P r o c . N a t l . A c a d . S c i .

US A
V o l . 9 3 , p p . 5 3 4 7 - 5 3 5 1 , Ma y 1 9 9 6
P h ys i o l o g y
E x p r e s s i o n o f a r e n a l t yp e I
s o d i u m / p h o s p h a t e t r a n s p o r t e r
( N a P i - 1 ) i n d u c e s a c o n d u c t a n c e i n
Xe n o p u s o o c yt e s p e r m e a bl e
f o r o r g a n i c a n d i n o r g a n i c a n i o n s
( p h o s p h a t e / t r a n s p o r t / i o n c h a n n e l s )
A N DRE A S E . B US C H * t , A N DRE A S S C H US T E R* , S I E G F RI E D W A L DE G G E R* , C A RS T E N A .
W A G N E R* , G UJ N T H E R Z E MP E L * ,
S T E F A N B RO E R* , J URG B I B E Rt , H E I N I MURE Rt , A N D F L O RI A N L A N G *
* I n s t i t u t e o f P h ys i o l o g y I , E be r h a r d - K a r l s - Un i v e r s i t a t T u bi n g e n , G m e l i n s t r a s s e 5 , D- 7 2 0 7 6 T u bi n g e n , G e r m a n y; a n d t l n s t i t u t e o f P h ys i o l o g y, Un i v e r s i t y
o f Z u r i c h ,
W i n t e r t h u r e r s t r a s s e 1 9 0 , C H - 8 0 5 7 Z u r i c h , S w i t z e r l a n d
C o m m u n i c a t e d by Ro be r t B e r l i n e r , Y a l e Un i v e r s i t y, N e w H a v e n , C T , J a n u a r y 1 9 , 1 9 9 6 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w O c t o be r 1 8 , 1 9 9 5 )
A B S T RA C T T w o d i s t i n c t m o l e c u l a r t yp e s ( I a n d I I ) o f
r e n a l p r o x i m a l t u bu l a r br u s h bo r d e r
N a + / P i c o t r a n s p o r t e r s
h a v e be e n i d e n t i f i e d by e x p r e s s i o n c l o n i n g o n t h e ba s i s o f t h e i r
c a p a c i t y t o i n d u c e N a + - d e p e n d e n t P i
i n f l u x i n t r a c e r e x p e r i -
m e n t s . W h e r e a s t h e t yp e I I t r a n s p o r t e r s ( e . g . , N a P i - 2 a n d
N a P i - 3 ) r e s e m bl e w e l l kn o w n c h a r a c t e r i s t i c s o f br u s h bo r d e r
N a + / P ; c o t r a n s p o r t , l i t t l e i s kn o w n a bo u t t h e p r o p e r t i e s o f t h e
t yp e I t r a n s p o r t e r ( N a P i - 1 ) . I n c o n t r a s t t o t yp e I I , t yp e I
t r a n s p o r t e r s p r o d u c e d e l e c t r o g e n i c t r a n s p o r t o n l y a t h i g h
e x t r a c e l l u l a r
P i
c o n c e n t r a t i o n s ( 2 3 m M) . O n t h e o t h e r h a n d ,
e x p r e s s i o n o f N a P i - 1 i n d u c e d a C l - c o n d u c t a n c e i n Xe n o p u s
l a e v i s o o c yt e s , w h i c h w a s i n h i bi t e d by C l - c h a n n e l bl o c ke r s
[ 5 - n i t r o - 2 - ( 3 - p h e n yl p r o p yl a m i n o ) be n z o i c a c i d ( N P P B ) > n i f l u -
m i c a c i d >> 4 , 4 ' - d i i s o t h i o c ya n a t o s t i l be n e - 2 , 2 ' - d i s u l f o n i c a c i d ] .
F u r t h e r , t h e C l - c o n d u c t a n c e w a s i n h i bi t e d by t h e o r g a n i c
a n i o n s p h e n o l r e d , be n z yl p e n i c i l l i n ( p e n i c i l l i n G ) , a n d p r o be n e -
c i d . T h e s e o r g a n i c a n i o n s i n d u c e d o u t w a r d l y d i r e c t e d c u r r e n t s i n
t h e a bs e n c e o f C l - . I n t r a c e r s t u d i e s , w e o bs e r v e d u p t a ke o f
be n z yl p e n i c i l l i n w i t h a K m o f 0 . 2 2 m M; be n z yl p e n i c i l l i n u p t a ke
w a s i n h i bi t e d by N P P B a n d n i f l u m i c a c i d . T h e s e f i n d i n g s s u g g e s t
t h a t t h e t yp e I N a + / P i c o t r a n s p o r t e r f u n c t i o n s a l s o a s a n o v e l
t yp e o f a n i o n c h a n n e l p e r m e a bl e n o t o n l y f o r C l - bu t a l s o f o r
o r g a n i c a n i o n s . S u c h a n a p i c a l a n i o n c h a n n e l c o u l d s e r v e a n
i m p o r t a n t r o l e i n t h e t r a n s p o r t o f C l - a n d t h e e x c r e t i o n o f
a n i o n i c x e n o bi o t i c s .
Re n a l p r o x i m a l t u bu l e c e l l s p l a y a m a j o r r o l e i n t h e r e a bs o r p -
t i o n a n d e x c r e t i o n o f p h ys i o l o g i c a l s u bs t r a t e s a s w e l l a s x e n o -
bi o t i c s . T w o p r o t e i n s w i t h d i s t i n c t m o l e c u l a r s t r u c t u r e s ( t yp e
I a n d I I ) h a v e be e n i d e n t i f i e d i n t h e a p i c a l m e m br a n e o f r e n a l
t u bu l e c e l l s a n d s h o w n t o i n d u c e t r a n s p o r t o f
P i
u p o n e x p r e s -
s i o n i n Xe n o p u s o o c yt e s ( 1 - 4 ) . T h e t yp e I I N a + - c o u p l e d P i
t r a n s p o r t e r e x p r e s s e d i n Xe n o p u s o o c yt e s m e e t s a l l kn o w n
c h a r a c t e r i s t i c s o f r e n a l br u s h bo r d e r m e m br a n e N a + / P i c o -
t r a n s p o r t , s u c h a s s i g m o i d a l N a + d e p e n d e n c e , p H d e p e n d e n c e ,
h i g h P 1 a f f i n i t y ( K m o f 0 . 1 m M) , a n d r e g u l a t i o n by p r o t e i n
ki n a s e C ( 2 , 5 - 7 ) . T h i s t r a n s p o r t e r i s a l t e r e d a t t h e f u n c t i o n a l
a n d m o l e c u l a r l e v e l s u n d e r a v a r i e t y o f p h ys i o l o g i c a l a n d
p a t h o p h ys i o l o g i c a l c o n d i t i o n s ( 8 - 1 2 ) . I n c o n t r a s t t o t yp e I I ,
t h e t yp e I t r a n s p o r t e r i n d u c e s o n l y a r e l a t i v e l y w e a k P i -
t r a n s p o r t a c t i v i t y w i t h a l o w P i a f f i n i t y i n Xe n o p u s o o c yt e s ( 1 ) .
