Fundao Paulista de Tecnologia e Educao

Laboratrio de Anlises Qumicas, Microbiolgicas e

Controle Industrial
Ttulo:
Contagem de Clostridium Sulfito Redutor e
Clostridium perfringens
ata de emiss!o:
maio"#$$%
&di'!o"Re(is!o:
$)"$*
+rea emitente:
e,artamento da Qualidade
Identifica'!o:
-A.LACI M/.$$0
1ol2a:
) de 3
1. OBJETIVOS
Estabelecer procedimento para a contagem de Clostridium sulfto redutores e
de Clostridium perfringens em alimentos;
2. APLICAO
Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos.
3. PRINCPIO
3.1. Contagem
Baseia-se na inoculao da amostra ou de uma diluio da mesma em meios
de cultura seletivos. Aps incubao em anaerobiose, os Clostridium formam
colnias negras, devido ! reao de reduo de sulfto a sulfeto, "ue reage com
citrato de amnio e ferro ###, formando um precipitado negro.
3.2. Fermentao tem"e#t$o#a
Baseia-se na verifcao da fermentao tempestuosa do leite presente no
meio leite com ferro, caracter$stica do Clostridium perfringens.p
Essa fermentao caracteri%a-se por formao de co&gulo bem defnido, com
grande formao de g&s, durante incubao ! temperatura seletiva de '( ) *+,.
3.3. Te#te# %on&rmat'(o#
A confrmao de Clostridium perfringens se fa% por meio de provas
confrmativas, com as "uais se evidenciam suas caracter$sticas de- imobilidade,
reduo de nitratos, produo de &cido e g&s a partir da lactose, fermentao da
rafnose e li"uefao da gelatina.
). *ATERIAIS
).1. E+$'"amento#, ('-rar'a# e o$tro#
E"uipamentos, vidraria e demais insumos b&sicos obrigatrios em
laboratrios de microbiologia de alimentos;
).2. *e'o# -e %$.t$ra# e reagente#
.oluo salina peptonada /,*0;
1gar triptose - sulfto - cicloserina 23.,4- base ou 1gar .a5id 6erguson
7erfringens 2.674 8base;
1gar esto"ue;
1gar motilidade - nitrato tamponado;
E.a/orao
E.'#a *ar'a Fernan-e#
A"ro(ao
*a$r0%'o Ferre'ra -e *a%e-o
ma'o12223 ma'o12223
C4PIA CONTROLA5A
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Clostridium perfringens
ata de emiss!o:
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&di'!o"Re(is!o:
$)"$*
+rea emitente:
e,artamento da Qualidade
Identifica'!o:
-A.LACI M/.$$0
1ol2a:
# de 3
9eio leite com ferro;
9eio lactose-gelatina;
,aldo vermel5o de fenol-base;
.oluo de rafnose */0 ;
,aldo de carne co%ida 2opcional caldo 3aro%%i4;
9eio tioglicolato;
Alfa naftilamina /,:0;
1cido sulfan$lico /,;0;
.oluo de cicloserina :0;
7olimi<ina B;
=anamicina;
>aspar ou leo mineral ou parafna l$"uida;
?erador de anaerobiose;
@eagentes para colorao de ?ram.
6. T7CNICA
6.1. Pe#agem e "re"aro -a amo#tra
7esar A: /,A g da amostra de acordo com as instruBes contidas no
7C7.DA,# DAB.//(, E7rocedimentos para o preparo, pesagem e descarte de
amostrasF.
Adicionar AA: mD de soluo salina peptonada /,*0 e 5omogenei%ar por
apro<imadamente (/ segundos em Estomac5erF. Essa a diluio */
-*
.
6.2. Pro%e-'mento# -e %ontro.e
Aplicar os procedimentos de controle espec$fcos estabelecidos pelo
laboratrio 8 7C7.DA,# DAB.//G.
6.3. Ino%$.ao em P.a%a#
A partir da diluio inicial */
-*
, efetuar as diluiBes deseHadas de acordo com
o 7C7.DA,# DAB.//I, EJiluiBes e soluBesF.
A partir das diluiBes escol5idas, semear al$"uotas de * mD em placas
estreis e adicionar cerca de *: mD de &gar 3., ou .67 em temperatura de '( -
';+,.
