Apostila Pratica Vet

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA
CURSO: MEDICINA VETERINRIA

APOSTILA
DE
AULAS PRTICAS

- DISCIPLINA -
BACTERIOLOGIA

MEDICINA VETERINRIA

ORIENTADOR DIDTICO: PROFESSOR ALOYSIO CERQUEIRA
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ASSUNTO
- Material utilizado nas prticas de Bacteriologia
- Tcnica e Processos de Assepsia em Bacteriologia
- Microscopia

OBJETIVOS

1- Apresentar a vidraria e outros materiais de uso corrente em um laboratrio de
Microbiologia.
2- Executar tcnicas de preparo de material e montagem para esterilizao.
3- Treinar tcnicas de distribuio assptica.
4- Evidenciar a existncia de bactrias no ar, roupas, etc.
5- Explanao sobre o microscpio.

FUNDAMENTAO TERICA

Tcnicas de Assepsia

fundamental tomar certos cuidados com a assepsia durante os procedimentos realizados
num laboratrio de Microbiologia, a fim de se evitar contaminao de materiais e erros nos
resultados finais. Estes cuidados incluem:

Desinfeco da bancada e das mos antes e depois da prtica executada
Trabalhar na rea estril ao redor do Bico de Bunsen
Esterilizar alas e agulhas antes e depois do seu uso.
Flambar bocas de tubos e frascos antes e depois das inoculaes

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Cuidados de assepsia na remoo de bactrias

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O Bico de Bunsen

O bico de Bunsen utilizado nos laboratrios de bacteriologia para evitar a contaminao
do manipulador, do material esterilizado ou das culturas de microrganismos, a fim de evitar a
penetrao de um microrganismo num local que no o contenha.
Deve-se deix-lo na chama azul, que mais quente que a laranja. Ele cria uma rea de
segurana (estril) de 10 cm de raio ao seu redor, porque o ar frio chega (com microorganismos em
suspenso) e ao esquentar, se dispersa, dispersando com ele os microorganismos.
As manipulaes devem ser feitas, preferencialmente, por trs da chama do bico de Bunsen.

A ala e a agulha de platina

A platina ou o ao (mais freqentemente usado) so os materiais ideais porque esquentam e
esfriam rapidamente. As alas e agulhas bacteriolgicas so feitas de fio de platina, de calibre 24 a
26, fixados a um suporte. Nas alas, o fio de platina fechado na extremidade em forma circular,
com um dimetro de 2a 3 mm, onde cabe um inoculo de 10 milhes de bactrias.
A ala utilizada para repique e semeadura de bactrias em meios lquidos e slidos. Para
sua esterilizao, devem ser flambadas no Bico de Bunsen at ficarem rubras, num aquecimento
progressivo da base para a ponta, para evitar a formao de aerossis. Aps flambar, deve-se deix-
las esfriar um pouco na rea de segurana antes de iniciar os procedimentos nos meios de cultura.

MATERIAL

- Vidrarias.
- Outros materiais de uso em um laboratrio de Microbiologia.
- gua peptonada.
- Placas de Petri com gar simples.
- Pipetas e tubos de ensaio estreis.
- Papel, barbante, algodo cardado, gaze.

PRTICA PARA EXECUTAR

A. Apresentao da vidraria e outros objetos de uso freqente nos laboratrios de Microbiologia.
B. Demonstrao, pelo professor, de uma cadeia de assepsia nos trabalhos microbiolgicos.
C. Cada grupo de alunos treinar, com gua peptonada, as tcnicas de distribuio assptica, usando
pipetas. Deixar os tubos em temperatura ambiente por no mnimo 48 horas.
D. Expor placas de gar simples (1 por grupo) ao ar por diferentes espaos de tempo. Deixar
temperatura ambiente o mnimo de 48 horas.
E. Evidenciar bactrias da pele, roupa, bancada em meio gar simples.
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F. Montagem de vrios materiais (tubos, placas, pipetas) para esterilizao.

RESULTADOS E OBSERVAES

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ASSUNTO
- Meios de Cultura
- Tcnicas de Semeadura

OBJETIVOS

1- Explanao sobre os principais meios de cultura empregados em laboratrios de
Microbiologia
2- Identificao das tcnicas de semeadura mais empregadas na rotina bacteriolgica
3- Cultivo de bactrias com finalidade de obteno de cultura pura, ou seja, uma populao
onde todas as bactrias se originam de uma nica clula bacteriana.

FUNDAMENTAO TERICA

Meios de cultura

O estudo das bactrias necessita normalmente do seu prvio isolamento e identificao.
Para tanto diversos meios de cultura so utilizados. Define-se meio de cultura como uma mistura de
nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrognio, sais minerais e gua, que propiciam o
crescimento in vitro de bactrias.
A maioria das bactrias cresce em meios de cultura. Excees so as riqutsias e clamdias
que por serem parasitas intracelulares obrigatrios s se desenvolvem in vitro em meios celulares
(cultivo celular, ovos embrionados), Mycobaterium leprae e Treponema pallidum.
A inoculao das bactrias em diferentes meios envolve vrias tcnicas de semeadura. Toda
a manipulao de culturas bacterianas, meios e instrumental necessrio deve ser feita seguindo-se os
procedimentos bsicos de assepsia e antissepsia, visando evitar qualquer tipo de contaminao.

Classificao dos meios de cultura
A) Quanto composio:
A.1) Naturais so aqueles de origem vegetal (um pedao de batata, po, frutas)
ou animal (gema de ovo).
A.2) Artificiais so aqueles constitudos de substncias qumicas podendo ser
definidos ou indefinidos (complexos).
Definidos: sabido toda a sua composio qumica.
Indefinidos ou Complexos: desconhecido por si. Sabe-se apenas
aproximadamente sua composio. Os meios utilizados na rotina so complexos.

B) Quanto ao seu estado fsico:
Lquido so os caldos, desprovidos de Agar. Utilizados para transporte e para
bactrias que j sofreram a ao de antimicrobianos.
Semi-slido so aqueles que apresentam em sua composio at 1% de Agar.
Geralmente utilizados para bactrias microaerfilas.
Slido so aqueles que apresentam em sua composio 1,5 a 2,5% de Agar.

OBS: O Agar um polissacardeo extrado de algas, utilizado para solidificar os meios e que
escolhido por no reagir com nenhuma bactria e por ser altamente resistente a variaes.

C) Quanto finalidade e caractersticas:
Simples contm apenas componentes bsicos para o crescimento de uma bactria.
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Enriquecido meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a
bactria pela adio de substncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro, leite. De uso
freqente para bactrias de difcil crescimento (fastidiosas).
De enriquecimento meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactrias
acompanhantes e permitir o crescimento da bactria alvo que se pretende posteriormente
isolar, aumentando assim a proporo desta em relao s demais. Por ser um meio lquido
no se destina ao isolamento da bactria.
Seletivo contm substncias seletivas que inibem o crescimento de certas bactrias
e permitem o crescimento de outras. So meios slidos e tm como objetivo isolar culturas
puras.
Indicadores meios que permitem a diferenciao visual do crescimento bacteriano
facilitando a sua identificao. Freqentemente os meios seletivos so tambm indicadores e
todos os meios utilizados na confirmao bioqumica dos isolamentos so indicadores. A
indicao mais freqente a alterao de cor do meio por mudana no pH do mesmo,
podendo ainda ser a produo de gs, precipitao de componentes do meio por atividade
proteoltica e lipoltica das bactrias, etc...
Estoque so meios normalmente semi-slidos com a finalidade de preservar uma
cultura bacteriana pura para posteriores utilizaes no laboratrio.

Tcnicas de semeadura

Procedimento para remover bactrias de um caldo com a ala de platina
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A finalidade bsica das tcnicas de semeadura permitir a transferncia (inoculao) de
bactrias ou de uma cultura bacteriana de um material (secreo, alimento, etc) ou de um meio de
cultura para outro (s) garantindo que apenas os microrganismos em questo sejam semeados.
De acordo com o tipo de meio de origem e destino bem como da finalidade especfica da
inoculao, diferentes tcnicas so executadas, a saber:

I - Semeadura em meios slidos

A. Meio Inclinado em tubos (utilizar ala ou agulhas)

o Em estria sinuosa: semear com ala de platina, em ziguezague, partindo da
base para a extremidade da superfcie inclinada do meio. Este tipo de semeadura permite a
obteno de intensa massa de microorganismos.

o Em estria reta: semear com agulha de platina, em estria reta, partindo da base
para a extremidade da superfcie inclinada do meio, ou em profundidade e superfcie. Este
tipo de semeadura utilizado quando se necessita um inoculo pequeno de bactrias, como
em provas bioqumicas para identificao bacteriana.

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Procedimento para inocular um meio Agar inclinado a partir de uma Placa de Petri

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Procedimento para repique de um meio inclinado para outro

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B. Meios em p (camada alta)

o Em picada em profundidade: com agulha de platina perfurar o centro do
meio, sem movimentos de lateralidade e fazer o inoculo penetrar de 0,5 a 1,0 cm no centro
do meio de cultura. Este tipo de semeadura bastante utilizado para conservao de
bactrias no meio de cultura e quando o meio utilizado semi-slido, esta semeadura
utilizada para a verificao da motilidade (As bactrias que cresceram somente ao redor do
pico de semeadura no so mveis).

C. Em Placa de Petri

C.1. Em superfcie

o Estrias mltiplas ou esgotamento: faz-se o inculo num ponto da
superfcie do meio espalhando-se o mesmo por estrias em toda a placa, de modo a
gradativamente esgotar o material contido no inculo. Preferencialmente usa-se um
esquema de diviso da placa em 4 quadrantes sendo que a estria de cada quadrante toca no
final da estria do quadrante anterior arrastando bactrias deste ltimo. Nesse caso, deve-se
flambar a ala aps a inoculao de cada quadrante. Pode-se tambm optar por no tocar no
final da estria do quadrante anterior, no sendo assim necessrio flambar a ala aps cada
quadrante. A estria do ltimo quadrante ocupa a maior parte da placa. Alternativamente
pode-se fazer 3 estrias, a primeira ocupando metade da placa e as outras duas um quarto da
placa cada. Neste modo as estrias no se tocam. Este tipo de semeadura empregado para o
isolamento de colnias bacterianas e obteno culturas puras.
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o Por distenso: com pipeta, colocar no centro da superfcie do meio 0,1 mL da suspenso e
espalhar uniformemente com swab ou ala de Drigalski. Com swab, obteremos crescimento
confluente, para realizao de antibiogramas, por exemplo. Com ala de Drigalski,
utilizamos para obteno de colnias dispostas de modo regular para contagem.

C.2. Em profundidade ou disseminao

o Pour plate: depositar na placa de Petri 0,1/ 1,0 mL da suspenso bacteriana. Adicionar 10
mL do meio fundido (O Agar funde a 85 C) em tubo de ensaio e resfriado a 45-50 C.
Homogeneizar com movimentos giratrios da placa sobre uma superfcie plana.Utilizado
para isolamento, contagem e identificao bacteriana, conforme o meio de cultura utilizado.
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Pour Plate
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Inoculao na Placa de Petri

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D. Repique por pescaria: colnia em placa de Petri retirada atravs de uma agulha para um meio de
cultura lquido ou slido. Mtodo empregado para isolamento bacteriano.

II. Semeadura em meios lquidos

o Difuso: com ala de platina ou pipeta, introduzir o inoculo (>0,1 mL) na massa do meio,
esfregando contra o interior do tubo na rea exposta pela inclinao do mesmo em 30.
Aps se recolocar o tubo na posio vertical, as bactrias inoculadas se difundem para o
meio. Este tipo de semeadura empregado para obteno do crescimento bacteriano (o
meio fica turvo se houve crescimento). um repique normal.

MATERIAL

- Tubos de ensaio com caldo simples, Agar simples e Agar semi-slido.
- Placas de Petri com Agar simples.
- Culturas bacterianas em caldo simples, Agar simples (em placa de Petri).
- Ala e agulha de platina.


Definir meio de cultura, cultivo e condies necessrias ao crescimento de
microorganismos (pH, presso osmtica, temperatura de incubao, etc.).
Classificao dos meios de cultura quanto origem, estado fsico, fora seletiva.
Seqncia da preparao dos meios.

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ASSUNTO
- Bactrias no Ambiente

OBJETIVOS
Aps a realizao da atividade prtica voc dever ser capaz de constatar a presena de
bactrias no ambiente; compreender a importncia dos critrios bsicos de higiene na produo e
manipulao de alimentos, visando evitar a contaminao dos mesmos por bactrias ambientais.