I n f u r t h e r c o n t r a s t t o t h e t yp e I I t r a n s p o r t e r , t h e t yp e I p r o t e i n
l a c ks a n o t h e r m a i n c h a r a c t e r i s t i c o f P i t r a n s p o r t , n a m e l y a n
i n c r e a s e o f i t s e x p r e s s i o n d u r i n g a l o w P i d i e t ( 3 , 8 , 1 3 ) .
T h e r e f o r e , w e w e r e i n t e r e s t e d i n t h e t r a n s p o r t c h a r a c t e r i s t i c s
o f t h e t yp e I P i t r a n s p o r t e r , i t s e l e c t r o g e n i c p r o p e r t i e s o f
t r a n s p o r t , a n d t h e q u e s t i o n o f w h e t h e r i t m a y s e r v e a n o t h e r
f u n c t i o n i n t h e a p i c a l m e m br a n e o f r e n a l p r o x i m a l t u bu l e c e l l s .
MA T E RI A L S A N D ME T H O DS
c RN A e n c o d i n g N a P i - 1 ( 1 ) , N a P i - 2 ( 2 ) , N a P i - 3 ( 2 ) , a n d r B A T
( 1 4 ) w a s s yn t h e s i z e d i n v i t r o a s p r e v i o u s l y d e s c r i be d . Di s s e c t i o n
o f Xe n o p u s l a e v i s o v a r i e s a n d c o l l e c t i o n a n d h a n d l i n g o f t h e
o o c yt e s h a v e be e n d e s c r i be d ( 1 5 ) . T h e e x p e r i m e n t s w e r e
p e r f o r m e d o n o o c yt e s i n j e c t e d w i t h 1 0 n g o f c RN A p e r o o c yt e .
T w o - e l e c t r o d e v o l t a g e - c l a m p r e c o r d i n g s w e r e p e r f o r m e d 3 - 8
d a ys a f t e r i n j e c t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e u s i n g a G e n e c l a m p
5 0 0 a m p l i f i e r ( A x o n I n s t r u m e n t s , F o s t e r C i t y, C A ) a n d a
Ma c L a b D/ A c o n v e r t e r a n d s o f t w a r e f o r d a t a a c q u i s i t i o n a n d
a n a l ys i s ( A DI n s t r u m e n t s , C a s t l e H i l l , A u s t r a l i a ) . T h e e x t e r n a l
c o n t r o l s o l u t i o n ( N D 9 6 ) c o n t a i n e d 9 6 m M N a C l , 2 m M K C l ,
1 . 8 m M C a C l 2 , 1 m M Mg C l 2 , a n d 5 m M H e p e s ( t i t r a t e d w i t h
N a O H t o p H 7 . 4 ) . F o r s o m e e x p e r i m e n t s , a l l e x t r a c e l l u l a r
c a t i o n s w e r e s u bs t i t u t e d w i t h t e t r a e t h yl a m m o n i u m ( T E A ; 1 0 0
m M) o r C a 2 + w a s o m i t t e d ( N D 9 6 / 0 C a 2 + ) . I n s o m e e x p e r i -
m e n t s , a l l e x t e r n a l C l - w a s s u bs t i t u t e d by g l u c o n a t e , i o d i d e , o r
br o m i d e . B e c a u s e o f i t s C a 2 + - c h e l a t i n g c a p a c i t y, t h e f r e e C a 2 +
c o n c e n t r a t i o n i n t h e g l u c o n a t e c o n c e n t r a t i o n w a s < 0 . 1 m M.
Re p l a c e m e n t o f C l - w i t h g l u c o n a t e c a u s e d a j u n c t i o n p o t e n t i a l
o f "1 0 m V t h a t m u s t be c o n s i d e r e d f o r t h e i n t e r p r e t a t i o n o f
t h e s h i f t i n r e v e r s a l p o t e n t i a l s a n d d e p o l a r i z a t i o n s o bs e r v e d
a f t e r t h e s u bs t i t u t i o n o f C l - w i t h g l u c o n a t e ( s e e Re s u l t s a n d
Di s c u s s i o n ) . T h e f l o w r a t e o f t h e s u p e r f u s i o n w a s 2 0 m l / m i n ,
a n d a c o m p l e t e e x c h a n g e o f t h e ba t h s o l u t i o n w a s r e a c h e d
w i t h i n a bo u t 1 0 s . Up t a ke s t u d i e s w i t h be n z yl [ 1 4 C ] p e n i c i l l i n a n d
[ 3 H ] p - a m i n o h i p p u r a t e ( P A H ) w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i be d ( 1 6 ) .
C h e m i c a l s u s e d w e r e 5 - n i t r o - 2 - ( 3 - p h e n yl p r o p yl a m i n o ) be n z o i c
a c i d ( N P P B ; a g i f t f r o m R. G r e g e r , Un i v e r s i t y o f F r e i bu r g ,
G e r m a n y) , 4 , 4 ' - d i i s o t h i o c ya n a t o s t i l be n e - 2 , 2 ' - d i s u l f o n i c a c i d
( DI DS ) , n i f l u m i c a c i d , p h e n o l r e d , be n z yl p e n i c i l l i n a n d p r o be -
n e c i d ( S i g m a ) , a n d be n z yl [ 1 4 C ] p e n i c i l l i n ( A m e r s h a m ) . P A H a n d
[ 3 H ] P A H w e r e a g e n e r o u s g i f t f r o m K . J . Ul l r i c h ( Ma x P l a n c k
I n s t i t u t e , F r a n kf u r t , G e r m a n y) . A l l d a t a a r e g i v e n a s m e a n
S E M, w i t h n i n d i c a t i n g t h e n u m be r o f e x p e r i m e n t s . T h e r e c o r d e d
c u r r e n t s i n N a P i - 1 - e x p r e s s i n g o o c yt e s v a r i e d s i g n i f i c a n t l y, d e -
p e n d i n g o n t h e t i m e p e r i o d a f t e r c RN A i n j e c t i o n a n d o n t h e ba t c h
o f o o c yt e s ( f r o m d i f f e r e n t a n i m a l s ) . T h e r e f o r e , t h r o u g h o u t t h e
p a p e r , w e s h o w e x p e r i m e n t a l d a t a o bt a i n e d o n o n e s p e c i f i c d a y.
A l l s e t s o f e x p e r i m e n t s h a v e be e n r e p e a t e d a t l e a s t o n c e ; i n a l l
r e p e t i t i o n s , q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r d a t a h a v e be e n o bt a i n e d .
