Biologia Molecular I

Bioqumica estudo de um nico componente em um organismo

Gentica estudo de um organismo sem esse componente
Gentica Bioqumica
Veja a via biossinttica da arginina:
A B C

Arginina
Intermedirios: , , Enzimas: A,B,C
A via envolve a converso de via dois intermedirios, e , para arginina. As trs etapas na converso de
para arginina so catalisados pelas trs enzimas, A, B e C (genes A, B e C). (Frase incompleta)
possvel haver defeitos em qualquer uma das etapas na sntese da arginina. Com arginina no meio, todos os
mutantes arg podem crescer em meio mnimo.
Dado um conjunto de mutantes arg, voc pode determinar quais mutantes possuem mutaes e em quais
genes (etapas) da via, para isso testando o crescimento dos mutantes e analisando o acmulo de
intermedirios na via.
Via e etapas que so defectivas em cada mutante:
A

C

Arginina
Mutante
Arg1 X Arg1 possui uma mutao no gene A
Arg3 X Arg3 possui uma mutao no gene B
Arg5 X Arg5 possui uma mutao no gene C
Arg1/Arg3 X X
(mutante duplo: bloqueado em duas etapas)
Testes de Epstase
Epstase quando o fentipo associado com um alelo mascara a expresso do fentipo associado com outro
alelo.
Usando cepas mutantes, voc pode fornecer intermedirio e testar os mutantes quanto ao crescimento sob
certas condies. Usando esse tipo de informao, voc pode ordenar os genes na via (se a ordem no for
conhecida).
Crescimento de cepas sob as seguintes condies:
Meio mnimo com:
tipo selvagem arginina
Arg1 + + + +
Arg3 - - + +
Arg5 - - - +
Arg1/Arg3 - - + +
+ = crescimento, - = sem crescimento Arg1/Arg3 haplide com duas mutaes
Interpretaes:
Por exemplo, dado o meio mnimo mais , o mutante Arg1 no consegue crescer porque tem um defeito
na etapa que converte (mutao no gene A).
O mutante Arg1 s consegue crescer se ou ou arginina for adicionado ao meio.
O mutante Arg1 ir se acumular, por que no possvel convert-lo para .
O mutante duplo possui defeitos em duas etapas da via. Esse mutante possui mutaes nos genes A e B. Ele
est bloqueado na etapa anterior da via.
O mutante duplo Ar1/Arg3 possui os mesmos requerimentos de crescimento as que o mutante nas ltima das
duas etapas (por exemplo, neste caso, o mutante Arg3).
O mutante duplo Arg1/Arg3 acumula o intermedirio como o mutante na primeira das duas etapas (por
exemplo, neste caso, o mutante Arg1).
Este um exemplo de epstase. O fentipo do mutante Arg3 mascara o fentipo do mutante Arg1 ao testar o
crescimento em diferentes intermedirios.
As informaes deste tipo de ensaio (teste de crescimento) permitem que se determine a ordem das etapas
(ou seja, os genes) em uma via biossinttica.
Biologia Molecular
Vrios experimentos-chave foram realizados do incio at a metade do sculo XX para se deduzir a natureza
do material gentico.
1. A descoberta do Princpio de Transferncia
1928: Experimentos feitos por F. Griffith com bactrias.
Griffith estava estudando a bactria pneumococo infectava camundongo e os matava.
Duas cepas:
1) Cepa lisa infecciosa (virulenta); cresce como colnias listas em placa de Petri (cepa S - do
ingls Smooth) (ela encapsulada por uma capa de polissacardeos que a torna resistente ao
sistema imune do camundongo).
2) Cepa rugosa no-infecciosa (no-virulenta); cresce como colnias rugosas em placa de Petri
(cepa R - do ingls Rough) (ela no tem a capa de polissacardeos, portanto est vulnervel ao
sistema imune do camundongo).
Griffith estudou o efeito das cepas SE das bactrias em camundongos.
Ele infectou camundongos com a bactria pneumococo.
Experimentos:
1) Injetou a cepa S no camundongo o camundongo morreu
2) Injetou a cepa R no camundongo no houve efeito prejudicial
3) Injetou cepa S morta pelo calor em camundongos no houve efeito prejudicial
4) Injetou nos camundongos uma mistura de cepa R viva e cepa S morta pelo calor os camundongos
morreram
Os resultados do experimento 4 foram surpreendentes, pois nem a cepa R nem a cepa S morta pelo calor
eram virulentas quando administradas independentemente. Griffith isolou o sangue do camundongo morto e
fez uma cultura. Ele descobriu bactrias lisas presentes no sangue do camundongo morto!
Ele isolou a cepa S viva do sangue desses camundongos. A cepa S morta pelo calor deve ter transformado a
cepa R viva na cepa S!
Deve ter havido algum material na cepa S morta pelo calor que foi capaz de converter uma cepa R no-
virulenta em uma cepa S virulenta.
