBV reao com eritrcitos de carneiro ou de cavalo). Auto anticorpos tambm so produzidos, como o IgM para eritrcitos (crioaglutininas).

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Linfcitos atpicos do EBV

Fonte: Robbins, 2005

Fonte: Mims, 2005

Os anticorpos heterofilos so detectados pela Reao de Paul Bunnel (>40 positivo; <40 negativo) Esses anticorpos podem aparecer na mononucleose infecciosa (+++), na doena do soro (+++) e mesmo em indivduos normais (+). O mdico dever pedir IgM contra o capsdeo viral para o diagnstico, bem como o IgG. Hemograma til por causa da formao dos linfcitos atpicos. Outros achados clnicos incluem a esplenomegalia, hepatomegalia e linfadenopatia. No h antiviral eficaz contra o EBV, o que faz com que a doena siga seu curso autolimitado em pacientes sadios e no-imunocomprometidos. Autolimitada uma doena que se cura sem interveno medicamentos. Ex: gripe, varicela.

NEOPLASIAS INDUZIDAS PELO EBV Linfoma de Burkitt: s o EBV no consegue fazer o linfoma. Ele se associa com algumas espcies de Plasmodium sp. como o Plasmodium falciparum ou o Plasmodium infantum, enfraquecendo o controle das clulas T e talvez causando ativao policlonal das clulas B, tornando-as suceptveis a maior formao neoplsica. O DNA e o RNA transcritos so encontrados nas clulas tumorais, que tambm mostram uma translocao dos oncogenes myc no cromossomo 8 para o locus da cadeia pesada da imunoglobulina localizada no cromossomo 14.

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Fonte: Robbins, 2005

Fonte: Robbins, 2005

Resultado =
Fonte: Bogliolo, 2006 Fonte: Mims, 2005

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Carcinoma Naso-Faringeal: O DNA do EBV detectvel nas clulas tumorais, e um cocarcingeno, possivelmente de nitrosaminas ingeridas com peixes em conserva. Fatores genticos do hospedeiro que controlam o HLA (human leucocyte antigen) e a resposta imune podem ser fatores de suceptibilidade. HHV-2 faz carcinoma genital e HHV-8 faz Sarcoma de Kaposi.

CORRELAES CLNICAS: Antes de chegar a estas aberraes, temos como obrigao fazer o diagnstico. Boa anamnese e bom exame fsico so essenciais.

Fonte: Mims, 2005

esquerda, a MEMBRANA nas tonsilas palatinas ocasionada pelo EBV; direita, as placas proporcionadas pelo j conhecido de vocs, Streptococcus pyogenes (Estreptococo beta hemoltico do grupo A de Lancefield), entre outros agentes. Vo prescrever antibiticos para qual dos dois quadros mesmo? Clnica sem diferenciao: Infeces por Streptococcus pyogenes / Haemophilus influenzae / Moraxella catarrhalis

Fonte: Fernando Bortolozzi

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS PARA ATUALIZAO DO MATERIAL EM 2008

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