RE S UL T S A N D DI S C US S I O N
A s d e s c r i be d i n d e t a i l be l o w , l a r g e i n w a r d l y d i r e c t e d h o l d i n g
c u r r e n t s w e r e r e q u i r e d t o c l a m p Xe n o p u s o o c yt e s e x p r e s s i n g
A bbr e v i a t i o n s : T E A , t e t r a e t h yl a m m o n i u m ; N P P B , 5 - n i t r o - 2 - ( 3 - p h e n -
yl p r o p yl a m i n o ) be n z o i c a c i d ; DI DS , 4 , 4 ' - d i i s o t h i o c ya n a t o s t i l be n e - 2 , 2 ' -
d i s u l f o n i c a c i d ; P A H , p - a m i n o h i p p u r a t e .
t T o w h o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d be a d d r e s s e d . e - m a i l : a n d r e a s .
bu s c h @ u n i - t u e bi n g e n . d e .
5 3 4 7
T h e p u bl i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a ye d i n p a r t by p a g e c h a r g e
p a ym e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e be h e r e by m a r ke d "a d v e r t i s e m e n t " i n
a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U. S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 3 ( 1 9 9 6 )
D
6 0 m V
N I R
-
- e p u A
N a P i - 2 e x p r e s s i n g o o c yt e
0 . 4 s
- 4 0 _
- 2 A
1 s
F I G . 1 . C u r r e n t s i n Xe n o p u s o o c yt e s i n d u c e d by t h e e x p r e s s i o n o f t h e t yp e I N a + / P i c o t r a n s p o r t e r N a P i - 1 ( A - C ) a n d t h e t yp e I I t r a n s p o r t e r
N a P i - 2 ( D) . I n A , B , a n d D, c u r r e n t s w e r e r e c o r d e d d u r i n g v o l t a g e r a m p s ( d u r a t i o n w a s 2 s ) f r o m - 8 0 t o 6 0 m V ( h o l d i n g p o t e n t i a l w a s - 4 0 m V ) .
T h e d a s h e d l i n e i n d i c a t e s 0 c u r r e n t . ( A ) Re p l a c e m e n t o f e x t r a c e l l u l a r C l - w i t h g l u c o n a t e ( 0 C l ) r e d u c e s t h e o u t w a r d l y r e c t i f yi n g c u r r e n t a n d s h i f t s
t h e r e v e r s a l p o t e n t i a l ( p o t e n t i a l a t 0 c u r r e n t ) t o t h e r i g h t . ( B ) Re p l a c e m e n t o f e x t r a c e l l u l a r C l - w i t h i o d i d e ( I ) o r br o m i d e ( B r ) i n c r e a s e s t h e
c o n d u c t a n c e a n d s h i f t s t h e r e v e r s a l p o t e n t i a l t o t h e l e f t . ( C ) T h e c u r r e n t s i n d u c e d by N a P i - 1 d i d n o t i n a c t i v a t e d u r i n g l o n g v o l t a g e s t e p s ( 5 s ) t o
t h e v o l t a g e s i n d i c a t e d a t t h e c u r r e n t t r a c e s . ( D) I n N a P i - 2 - e x p r e s s i n g o o c yt e s , n o s i g n i f i c a n t ba c kg r o u n d c u r r e n t w a s o bs e r v e d . T h i s p a n e l s h o w s
s u p e r i m p o s e d t r a c e s u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s a s d e s c r i be d f o r B .
N a P i - 1 a t a h o l d i n g p o t e n t i a l o f - 5 0 m V , bu t s u p e r f u s i o n w i t h
P i
a t c o n c e n t r a t i o n s < 3 m M d i d n o t i n d u c e s i g n i f i c a n t c u r r e n t s
d e v i a t i n g f r o m t h e h o l d i n g c u r r e n t . S u p e r f u s i o n w i t h 1 m M
P i
i n d u c e d i n w a r d c u r r e n t s o f - 3 . 6 1 . 8 n A ( n =2 0 ) a n d 1 . 8
+
0 . 3 n A ( n = 6 ) i n N a P i - 1 - e x p r e s s i n g a n d c o n t r o l o o c yt e s ,
r e s p e c t i v e l y ( P = 0 . 5 9 5 ) . T h i s r e s u l t i s i n c o n t r a s t t o r e s u l t s
o bt a i n e d w i t h t h e t yp e I I
N a + / P i c o t r a n s p o r t e r s N a P i - 2 a n d
N a P i - 3 , w h i c h d i d n o t i n d u c e a ba c kg r o u n d c o n d u c t a n c e u n d e r
c o n t r o l c o n d i t i o n s bu t i n d u c e d N a + / P i - c a r r i e d
c u r r e n t s a t l o w
e x t r a c e l l u l a r P i
c o n c e n t r a t i o n s ( 5 , 6 ) . I n N a P i - 1 - e x p r e s s i n g
o o c yt e s , o n l y P 1 c o n c e n t r a t i o n s . 3 m M p r o d u c e d a n i n w a r d
c u r r e n t t h a t w a s l a r g e r t h a n t h e c u r r e n t i n d u c e d i n H 2 0 -
i n j e c t e d o o c yt e s ( - 1 4 . 2 3 . 5 n A v s . - 2 . 3 0 . 5 n A ; n =6 a n d
5 , r e s p e c t i v e l y) . T h i s c u r r e n t w a s p a r t i a l l y N a + d e p e n d e n t a n d
r e d u c e d t o - 5 . 5 3 . 7 n A ( n =6 ) i n t h e a bs e n c e o f e x t r a c e l -
l u l a r N a + . T h e c u r r e n t d i f f e r e n c e o f =1 0 n A c o r r e s p o n d s t o a
n e t i n w a r d m o v e m e n t o f 6 p m o l o f p o s i t i v e c h a r g e s p e r m i n ,
w h i c h c o r r e s p o n d s a p p r o x i m a t e l y t o t h e N a + - d e p e n d e n t P 1
t r a n s p o r t i n p r e v i o u s s t u d i e s o n N a P i - 1 - e x p r e s s i n g o o c yt e s ( 1 ) .
H o w e v e r , a s m e n t i o n e d a bo v e , t h e e x p r e s s i o n o f N a P i - 1
i n d u c e d i n a l l o o c yt e s ( n = 2 2 0 ) a ba c kg r o u n d c o n d u c t a n c e
r a n g i n g f r o m 2 . 5 , u S t o 2 0 0 , S ( c a l c u l a t e d f r o m c u r r e n t s
e l i c i t e d w i t h v o l t a g e r a m p s f r o m - 8 0 t o 6 0 m V ) , d e p e n d i n g o n
t h e ba t c h o f o o c yt e s a n d t h e d a y o f N a P i - 1 e x p r e s s i o n . I n o n e
ba t c h o f o o c yt e s , t h e N a P i - 1 - i n d u c e d c o n d u c t a n c e w a s 1 9 . 4
3 . 7 , t S ( n
=
7 ) a n d 1 6 7 . 9 9 . 3 , u S ( n
=
7 ) o n d a ys 2 a n d 6 o f
N a P i - 1 e x p r e s s i o n , r e s p e c t i v e l y. T h e r e v e r s a l p o t e n t i a l f o r t h i s
c o n d u c t a n c e w a s - 3 0 . 3 0 . 8 m V , w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e
e q u i l i br i u m p o t e n t i a l f o r C l - ( E c i ) i n Xe n o p u s o o c yt e s ( F i g .