FUNDAMENTAO TERICA
A presena de bactrias pode ser verificada em quase todos os ambientes, no solo, na gua, no
ar e colonizando o nosso corpo (ex: trato gastrointestinal, pele). Freqentemente tais bactrias no
esto associadas a nenhum prejuzo.
A microbiota intestinal desempenha importante papel na defesa do organismo contra certas
infeces; existem estudos que sugerem que a microbiota normal estimula o desenvolvimento das
defesas imunolgicas. Ao mesmo tempo em que desenvolve atividades benficas, a microbiota pode
ser responsvel por uma srie de doenas oportunistas que podem ser relacionadas, por exemplo, ao
uso constante de drogas imunossupressoras, antibiticos e internaes em UTI.
Muitas infeces causadas por bactrias so adquiridas por contato direto ou veiculadas por
alimentos. Ao contrrio do que se pensava antigamente, a disseminao de bactrias patognicas
pelo ar e poeira no ocorre com grande freqncia, pois de um modo geral, no sobrevivem por
longos perodos no ambiente externo. Entretanto, estas vias de transmisso podem ser de grande
importncia em determinadas situaes. No caso de bactrias esporuladas a transmisso area
mais importante. Os alimentos so uma importante via de transmisso de doenas bacterianas como
a shigelose e a salmonellose.
MATERIAL
- 01 placa com Agar simples divididas em 4 quadrantes
- 01 placa com Agar simples
- 01 swab estril


A) Inocular em cada quadrante, respectivamente:
- a impresso do dedo polegar
- um carimbo do tecido do jaleco
- alguns fios de cabelo
- um swab previamente passado sobre a bancada de trabalho
Incubar a 37
o
C por 24 horas
Analisar o crescimento obtido

B) Abrir as placas, fora da rea de segurana, deixando cada uma por 5, 10, 15 e 20, fechando
quando atingido o tempo respectivo. Incubar a 37
o
C por 24 horas e analisar o crescimento obtido.

5 min 10 min 15 min 20 min
1.
DEDO
2.
JALECO
3.
BANCADA
4.
CABELO
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ASSUNTO
- Esterilizao e Desinfeco
- Ao dos Agentes Fsicos e Qumicos sobre as Bactrias

OBJETIVOS

1. Verificar a eficincia de agente qumico sobre as bactrias
2. Verificar a eficincia de agente fsico sobre as bactrias

FUNDAMENTAO TERICA

As taxas de crescimento e morte microbianas so fortemente influenciadas por vrios
fatores ambientais. O controle microbiano compreende uma srie de procedimentos com a
finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir ou impedir a multiplicao de
microrganismos existentes em um determinado equipamento, ambiente, em alimentos ou em
superfcies vivas. de extrema importncia apresentando inmeras aplicaes prticas na rea
mdica.
importante inicialmente definir alguns termos utilizados no controle microbiolgico:
A) Desinfeco reduo do nmero de microrganismos em superfcies inanimadas (ambiente ou
materiais) e conseqente eliminao de sua potencialidade infecciosa.
B) Sanitizao mesmo significado de desinfeco, porm utilizado rotineiramente em indstria de
alimentos.
C) Antissepsia reduo do nmero de microrganismos em tecidos vivos.
D) Esterilizao destruio ou remoo completa dos microrganismos em ambientes ou materiais.
E) Assepsia Ausncia de microrganismos. As tcnicas asspticas representam uma srie de
cuidados que previnem a contaminao.

O controle de microrganismos pode ser feito por agentes fsicos ou qumicos.

Controle Microbiano por Agentes Fsicos

o Calor

o mtodo mais empregado para destruio de microrganismos por ser barato, eficaz e
prtico. Quando se tem finalidade esterilizante deve ser calculado para a destruio das formas
esporuladas de bactrias, mais resistentes. Pode ser utilizado na forma de calor seco ou calor mido
em funo da presena de gua. O primeiro mata as bactrias por oxidao protica enquanto o
segundo por desnaturao protica. Alm disso, o calor mido um mtodo de maior eficincia
devido gua ser um melhor condutor de calor do que o ar.

Calor Seco: na ausncia de gua
- Flambagem: contato direto do material a ser tratado com o fogo. um tipo de esterilizao.
- Forno ou Estufa: material submetido a uma temperatura de 170 a 180
o
C por 1 - 2 horas.
um tipo de esterilizao, porm no qualquer material que pode ser submetido a esse tratamento.
Utilizado principalmente para vidraria e metais (instrumentos cirrgicos p. ex.).
- Incinerao: a queima total de um material. Mtodo utilizado com materiais descartveis,
principalmente aqueles materiais hospitalares.

Calor mido: na presena de gua (ou vapor dgua)
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- <100
o
C: pasteurizao (mtodo desinfetante). Muito utilizado para alimentos e bebidas. A
pasteurizao rpida do leite emprega uma temperatura em torno de 72
o
C por 15 a 20 segundos,
seguida de resfriamento rpido. A pasteurizao consegue eliminar cerca de 99,5% de
microrganismos, porm aqueles esporulados so termoresistentes, conseguindo resistir a esse
tratamento.
- =100
o
C: fervura (mtodo desinfetante). O alimento submetido a uma temperatura igual a
100
o
C por at 15 minutos. Eficiente contra as formas vegetativas bacterianas, mas no destri
completamente as formas esporuladas.
- >100
o
C: autoclavao (mtodo esterilizante). Os materiais e alimentos so submetidos a
uma temperatura em torno de 121
o
C por 15-30 minutos, um tempo e temperatura bem inferiores
queles empregados em calor seco. Isso possvel pelo emprego de alta presso interna (1 ATM) na
autoclave. A autoclave similar a uma panela de presso.

o Radiao

Ultravioleta (radiao no ionizante): Possui uma atividade mxima num comprimento de
onda de 260nm. Geralmente so desinfetantes e usados em ambientes.
- Limitao: no tem poder de penetrao, tudo que estiver embalado ou protegido por vidro no
desinfetado. Aps umas 200 horas de uso da lmpada sua eficincia diminuda.
- Por que mata? Ela penetra nos microrganismos e captada pelos seus cromossomos, causando
mutao letal por ser absorvida diretamente.

Radiao Gama (radiao ionizante): um mtodo de esterilizao mais energtico que as
radiaes UV, com menor comprimento de onda e desequilibra quimicamente as clulas
irradiadas. Todos os seus componentes qumicos podem ser alterados. Muito utilizado para
esterilizao de produtos hospitalares descartveis.

o Filtrao

Mtodo utilizado principalmente para materiais lquidos, que so alterados pelo calor.

Clarificantes: so os filtros domsticos, retm as impurezas grosseiras, so desinfetantes.

Esterilizantes: possuem poros iguais ou menores a 1 m podendo reter inclusive alguns
vrus.

o Outros

Presso Osmtica (Salga); Dessecao; Uso de baixas temperaturas (refrigerao,
congelamento).

Controle Microbiano por Agentes Qumicos

o Fenis e derivados

um desinfetante fraco, porm utilizado como um desinfetante de referncia para ser
comparado com outros produtos.
Atuao: fenis/cresis desnaturam protenas.
OBS: Dos cresis o mais importante a creolina, utilizada para pisos e sanitrios. O hexaclorofeno muito
usado na antissepsia cirrgica.
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o lcool Etlico

Possui vrios mecanismos de ao, sendo relativamente eficiente. So solventes de lipdios (ao
detergente), desidratantes (retiram a gua das clulas) e desnaturam protenas. O lcool etlico pode ser usado
como desinfetante ou anti-sptico. O lcool absoluto (no hidratado) fraco germicida. Um lcool
parcialmente hidratado (60- 70%) mais ativo que o absoluto, pelo maior poder de penetrao e conseqente
desnaturao protica mais rpida.

o Cloro / Iodo (Halognios)
- O Cloro desinfetante de guas, alimentos e pisos. Mecanismo de ao oxidao.
- O mecanismo de ao do Iodo a sua combinao irreversvel com protenas atravs da
interao com aminocidos aromticos, fenilalanina e tirosina, levando desnaturao das
mesmas. um dos anti-spticos mais utilizados na prtica cirrgica.

o Detergentes catinicos (agentes de superfcie)
Alteram a permeabilidade de membrana (ex: compostos quaternrios de amnio cloreto de
benzalcnio). Mais ativo contra Gram negativos.

o Sais de Metais Pesados
- Mercrio (Hg): anti-sptico. Em desuso pelo risco de intoxicao por absoro.
- Sulfato de Cobre (CuSO
4
): desinfetante para guas de recreao.
- Nitrato de Prata (AgNO
3
): anti-sptico. altamente eficiente contra gonococos, que causam
oftalmia em recm-nascidos.
Atuao: afinidade por protenas, inativando enzimas, por isso importante no ingeri-los.
Uso tpico apenas.

o cidos orgnicos e inorgnicos
Freqentemente usados na conservao de alimentos. Ex: cidos actico, ltico, benzico.

o lcalis
- Hidrxido de Sdio (NaOH) =presente nos sabes conferindo a estes a sua relativa ao
anti-sptica.
- Outros: KOH, Ca (OH)
2

o Corantes Bsicos
Mais eficientes contra Gram positivos. Ex: Cristal Violeta, Azul de Metileno.

o Oxidantes e Redutores
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A clula microbiana est em equilbrio, oxidantes e redutores rompem esse equilbrio,
matando a clula.
- Oxidantes: oxidam componentes celulares levando morte das clulas. Ex: Oznio (O
3
), gua
oxigenada (H
2
O
2
), permanganato de potssio, perxido de zinco. Usados como anti-spticos.
- Redutores: reduzem compostos celulares levando morte das clulas.
Aldedos e derivados:
- Formaldedo/ formalina: muito irritante, So usados para desinfetar paredes e pisos.
-Glutaraldedo: mais ativo e menos txico que o formaldedo. Esporocida aps 6 horas de
contato.
xido de Etileno (gs):
um agente alquilante, inativando protenas e cido nuclico. Usado em um recipiente
fechado que recebe todo material a ser utilizado (contm algumas ampolas de xido de etileno
lquido), temperatura de 52
o
C, este lquido torna-se gasoso, assim, seus vapores so esterilizantes.
Usado para esterilizao de materiais de borracha ou plstico.

o Antimicrobianos
Ao contrrio dos anteriores possuem ao seletiva contra microrganismos por isso no sero
discutidos neste assunto.

MATERIAL

- Placas de Petri com Agar simples ou caldo simples
- Culturas de E. coli e Bacillus sp
- Solues antisspticas
- Gaze
- Trip, tela de amianto e panela.

Prtica para executar

a. Definio de alguns termos utilizados no controle da populao microbiana:
- Agente antimicrobiano, assepsia, assptico, antissepsia, bactericida, bacteriosttico,
desinfeco, esterilizao, germicida, saneador, sanitizao.
- Agentes fsicos: radiaes, calor, filtrao.
- Agentes qumicos

b. Atividade antissptica do sabo, lcool e lcool iodado:

- Observao de existncia de bactrias na superfcie do dedo:

1. Pegar uma placa de Agar simples e fazer a semeadura utilizando a ponta do polegar (fazer a
impresso digital suavemente para no ferir a camada do meio de cultura).
2. Em seguida, lavar o dedo com sabo.
3. Aps 1 minuto, fazer a impresso digital no 2 quadrante da placa.
4. Repita a operao com os demais antisspticos (lcool e lcool iodado)
5. Incubar a placa a 37 C por 24 horas.
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c. Atividade do agente fsico: calor

1. Cultura de E. coli em caldo. Para o primeiro inculo, marcar t =zero, colocar o tubo em
gua fervente por 5, 10 e 20 minutos.
2. Aps cada intervalo de tempo retirar um inculo marcando t
5
, t
10
,e t
20
. Incubar a 37 C
por 24 horas.
3. Repetir a tcnica com a cultura de Bacillus sp.

d. Atividade de diferentes agentes qumicos:

1.Semear uma cultura bacteriana com swab (para crescimento confluente) em uma placa de
Petri com Agar simples.
2.Assepticamente, com pina, embeber discos de papel de filtro com diferentes agentes
qumicos.
3. Colocar os discos eqidistantes na placa semeada.
4. Incubar a 37 C por 24 horas.
5. Leitura e interpretao dos dados obtidos.