In 1944: O. Avery, C. Macleod e M. McCarty: planejou para descobrir a natureza do princpio de
transformao.
- Repetiu os experimentos de transformao em uma proveta.
- Descobriu que eles poderiam converter a cepa R em uma cepa S bastando para isso adicionar um
extrato livre de clulas da cepa S na cepa R.
Mas o que havia no extrato livre de clulas que poderia converter a cepa R em cepa S?
Era uma protena?
Era um cido nuclico?
Era um lipdio?
Para deduzir isso, eles pegaram o extrato livre de clulas e o trataram com vrias enzimas para verificar se o
extrato ainda era efetivo na transformao de R S.
1) Tratou o extrato livre de clulas com proteases (corta as protenas) ainda estava ativo
portanto no era uma protena
2) Tratou o extrato livre de clulas com ribonuclease (corta o RNA) ainda estava ativo
portanto no era RNA
3) Tratou o extrato livre de clulas com desoxirribonuclease (corta o DNA) NO estava ativo
DEVE SER DNA
A natureza do material que transformou a cepa R na cepa S era DNA (cido desoxirribonuclico).
Apesar desses experimentos, as pessoas no estavam convencidas de que DNA era o material gentico.
Por qu? Porque o DNA era considerado uma molcula desinteressante. As protenas eram consideradas
mais interessantes; tantos tipos diferentes de protenas!
2. Estrutura do DNA
O DNA composto de 3 componentes:
a) Acar: (pentose)
b) Base: 4 tipos no DNA
acar + base = nucleosdeo
a base est ligada ao carbono C1 do acar.
Bases no DNA: Purinas: Adenina (A) e Guanina (G)
duas estruturas anelares feitas de tomos de
N, C, H e O
Pirimidinas: Citosina (C) e Timina (T)
uma estrutura anelar feita de tomos de C, H, O e
N
c) trifosfato: 3 grupos de fosfato
acar + base + grupo fosfato = nucleotdeo
Purina (A, G) ou Pirimidina
(C, T (U e C no RNA)
O monmero um trifosfato
desoxirribose em DNA
ribose (possui 2' OH) em RNA
Os Nucleosdeos do DNA
Polimerizao de Nucleotdeos:
O DNA composto de monmeros chamados de desoxirribonucleotdeos (dNTPs)
Os dNTPs so ligados por meio de uma ligao de acar-fosfato que forma a estrutura do DNA:
O acar (desoxirribose) ligado de modo covalente a um grupo de fosfato via uma ligao fosfodister:
Estrutura de acar-fosfato do DNA:
(de http://esg-www.mit.edu:8001/esgbio/lm/nucleicacids/dna.html)
DNA: cido Desoxirribonuclico
O DNA um cido nuclico porque o pKa do grupo fosfato ~1,0
O DNA tem uma carga negativa de pH 7,0 em razo de seus grupos de fosfato
3. Vrus Bacterianos e o Experimento de Hershey-Chase
1952: O maior suporte do papel gentico do DNA vem de estudos feitos por A. Hershey e M. Chase com um
vrus que infecta as bactrias E.coli.
Esses vrus so chamados de bacterifagos (vrus ou patgenos que infecta a bactria)
- O material gentico de um vrus armazenado dentro de um capsdeo protico.
O DNA possui polaridade. Uma extremidade
possui um grupo de 5' fosfato (P). A outra
extremidade possui um grupo 3' OH
novos nucleotdeos
(desoxirribonucleotdeos) sempre
adicionam ao grupo 3' OH do nucleotdeo
precedente
- Quando o fago infecta a bactria, ele injeta seu DNA viral dentro da clula. O DNA replicado; novos
virions de prognie (partculas virais) so feitos. A lise da clula feita medida que prognie do vrus
liberada, causando a morte celular.
Como ocorre o processo de infeco?
O bacterifago injeta seu DNA, seu capsdeo protico ou ambos?
Para rastrear qual material entra na clula, necessrio fazer uma distino entre DNA e Protena.
Para rastrear onde a protena e o DNA entram na clula, eles usaram radioistopos
- foi usado o istopo
32
P para marcar o DNA viral (marca apenas o DNA porque o fsforo no
est presente em protenas)
- foi usado o istopo
35
S para marcar protena virais (marca apenas protenas, porque o enxofre no
est presente no DNA)
O Experimento do Misturador
de Hershey-Chase
1
os vrus infectam
a bactria
2
os vrus so removidos das
clulas no misturador
3
as clulas e os fagos so
separados por centrifugao
no foi detectado enxofre nas
clulas
fsforo detectado nas clulas
(de http://esg-www.mit.edu:8001/esgbio/dogma/history2.html)
cpsula protica
marcada por enxofre
ncleo de DNA
marcado por fsforo
enxofre detectado
no sobrenadante
no foi detectado fsforo
no sobrenadante
As partculas virais so menores que as bactrias que restaram no sobrenadante parte lquida da mistura na
proveta depois da centrifugao. As bactrias fizeram uma pelota no fundo da proveta por serem mais
pesadas.
Resultado do Experimento:
1) A maior parte da marcao
32
P