1 A ; n =
3 0 ) . T h e N a P i - 1 - i n d u c e d c o n d u c t a n c e w a s o u t w a r d l y
r e c t i f yi n g ( i . e . , a t m o r e p o s i t i v e p o t e n t i a l s , t h e c u r r e n t s p e r
v o l t a g e d i f f e r e n c e w e r e l a r g e r t h a n a t n e g a t i v e v o l t a g e s ) .
T h i s c o n d u c t a n c e w a s i n d e p e n d e n t o f e x t r a c e l l u l a r C a 2 + .
W h e n e x t r a c e l l u l a r C a 2 + w a s o m i t t e d ( N D 9 6 / 0 C a 2 + ) , t h e
c o n d u c t a n c e w a s 2 1 . 0 1 . 4 , u S ( n
=
5 ) c o m p a r e d w i t h 2 0 . 1
1 . 3 , t S ( n
=
5 ) i n t h e p r e s e n c e o f 1 . 8 m M e x t r a c e l l u l a r C a 2 +
( N D 9 6 ) . F u r t h e r m o r e , a c o m p l e t e r e p l a c e m e n t o f e x t r a c e l -
l u l a r c a t i o n s w i t h T E A ( 1 0 0 m M) d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r t h i s
c o n d u c t a n c e . Un d e r c o n t r o l a n d T E A , t h e N a P i - 1 - i n d u c e d
B
c
. 2
. 0
c
.
0 . 1 1 1 0
c o n c e n t r a t i o n
( g M)
N P P B
1 , A
1 0 0
F I G . 2 . I n h i bi t i o n o f N a P i - 1 - i n d u c e d C l - c u r r e n t s by C l - c h a n n e l
bl o c ke r s . ( A ) N P P B i n h i bi t s , d e p e n d i n g o n t h e c o n c e n t r a t i o n , bo t h
i n w a r d a n d o u t w a r d c u r r e n t s . ( B ) C o n c e n t r a t i o n - i n h i bi t i o n r e l a t i o n -
s h i p f o r N P P B a n d n i f l u m i c a c i d f o r t h e c u r r e n t a t - 8 0 m V . N P P B
d i s p l a ys =1 0 - f o l d h i g h e r a f f i n i t y c o m p a r e d w i t h n i f l u m i c a c i d .
A ~ 6
1 0 0
C l
1
- 4 0 m V /
- 8 0
0 c
- - - - - - - - ; C L - - - -
-
' =| ~~~~~~~~~1
l i A
0 . 4 s
C
br
__ i
1
g A
0 . 4 s
5 3 4 8
P h ys i o l o g y:
B u s c h e t a l .
B
- - - - - - - - - - - - - -
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 3 ( 1 9 9 6 ) 5 3 4 9
/
~~~- 0 m
1 m M p r o be n e c i d
F ~ ~
~~~~
2 , A
0 . 4 S
B
1 0 0
8 0
* p r o be n e c i d
8 0
-
p e n i c i l l i n G
- U- p h e n o l r e d
: ; O
6 0 -
4 0 -
2 0 .
0
0 . 0 1 0 . 1 1
c o n c e n t r a t i o n ( m M)
F I G . 3 . I n h i bi t i o n o f N a P i - 1 - i n d u c e d C 1 - c u r r e n t s by o r g a n i c
a n i o n s . ( A ) P r o be n e c i d - m e d i a t e d C 1 - c u r r e n t i n h i bi t i o n i s a l m o s t
c o m p l e t e a t 1 m M. ( B ) C o n c e n t r a t i o n - i n h i bi t i o n r e l a t i o n s h i p f o r
p r o be n e c i d , be n z yl p e n i c i l l i n ( p e n i c i l l i n G ) , a n d p h e n o l r e d . P e n i c i l l i n
G i s t h e w e a ke s t i n h i bi t o r , w h e r e a s p h e n o l r e d d i s p l a ys t h e h i g h e s t
a p p a r e n t a f f i n i t y bu t a m a x i m a l i n h i bi t i o n o f o n l y - 5 0 % .
c o n d u c t a n c e w a s 9 . 2 1 . 7 , u S ( n =6 ) a n d 8 . 4 1 . 4 , S ( n =
6 ) , r e s p e c t i v e l y.
S u bs t i t u t i o n o f e x t r a c e l l u l a r C l - w i t h g l u c o n a t e d r a m a t i c a l l y
d e c r e a s e d bo t h i n w a r d a n d o u t w a r d c u r r e n t s a n d s h i f t e d t h e
r e v e r s a l p o t e n t i a l t o - 1 1 . 9 5 . 6 m V ( F i g . 1 A ; n =9 ) , s t r o n g l y
s u g g e s t i n g t h a t t h e o bs e r v e d c u r r e n t s a r e c a r r i e d by C l - .
C o n s i d e r i n g t h e l i q u i d j u n c t i o n p o t e n t i a l c a u s e d by t h e r e -
p l a c e m e n t o f C l - w i t h g l u c o n a t e ( =1 0 m V ) t h e a c t u a l s h i f t o f
t h e r e v e r s a l p o t e n t i a l i s e v e n h i g h e r . T h e c o n d u c t a n c e w a s a l s o
p e r m e a bl e f o r br o m i d e a n d i o d i d e , w h i c h s h i f t e d t h e r e v e r s a l
p o t e n t i a l f r o m - 3 0 . 8 1 . 6 m V a t c o n t r o l t o - 3 9 . 7 1 . 7 m V
a n d - 5 2 . 9 1 . 5 m V ( n =6 ) , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 1 B ) . A t 6 0 m V ,
bo t h B r - a n d C l - w i t h 3 . 1 2 0 . 3 1
p A
a n d 2 . 9 8 0 . 2 4 p A ,
r e s p e c t i v e l y, i n d u c e d a s i g n i f i c a n t l y l a r g e r o u t w a r d c u r r e n t
t h a n C l - ( 2 . 3 0 0 . 2 2 t L A ; n = 5 ) . T h e c o n d u c t a n c e w a s
p e r m a n e n t l y o p e n a n d d i d n o t i n a c t i v a t e d u r i n g 5 - s d e p o l a r -
i z a t i o n s o r h yp e r p o l a r i z a t i o n s ( F i g . 1 C ; n = 6 ) .