B A
C D
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ASSUNTO
- Diluio
- Contagem de u.f.c.viveis
- Obteno de Cultura Pura

OBJETIVOS

1. Metodologia de Diluies
2. Plaqueamento para contagem de u.f.c. viveis
3. Contagem de u.f.c. viveis
4. Obteno de cultura pura

MATERIAL

- Tubos com 9mL de salina
- Placas de Petri com Agar simples
- Alas de Drigalski
- Cubas com lcool 70
- Agar inclinado
- Caldo simples
- Cultura bacteriana em caldo
- Pipetas de 1mL


a. Diluio ( necessria para diminuir o nmero de bactrias no inculo, facilitando a contagem)
A partir da cultura bacteriana, inocular 1mL do caldo em 9mL de salina (que deve estar morna),
homogeneizar, retirar 1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina...
Obtendo assim, as diluies 1/10, 1/100, 1/1000...

b. De cada diluio inocular 0,1mL na superfcie do meio de Agar simples. Semear por distenso
com ala de Drigalski. Incubar a 37C por 24 horas.

c. Contagem da u.f.c. com diluio n placa 1 +n placa 2 aplicar na frmula:
2

u.f.c. =n encontrado x inverso da diluio x inverso do inoculo

d. Repicar u.f.c. para Agar inclinado e caldo simples.

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ASSUNTO
- Colorao de Gram

OBJETIVOS

1. Observar e interpretar o mecanismo de reao de Gram como um mtodo de colorao
diferencial.
2. Discutir as vrias etapas da metodologia e a importncia taxonmica do mtodo na Bacteriologia.

FUNDAMENTAO TERICA

O mtodo de colorao de Gram o mais utilizado em Bacteriologia e permite a
diferenciao da maioria das bactrias em 2 grupos pelas diferenas marcantes na parede celular
que apresentam. Com base nessas diferenas de parede celular os corantes utilizados coram as
bactrias Gram-positivas em roxo e as Gram-negativas em vermelho.
O mtodo de Gram utilizado na maioria das infeces bacterianas, permitindo o
diagnstico de algumas delas com bastante segurana. Porm no se aplica para micoplasmas,
bactrias desprovidas de parede, micobactrias pela presena de muitos lipdios insolveis na
parede e espiroquetas pela estrutura muito delgada e pouco permevel aos corantes.
A colorao pelo mtodo de Gram chamada de colorao diferencial porque so utilizados
dois corantes e as bactrias ficam coradas em tonalidades diferentes. Isso possvel devido
composio da parede celular das mesmas.
Bactrias Gram-negativas possuem uma parede composta de vrias camadas que diferem na
sua composio qumica e, conseqentemente, so mais complexas. O arranjo dessa parede dado
por uma fina camada de peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por
lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e lipopolissacardeos (membrana externa).
As bactrias Gram-positivas possuem parede celular mais espessa em comparao s Gram-
negativas, apesar disso, apresenta predominantemente um nico tipo de macromolcula, uma
espessa camada de peptidoglicano (representando aproximadamente 90%) e cido tecico.
Essas bactrias podem ser aerbias, anaerbias facultativas e anaerbias. Possuem a forma
de cocos, bacilos ou vbrios (bacilos encurvados). Muitas so patognicas e outras, membros da
microbiota normal.
A maioria dos cocos Gram-positiva, com exceo dos gneros Neisseria e Veillonella que
so os nicos Gram-negativos; entre os bacilos Gram-positivos incluem-se aqueles pertencentes aos
gneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium; os demais bacilos so
Gram-negativos (a maioria); os vbrios so Gram-negativos.
A investigao das caractersticas morfolgicas e de colorao (morfo-tintoriais) das
bactrias a etapa inicial de grande importncia no isolamento e identificao de bactrias de
material clnico. No entanto, a identificao completa de uma bactria sempre necessitar de dados
fisiolgicos ou genticos da mesma.
O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da parede celular. Durante o
processo de colorao, o tratamento com lcool (ou lcool-acetona) extrai os lipdeos, da
resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das Gram negativas
Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as Gram negativas so
descoradas. A parede celular das bactrias Gram positivas, em virtude de sua composio diferente,
torna-se desidratada durante o tratamento com lcool, a porosidade diminui, a permeabilidade
reduzida e o complexo CV-I no pode ser extrado.
Outra explicao baseia-se tambm em diferenas de permeabilidade entre os dois grupos
de bactrias. Nas bactrias G
+
, o complexo CV-I retido na parede aps o tratamento pelo lcool, o
que causa, provavelmente, uma diminuio do dimetro dos poros da camada de glicopeptdeo ou
27
peptideoglicano da parede celular. Os poros da parede das bactrias G
-
permanecem suficientemente
grandes, mesmo depois do tratamento pelo lcool, possibilitando a extrao do complexo CV-I.
Segundo o autor Trabulsi, na etapa diferencial com lcool, as bactrias G
-
devido pequena
espessura da camada basal e s descontinuidades existentes nesta camada, em pontos de aderncia
entre a membrana externa e a membrana celular, tm o complexo corado extrado pelo lcool que
deixa as clulas descoradas.

O preparo e a fixao do esfregao

a) Preparo das lminas

As lminas novas oferecem maior garantia para a confeco de boas preparaes coradas,
no obstante as mesmas possam ser recuperadas depois de usadas. O processo de limpeza e
esterilizao dessas lminas implica numa srie de medidas que passaremos a enumerar: lavar com
gua e sabo, mergulhar em soluo detergente e deixar em ebulio por cerca de 1 a 2 horas, lavar
novamente em gua corrente, escorrer e rinsar com gua destilada, escorrer e secar. As lminas
devem ser colocadas em frascos fechados contendo lcool.

As preparaes coradas so feitas em 3 etapas:
1 esfregao
2 fixao
3 colorao

b) Esfregao

- Tirar do frasco uma lmina esterilizada e enxugar bem
- Flambar, rapidamente, nos dois lados da lmina
- Flambar a ala de platina ao rubro e deix-la esfriar prximo chama
- Tomar o tubo de cultura (em caldo) com a mo esquerda e com os dedos mdio e anular da mo
direita remover o tampo de algodo da boca do tubo
-Flambar a boca do tubo de cultura
- A ala de platina, segura entre o polegar e o indicador da mo direita, ser introduzida no interior
do tubo at tocar no meio de cultura
- Flambar novamente a boca do tubo
- Fechar o tubo com o tampo de algodo e coloc-lo na estante
- Tomar a lmina com a mo esquerda e depositar no centro da mesma uma gotcula (uma alada)
da suspenso bacteriana
- Com movimentos de rotao da ala de platina, o material deve ser bem espalhado a fim de se
obter um esfregao de forma oval, bem fino e uniforme
- Deixar secar ao ar e marcar com lpis dermatogrfico do lado oposto onde se situa a preparao

Em se tratando de material de cultura em meio slido, deve ser observado o seguinte:
- Depositar uma pequena gota de gua destilada ou soluo fisiolgica estril no centro da lmina
- Tocar a colnia com uma agulha de platina esterilizada e suspender a mesma na gotcula dgua,
de forma a obter um esfregao fino e uniforme

c) Fixao do material

A fixao evita que o material se desprenda no decurso das manipulaes posteriores. Pode ser feita
por:

28
#Agentes Fsicos (calor) consiste em passar a lmina, com a face onde se acha o esfregao para
cima, na chama do bico de Bunsen 2 a 3 vezes rapidamente

#Agentes Qumicos utiliza-se uma substncia qumica como lcool metlico, lcool etlico,
lcool-acetona, ter-acetona, formol etc., deixando-se em contato com os esfregaos dessecados
durante alguns minutos (2 a 10 minutos). O fixador pode ser posto sobre o esfregao
convenientemente protegido contra a evaporao rpida, ou ento o preparado ser mergulhado no
fixador contido em recipientes apropriados.

MATERIAL

- Lminas
- Culturas em meios lquido e slido
- Ala e agulha de platina
- Cristal violeta
- Lugol
- lcool etlico
- Fucsina de Ziehl.

Solues reagentes

1. Cristal violeta:
- Cristal violeta 1,0g
- lcool a 95 10mL
- gua 100mL

2. Lugol:
- Iodo 1,0g
- Iodeto de potssio 10mL
- gua 300mL

3. Fucsina:
- Fucsina bsica 0,3g
- Fenol 5,0g
- lcool a 95 10mL
- gua 100mL

4. lcool-acetona proporo 1:1.


COLORAO DE GRAM (MTODO CLSSICO)

a. Preparar um esfregao fino, secar a temperatura ambiente e fixar pelo calor.
b. Cobrir o esfregao seco e fixado com a soluo de cristal violeta (corante) durante 1 minuto.
c. Esgotar a lmina e cobrir com lugol (mordente) durante 1 minuto. O Lugol fixa as molculas do
corante s protenas citoplasmticas, formando compostos estveis.
d. Inclinar a lmina 45 e lavar em gua corrente.
e. Mantendo-a inclinada, diferenciar (lavar) com lcool 95 GL (diferenciador).
29
f. Lavar e depois cobrir a preparao com soluo diluda de fucsina de Ziehl (contra-corante) (15 a
30 segundos).
g. Lavar e secar entre duas fitas de papel de filtro, delicadamente.
h. Colocar uma gota de leo de cedro no centro do esfregao.
i. Observar com a objetiva de imerso.

Vi Lulu Ali A Fumar Algo
Cristal Lugol lcool gua Fucsina gua
Violeta

30

Mudanas de colorao que ocorrem em cada passo do Mtodo de Gram.

NOTAS

1. O etanol poder ser usado como agente descorante fraco.
2. O material dos corantes empregados na tcnica, principalmente sedimento do cristal violeta
poder aparecer como artefato.
3. O descoramento para mais ou para menos resultante de incorreta diferenciao pelo lcool.
4. A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamental na colorao de Gram. Em culturas
envelhecidas, clulas Gram-positivas freqentemente se tornam Gram-negativas. Enzimas lticas
excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos membrana da clula,
como, por exemplo, alterando a permeabilidade dos solventes. Conseqentemente, o complexo
iodo-cristal violeta poder ser retirado da clula.
5. Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou Gram-negatividade da cultura,
uma colorao de Gram paralela aconselhvel. Para isto, deve-se usar culturas bacterianas
conhecidas como G
+
(Staphylococcus aureus) e G
-
(Escherichia coli) como controle.

INTERPRETAO

Bactrias G
+
coradas em roxo.
Bactrias G
-
coradas em vermelho.

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ASSUNTO
- Cocos Gram-positivos

OBJETIVOS:

1. Isolamento de bactrias das vias areas superiores.
2. Identificao bioqumica atravs da interpretao do metabolismo microbiano.

FUNDAMENTAO TERICA

Identificao das bactrias de importncia mdica

Material de colheita: secrees, lquidos biolgicos e outros.

Cocos Gram positivos aerbios

I. Staphylococcus

http://de.wikipedia.org/wiki/Staphylokokken

Este gnero, membro da famlia Micrococcaceae, constitudo de vrias espcies, sendo 5 as
de maior interesse em Veterinria (S. aureus, S. intermedius, S. epidermidis, S. hycius e S.
schleiferi) . So microorganismos esfricos, imveis, gram positivos, que crescem em
agrupamentos semelhantes a cachos de uva, devido aos seus arranjos irregulares. So membros
normais da microbiota anfibintica da pele e membranas mucosas de mamferos e aves, sendo
encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe.
Causam diferentes doenas supurativas tais como: furnculo, impetigo, osteomielite, abcessos
de tecidos, pneumonia, meningite, artrite purulenta, etc. Algumas amostras (S. aureus) produzem
uma enterotoxina que provoca um quadro agudo de intoxicao alimentar, enquanto outros (S.
aureus eS. saprophyticcus) causam infeces do trato urinrio.

Espcies de importncia veterinria

S. aureus (coagulase +) Agente piognico comum em diferentes espcies animais.
Recebe esse nome, pois pigmentos carotenides na membrana celular podem conferir
colorao urea (latim aureus) s colnias.
33
OBS: Coagulase +so os Staphylococcus com potencial patognico. Estes crescem melhor em
condies de restrio de ferro, se comparados aos coagulase -, com menor potencial patognico.
S. intermedius (coagulase +) Mais freqente em ces, estando envolvida na piodermite
canina (inflamao cutnea piognica). Pode causar tambm urolitase de ces (pela urease)
S. epidermidis (coagulase -) Encontrado na pele e em algumas membranas mucosas.
Raramente patognico.
S. hycius Causa epidermite exsudativa em sunos. a chamada Doena do porco gordo,
que acomete sunos jovens, sistmica e rapidamente fatal. As leses cutneas
caracterizam-se pela presena de um exsudato espesso, cinza acastanhado, especialmente ao
redor das faces e das orelhas.
S. schleiferi subespciecoagulans Est associado a otite externa em ces.

Grande parte das infeces de animais provavelmente endgena, isto , provocada por uma
cepa residente.
Supurao e formao de abcesso (leso tpica) so um modelo predominante da patogenia.
A estafilococose em perus uma bacteremia que se localiza em articulaes e bainhas
tendinosas.
Piemia em cordeiros decorre de inoculao cutnea de S. aureus por picada de carrapato.