(DNA do fago) foi encontrada dentro das clulas bacterianas
2) A maior parte da marcao
35
S

(protena do fago) foi encontrada no sobrenadante
Concluso:
Como foi encontrado principalmente DNA dentro das clulas, eles concluram que DNA era o material
gentico.
Houve uma marcao
35
S encontrada que estava associada com as clulas bacterianas assim,
algumas pessoas acreditavam que o material gentico governava a protena que estava presa clula.
MAS, em geral, a maioria das pessoas acreditava que o DNA era o material gentico.
Esses experimentos reforaram as noes propostas anteriormente por Avery, MacLeod e McCarty.
4. Estrutura do DNA
A partir de estudos feitos por E Chargaff (1950) e M. Wilkins (no incio da dcada de 1950), foram
determinadas algumas informaes sobre a natureza do DNA.
A partir desses resultados, J. Watson e F. Crick deduziram a estrutura do DNA em 1953.
Model of the structure of DNA: 1953 J. Watson e F. Crick
1) O DNA formado por dois polinucleotdeos que so antiparalelos, complementares e enrolados um ao
redor do outro em uma hlice dupla para a direita.
2) As bases de purina e pirimidina esto na parte interna com acar-fosfato
a estrutura est na parte externa da hlice
3) As duas cadeias so presas juntas por ligaes de hidrognio especificamente formadas entre as
bases:
A se liga com T 2 ligaes de hidrognio (A=T)
C se liga com 3 ligaes de hidrognio (C=G)
4) Existem 10 pares de bases (pb) por cada volta da hlice = 34 angstrons
- A distncia entre os pares de base de 0,34 nm e a largura da hlice de 2nm (20 angstrons)
**O aspecto mais importante do modelo de DNA de Watson-Crick era a formao de pares de base
encontrada no DNA.
As purinas sempre formavam par com as pirimidinas, mas o A poderia fazer par apenas com o T
e somente o G poderia fazer com o C em decorrncia dos requerimentos de ligao do hidrognio.
(de http://esg-www.mit.edu:8001/esgbio/lm/nucleicacids/dna.html)
Pares de Base Encontrados no DNA:
Adenosina Timidina Guanosina Citidina
(Adenina Timina) (Guanina Citosina)
(de http://esg-www.mit.edu:8001/esgbio/lm/nucleicacids/nucleicacids.html)
Os dois
filamentos esto
dispostas de forma
antiparalela um
ao outro
- Antigamente (em 1950, antes dos achados de Watson e Crick), E. Chargaff analisou o contedo de purina e pirimidinas de vrios
DNAs de diferentes fontes: leveduras, bactrias, seres humanos, etc.
- Chargaff descobriu que a porcentagem de A era sempre igual porcentagem de T e que a porcentagem de
G era sempre igual de porcentagem de C.
Regras de Chargaff
%A=%T
%G=%C
Mas Chargaff no conseguia dar explicaes para seus achados. No at que Watson e Crick propuseram seu
modelo da estrutura de DNA no qual as regras de Chargaff faziam sentido.
Assim, agora que o modelo do DNA estava deduzido, o que tinha de to fascinante sobre o DNA?
Qual o segredo da vida? Como voc passa a "hereditariedade" para sua prole?
A estrutura do DNA possibilitou que as pessoas tivessem resposta a algumas dessas perguntas.
Cada filamento da hlice de filamentos duplos do DNA uma "cpia" complementar do outro filamento.
Veja esta pequena seqncia de DNA:
(de http://esg-www.mit.edu:8001/esgbio/dogma/history2.html)
O modelo de hlice dupla do DNA sugeriu um mecanismo para a replicao do DNA (cpia do DNA)
Os filamentos se separam; cada
filamento serve como um modelo
para fazer um novo filamento.
Cada nova hlice de DNA com
filamento duplo composta de um
filamento principal e um filamento
derivado
A estrutura do DNA (dois filamentos complementares de DNA) explica:
1) Processo de Replicao do DNA