O o c yt e s e x p r e s s i n g t h e t yp e I I N a + / P i t r a n s p o r t e r s N a P i - 2
o r N a P i - 3 ( 2 ) i n d u c e d i n w a r d c u r r e n t s u p o n s u p e r f u s i o n w i t h
P i
( 1 m M) a s d e s c r i be d ( 5 , 6 ) bu t d i d n o t i n d u c e a c o n d u c t a n c e
i n t h e a bs e n c e o f P 1 ( F i g . 1 D) . A t d a y 6 a f t e r RN A i n j e c t i o n ,
t h e c o n d u c t a n c e i n N a P i - 2 - a n d N a P i - 3 - e x p r e s s i n g o o c yt e s w a s
1 . 4 0 . 2
, u S ( n
=
2 5 ) a n d 1 . 4 0 . 1 , u S ( n
=
1 5 ) , r e s p e c t i v e l y,
i n t h e a bs e n c e o f e x t r a c e l l u l a r
P i .
F u r t h e r m o r e , e x p r e s s i o n o f
t h e a m i n o a c i d e x c h a n g e r r B A T , a n o t h e r r e n a l br u s h bo r d e r
t r a n s p o r t e r , i n d u c e d o u t w a r d a n d i n w a r d c u r r e n t s u p o n s u -
p e r f u s i o n w i t h L - l e u c i n e ( 1 m M) o r L - a r g i n i n e ( 0 . 1 m M) a s
d e s c r i be d ( 1 7 ) bu t d i d n o t i n d u c e a c o n d u c t a n c e i n t h e a bs e n c e
o f n e u t r a l o r d i ba s i c a m i n o a c i d s ( t h e c o n d u c t a n c e w a s 1 . 8
0 . 2 , u S a t d a y 6 o f r B A T e x p r e s s i o n ; n =
6 ) . Mo r e o v e r , a
p e r m a n e n t l y o p e n C l - c o n d u c t a n c e c o u l d a l s o n o t be d e t e c t e d
i n H 2 0 - i n j e c t e d o r n o n i n j e c t e d o o c yt e s . T h e c o n d u c t a n c e s
A
0
- 2
- 4
- 6
E 8
> - 1 0
- 1 2
- 1 4
- 1 6
B
C
C :
C - a
0 )
C :
5 0 0
4 0 0
3 0 0
2 0 0
1 0 0 1
0 o
C ] p r o be n e c i d
* p e n i c i l l i n G
E D p h e n o l r e d
p e n i c i l l i n G
T J 3 0 n A
0 . 5 m i n
: . .. : : : . . . . .
F I G . 4 . E f f e c t s o f t h e o r g a n i c a n i o n s p r o be n e c i d , p e n i c i l l i n G , a n d
p h e n o l r e d i n t h e a bs e n c e o f C l - . I n c u r r e n t - c l a m p ( A ) a n d v o l t a g e -
c l a m p ( B ; h o l d i n g p o t e n t i a l w a s - 8 0 m V ) c o n d i t i o n s , a l l t h r e e a n i o n s
i n d u c e a h yp e r p o l a r i z a t i o n a n d o u t w a r d c u r r e n t s , r e s p e c t i v e l y. T h e
t r a c e s d i s p l a y t h e e f f e c t s o f a 3 0 - s s u p e r f u s i o n p e r i o d w i t h p e n i c i l l i n
( 1 m M) .
h e r e w e r e 1 . 6 0 . 1 , u S ( n =1 6 ) a n d 1 . 2 0 . 1 , u S ( n =3 5 ) f o r
H 2 0 - i n j e c t e d a n d n o n i n j e c t e d o o c yt e s , r e s p e c t i v e l y, s u g g e s t i n g
t h a t N a P i - 1 s p e c i f i c a l l y i n d u c e s t h e a n i o n c o n d u c t a n c e d e -
s c r i be d a bo v e .
T h e N a P i - 1 - i n d u c e d C l - c o n d u c t a n c e w a s s e n s i t i v e t o C l -
c h a n n e l bl o c ke r s ( F i g . 2 A a n d B ) . N P P B a n d n i f l u m i c a c i d
i n h i bi t e d N a P i - 1 - i n d u c e d c u r r e n t s e f f e c t i v e l y w i t h E C 5 0 v a l u e s
o f 1 . 9 9 0 . 2 2 , L M ( n = 5 ) a n d 4 3 . 0 1 2 . 6 p . M ( n = 5 ) ,
r e s p e c t i v e l y, w h e r e a s DI DS w a s a m u c h w e a ke r bl o c ke r ( 4 5 . 5
4 . 1 % i n h i bi t i o n a t 1 m M; n = 8 ) .
I n t h e a p i c a l m e m br a n e o f r e n a l p r o x i m a l t u bu l e c e l l s , t h e
s i t e o f N a P i - 1 e x p r e s s i o n ( 1 8 , 1 9 ) , n u m e r o u s a n i o n t r a n s p o r t
s ys t e m s a n d / o r c o n d u c t a n c e s h a v e be e n d e s c r i be d , o n e o f
w h i c h i s p e r m e a bl e t o o r g a n i c a n i o n s a n d i n h i bi t e d by p r o be -
n e c i d ( 2 0 ) . T h e r e f o r e , w e a n a l yz e d t h e e f f e c t s o f t h e o r g a n i c
a n i o n s p r o be n e c i d , p h e n o l r e d , a n d be n z yl p e n i c i l l i n o n N a P i -
1 - i n d u c e d C l - c u r r e n t s . T h e s e t h r e e o r g a n i c a n i o n s i n h i bi t e d
t h e C l - c o n d u c t a n c e w i t h d i s t i n c t p o t e n c i e s ( F i g . 3 A a n d B ) .
T h e m a x i m a l i n h i bi t i o n o f t h e C l - c o n d u c t a n c e by p r o be n e c i d
w a s e x t r a p o l a t e d t o 1 0 0 % w i t h a n E C 5 0 o f 0 . 2 2 0 . 0 3 m M ( n
=
6 ) . T h e m a x i m a l e x t r a p o l a t e d i n h i bi t i o n w i t h p h e n o l r e d a n d
be n z yl p e n i c i l l i n w a s 5 2 . 3 1 . 7 % ( n =6 ) a n d 4 3 . 1 1 9 . 4 % ( n
=
5 ) a t E C 5 0 v a l u e s o f 0 . 0 2 0 . 0 1 m M a n d 1 . 2 8 0 . 1 4 m M,
r e s p e c t i v e l y. I n c o n t r a s t t o t h e s e c o m p o u n d s , t h e o r g a n i c a n i o n
P A H h a d a t 1 m M n o e f f e c t o n t h e N a P i - 1 - i n d u c e d c o n d u c -
t a n c e . T h e c o n d u c t a n c e w a s 4 0 . 2 5 . 5 , u S ( n =5 ) a n d 4 1 . 9
5 . 4 , u S ( n
=
5 ) u n d e r c o n t r o l a n d 1 m M P A H , r e s p e c t i v e l y.