A colheita do material deve ser realizada com o mximo de assepsia: swab de nasofaringe,
fezes, urina. Em se tratando de sangue, este dever ser colhido com heparina, ou ser desfibrinado,
nunca utilizar citrato de sdio, pois o sdio inibe G
+
, principalmente em pH prximo a 6.

Caractersticas do crescimento

So bactrias anaerbias facultativas, de fcil crescimento. Crescem dentro de 12hs em meio
de Agar Simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colnias so redondas, lisas, elevadas, opacas, de
colorao amarelo-dourado a branco e com mais de 1mm de dimetro no Agar. Crescem em
presena de altas concentraes de NaCl, sendo este um fator de estimulao da produo da
enzima coagulase. So inibidos pela presena de corantes dos tipos Azul de Metileno e Violeta de
Genciana.
O meio Chapman seletivo, porque contm 7,5% de NaCl; indicador porque possui manitol
e o indicador Vermelho de Fenol, as UFCs fermentadoras do manitol apresentam-se com colorao
amarelas aps 24 48 horas de incubao a 37C. Aps o crescimento de colnias tpicas fazemos a
colorao de Gram para observarmos a presena de cocos Gram +dispostos em grupos (cachos) ou
isolados.

Diferenciamos o gnero Staphylococcus do gnero Streptococcus atravs da prova da
catalase. A diferenciao das espcies do gnero se d atravs das provas de fermentao do
manitol, da coagulase, da DNAse, da sensibilidade a novobiocina e da reduo de nitratos.

Provas bioqumicas

- Prova da Catalase:

A catalase uma enzima responsvel pela neutralizao de formas txicas do oxignio ao
microorganismo (perxidos e superxidos).
Na prova, utilizado o perxido de hidrognio (H
2
O
2
a 30%). Se o microorganismo produzir
catalase, o H
2
O
2
(gua oxigenada) ser degradado em H
2
O e O
2
(oxignio molecular). A reao
observada atravs do desprendimento de bolhas gasosas (O
2
) da cultura. Na ausncia da catalase,
no h decomposio do perxido.
34
A prova pode ser realizada com o microorganismo obtido em qualquer meio de cultura,
exceto meios com sangue, pois este possui catalase, levando a resultados falso-positivos.

http://medinfo.ufl.edu/year2/mmid/bms5300/bugs/stapaure.html

- Fermentao do Manitol:

O manitol um acar que alguns microorganismos so capazes de utilizar como fonte de
energia, a travs da fermentao. A prova se baseia na alterao do pH do meio, graas produo
de cidos durante o processo de fermentao. Essa mudana de pH pode ser observada pela viragem
de cor do meio devido presena do indicador de pH Vermelho de Fenol. A prova pode ser
realizada em meios de cultura lquidos ou slidos. Aps a semeadura, o meio deve ser incubado a
37C por 18 24 horas.

Interpretao:
Positivo: meio amarelo
Negativo: no h alterao da cor do meio.
35

pathmicro.med.sc.edu/fox/Mannitol.jpg

- Prova da coagulase:

A coagulase estafiloccica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e coagulase livre.
A coagulase ligada, presente na parede da clula bacteriana, converte o fibrinognio em
fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulao, e pode ser detectado em teste
direto em lmina, utilizando-se da suspenso de Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma
citratado, fazendo movimentos circulares e observando-se a formao de cogulo no tempo de 1-2
minutos. Pode-se tornar mais sensvel o teste em tubo, por este detectar tanto a coagulase livre
quanto a ligada, sendo a prova de escolha.
A coagulase livre produzida e liberada pelo microorganismo, reagindo com o fator de
coagulao do plasma, o CRF, formando uma substncia semelhante, mas no idntica, trombina,
que converte fibrinognio em fibrina. Para o teste, utiliza-se plasma citratado humano ou de coelho,
estril, diludo em soluo salina na proporo de 1:5. A reao ocorre volume a volume a 37C.
Estudos recentes demonstraram que a produo da enzima coagulase se intensifica quando o
microorganismo crescido em meio contendo alta concentrao de NaCl. Desta forma, aconselha-
se a utilizao de colnias para a prova, crescidas em Agar Manitol Salgado contendo NaCl e
Vermelho de Fenol. Este procedimento aumentaria a sensibilidade do teste.
A prova consiste da semeadura de uma alada do microorganismo em estudo em tubo
contendo o plasma diludo e incubao a 37C. A menor coagulao considerada positiva. Devem
ser feitas leituras peridicas a cada 2 horas, por at 24 horas, pois algumas espcies produzem
fibrinognio, que dissolve o cogulo formado.
Aconselha-se tambm utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus.
36

http://www.aic.cuhk.edu.hk/web8/staphylococci.htm

- Prova da DNAse:

Alguns microorganismos so capazes de utilizar o DNA presente no meio como fonte de
energia, atravs da produo da enzima DNAse.
No meio com DNA deve ser feita uma estria simples (reta) ou um spot (ponto de semeadura)
central com o microorganismo em estudo. Incubar a 37C por 24 horas e adicionar ao meio HCl 1N
e aguardar a turvao do meio.
Lembrando que o DNA material protico e que o HCl, como cido, tem poder desnaturante
sobre as protenas, a turvao do meio apenas a precipitao do DNA desnaturado. Se a bactria
produzir DNAse, todo o DNA ao seu redor ter sido degradado, ento ao adicionar o HCL no
haver turvao nesta rea. Portanto, se houver um halo claro ao redor do crescimento bacteriano, o
resultado positivo.

- Sensibilidade a Novobiocina:

Semear o microorganismo suspeito em placa de Agar simples ou Mueller Hinton com swab,
para obteno de crescimento confluente, e adicionar o disco de novobiocina (5g/ml). Incubar a
37C por 24 horas. As bactrias resistentes no apresentaro halo de inibio, enquanto as sensveis
sim.

37
Interpretao das provas bioqumicas

Provas bioqumicas S. aureus S. epidermidis S. sapophyticus
Catalase + + +
Fermentao do manitol + - -
Coagulase +/- - -
DNAse + - -
Sensibilidade a novobicina R S R
Reduo de nitratos + -

II. Streptococcus

textbookofbacteriology.net/nfStreptococcus

Animais de sangue quente albergam uma flora de Streptococcus nas mucosas dos tratos
respiratrio superior, genital inferior e quase todo o trato digestivo (enterococcus).
Apresentam-se em forma de cadeia ou em pares, e so Gram positivos.
Em 1903, Schottmuller props que os estreptococos fossem classificados conforme a
capacidade de lisar hemcias in vitro. Em 1919, Brown chamou de alfa, beta e gama as lises
observadas nas hemcias em placas de Agar sangue.
Os estreptococos alfa hemolticos apresentam zonas de hemlise parciais, com hemcias
integras na parte mais interna (junto colnia) e hemlise maior na parte mais externa.
Frequentemente aparece uma colorao esverdeada na rea de hemlise (devido a alterao da
hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da clula bacteriana libera biliverdina e bilirrubina), que
originou a qualificao estreptococos do grupo esverdecente ou Streptococcus viridans. O
Streptococcus pneumoniae apresenta hemlise alfa e colnia puntiforme com aprofundamento no
pice da colnia (parecendo um pequeno vulco). A maior parte dos Streptococcus comensais de
animais alfa hemoltico.
Os estreptococos beta hemolticos produzem uma zona de hemlise total, no se observando
hemcias ntegras (microscpio ptico com objetiva de 10x), ou seja, produzem zonas de
transparncia ao redor de suas colnias. O Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de
hemolisinas: O e S. A hemolisina O destruda pela ao do oxignio atmosfrico e, portanto, s
demonstrada em colnias crescidas em profundidade no Agar Sangue. A hemolisina S estvel ao
oxignio do ar e produz hemlise mesmo nas colnias crescidas na superfcie do meio de cultura.
Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessria a semeadura
do microorganismo pela tcnica do pour-plate. A maioria dos tipos patognicos beta-hemoltica.
Os estreptococos gama so anemolticos, ou seja, no produzem hemlise no meio. A maior
parte no patognica.

38

Principais espcies acometidas Principais doenas
S. pyogenes Roedores, bovinos e humanos. Piodermites, erisipelas, febre
puerperal, febre reumtica,
glomerulonefrite
S. agalactie Bovinos de raas leiteiras Mastite* e infeces neonatais
S. equi Equinos Garrotilha **
S. equismilis Sunos, equinos Condies supurativas mistas
S. zooepidemicus Equinos Problemas genitais (metrite) e
neonatais (infeces umbilicais
disseminadas pela corrente
sangunea). Pneumonias
secundrias.
S. canis Carnvoros Linfadenite felina, condies
supurativas mistas em ces e
gatos.
S. suis Sunos Infeces neonatais,
septicemias, pneumonia.
S. pneumoniae Primatas Pneumonia***, septicemia e
meningite.
S. uberis Bovinos Mastite (geralmente mais
suave).

* A mastite transmitida por ordenha sem condies higinicas adequadas. A infeco instala-se na
glndula mamria pelo canal da teta e a proliferao causa uma inflamao aguda e por fim a
glndula inteira pode ser perdida.

** Rinofaringite eqina contagiosa, que se caracteriza por secreo nasal serosa ou purulenta, dor
local, tosse e anorexia. Desenvolvem-se abscessos nos linfonodos regionais, que tipicamente se
drenam e rompem em 2 semanas.

*** A evoluo muito aguda em macacos, levando a altas taxas de mortalidade.

Um Streptococcus beta-hemoltico responsvel por uma forma de septicemia em peixes de
gua doce em aqurios.
Infeces neonatais comumente originam-se de infeco no trato genital materno.


As exigncias de crescimento so mais bem supridas por meios contendo sangue. Produzem
colnias claras aps 12 horas de incubao. So anaerbios facultativos, catalase negativos.
Suportam a azida sdica a 0,02%, que empregada nos meios utilizados para isol-los.

Cultura (pour plate)

Fazer uma suspenso do material colhido em um tubo contendo 1 ml de soluo fisiolgica
estril e adicionar a uma placa de Petri estril. J untar o Agar Sangue fundido e resfriado e promover
a difuso do inculo no meio atravs de movimentos circulares. Incubar a 37C por 18 horas em
atmosfera de microaerofilia para melhor rendimento, ou jarra com vela.
39

Leitura:

Observao do tipo de hemlise em Agar Sangue.

Provas bioqumicas

- Prova da optoquina:

Colocar um disco de optoquina na superfcie do Agar Sangue (pode-se incluir no
antibiograma). Havendo impedimento do crescimento das colnias ao redor do disco de optoquina
(2 cm de dimetro), trata-se de teste positivo.

- Bile solubilidade:

A prova realizada conforme esquema que se segue:
1. A 1,0 ml de cultura em caldo, adicionar uma gota de vermelho de fenol.
2. Acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rsea)
3. Adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sdio ou blis
4. Incubar juntamente com o tubo sem blis a 37C por 3 horas

* clareamento: positivo
* inalterado: negativo

- Bacitracina:

Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,04 U) colocados na superfcie do meio de
cultura semeado com o microorganismo em estudo (pode-se incluir no antibiograma) e incubar a
37C por 24 horas em microaerofilia.

* Grupo A: sensvel a bacitracina
* demais grupos: resistentes

40
- Crescimento a 56C:

Para evitar dvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis), submeter a
cultura a um aquecimento a 56C por 30 minutos. Somente os enterococos resistem a este
tratamento.

- Crescimento em Agar Chapman:

Os enterococos toleram altas concentraes de NaCl, como acontece com Staphylococcus.

- Crescimento em Agar EMB:

Os enterococos suportam a presena de corantes, como o azul de metileno

MATERIAL:

- cultura de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis
- Placas de Chapman
- Tubos de caldo simples
- Tubos com plasma citratado
- Tubos com Agar simples
- Tubos com gua destilada estril
- Placas DNAse

- Bateria de Gram
- gua oxigenada a 30%
- Swabs
- Soluo salina estril
- Lminas, alas...
- Microscpio


1 DIA:

a. Inocular swab de orofaringe em Caldo Hitchens-Pike (para observao de Streptococcus)
b. Inocular swab de nasofaringe em Agar Chapman pela tcnica de esgotamento (para observao de
Staphylococcus)

2 DIA:

a. Semear material do crescimento em Hitchens Pike em placa de Agar Sangue, pela tcnica de
esgotamento.
b. Inocular a UFC tpica de Staphylococcus nas provas bioqumicas (catalase, coagulase e
DNAse)
c. Realizar a colorao de Gram

3 DIA:

a. Leitura e interpretao da placa de Agar Sangue
b. Leitura e interpretao das provas bioqumicas
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42
ASSUNTO
- Provas Bioqumicas para a Identificao de Bacilos Gram-negativos

FUNDAMENTAO TERICA

Bacilos gram negativos causam doenas em animais de produo (como a diarria neonatal e
salmonelose) e de companhia (infeces no trato urinrio, abscessos, etc).
Quanto morfologia, so bastonetes pleomrficos, anaerbios facultativos. muito difcil
distinguir os gneros entre si por microscopia (observao visual).