Cada filamento serve como modelo para cpia satisfaz o modelo de hereditariedade
2) Ocorrncia de Mutaes
Os erros na replicao do DNA (insero de uma base no complementar durante uma cpia de
DNA) levaria a mutaes (alteraes na seqncia do DNA).
5. Provando o Modelo de Crick- Watson
Durante a replicao do DNA, cada filamento age como modelo para a sntese do outro filamento. Cada nova
molcula de DNA consistir de um filamento principal (antigo) e um filamento de prognie (derivado, novo).
Se cada filamento servir como modelo para a replicao de DNA, ento ela deveria ocorrer em um
mecanismo semi-conservador, ou seja, cada nova molcula de DNA feita de um novo filamento e um
filamento antigo.
O mecanismo semi-conservador da replicao do DNA foi proposto por Watson e Crick.
Os filamentos se separam; cada
filamento serve como um modelo
para fazer um novo filamento.
Cada nova hlice de DNA com
filamento duplo composta de um
filamento principal e um filamento
derivado
Outro modelo: A Replicao Conservadora do DNA foi sugerida como:
1957 M. Meselson e F. Stahl queriam confirmar se a replicao do DNA ocorria de modo semi-conservador.
Eles fizeram isso usando um istopo pesado (
15
N) de
14
N (nitrognio).
Experimentos:
1) Eles cultivaram bactrias E.Coli em um meio que continha
15
NH
4
Cl como fonte nica de
nitrognio.
- O
15
N incorporado nas bases de purina e pirimidina no DNA, portanto o DNA ser mais pesado
que o normal.
- Eles cultivaram bactrias por muitas geraes em
15
N de modo que os filamentos de DNA
contivessem
15
N. Eles isolaram um pouco desse DNA pesado.
2) Eles pegaram as bactrias cultivadas em
15
N e as transferiram para um meio contendo
14
NH
4
Cl. O
DNA ento foi isolado em vrios momentos depois de a bactria estar no meio
14
N. Eles cultivaram
bactrias por duas outras geraes e isolou o DNA.
3) Eles usaram a tcnica de centrifugao em gradiente de densidade (tambm chamada de
centrifugao isopcnica) que permite que as molculas de DNA sejam separadas umas das outras
com base na densidade.
Centrifugao em Gradiente de Densidade:
O DNA misturado com uma soluo de cloreto de csio (CsCl). A mistura de CsCl-DNA
centrifugada com uma alta fora G em um tubo de centrfuga. O DNA ir agrupar no gradiente do CsCl
(formado pela centrifugao) em sua densidade correspondente.
Uma pequena quantidade do DNA
15
N/
15
N original e as diferentes amostras de DNA tiradas depois de 1
gerao e 2 geraes foi centrifugada no gradiente do CsCl. Depois, a centrifugao das diferentes amostras:
A hlice dupla original serve de alguma
maneira como modelo para replicao;
entretanto, depois de a replicao ocorrer,
os filamentos original voltam juntos.
Amostra original 1 gerao 2 geraes
(TODA PESADA) (TODA INTERMEDIRIA) (2 INTERMEDIRIAS e 2 LEVES)
Por que o DNA forma uma banda em determinada posio do gradiente de CsCl?
O DNA se estabelece em uma camada na posio do tubo na qual a densidade da soluo de CsCl for igual
do DNA.
Os experimentos de Meselson e Stahl provaram que o DNA foi replicado por um mtodo semi-conservador.
**A ausncia de uma banda na posio pesada no gradiente depois de uma gerao contradisse o mtodo
conservador; assim, a replicao era semi-conservadora.
**O Modelo de Crick e Watson estava correto a replicao do DNA por um mtodo semi-conservador: um
filamento de cada molcula de DNA de filamento duplo conservado na nova molcula derivada de DNA de
filamento duplo.
Aumento do
gradiente de
CsCl
Todo o
DNA
pesado
Todo o DNA
intermedirio
do DNA pesado
(camada inferior) e
do DNA leve (camada
superior)
Amostra original
1 gerao (uma rodada
de replicao)
Depois de 2 geraes