T h e e f f e c t s o f o r g a n i c a n i o n s o n N a P i - 1 - e x p r e s s i n g o o c yt e s
w e r e t h e n s t u d i e d u n d e r d i s t i n c t c o n d i t i o n s . I n c u r r e n t - c l a m p
e x p e r i m e n t s , t h e c o n t r o l m e m br a n e p o t e n t i a l w a s - 3 3 . 6 3 . 5
m V ( n
=
1 4 ) . Un d e r t h e s e c o n d i t i o n s , p r o be n e c i d a n d p h e n o l
r e d ( e a c h a t 1 m M) a n d be n z yl p e n i c i l l i n ( 1 0 m M) h a d n o
e f f e c t s o n t h e m e m br a n e p o t e n t i a l , w h i c h w a s - 3 4 . 2 1 . 2 m V
( n
=
6 ) , - 3 4 . 8 1 . 8 m V ( n
=4 ) , a n d - 3 5 . 2 2 . 1 m V ( n =
4 ) , r e s p e c t i v e l y, u p o n s u p e r f u s i o n w i t h t h e s e c o m p o u n d s .
P h ys i o l o g y:
B u s c h e t a L
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 3 ( 1 9 9 6 )
E l p e n i c i l l i n G ( 0 . 1 m M)
B a z ]
p e n i c i l l i n
G
( 0 . 1 m M) / N P P B ( 0 . 1 m M)
* p e n i c i l l i n G ( 0 . 1 m M) / n i f l u m i c a c i d ( 0 . 3 m M)
K m : 0 . 2 2 0 . 0 3 m M
-
* ,
I , - r
0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1
B e n z yl [ 1 4 C ] p e n i c i l l i n c o n c e n t r a t i o n ( m M)
3 0 -
o 2 5 -
E
a
C D
- e
2 0 -
C a
- 1 5 -
a
( ) 1 0 -
_ )
=
5 -
C D a )
c
5
1 . 2
F I G . 5 . Up t a ke o f
be n z yl [ 1 4 C ] p e n i c i l l i n
i n N a P i - 1 - e x p r e s s i n g o o c yt e s . I n c u ba t i o n t i m e w a s 1 5 m i n ; t h e u p t a ke w a s c a l c u l a t e d i n p m o l / h a f t e r
t h e s u bt r a c t i o n o f be n z yl [ 1 4 C ] p e n i c i l l i n u p t a ke i n H 2 0 - i n j e c t e d o o c yt e s . F o r e a c h p o i n t , n w a s 7 . ( A ) C o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n c e o f
be n z yl [ 1 4 C ] p e n i c i l l i n u p t a ke f i t t e d by Mi c h a e l i s - Me n t e n ki n e t i c s . ( B ) B e n z yl [ 1 4 C ] p e n i c i l l i n u p t a ke i n t h e a bs e n c e a n d p r e s e n c e o f N P P B a n d
n i f l u m i c a c i d .
H o w e v e r , w h e n e x t r a c e l l u l a r C l - w a s r e p l a c e d by g l u c o n a t e ,
t h e s e c o m p o u n d s c a u s e d a h yp e r p o l a r i z a t i o n . P r o be n e c i d ,
p h e n o l r e d , a n d be n z yl p e n i c i l l i n ( a l l a t 1 m M) c h a n g e d t h e
r e s t i n g m e m br a n e p o t e n t i a l i n t h e a bs e n c e o f e x t r a c e l l u l a r C l -
( t h e m e a s u r e d c o n t r o l p o t e n t i a l u n d e r g l u c o n a t e w a s - 1 3 . 8
4 . 8 m V ; n = 1 4 ) by - 7 . 2 1 . 5 m V ( n =6 ) , - 1 0 . 2 4 . 4 m V
( n =4 ) , a n d - 6 . 1 3 . 3 m V ( n =4 ) , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 4 A ) . I n
v o l t a g e - c l a m p e x p e r i m e n t s ( a t - 8 0 m V ) , p r o be n e c i d ( n =6 ) ,
p h e n o l r e d ( n =4 ) , a n d be n z yl p e n i c i l l i n i n d u c e d i n t h e a bs e n c e
o f e x t r a c e l l u l a r C l - o u t w a r d c u r r e n t s ( s e e F i g . 4 B ) .
T h e a p p e a r a n c e o f a h yp e r p o l a r i z a t i o n o r o u t w a r d c u r r e n t s
c o u l d be e i t h e r t h e r e s u l t o f a d i r e c t i n w a r d m o v e m e n t o f t h e s e
o r g a n i c a n i o n s o r t h e i n h i bi t i o n o f a r e s i d u a l o u t w a r d m o v e -
m e n t o f a n a n i o n ( i . e . , i n h i bi t i o n o f a n i n w a r d c u r r e n t ) .
E x t e n d e d s u p e r f u s i o n p e r i o d s ( >1 0 m i n ) w i t h C l - f r e e s o l u -
t i o n a t a h o l d i n g p o t e n t i a l o f - 8 0 m V d i d n o t a l t e r t h e h o l d i n g
c u r r e n t a n d p r o be n e c i d ( 1 m M) - i n d u c e d o u t w a r d c u r r e n t ( n
=
6 ) . T h e i n h i bi t i o n o f a r e s i d u a l o u t w a r d m o v e m e n t o f C l - o r
a n o t h e r e n d o g e n o u s a n i o n i s , t h e r e f o r e , u n l i ke l y t o be t h e
m a i n r e a s o n f o r t h e p r o be n e c i d - i n d u c e d h yp e r p o l a r i z a t i o n .
T h e r e f p r e , w e t e s t e d t h e o n l y a v a i l a bl e r a d i o a c t i v e o f t h e s e
t h r e e a n i o n s , be n z yl [ 1 4 C ] p e n i c i l l i n , f o r u p t a ke . N a P i - 1 -
e x p r e s s i n g o o c yt e s i n d e e d d i s p l a ye d
be n z yl [ 1 4 C ] p e n i c i l l i n u p -
t a ke t h a t s a t u r a t e d w i t h a n a p p a r e n t K m o f 0 . 2 2 0 . 0 3 m M
( F i g . 5 A ; n =
7 ) . B e n z yl [ 1 4 C j p e n i c i l l i n ( 0 . 1 m M) u p t a ke w a s
r e d u c e d t o 2 1 . 4 % a n d 4 8 . 8 % o f c o n t r o l i n t h e p r e s e n c e o f
N P P B ( 0 . 1 m M) a n d n i f l u m i c a c i d ( 0 . 3 m M) , r e s p e c t i v e l y ( F i g .
S B ; n =
7 ) . I n c o n t r a s t , N a P i - 1 e x p r e s s i o n d i d n o t i n c r e a s e
u p t a ke o f
[ 3 H ] P A H ( 0 . 1 m M) i n t o o o c yt e s . E x t r a p o l a t e d
u p t a ke o f [ 3 H ] P A H w a s 2 2 . 3 1 . 3 p m o l / h ( n
=
7 ) a n d 2 0 . 5
+ 1 . 7 p m o l / h ( n
=
7 ) i n N a P i - 1 - e x p r e s s i n g a n d H 2 0 - i n j e c t e d
o o c yt e s , r e s p e c t i v e l y ( P
=
0 . 4 1 7 ) .