Caractersticas de crescimento

Em condies anaerbicas, so dependentes da presena de carboidratos fermentveis. Os
produtos finais da fermentao de acares so teis para a identificao do microorganismo. Uma
importante caracterstica bioqumica de todas as espcies da famlia til para o diagnstico a
ausncia de citocromo C, tornando-as oxidase negativas.

Resistncia

No resistem luz solar, dessecao, pasteurizao e desinfetantes comuns. Em ambientes
sombreados, como pastos, estercos e cama de palha podem sobreviver por vrios meses.

Caractersticas de cultura

Microorganismos entricos (E.coli, Klebsiella, Enterobacter) crescem muito bem em Agar
MacConkey.
Os mtodos utilizados para isolamento de patgenos entricos dependem da fonte da amostra
ser intestinal ou extra-intestinal. Quando a fonte extra-intestinal e a amostra colhida de locais
normalmente estreis, o isolamento de qualquer microorganismo da famlia significativo. Quando
a fonte intestinal, dois gneros patognicos so freqentemente isolados de amostras de fezes:
Salmonella eShigella.
Os princpios dos meios de cultura para isolamento de bactrias entricas so:
- Uma substncia inibidora (normalmente um sal biliar ou um corante), que inibe o crescimento de
bactrias gram positivas;
- Um substrato utilizado ou no por Salmonella, Shigella e alguns outros microorganismos;
- Um indicador de pH para revelar mudanas de cor do meio de cultura.
O enriquecimento seletivo feito em meios lquidos seletivos, visando aumentar a proporo
de Salmonella em relao ao restante da microbiota e facilitar seu posterior isolamento: Os meios
usados so o caldo tetrationato e o caldo selenito.


As espcies que mais freqentemente acometem animais so: Enterobacter, E.coli, Klebsiella,
Proteus, Salmonella, Shigella, Yersinia, Providencia. Dentre elas, as mais importantes so:

E. coli
A principal espcie que compe a flora normal do TGI inferior pode ser causa de doena
septicmica em potros, bezerros, leites, filhotes de ces e cordeiros; de diarria enterotoxignica
em neonatos de animais de produo e de doena edematosa em sunos (uma enterotoxemia aguda)
e tambm causa a colibacilose dos pintinhos (Cepas potencialmente patognicas que contaminam a
43
superfcie do ovo, por ocasio da postura, podendo penetrar a casca e infectar o saco vitelnico) ou o
pintinho infectado pelo trato respiratrio.
Pode tambm ser oportunista em quase todas as espcies animais.

Salmonella
Tem o TGI como reservatrio. Fontes de infeco incluem: solo contaminado, vegetao,
gua e componentes de raes animais (farinhas de peixe, carne e osso) e fezes de animais
contaminados. Lagartos e cobras (geralmente assintomticos) esto comumente infectados.
A salmonelose caracterizada por diarria e resposta inflamatria no tecido linfide e
submucosa, podendo ou no ocorrer septicemia. uma doena significativa em ruminantes,
especialmente bovinos, afetando principalmente animais em confinamento.
Pode ocorrer aborto aps a septicemia e pneumonia adquirida por via hematgena em
bezerros com S. dublin (que junto comS. typhimurium e S. newport so os sorotipos mais comuns
em bovinos.)
Em sunos apresenta-se como septicemia aguda e fulminante ou como doena crnica
debilitante e mais freqentemente vista em sunos submetidos a stress, em regime de engorda,
uma faixa etria em que a salmonelose muito comum, sendo aS. typhimurium e S. cholerae suis
os sorotipos predominantes.
Em cavalos, clica, cirurgia gastrointestinal e agentes antimicrobianos predispem o animal
ao desenvolvimento de sinais clnicos e S. typhimurium eS. anatum so os sorotipos comumente
isolados.
incomum em ces e gatos.
S. pullorum especfico de aves domsticas, causando a chamada pulorose. A bactria infecta
o vulo de perus e galinhas e uma vez posto o ovo infectado, o ambiente de incubao
contaminado, infectando outras aves. A morte resulta de septicemia.
Os animais e seus subprodutos tambm so importantes fontes de infeco para o homem,
sendo o S. typhimurium o mais comum, produzindo gastroenterite.
S. gallinarum causa o tifo avirio, uma doena septicmica aguda ou grave que acomete aves
adultas, principalmente galinhas.
S. arizonae o agente da arizonose aviria, freqentemente isolada de perus. A bactria se
mantm nas granjas por meio de ovos incubados infectados aps a ingesto do microorganismo
pelas aves e tambm se dissemina pelas fezes.

Shigella

Causa disenteria bacilar em primatas, principalmente em cativeiro. A doena parece estar
relacionada a situaes de stress ou disfunes imunolgicas. O reservatrio o intestino grosso de
animais clinicamente doentes, assintomticos ou convalescentes. Drogas antimicrobianas e
mudanas dietticas aumentam o risco de infeco.
S. flexneri 4 isolada em doena periodontal de macacos.
A Shigella no fermentadora de lactose.

OBJETIVO

Identificar enterobactrias em gneros ou espcies, utilizando-se para isso vrios meios de
cultura especiais, de acordo com o esquema a seguir:

1. Plaqueamento Seletivo

Etapa de isolamento bacteriano a partir de espcies clnicos, utilizando meios seletivo-
indicadores como o Agar EMB. Neste meio as bactrias Gram positivas so inibidas pela presena
44
de eosina e azul de metileno. As bactrias Gram negativas fermentadoras de lactose (LAC +)
apresentam-se como colnias rosa-avermelhadas com ou sem centro negro, enquanto as no-
fermentadoras (LAC -) formam colnias transparentes.

2. Triagem

Conjunto de provas bioqumicas realizadas simultaneamente em 1 ou 2 meios, permitindo
uma diferenciao inicial dos isolamentos e direcionamento da contaminao bioqumica. Quando
realizada em meio TSI, podemos observar:
- Fermentao de glicose e produo de gs
- Fermentao de lactose e/ou sacarose
- Produo de H
2
S

Bactrias que utilizam apenas glicose provocam acidificao (de colorao amarela) apenas
na base, permanecendo o pice alcalino (de cor avermelhada). Bactrias fermentadoras de lactose
e/ou sacarose acidificam todo o meio. A formao de gs evidenciada pelo rompimento ou
descolamento do meio. A produo de H
2
S se manifesta pelo escurecimento do meio (devido a sua
reao com o ferro).

3. Confirmao Bioqumica

Conjunto de provas necessrias para a identificao bioqumica das colnias suspeitas.
Algumas dessas provas esto descritas abaixo:

a. Fermentao de Carboidratos: glicose, lactose, manitol, sacarose.

A utilizao dos carboidratos leva formao de cidos, com viragem do indicador (vermelho
de fenol) para cor amarela. A partir da glicose podemos observar tambm a produo ou no de gs
(CO2, H2) no interior do tubo de Durhan.
A inoculao realizada a partir de cultura bacteriana overnight (+/- 18h) em Agar. Incubar
por 24 horas a 37C.
Leitura: cor amarelada =+(positivo)
sem alterao =- (negativo)

b. VM: Verifica a ocorrncia de fermentao cido-mista ( glicose cidos estveis).

Meio: Clark & Lubs.
Inoculao: idem ao item a. Aps incubao ( 48 h ), adicionar 3 5 gotas do reativo de VM
(vermelho de metila alcalino = amarelo plido / cido = vermelho).
Leitura: Cor vermelha =+(Indica a produo de cido estvel)
Cor amarela =- (No houve produo de cido estvel)

c. VP ( Voges & Proskauer ):

Verifica a ocorrncia de fermentao acetonica (glicoseacetona).
Meio: Clark & Lubs (meio glicosado e tamponado).
Inoculao: idem ao item a. Aps inoculao (48 h), adicionar os reativos:
VP I (Barrit I): alfa-naftol (0, 6 mL)
VP II (Barrit II): KOH 40% (0, 2 mL)
Leitura (aps 10 15 minutos):
45
* observar o aparecimento de anel vermelho na superfcie do tubo (resultado
positivo)
* sem alterao: resultado negativo (forma-se um halo marrom)

d. Citrato:

Verifica a utilizao do citrato como nica fonte de carbono.
Meio: Citrato de Simmon.
Inoculao: idem ao item a.
Leitura:
* Meio azulado =+
* Sem crescimento =- (O meio continua verde)

e. Indol:

Verifica a produo de triptofanase, que quebra triptofano, liberando indol, este revelado
com o reativo de Kovacs, observa-se a formao de um anel escarlate na superfcie do meio.

Meio: Caldo semi-slido (SIM).
Inoculao: idem ao item a. aps a inoculao, adicionar 5 gotas do Reativo de Kovacs.
Leitura: cor rosa =+
Sem alterao =-

f. Mobilidade:

Verifica se a bactria mvel ou imvel.

Meio: Agar semi-slido (SIM).
Inoculao: utilizar agulha bacteriolgica, fazendo uma picada central at da profundidade
do tubo.
Leitura: Crescimento fora do local da picada =+(mvel)
Crescimento somente ao redor da picada =- (imvel)

46
g. Nitrato:

Verifica a capacidade de reduo do nitrato ( NO3) nitrito (NO2).

Inoculao: idem ao item a. Aps incubao, adicionar 3 a 5 gotas dos reativos:
Nitrato A: alfa naftilamina
Nitrato B: cido sulfanlico
Leitura: Cor vermelha (violcea, escarlate) =+(liberao de NH3)
Sem alterao =-

h. Uria:

Meio contendo uria para verificar a produo da enzima urease.

Inoculao: idem ao item a.
Leitura: cor vermelha (violcea, escarlate) =+(liberao de NH3)
sem alterao =-

OBJETIVOS

Aps a realizao da atividade prtica voc dever ser capaz de:
1- Compreender o papel das enterobactrias como agentes de toxinfeces alimentares;
2- Caracterizar e compreender o modo de ao dos meios de Teague (ou EMB) utilizado
para o isolamento de bacilos gram negativos, diferenciando o crescimento de fermentadores e no
fermentadores da lactose;
3- Citar outros meios utilizados no isolamento de enterobactrias;
4- Caracterizar as provas bsicas de triagem e confirmao bioqumica para identificao e
diferenciao de enterobactrias compreendendo seu mecanismo de ao.