Komogenei%ar cuidadosamente e dei<ar solidifcar em superf$cie plana.
Aps, adicionar uma segunda camada de cerca de */ mD do mesmo meio.
Jei<ar solidifcar em superf$cie plana.
6.). In%$/ao
#mediatamente aps a solidifcao do &gar, incubar as placas 2sem inverter4,
em Harra de anaerobiose a I( *+, por *; a A' 5oras.
E.a/orao
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A"ro(ao
*a$r0%'o Ferre'ra -e *a%e-o
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* de 3
6.6. Se.eo e I#o.amento
As colnias t$picas de Clostridium sulfto redutores so negras e de taman5o
vari&vel de * a I mm no &gar 3., e no &gar .67.
.elecionar placas "ue conten5am entre A/ e A// colnias t$picas.
,ontar todas as colnias negras presentes. Anotar o resultado.
Esse resultado, multiplicado pela diluio usada, corresponde ao nLmero de
Clostridium sulfto redutores presentes por grama da amostra em an&lise.
Escol5er : colnias negras e repicar para tubos com &gar esto"ue. #ncubar
em anaerobiose a I( *+, por no m$nimo A' 5oras. 7aralelamente, repicar para
meio tioglicolato ou caldo de carne co%ida 2com selo estril de vaspar ou vaselina
ou parafna l$"uida ou leo mineral4.
6.8. Te#te# %on&rmat'(o# "ara Clostridium perfringens
6.8.1. Co.orao -e 9ram
A partir de cultura pura em &gar esto"ue ou dos meios usados
paralelamente, preparar esfregao e corar pelo mtodo de ?ram. Muando for
verifcada a presena de bastonetes retos com e<tremidades arredondadas,
?ram-positivos, reali%ar a prova de fermentao tempestuosa.
6.8.2. Fermentao tem"e#t$o#a :#torm te#t;
3ransferir * mD da cultura fresca obtida no meio tioglicolato ou no caldo de
carne co%ida para um tubo contendo meio leite com ferro. Adicionar o selo estril
e incubar a '( ) *+, em ban5o-maria por ( 5oras 2reincubar por maior tempo
2*A a *; 54 "uando o controle positivo no apresentar reao claramente
positiva4.
Alternativamente, pode ser utili%ada uma suspenso da cultura em teste,
obtida pela lavagem da superf$cie do &gar esto"ue com soluo salina peptonada
/,*0, transferindo * mD desta para o meio leite com ferro.
C Clostridium perfringens geralmente coagula o leite em at ( 5oras a '(+,,
com formao de co&gulo frme e grande "uantidade de g&s 2Efermentao
tempestuosaF4.
A partir das culturas "ue se apresentaram como C.perfringens na colorao
de ?ram e ofereceram resultado positivo na prova de fermentao tempestuosa,
reali%ar as seguintes provas-
6.8.3. Pro(a -a mot'.'-a-e
#nocular a cultura, com agul5a, em &gar motilidade-nitrato tamponado.
#ncubar em anaerobiose a I( ) *+, por A' 5oras.
C Clostridium perfringens imvel, com crescimento apenas ao longo da
lin5a de inoculao.
E.a/orao
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6.8.). Pro(a -a re-$o -o n'trato
Aps a leitura da motilidade, acrescentar ao 1gar /,: a * mD de soluo de
alfa-naftilamina /,:0 e /,: a * mD de &cido sulfan$lico /,;0.
C aparecimento de colorao vermel5a indicar& a reduo do nitrato a nitrito.
7ara confrmao do resultado negativo, acrescentar alguns miligramas de p
de %inco.
C aparecimento de uma cor rosa ser& indicativo da no reduo do nitrato,
en"uanto a no alterao da cor ser& indicativa de reao positiva para reduo
do nitrato.
C Clostridium perfringens redu% nitrato a nitrito.
6.8.6. Fermentao -a .a%to#e e .'+$e<ao -a ge.at'na
#nocular a cultura, com agul5a, em v&rios pontos do meio lactose-gelatina.
.e o meio for utili%ado ; ou mais 5oras aps a sua preparao, regener&-lo
por a"uecimento a :/+, por A 5oras em ban5o-maria, antes da inoculao.