T h e d a t a p r e s e n t e d h e r e d e m o n s t r a t e t h a t N a P i - 1 i n d u c e s
a n a n i o n c o n d u c t a n c e u p o n e x p r e s s i o n i n Xe n o p u s o o c yt e s . S o
f a r , i n d u c t i o n o f a n i o n c o n d u c t a n c e s i n Xe n o p u s o o c yt e s c o u l d
be s h o w n f o r r e p r e s e n t a t i v e s o f t h e C l C f a m i l y ( 2 1 ) , C F T R
( 2 2 ) , a n d
I C I n ( 2 3 ) , a p r o t e i n t h a t i n d u c e s a s w e l l i n g - i n d u c e d
C l - c o n d u c t a n c e u p o n e x p r e s s i o n i n Xe n o p u s o o c yt e s . N a P i - 1
s h o w s n o m o l e c u l a r s i m i l a r i t i e s t o a n y o f t h e s e p r o t e i n s .
Mo r e o v e r , a l l t h e s e c o n d u c t a n c e s c a n be c l e a r l y d i s t i n g u i s h e d
f r o m t h e N a P i - 1 - i n d u c e d a n i o n c o n d u c t a n c e r e p o r t e d i n t h i s
s t u d y by e l e c t r o p h ys i o l o g i c a l m e a n s ( v o l t a g e d e p e n d e n c e o f
a c t i v a t i o n , i n a c t i v a t i o n , a n d d e a c t i v a t i o n ) by t h e i r a n i o n s e -
l e c t i v i t y ( r a n k o r d e r o f p e r m e a bi l i t y f o r C l - , B r - , a n d I - ) a n d
p h a r m a c o l o g y ( s e n s i t i v i t y' f o r t h e C l - c h a n n e l bl o c ke r N P P B ,
n i f l u m i c a c i d , a n d DI DS ) . T o o u r kn o w l e d g e , t h e r e h a s be e n
n o r e p o r t o n a n a n i o n c o n d u c t a n c e i n Xe n o p u s o o c yt e s ( e n -
d o g e n o u s o r e x p r e s s e d a f t e r c RN A i n j e c t i o n ) t h a t m e e t s t h e
c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e c o n d u c t a n c e i n d u c e d by N a P i - 1 ( i . e . ,
p e r m a n e n t l y a c t i v a t e d , o u t w a r d l y r e c t i f yi n g a n i o n c o n d u c -
t a n c e , h i g h 1 - p e r m e a bi l i t y, a n d h i g h N P P B bu t l o w DI DS
s e n s i t i v i t y) . Mo r e o v e r , t h e e x p r e s s i o n o f a n u m be r o f u n r e l a t e d
m e m br a n e p r o t e i n s ( t yp e I I P i t r a n s p o r t e r s N a P i - 2 a n d N a P i - 3
a n d t h e a m i n o a c i d e x c h a n g e r r B A T ) d i d n o t i n d u c e a s i m i l a r
c o n d u c t a n c e n o r w a s s u c h a c o n d u c t a n c e e v e r o bs e r v e d i n
n o n i n j e c t e d o r H 2 0 - i n j e c t e d o o c yt e s , s u g g e s t i n g t h a t t h i s
a n i o n c o n d u c t a n c e i s s p e c i f i c a l l y i n d u c e d by N a P i - 1 . N a P i - 1 ,
w h i c h w a s o r i g i n a l l y c l o n e d f r o m r a bbi t ki d n e y a n d i s a l s o
h i g h l y e x p r e s s e d i n l i v e r , d i s p l a ys n o m o l e c u l a r s i m i l a r i t i e s t o
a n y o f t h e p r o t e i n s kn o w n t o i n d u c e a n i o n c o n d u c t a n c e s i n
Xe n o p u s o o c yt e s . H o w e v e r , t h e h u m a n a n a l o g g e n e , w h i c h i s
a l m o s t i d e n t i c a l t o N a P i - 1 , w a s r e c e n t l y c l o n e d ( 2 4 ) . Mo r e o v e r ,
a br a i n - s p e c i f i c p r o t e i n r e l a t e d t o N a P i - 1 ( B N P I ) w a s r e c e n t l y
i d e n t i f i e d ( 2 5 ) . I f B N P I i n d u c e s a l s o a n a n i o n c o n d u c t a n c e , i t s
i n f l u e n c e o n n e u r o n e x c i t a bi l i t y w o u l d be o f h i g h p h ys i o l o g i c a l
i m p o r t a n c e . I n ki d n e y, N a P i - 1 m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e bo t h
i n t h e C l - ba l a n c e o f p r o x i m a l t u bu l e c e l l s a n d f o r t h e
e x c r e t i o n o f a n i o n i c x e n o bi o t i c s . A bl o c ka d e o f N a P i - 1 ( e . g . ,
w i t h p r o be n e c i d ) c o u l d i n c r e a s e t h e h a l f - l i v e s o f o t h e r a n i o n i c
x e n o bi o t i c s ( e . g . , be n z yl p e n i c i l l i n ) .
T h e a u t h o r s a r e i n d e bt e d t o Dr . P . H a u s e n a n d B . N o l l f o r t h e i r
d i s c u s s i o n o f t h e m a n u s c r i p t a n d t h e p r e p a r a t i o n a n d h a n d l i n g o f
o o c yt e s . W e g r a t e f u l l y a c kn o w l e d g e t h e t e c h n i c a l a s s i s t a n c e o f A .
B r o e r . A . E . B . i s a H e i s e n be r g F e l l o w . T h i s w o r k w a s f u r t h e r s u p p o r t e d
by De u t s c h e F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t G r a n t s B u 7 0 4 / 3 - 1 ( t o A . E . B . )
a n d L a 3 1 5 / 4 - 1 ( t o F . L . ) a n d S w i s s N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n
G r a n t 3 2 - 3 0 7 8 5 - 9 1 ( t o H . M. ) .
1 . W e r n e r , A . , Mo o r e , M. L . , Ma n t e i , N . , B i be r , J . , S e m e n z a , G . &
Mu r e r , H . ( 1 9 9 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 8 , 9 6 0 8 - 9 6 1 2 .
2 . Ma g a g n i n , S . , W e r n e r , A . , Ma r ko v i c h , D. , S o r r i ba s , V . , S t a n g e ,
G . , B i be r , J . & Mu r e r , H . ( 1 9 9 3 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 0 ,
5 9 7 9 - 5 9 8 3 .
3 . Mu r e r , H . & B i be r , J . ( 1 9 9 4 ) C u r r . O p i n . N e p h r o l . H yp e r t e n s . 3 ,
5 0 4 - 5 1 0 .
4 . B i be r , J . & Mu r e r , H . ( 1 9 9 4 ) C e l l . P h ys i o l . B i o c h e m . 4 , 1 8 5 - 1 9 7 .