MATERIAL

1a. aula: tubo de caldo triptcase soja (TSB) com crescimento de enterobactria; placa de gar
EMB;
2a. aula: gar TSI, gar Citrato de Simmons, gar SIM, caldo (gua) triptonada; caldo MR-VP
(glicosado tamponado) [2 tubos]; caldo uria, caldos de fermentao com glicose (e tubo
de Durhan), lactose e manitol;
3a. aula: Reativo para indol (Kovacs=paradimetilaminobenzaldedo); reativo para VM (vermelho
de metila), reativos para VP (VP1= -naftol; VP2=KOH)


1o. dia - inocular o meio de EMB com a cultura de TSB ATENCO: tcnica de esgotamento em
estria !;
2o. dia - observar o crescimento obtido: anotar as caractersticas das colnias e comparar com os
dados da tabela abaixo:

47
Caracterstica colonial Gneros (ou espcies)
- colnias transparentes ou de cor mbar Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia
- colnias com brilho verde metlico luz
refletida e centro negro luz transmitida
Escherichia coli
- colnias maiores que as de E. coli, mucosas,
confluentes, com centro escuro luz
transmitida.
Enterobacter, Klebsiella

- inocular os meios de triagem e confirmao bioqumica da seguinte forma:
- TSI: picada central na coluna ou base e estria na superfcie inclinada (agulha);
- SIM: picada central at o meio do tubo (agulha);
- citrato: estria reta na superfcie (agulha);
- caldo uria, caldo triptonado, caldos MR-VP e caldos de fermentao: repique com
ala (difuso).
3o.dia - utilizando os reativos prprios, quando necessrio, e segundo orientao do professor,
fazer as leituras das provas bioqumicas e conferir de acordo com a tabela a seguir,
procurando identificar a enterobactria estudada:

* exceto S. pullorum e S. gallinarum

Gnero GLI LAC SAC MAN H
2
S MOT IND CIT VM VP URE TSI GS
Salmonella + - - + + +* - + + - - Alc/
c
+
Escherichia + + +/- + - + + - + - - Ac/c +
Klebsiella + + + + - - - + - + +/- Ac/c +
Proteus + - +/- - + + +/- +/- + - + Alc/
c ou
c/c
+
48

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49
ASSUNTO
- Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA)
Mtodo de Kirby-Bauer

FUNDAMENTAO TERICA

O sucesso na teraputica antimicrobiana de uma infeco bacteriana depende da
sensibilidade do agente droga utilizada. Algumas bactrias apresentam um perfil de sensibilidade
previsvel e constante, no entanto muitas outras so altamente suscetveis ao desenvolvimento ou
aquisio de resistncia a diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso adequado e criterioso de
antimicrobianos muito importante para preveno da seleo de amostras bacterianas
multirresistentes. O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou antibiograma permite o
esclarecimento objetivo do perfil de sensibilidade do patgeno e a utilizao de drogas eficazes no
tratamento. feito principalmente para bactrias que realizam a conjugao.
O antibiograma ou TSA indicado para qualquer microrganismo relacionado ao processo
infeccioso mas principalmente queles cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na
terapia no seja previsvel como por exemplo: S. aureus, bacilos gram-negativos no fermentadores
(Pseudomonas), bacilos Gram negativos fermentadores (enterobactrias) etc.
Uma bactria considerada sensvel a um antimicrobiano quando o seu crescimento
inibido, in vitro, por uma concentrao trs, ou mais vezes, inferior quela que o antimicrobiano
atinge no sangue, caso contrrio ela considerada resistente. O meio termo (bactrias
moderadamente resistentes) dado por aquelas cujo crescimento inibido por concentraes
intermedirias.
A concentrao inibitria do antimicrobiano pode ser determinada direta ou indiretamente.
A determinao direta feita pelos chamados mtodos da diluio, e, a indireta, pelo mtodo de
difuso em placa com discos impregnados com as drogas.
No mtodo de diluio, concentraes variadas do antibitico, obtidas pela diluio em
caldo ou Agar, so inoculadas com o microrganismo. A concentrao mais baixa do antibitico que
evita o crescimento aps a incubao de 12 a 24 horas a concentrao inibitria mnima, a
medida da sensibilidade.
Nos testes pelo mtodo de difuso, discos de papel impregnados com o antibitico so
colocados uniformemente na superfcie do Agar semeado com o microrganismo. Forma-se, ento,
um gradiente de concentrao pela difuso do antibitico a partir do disco para o Agar com
conseqente inibio do crescimento do microorganismo sensvel ao (s) determinado (os)
antibitico (os).
Devido sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os mtodos de difuso
com discos (de Bawer e Kirby) tm preferncia sobre os de diluio para os testes de rotina, mas
indispensvel que sejam rigorosamente padronizados, porque a presena de algumas substncias
nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibio.
Ento utilizamos o meio enriquecedor denominado Muller-Hinton, que um meio
padronizado, de pH neutro, lembrando que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma
cultura pura, devendo-se fazer uma colorao de Gram antes de qualquer TSA para a confirmao
da pureza da cultura.
A base para o julgamento de sensibilidade o tamanho real do halo de inibio (zona sem
crescimento em volta dos discos de antibitico), o tamanho do halo sozinho no uma medida
quantitativa da atividade do antibitico, assim, errneo pensar que quanto maior o halo, mais
potente seja o antibitico. Por essa razo, comparaes diretas dos dimetros dos halos produzidos
por antibiticos no relacionados so falsas e no devem ser realizadas. Deve-se interpretar a
sensibilidade de acordo com os dados obtidos (dimetro do halo) em comparao aos dados da
tabela de interpretao do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na teraputica clnica.

50
o Limites para Interpretao do Antibiograma com 32 Antimicrobianos
de uso corrente na Teraputica Clnica
Antimicrobiano Smbolo CONC. DISCO. DIMETRO DO HALO DE INIBIO
RESISTENTE INTERMEDIRIO SENSVEL
Amicacina BB 30 mcg <14 15-18 >17
Ampicilina ao testar microorganismos
gram-negativos e enterococos
AP 10mcg 11 12-13 14
Ampicilina ao testar estafilococos e
microorganismos sensveis
Penicilina G
AP 10 mcg <20 21-28 >29
Ampicilina ao testar
Haemophilus sp.
AP 10 mcg <19 - >20
c. Nalidxico NA 30 mcg 13 14 -18 19
Bacitracina BC 10 un. <8 9-12 >13
Carbenicilina ao testar Proteus sp. e E.
coli
CR 100 mcg <17 18-22 >23
Carbenicilina ao testar Pseudomonas
aeruginosa
CR 100 mcg <13 14-16 >17
Cefalotina ao relatar sensibilidade a
todas as cefalosporinas
CF 30 mcg <14 15-17 >18
Cefoxitina CT - 14 15-17 18
Clindamicina ao relatar sensibilidade
clindamicina e lindomicina
CI 2 mcg <14 15-16 >17
Cloranfenicol CO 30 mcg 12 13 -17 18
Colistina CL 10 mcg <8 9-10 >11
Eritromicina EL 15 mcg 13 14-17 18
Estreptomicina ET 10 mcg 11 12 -14 15
Gentamicina GN 10 mcg <12 13-14 >15
Konanilcina KN 30 mcg <13 14-17 >18
Nalidxico cido AN 30 mcg <13 14-18 >19
Neomicina NO 30 mcg <12 13-16 >17
Nitrofurantona NT 300 mcg <14 15-16 >17
Novoblocina NV 30 mcg <17 18-21 >22
Oxocilina OX 6 mcg <9 10-13 >14
Penicilina G. ao testar
Estafilococos
PN 10 un. <20 21-28 >29
Penicilina G. ao testar outros
microorganismos
PN 10 un. <11 12-21 >22
Penicilina G. PL 500 un. <8 0-11 >12
Polimixina - - 8 09-11 12
Sulfa-Trimetropim STX 30 mcg 10 11-15 16
Sulfazotrim(Sulfamotoxazol +
Trimetoprim)
SFT 25 mcg 10 11 -15 16
Sulfonamidas SF 300 mcg 12 13-16 17
51
Tetraciclina TT 30 mcg 14 15-18 19
Tobramicina TB 10 mcg 12 13-14 15
Vancomicina VC 30 mcg 9 10-11 12

OBJETIVOS

1. Determinar a sensibilidade de uma bactria frente a diferentes antimicrobianos, para a escolha da
droga mais adequada no tratamento de uma doena.
2. Interpretar um antibiograma em funo do halo de inibio de diferentes antibiticos.

MATERIAL

- cultura pura recente do microorganismo em teste
- discos com antimicrobianos
- placas com Agar Mueller-Hinton
- swabs estreis
- pinas, rgua graduada.


1. Inculo:
Cultura pura, em fase log, padronizado, diluda at obteno de turvao semelhante ao tubo n 0,5
da escala de McFarland (1,0x10
8
)

2. Meio
Mueller-Hinton, recente, em camada de 4 5 mm, pH =7,2 7, 4, com umidade adequada. Em
alguns casos pode ser enriquecido com 5% de sangue, etc.

3. Semeadura
Inocular a cultura a ser testada na superfcie do Agar, com o auxlio de um swab, para um
crescimento confluente.

4. Antimicrobianos
Com o auxlio de uma pina flambada, aplicar os discos com antimicrobianos sobre o meio recm-
semeado de modo eqidistante.
Identificar a placa e incubar a 37C por 18 24 horas em posio invertida.
Ocorrer difuso das substncias e suas concentraes diminuem gradativamente medida que se
afastam do disco.
A eficincia de uma droga demonstrada pelo aparecimento de um halo de inibio do crescimento
do microorganismo.

5. Leitura
Com o auxlio de uma rgua graduada, medir o dimetro dos halos de inibio, incluindo o dimetro
do disco.

6. Interpretao
Interpretar a sensibilidade aos antimicrobianos de acordo com o dimetro do halo de inibio
encontrado em tabelas padronizadas que contm os valores em mm, para as drogas disponveis
comercialmente.
52
7. Controle
Usar como controles os seguintes microorganismos, de acordo com as drogas utilizadas:
- Staphylococcus aureus ATCC 25923
- Escherichia coli ATCC 25922
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

53
Notas:

1. leituras de 4 e 6 horas podero ser feitas em caso de emergncia, mas leituras definitivas devero
ser feitas somente aps o tempo estipulado (18 24 horas)

2. No usar sinais para expressar os resultados. Usar as letras S para os microorganismos
sensveis e R para os microorganismos resistentes.

3. Lembrar que um halo de inibio maior que outro no indica propriamente uma maior atividade
do antibacteriano sobre o microorganismo em teste. Outros fatores, como carga antibitica,
difusibilidade, etc., intervm na formao dos halos. Portanto, deve ser utilizada a tabela na
interpretao dos resultados.

4. Atualmente, no intuito de minimizar erros de interpretao, considera-se a sensibilidade
intermediria como resistente.


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54
ANEXO I

TCNICAS DE COLORAO

A utilizao de corantes em microbiologia atribuda a Goeppert e Cohn (1849).
Os corantes empregados, geralmente derivados da anilina, tm frmula quimicamente
complexa, e so obtidos por sntese; quase sempre so sais de potssio ou de sdio, sendo
classificados em: naturais, entre os quais podemos citar o carmim e a hematoxilina, e artificiais, que
se dividem em: bsicos ou nucleares, cidos ou citoplasmticos e neutros.
As clulas bacterianas so ricas em cido nuclico, conduzindo cargas negativas sob a
forma de grupamentos fosfato, e estes se combinam com os corantes bsicos, que so carregados
positivamente. Os corantes cidos no coram as clulas bacterianas, e por isso podem ser utilizados
para corar o material de fundo com uma cor contrastante.
As solues corantes so classificadas quanto ao veculo nos seguintes grupos: solues
aquosas, solues hidroalcolicas e solues hidroalcolicas mordentes. Utilizam-se as solues
aquosas quando se quer preservar a vitalidade dos microorganismos. A adio de substncias
mordentes tem a vantagem de preserv-las da contaminao mais ou menos estvel entre ambas.
Como exemplos de substncias que funcionam como mordentes citamos o fenol, iodo, formol e
tanino.
As coloraes podem ser simples, quando utilizamos um s corante, duplas e mistas. Assim
podemos ter uma noo da morfologia dos germes utilizando uma colorao simples, e de outras
informaes com o emprego de tcnicas especiais de colorao, como por exemplo, para diferenciar
flagelos, cpsulas, paredes celulares, membranas celulares, grnulos, ncleos e esporos.

I. TCNICA DE COLORAO ZIEHL-NEELSEN

FUNDAMENTAO TERICA

O gnero Mycobacterium constitui um grupo que causa doenas no homem e nos animais
superiores. No homem essas doenas variam de infeces superficiais at a tuberculose.
As micobactrias so microorganismos encontrados com facilidade no meio ambiente, com
exceo do Mycobacterium tuberculosis eM. leprae. Podem sobreviver por longos perodos no
solo, pois produzem esporos. Apresentam-se como bacilos longos, delgados, retos ou ligeiramente
encurvados, imveis e aerbios estritos. Apresentam crescimento lento e alto contedo lipdico
(cidos miclicos) na parede celular. Esses lipdios so os responsveis pela estabilidade cida.
As micobactrias liberam tuberculinas (peptdeos bacterianos) no meio de cultura durante o
crescimento. Pode-se desenvolver reaes de hipersensibilidade tardia para esses peptdeos, durante
a infeco, o que os torna reagentes diagnsticos teis.
As micobactrias so eliminadas pela luz solar e por radiao UV e pasteurizao.


Algumas espcies podem crescer em meios simples, mas em geral, crescem melhor em
meios orgnicos complexos, como o de Lowenstein Jensen, que contm, entre outros ingredientes,
ovos inteiros.
A presena de glicerol no meio favorece o desenvolvimento de M. tuberculosis , mas no de
M. bovis e M. avium. A durao do desenvolvimento leva 12 horas ou mais, podendo passar
semanas at que colnias sejam visveis.
O crescimento de colnias dos bacilos de mamferos irregular. As formas avirias crescem
em colnias do tipo arredondadas.

55

M. tuberculosis
o agente etiolgico da tuberculose humana (tpica) e de primatas. Esta pode se apresentar em
diversas formas clnicas, sendo a mais comum a pulmonar (cerca de 80%), a nica forma clnica
contagiosa. O teste confirmativo para diagnstico da tuberculose a demonstrao do M.
tuberculosis em material clnico (escarro, em humanos) colhido do paciente suspeito, atravs de
baciloscopia, pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen ou cultura em meios apropriados (diagnstico
bacteriolgico).