#ncubar em anaerobiose a I( ) *+, por '' ) A5. Aps a incubao, manter
os tubos em geladeira por * 5ora.
Cbservar a fermentao da lactose pela produo de bol5as de g&s e pela
mudana da cor do meio de vermel5o para amarelo e tambm a li"uefao da
gelatina por meio da permanNncia do estado l$"uido aps o resfriamento por
cerca de * 5ora em geladeira.
C Clostridium perfringens fermenta a lactose e li"uefa% a gelatina em '' )
A5 a I( ) *+,.
6.8.8. Fermentao -a ra&no#e
@epicar a cultura para tubo contendo caldo para fermentao da rafnose.
Aps inoculao, adicionar * a A mD de selo estril- vaspar ou vaselina ou
parafna l$"uida ou leo mineral. #ncubar a I( ) *+, por OA ) A5.
>erifcar a fermentao da rafnose pela viragem da cor do indicador
vermel5o de fenol para amarelo.
As provas de li"uefao da gelatina em '' ) A5 5oras e a fermentao da
rafnose em OA ) A5 tornam poss$vel a diferenciao entre Clostridium
perfringens e outros clostr$dios imveis e redutores de nitrato como o Clostridium
celatum, Clostridium sardiniense e Clostridium paraperfringens.
C Clostridium perfringens fermenta a rafnose dentro de OA ) A5.
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CARACTERSTICAS 5IFERENCIAIS 5E CLOSTR5IOS
9eio motilidade
nitrato
9eio lactose-gelatina
Espcies de
Clostridium
9otilidad
e
Pitrato
1cidoQ
g&s
Di"uefa
o.
gelatina
C. perfringens A - R A?Q3 R 2';54
C.perfringens B - R A?Q3 R
2';QOA54
C. absonum R R A?Q,. -S
C. baratii - R A?Q,. -
C. celatum - R A?Q,. -
C.
paraperfringens
- R A?Q,. -
C. sardiniense 2R4 A?Q,. -S
A T &cido; A? T &cido e g&s; 3 T turbide%; ,. T claro com sedimento celular; R
T positiva; - T negativa; 2R4 T fraco; T motilidade fraca; S T 5idrlise lenta da
gelatina
8. RES=LTA5OS
8.1. C>.%$.o -o n?mero -e Clostridium #$.&to re-$tore# "re#ente# na
amo#tra@
,alcular o nLmero de Clostridium sulfto redutores multiplicando o nLmero de
colnias negras contadas no &gar 3., ou no &gar .67 pelo fator de diluio
usado, conforme recomendaBes constantes do 7C7.DA,# DAB.//:,
E7rocedimentos para contagem de colniasF.
8.2. C>.%$.o -o n?mero -e C.o#tr'-'$m "er<r'ngen#
,onsiderar como Clostridium perfringens as colnias "ue se apresentarem,
na colorao de ?ram, como bastonetes ?ram positivos, retos, com
e<tremidades arredondadas, positivos para a prova de fermentao
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3 de 3
tempestuosa, imveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose em '' )
A5, da rafnose em at OA ) A5 e capa%es de 5idroli%ar a gelatina em '' ) A5.
A partir dos dados obtidos, calcular o nLmero de microrganismos presentes,
de acordo com o 7C7.DA,# DAB.//:, E7rocedimentos para a contagem de
colniasF.
E<pressar o resultado em U6,Qg.
3. RE9ISTROS
@E?.DA,# DAB.//; 8 ,ontagem de Clostridium .ulfto redutor e Clostridium
Perfringens.
@E?.DA,# DAB.//G 8 ,MA 8 ,ontagem de Clostridium .ulfto redutor e
Clostridium Perfringens.
A. 5OC=*ENTO 5E REFERBNCIA
9#P#.3V@#C JA A?@#,UD3U@A 7E,U1@#A E ABA.3E,#9EP3C. #nstruo
Pormativa nW (A- Cfciali%a os 9todos Anal$ticos Cfciais para An&lises
9icrobiolgicas para ,ontrole de 7rodutos de Crigem Animal e 1gua. Bras$lia,
A//I.
E.a/orao
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