A
0
E
a D
C Z
Q -
a )
a
&
7 -
N
C :
a )
C D
5 3 5 0
P h ys i o l o g y:
B u s c h e t a L
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 3 ( 1 9 9 6 ) 5 3 5 1
5 . B u s c h , A . E . , W a l d e g g e r , S . , H e r z e r , T . , B i be r , J . , Ma r ko v i c h , D. ,
Mu r e r , H . & L a n g , F . ( 1 9 9 4 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 1 ,
8 2 0 5 - 8 2 0 8 .
6 . B u s c h , A . E . , W a g n e r , C . A . , S c h u s t e r , A . , W a l d e g g e r , S . , B i be r ,
J . & Mu r e r , H . ( 1 9 9 5 ) J . A m . S o c . N e p h r o l . 6 , 1 5 4 7 - 1 5 5 1 .
7 . H a ye s , G . , B u s c h , A . E . , L a n g , F . , B i be r , J . & Mu r e r , H . ( 1 9 9 5 )
P f l u g e r s A r c h . 4 3 0 , 8 3 0 - 8 3 6 .
8 . W e r n e r , A . , K e m p s o n , S . A . , B i be r , J . & Mu r e r , H . ( 1 9 9 4 ) J . B i o l .
C h e m . 2 6 9 , 6 6 3 7 - 6 6 3 9 .
9 . L e v i , M. , L o t s c h e r , M. , S o r r i ba s , V . , C u s t e r , M. , A r a r , M. ,
K a i s s l i n g , B . , Mu r e r , H . & B i be r , J . ( 1 9 9 4 ) A m . J . P h ys i o l . 2 6 7 ,
F 9 0 0 - F 9 0 8 .
1 0 . L e v i , M. , S h a ym a n , J . A . , A be , A . , G r o s s , S . K . , Mc C l u e r , R. H . ,
B i be r , J . , Mu r e r , H . , L o t s c h e r , M. & C r o n i n , R. E . ( 1 9 9 5 ) J . C l i n .
I n v e s t . 9 6 , 2 0 7 - 2 1 6 .
1 1 . T e n e n h o u s e , H . S . , W e r n e r , A . , B i be r , J . , S h u yi , M. , Ma r t e l , J . ,
Ro y, S . & Mu r e r , H . ( 1 9 9 4 ) J . C l i n . I n v e s t . 9 3 , 6 7 1 - 6 7 6 .
1 2 . T e n e n h o u s e , H . S . , Ma r t e l , J . , B i be r , J . & Mu r e r , H . ( 1 9 9 5 ) A m .
J . P h ys i o l . 2 6 8 , F 1 0 6 2 - F 1 0 6 9 .
1 3 . V e r r i , T . , Ma r ko v i c h , D. , P e r e g o , C . , N o r bi s , F . , S t a n g e , G . ,
S o r r i ba s , V . , B i be r , J . & Mu r e r , H . ( 1 9 9 5 ) A m . J . P h ys i o l . 2 6 8 ,
F 6 2 6 - F 6 3 3 .
1 4 . B e r t r a n , J . , W e r n e r , A . , Mo o r e , M. L . , S t a n g e , G . , Ma r ko v i c h , D. ,
B i be r , J . , T e s t a r , X. , Z o r z a n o , A . , P a l a c i n , M. & Mu r e r , H . ( 1 9 9 2 )
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 9 , 5 6 0 1 - 5 6 0 5 .
1 5 . B u s c h , A . E . , K a v a n a u g h , M. P . , V a r n u m , M. D. , A d e l m a n , J . P .
& N o r t h , R. A . ( 1 9 9 2 ) J . P h ys i o l . ( L o n d o n ) 4 5 0 , 4 5 5 - 4 6 8 .
1 6 . B r o e r , S . , B r o e r , A . & H a m p r e c h t , B . ( 1 9 9 4 ) B i o c h i m . B i o p h ys .
A c t a 1 1 9 2 , 9 5 - 1 0 0 .
1 7 . B u s c h , A . E . , H e r z e r , T . , W a l d e g g e r , S . , S c h m i d t , F . , P a l a c i n , M. ,
B i be r , J . , Ma r ko v i c h , D. , Mu r e r , M. & L a n g , F . ( 1 9 9 4 ) J . B i o l .
C h e m . 2 6 9 , 2 5 5 8 1 - 2 5 5 8 6 .
1 8 . B i be r , J . , C u s t e r , M. , W e r n e r , A . , K a i s s l i n g , B . & Mu r e r , H .
( 1 9 9 3 ) P f l u g e r s A r c h . 4 2 4 , 2 1 0 - 2 1 5 .
1 9 . C u s t e r , M. , Me i e r , F . , S c h l a t t e r , E . , G r e g e r , R. , G a r c i a - P e r e z , A . ,
B i be r , J . & Mu r e r , H . ( 1 9 9 3 ) P f l u g e r s A r c h . 4 2 4 , 2 0 3 - 2 0 9 .
2 0 . P r i t c h a r d , J . B . & Mi l l e r , D. S . ( 1 9 9 2 ) i n T h e ki d n e y: P h ys i o l o g y
a n d p a t h o p h ys i o l o g y, e d s . S e l d i n , D. W . & G i e bi s c h , G . ( Ra v e n ,
N e w Y o r k) , p p . 2 9 2 1 - 2 9 4 5 .
2 1 . J e n t s c h , T . J . , G i i n t h e r , W . , P u s c h , M. , S c h w a p p a c h , B . ( 1 9 9 5 ) J .
P h ys i o l . ( L o n d o n ) 4 8 2 P , 1 9 S - 2 5 S .
2 2 . W e l s h , M. J . , A n d e r s o n , M. P . , Ri c h , D. P . , B e r g e r , H . A . , De n -
n i n g , G . M. , O s t e d g a a r d , L . S . , S h e p p a r d , D. N . , C h e n g , S . H . ,
G r e g o r y, R. J . & S m i t h , A . E . ( 1 9 9 2 ) C e l l 8 , 8 2 1 - 8 2 9 .
2 3 . P a u l m i c h l , M. , L i , Y . , W i c km a n , K . , A c ke r m a n , M. , P e r a l t a , E .
& C l a p h a m , D. ( 1 9 9 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 5 6 , 2 3 8 - 2 4 1 .
2 4 . C h o n g , S . S . , K r i s t j a n s s o n , K . , Z o g h bi , H . Y . & H u g h e s , M. R.
( 1 9 9 3 ) G e n o m i c s 1 8 , 3 5 5 - 3 5 9 .
2 5 . N i , B . , Ro s t e c k, P . R. , J r . , N a d i , N . S . & P a u l , S . M. ( 1 9 9 4 ) P r o c .
N a t l . A c a d . S c i . US A 9 1 , 5 6 0 7 - 5 6 1 1 .
P h ys i o l o g y:
B u s c h e t a l .