M. bovis
Agente da tuberculose bovina e da zoontica em humanos.

M. avium
Agente da tuberculose aviria e em humanos imunossuprimidos (Tuberculose atpica)

M. leprae
o agente etiolgico da hansenase, uma doena que se caracteriza por leses da pele, mucosas
e nervos perifricos. Caracterizam-se pela disposio em feixes ou globias. At o momento no se
obteve xito para o seu cultivo em laboratrio, sendo considerado parasita intracelular obrigatrio.

As rs so potenciais reservatrios, sendo importantssimo fazer controle em raniculturas.
Esse um dos motivos para a carne de r no ser muito consumida atualmente.
A tuberculose uma doena que se estabelece num processo crnico. A infeco em
bovinos concentra-se no trato respiratrio e em linfonodos e cavidades serosas adjacentes,
ocorrendo disseminao hematgena.
Eqinos so raramente infectados, mas com freqncia relativamente maior por M. avium
do que por M. bovis e a infeco entra pelo trato alimentar.
Em sunos somente M. bovis causa doena progressiva com leses clssicas, geralmente
pela via alimentar.
Ces e gatos so susceptveis a M. bovis e M. tuberculosis, mas raramente so infectados
por M avium.
Canrios e psitacdeos so mais susceptveis a M. tuberculosis do que M. avium.
A tuberculose bovina est erradicada em pases industriais. uma doena tpica de cativeiro
e da domesticao, devido a alta transmisso nos grupos confinados. As leses so mais intensas em
indivduos imaturos. A maior prevalncia em rebanhos leiteiros do que em rebanhos de corte,
devido ao grande stress de produtividade em vacas leiteiras.

As micobactrias resistem colorao de gram devido espessura da camada de cidos
miclicos de sua parede.
A colorao de Ziehl-Neelsen uma tcnica de fcil execuo, muito til e importante para
o diagnstico clnico das micobacterioses e se fundamenta na propriedade tintorial que tm as
micobactrias de quando coradas resistirem ao descoramento por solues lcool-cido (sendo, por
isso, chamadas de BAARs - Bacilos lcool-cido resistentes). A evidenciao direta de BAARs no
material clnico suspeito (escarro, urina, lquor, fezes, leses de pele e lavado gstrico) apenas
presuntiva, pois no identifica a espcie observada.

OBJETIVOS

1. Evidenciar as caractersticas morfotintoriais de M. tuberculosis e micobactrias em geral.
2. Diagnstico e avaliao do tratamento de tuberculose pulmonar.
56
TCNICA

1. No material suspeito, observar o aspecto, colorao e presena ou no de sangue.
2. Na lmina limpa e desengordurada, fazer o esfregao do material com bastante assepsia,
retirando a alada da poro mais densa.
3. Flambar a ala.
4. Deixar o esfregao secar ao ar.
5. Fixar na chama do Bico de Bunsen.
6. Cobrir a lmina com fucsina de Ziehl concentrada, aquecendo a lmina at a emisso de
vapores (mais 5 minutos).
OBS: importante queimar os lipdeos da parede, amolecendo-os, para facilitar a entrada do
corante.
7. Escorrer o corante e lavar com a soluo lcool-cido clordrico 3% (diferenciador) tempo
delicado.
8. Lavar com gua
OBS: Aps esfriar, os lipdeos voltam ao normal e o corante no sai.
9. Cobrir a lmina com soluo de azul de metileno (contra corante) - (1 minuto)
10. Lavar, secar e observar ao microscpio com objetiva de imerso, leo de cedro e
iluminao forte.

No mtodo de Ziehl-Neelsen as micobactrias permanecem coradas, por serem BAARs, com
tonalidade vermelha, enquanto as outras estruturas e bactrias se mostram azuis.

Pelas normas estabelecidas pela Campanha Nacional contra a Tuberculose, a interpretao da
lmina pode ser:

Negativo (-) ausncia de BAARs em 100 campos microscpicos
Positivo (+) menos de 1 bacilo/campo em 100 campos
Positivo (++) 1 a 10 bacilos/campo em 50 campos
Positivo (+++) mais de 10 bacilos/campo em 20 campos

57
II. TCNICA PARA EVIDENCIAO DE ESPIROQUETAS

FUNDAMENTAO TERICA

Os organismos espiralados de significado mdico, os Treponemataceae, incluem trs
grupos patognicos para o homem e vrios outros animais: Leptospira, Borrelia e Treponema,
responsvel pelas doenas conhecidas como treponematoses, destacando-se T. pallidum, que causa
a sfilis e o T. cuniculi, que causa a sfilis em coelhos. Os hospedeiros naturais so o homem, os
macacos superiores e os coelhos, mas todos de sangue quente at agora testados podem ser
infectados.
Leptospirose um termo aplicado doena causada por todas as leptospiras, sem considerar
o sorotipo especfico. A doena ocorre em uma grande variedade de hospedeiros animais,
domsticos e selvagens e nos seres humanos uma ocorrncia acidental.
As leptospiras so classificadas pela composio antignica, divididas em 23 sorogrupos e
mais de 200 sorotipos. Os principais so:

Hospedeiros adaptados Hospedeiros clnicos
L. icterohaemorrhagiae Roedores (so os portadores
mais comuns de leptospiras)
Ces, eqinos, bovinos e
sunos
L.canicola Ces Sunos e bovinos
L. pomona Bovinos, sunos Eqinos, ovinos
L. hardjo bovinos Bovinos no adaptados

Manifestaes de leptospirose

o Canina: Doena septicmica, heptica e renal.
o Bovinos e sunos: doena septicmica nos jovens, enquanto o aborto a principal
manifestao em adultos, causado por morte fetal primria. Em leites septicemia com
ictercia e hemorragias.
o Eqinos: Aborto e uvete recidivante (cegueira peridica ou oftalmia peridica), febre e
ictercia moderada em infeces naturais.

Espiroquetas entram na corrente sangunea aps inoculao em mucosa ou trato
reprodutivo, colonizando vrios rgos, onde produzem alteraes degenerativas, alm de lesar o
endotlio vascular, resultando em hemorragias.
A infeco do animal por um sorotipo adaptado ao hospedeiro cursa como um quadro
inaparente. Infeces clnicas que manifestam sinais evidentes so decorrentes de infeces por
sorotipos no adaptados ao hospedeiro.
A transferncia direta ocorre por aerossis de urina em baldes de leite e galpes bovinos ou
pelos hbitos de cortejar dos ces, o que explica a predisposio dos machos a leptospirose canina.
A vacinao em geral previne a doena, mas no impede infeco nem o estado de
portador, embora reduza sua existncia.

Morfologia

A famlia Spirochaetaceae compreende bactrias de formas espiraladas, com 0,1 x 6 a 20
micrmetros, delgadas, tamanho varivel, possuindo cinco gneros. Esfregaos a fresco
demonstram que so mveis.

Caractersticas de crescimento

58
So microorganismos anaerbios estritos, que crescem melhor entre 29 e 30 C. O meio
essencialmente soro de coelho (<10%) em solues que variam de salina normal a misturas de
preparados de peptonas, vitaminas, eletrlitos e tampes. A maioria dos meios so lquidos ou semi-
slidos (Agar a 0,1%). Nos meios lquidos desenvolve-se ligeira turbidez. Em meios semi-slidos, o
crescimento concentrado em um disco chamado zona turva cerca de 0,5 cm abaixo da
superfcie.
So catalase e oxidase positivos. A identificao baseada na sorologia.
So eliminados por ressecamento, congelamento, calor (50 C por 10 minutos), sabo,
cidos biliares, detergentes e putrefao.

Visualizao

Como so microrganismos muito delgados e recobertos por uma bainha protica, a
colorao de Gram no til na sua visualizao. Para tanto so empregados mtodos de
impregnao com sais de prata de tecidos fixados artifcio que aumenta a espessura de sua parede
- (mtodo de Fontana-Tribondeau) que permite sua observao em microscopia de campo claro e a
observao direta em microscopia de campo escuro. Os sais de prata, uma vez aquecidos sofrem
oxidao e conseqente escurecimento.
As espirais so mais bem demonstradas por microscopia eletrnica.
O campo escuro conseguido pelo uso de um condensador especial que faz com que os
raios luminosos penetrem na objetiva apenas pelos seus bordos de modo que a iluminao das
partculas se faa por reflexo e no transmisso. Desse modo apenas as partculas presentes so
iluminadas contrastando com um fundo escuro. Atravs desta visualizao se faz possvel inclusive
a realizao do diagnstico por soroaglutinao microscpica (microaglutinao) na leptospirose.

Microorganismos transparentes, como os espiroque-
tdeos podem ser vistos mais facilmente quando
observados em microscopia de campo escuro.

A microscopia de campo escuro deve ser limitada a urina, porque outros lquidos corporais
contm artefatos similares a leptospiras.

OBJETIVO

- Evidenciao de espiroquetas atravs da microscopia de campo escuro e/ou impregnao pela
prata.
59

MATERIAL

a. Microscpio ptico (M.O.)
b. M.O. +condensador
c. Lminas
d. Reagentes Fontana-Tribondeau
e. SWAB
f. lcool
g. leo de cedro
h. Soluo salina
i. Culturas em meios lquidos e slidos
j. Exsudato positivo


Microscopia em campo escuro

Partculas cujas dimenses so inferiores a 0,2micrmetros ou objetos cujos ndices de
refrao so muito prximos daquele do meio em que esto suspensos no so visveis ao
microscpio ptico, ao exame em campo claro. Para v-los, recorre-se ao artifcio do campo escuro,
que consiste em adaptar ao microscpio ptico comum um dispositivo que impede a penetrao dos
raios diretos provenientes de uma fonte luminosa intensa, de tal maneira que s penetram na
objetiva os raios refratados e refletidos pelo objeto observado.

Soluo impregnadora (nitrato de prata amoniacal):

o Dissolver 5 g de nitrato de prata em 100 ml de gua
o Retirar alguns mL
o Ao restante, adicionar gota a gota soluo concentrada de amnia at que o precipitado
castanho formado dissolva-se totalmente.
o Adicionar gota a gota a soluo de nitrato que foi retirada at que aparea uma fraca
turvao persistente.

Resultado: num campo escuro as espiroquetas aparecem claras.

- Mtodo de Fontana-Tribondeau (Impregnao pela Prata)

Preparar o esfregao numa lmina limpa e desengordurada
Secar ao ar
Fixar o esfregao com lquido de Ruge durante 1 minuto
Lavar com gua destilada
Cobrir a preparao com cido tnico (mordente) e com chama de um swab embebido em
lcool, aquecer a lmina com soluo de nitrato de prata amoniacal aquec-la at a
emisso de vapores (30 segundos)
Cobrir a lmina com soluo de nitrato de prata amoniacal e aquec-la at a emisso de
vapore (30 segundos)
60
Secar ao ar
Examinar ao microscpio com objetiva de imerso.

Resultado: As formas espiraladas aparecem em marrom escuro em um campo marrom claro. Os
espiralados possuem uma parede delgada que no evidenciada pelos mtodos habituais, o nitrato
de prata impregna na parede.

Reagentes de Fontana-Tribondeau:

1. Lquido de Ruge
- cido actico 1,0 mL
- Formalina 2,0 mL
- gua 100 mL

2. Mordente
- fenol 1,0 g
- cido tnico 5,0 g
- gua 100 ml

61
ASSUNTO
- Colimetria

FUNDAMENTAO TERICA

A gua elemento fundamental para a sobrevivncia humana e animal.
As guas para abastecimento podem ser poludas por derramamento de despejos dos mais
diversos tipos, o que representa um grande risco para a sade pblica e grande impacto sobre os
ecossistemas aquticos. A noo de que o ambiente aqutico pode servir de reservatrio para
espcies microbianas patognicas e permitir a sobrevivncia das mesmas reconhecida desde os
primrdios da civilizao. Vrias doenas podem ser veiculadas pela gua, tais como febre tifide,
disenterias, leptospirose, tuberculose, doenas parasitrias e fngicas. Essas doenas so resultantes
da ingesto de gua e alimentos contaminados ou do emprego de gua poluda pela irrigao, pesca,
lazer, piscicultura, cultura de marisco.
Em cidades onde existe um sistema eficiente de esgotamento sanitrio, o esgoto domstico
um dos principais responsveis pela poluio das guas, estimulando o crescimento de
microrganismos. A assimilao destes contaminantes orgnicos biodegradveis realizada com o
concurso de bactrias presentes, por meio de um processo que consome o oxignio dissolvido na
gua dos rios ou reservatrios. Quando a carga contaminante dos esgotos superior a capacidade de
auto depurao do rio ou aude, estes ficam sem oxignio, ocasionando odores ftidos e impedindo
a sobrevivncia dos peixes.
Alm dos esgotos domsticos, os efluentes industriais e o escoamento superficial urbano
contribuem grandemente na poluio dos corpos dgua. Os efluentes industriais contm grande
nmero de contaminantes, como metais pesados, entre outros. O escoamento superficial urbano
contm todos os poluentes que se depositam na superfcie do solo na ausncia de chuvas, como lixo
e matria orgnica. Estes acumulados no solo, valas e bueiros so arrastos quando da estao
chuvosa para os cursos dgua superficiais, constituindo-se numa outra fonte de poluio.
Os microrganismos dotados de potencial patognico chegam s extenses hdricas
procedentes das excrees intestinais do homem e de outros animais. Embora j existam mtodos
desenvolvidos para a deteco de vrios organismos patognicos de veiculao hdrica, os mesmos
no so aplicveis na rotina devido ao alto custo e necessidade de pessoal especializado.
Uma alternativa para a avaliao da qualidade sanitria da gua a pesquisa de organismos
no patognicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de sangue quente, que
quando encontrados indicam a ocorrncia de contaminao fecal, evidenciando o risco da presena
de patgenos. No indivduo saudvel essas bactrias constituem os habitantes normais do intestinos
onde a Escherichia coli a representante caracterstica. O nmero desses microrganismos pode
atingir 10 a nona clulas/g de fezes. Assim a presena da Escherichia coli em alimentos e gua
indicativo de contaminao fecal e possibilidade de presena de patgenos entricos.
Microrganismos indicadores de poluio de gua so utilizados para monitorar, classificar e
restringir o uso das guas. Um indicador ideal deveria preencher os seguintes critrios: 1. Ser
aplicvel a todo tipo de gua; 2. Estar presente simultaneamente com os microrganismos
patognicos, com um tempo de sobrevivncia igual quele patgeno entrico mais resistente; 3. No
se reproduzir em guas contaminadas, para no resultar em valores aumentados ( HAGLER E
MENDONA-HAGLER, 1998 ).
No se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismo que atenda a todos
esses requisitos, mas h vrios que se aproximam das exigncias referidas e que so muito teis.
As bactrias empregadas como indicadores de poluio fecal em guas so: os coliformes
totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens. O Indicador
microbiolgico mais empregado o grupo dos coliformes. Este e outros indicadores de poluio
orientam a margem de segurana sanitria de gua potvel, da gua utilizada para fins recreativos e
dos cultivos de organismos marinhos comestveis.
62
A Organizao Mundial de Sade (OMS) recomenda para guas recreacionais um mximo
de 100 coliformes fecais por 100ml de gua.

Coleta de amostras

A coleta de amostras para exame microbiolgico deve ser feita em garrafas esterilizadas
que tenham sofrido tratamento prvio de limpeza e rinsagem com gua destilada.
gua clorada: adiciona-se 0,1 ml de tiossulfato de sdio 10% para cada 250ml de gua
para neutralizar o cloro livre presente, impedindo que continue com propriedades desinfetantes
entre o perodo da coleta e o momento da inoculao.
gua com alto teor de cobre e zinco: coleta na presena de um agente quelante, de forma
a reduzir a toxicidade provocada pelos metais ( 0,3 ml de EDTA a 15%, ph =6,5para cada 120mL
de gua ).
Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espao livre na garrafa (cerca de 2,5
cm) para facilitar a homogeneizao antes da inoculao. As garrafas devem ser mantidas vedadas
at o momento da coleta da amostra e devem ser tomados todos os cuidados de assepsia no
momento da coleta, de forma a evitar contaminaes secundrias.

Pontos de coleta

1. gua da torneira
a. Abrir a torneira e deixar correr por 5 minutos, para eliminar as impurezas e a gua na acumulada
nas tubulaes.
b. Com algodo embebido em lcool, passar na abertura e internamente e em seguida flambar.
c. Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos.
d. Abrir o frasco esterilizado e coletar a gua. Introduzir gua no frasco at cerca de trs quartos do
seu volume.
e. Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratrio.

2. Poos e Cisternas
a. Preparao do frasco amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com um barbante para
facilitar a descida no poo.
b. Descer o frasco dentro do poo sem permitir que o mesmo toque nos lados.
c. Submergir o frasco completamente na gua.
d. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da gua para criar um espao de
ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.

3. Rios, Lagoas e Mares

a. Coleta da amostra de gua de rios e lagoas nestes casos deve-se mergulhar o frasco at uma
profundidade de 20cm, com abertura voltada em direo contrria a corrente, a fim de evitar a
contaminao da gua com as mos.
b. Coleta da gua do mar a coleta deve ser feita na regio onde as pessoas costumam banhar-se,
que corresponde profundidade aproximadamente de 1,0 m, que a regio das praias mais utilizada
para a recreao de contato primrio, na mar baixa e 24 horas sem chuvas.

Acondicionamento e transporte da amostra para laboratrio

O ideal a anlise iniciar-se at 1 hora aps a coleta. Caso isto seja impossvel, a amostra
deve ser transportada sob refrigerao. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10 graus Celsius no
prazo mximo de at 30 horas aps a coleta.
63
Amostras presumivelmente poludas tm de ser inoculadas no mximo aps 6 horas da
coleta.
Entre o recebimento da amostra e o inicio da inoculao, a mesma deve ser mantida em
geladeira (cerca de 5 graus Celsius).

Exames bacteriolgicos da gua

O exame bacteriolgico da gua feito atravs de dois processos: Contagem de bactrias
heterotrficas viveis na gua e determinao ou estimativa do nmero de bactrias coliformes.
A metodologia padro empregada no exame bacteriolgico da gua, para medida do grupo
coliforme, inclui dois procedimentos: a tcnica dos tubos mltiplos e a tcnica da membrana
filtrante (Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater -APHA, 1980).

- Determinao de coliformes pela tcnica dos tubos mltiplos NMERO MAIS PROVVEL
(NMP)

A tcnica do nmero mais provvel consiste no exame de uma srie de tubos onde foram
inoculados volumes diferentes de amostra.
O valor obtido resulta da consulta a tabelas que foram estimadas com base em frmulas de
probabilidade. Consideraes tericas e determinaes repetidas em grande escala indicam que este
tipo de tcnica tende a fornecer valores mais elevados do que o nmero real. As disparidades
tendem a diminuir quando se adota sries com maior nmero de tubos em cada diluio. Portanto, a
sensibilidade do teste depende do nmero de tubos adotados.
Existem vrias tabelas de NMP e a escolha da srie a ser adotada funo das
caractersticas microbiolgicas da amostra.

Tabelas de NMP/100 ml de amostra:

1. 5 X 10 ml ----- 2,2 >NMP 16

2. 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP >ou =240
i. 1 X 1 ml
ii. 1 X 0,1 ml

3. 3 X 10 ml ----- 3 > NMP >ou = 2400
a. 3 X 1 ml
b. 3 X 0,1 ml

4. 1 X 50 ml ------ 1 >NMP >ou =240
a. 5 X 10 ml
b. 5 X 1 ml

5. 5 X 10 ml ----- 2 > NMP >ou =2400
i. 5 X 1
ii. 5 X 0,1 ml

6. 5 X 50ml ----- 1 > NMP >ou =240

OBS: nos tubos onde o inoculo de 10 ou 50 ml, usar concentrao dupla do meio e
volume igual ao inoculo.

64
TABELA DOS PADRES MICROBIOLGICOS DE PROBABILIDADE VIGENTES

TUBOS POSITIVOS POR: Nmp PARA 100 ml
10 ml 1 ml 0,1 ml 3 tubos
0 0 0 <3
0 0 1 3
0 1 0 3
0 2 0 6
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
1 2 0 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15
2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
2 3 0 30
3 0 0 23
3 0 1 39
3 0 2 64
3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 460
3 3 2 1100
3 3 3 2400

gua potvel: Ausncia de coliformes totais
Ausncia de coliformes fecais


Teste Presuntivo

Inocular, aps a escolha da tabela, em tubos contendo caldo lauril sulfato triptose ou caldo de
lactose em concentraes dupla ou simples. Os tubos devem conter tubinhos de Durham.
O crescimento com formao de gs significa teste presuntivo positivo para coliformes totais.
Os tubos que no apresentarem formao de gs com 24 horas de incubao devem ser incubados
at 48 horas.
Os tubos positivos com 24 horas devem ser imediatamente inoculados nos meios de
confirmao para se evitar que um crescimento muito abundante provoque o abaixamento do pH, o
que pode provocar resultados falsamente negativos.

65
Teste de Confirmao

Coliformes Totais

A partir dos tubos com formao de gs, semear por alada (dimetro =3 mm) em tubos
contendo caldo de blis para igual nmero de tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a 35 0,5
por 48 3 horas.
A formao de qualquer quantidade de gs constitui teste positivo para coliformes totais.

Coliformes Fecais

Dos tubos positivos do teste presuntivo, transferir com uma ala de platina uma pequena
poro do meio para igual nmero de tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a 44,5 0,2 C por
24 horas.
A presena de gs no interior dos tubinhos de Durhan considerada reao positiva,
indicando contaminao de origem fecal.
A ausncia de gs mesmo com evidncia de crescimento indica a presena de coliformes de
outra fonte que no seja de intestinos de animais de sangue quente.

Teste complemento

A partir dos tubos positivos de caldo blis verde brilhante, semear por estrias em placa
contendo endo agar ou azul de metileno agar (agar EMB). Incubar a 35 0,5C por 24 2 horas.

Colnias tpicas: Meio endo agar - colnias vermelhas
Meio agar BEM - colnias verdes com centro escuro.

De cada placa, escolher uma ou mais colnias tpicas e bem isoladas; transferir cada colnia
para tubos contendo caldo de lactose ou caldo lauril triptose e para um tubo inclinado de agar
nutriente. Incubar a 35 0,5C por 24 horas, prosseguindo a incubao at 48 3 horas caso no
tenha ocorrido formao de gs aps a primeira incubao.


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- TCNICA DE FILTRAO EM MEMBRANA

A tcnica de filtrao na membrana para anlise da gua passou a ser recomendada pelo
"Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", ao lado da tnica de NMP, aps
a 13 edio. A recomendao afirma que a tcnica pode ser adotada para determinar a potabilidade
de qualquer gua, desde que, aps uma srie de exames paralelos, obtenha-se com as duas tcnicas,
resultados compatveis.
Entretanto, deve ser observado, quanto tcnica de filtrao em membrana:

Vantagens:
- Os resultados so obtidos aps 22-24 horas.
- Podem ser analisados volumes maiores e mais representativos das amostras.
- Os resultados em membrana tm maior grau de preciso, em relao tcnica dos tubos
mltiplos, proporcionando tambm maior reprodutibilidade.
- Um maior nmero de amostras pode ser processado com um mnimo de espao e
equipamentos.

Limitaes:
- As amostras com alta densidade de bactrias no coliformes, porm capazes de se
desenvolver sobre o meio de cultura, pois os coliformes podero ser impedidos de se
desenvolverem ou seno a densidade de coliformes podero ser impedidos de se desenvolverem ou
seno a densidade de coliformes pode ser menor do que a obtida pela tcnica do NMP.
- guas com alta turbidez devido as algas ou substncias em suspenso, pois estas podem
formar uma pelcula na superfcie da membrana e interferir no desenvolvimento de colnias
caracterstica de coliformes.

Tcnica:

Um volume de 100 ml de amostra filtrada a vcuo atravs de uma membrana de 0,45 de
dimetro de poro.
As bactrias ficam retidas na membrana e esta transferida para placas apropriadas contendo
almofadas de papel absorventes embebidas nos meios adequados.

Meio para coliformes totais: Endo (caldo ou agar)
Incubao 35 0,5 C por 22-24 horas.
Colnias Tpicas: cor rosa ou vermelha escura com brilho metlico caracterstico.

Meio para coliformes fecais: M-FC-Broth
Incubao: 44,5 0,2 por 24 horas.
Colnias Tpicas: cor azul.

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ANEXO

Padres de crescimento de acordo com a necessidade de oxignio

68
Bibliografia

Hirsh, Dwight C. e Yuan Chung Zee. Microbiologia Veterinria. 2 edio,
2003. Editora: Guanabara Koogan.

Trabulsi, Luiz Rachid e Alterthum, Flvio. Microbiologia. 3 edio, 2000.
Editora: Atheneu

Benson. Microbiological Applications Laboratory Manual in General
Microbiology. 8 edio.

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