CLONAGEM MOLECULAR E TRANSFORMAO BACTERIANA

I - INTRODUO

Atualmente muito comum ouvirmos falar de clonagem em meios de

comunicao que atingem o grande pblico. tambm bastante comum assistirmos a
discusses sobre tica e importncia da clonagem entre pessoas que pouco sabem
sobre a parte tcnica do que esto discutindo e, muitas vezes, tambm sabem pouco
sobre os objetivos dos pesquisadores com os experimentos que so mostrados de
forma sensacionalista na mdia. Esta situao acaba dificultando o julgamento final:
quem clona do Bem ou do Mal?
O termo clonagem pode ser entendido como o processo de fazer cpias
exatas de um organismo ou de qualquer elemento. Portanto, quando dizemos que a
ovelha Dolly um clone, queremos dizer que ela uma cpia exata de outra ovelha.
Para obter este tipo de cpia, a clonagem iniciada com clulas e, por esta razo,
chamada clonagem celular.
O caso que vamos examinar, no consiste em fazer cpias de uma clula, mas
de uma molcula em particular. A clonagem de uma molcula (e no mais uma clula
ou um organismo) chamada clonagem molecular, assunto deste texto. A molcula a
ser clonada uma molcula de DNA. Alm disto, o termo utilizado, neste caso, no
mais para se referir a todo o processo de cpia da molcula, mas apenas etapa
inicial de ligao do inserto no vetor. Vetor? Inserto? Ligao? Vamos por etapas.
Talvez isso j tenha aparecido antes por a, mas vamos repetir.

Vetores so molculas de DNA plasmidial (plasmdios) dupla-fita, circular,

que tm replicao independente da do DNA genmico da bactria. Os plasmdios
so passados de gerao para gerao e podem ser facilmente introduzidos em
bactrias que no os contenham. Logo, se grudarmos um fragmento de DNA
(como, por exemplo, o gene que contm a informao para produo de insulina), em
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um vetor e o introduzirmos na bactria, o gene da insulina passar a ser copiado

cada vez que o vetor replicado. Os pesquisadores chamam os fragmentos
especficos de genes de insertos e o processo de grudar o inserto em vetores, de

ligao. O vetor que contm um inserto chamado de vetor recombinante, ou ento

de construo, e o processo de introduzir o vetor recombinante na bactria, para
que ela o copie, chamado de transformao bacteriana.

II CLONAGEM MOLECULAR

Antes de clonarmos um gene, temos que obt-lo em quantidade suficiente

para realizar o processo de lig-lo ao vetor. Para a obteno precisamos ter
informaes sobre este gene: sua seqncia de nucleotdeos, organismos que o
contenham e tecidos em que encontrado. A obteno do gene ou do cDNA de
interesse (o nosso inserto) pode ser feita por PCR, RT-PCR ou outras tcnicas
equivalentes, que so determinadas de acordo com o material de partida com o qual
estamos trabalhando. Se o material de partida DNA podemos utilizar PCR; se
RNA, temos que usar RT-PCR.
s vezes clonamos genes com a inteno de express-los em um organismo.

Expressar um gene significa produzir a protena que ele codifica. Quando estamos
trabalhando com genes de eucariotos e a inteno utilizar estes genes para serem
expressos em bactrias, temos que levar em conta que estas, como procariotos, no
so capazes de distinguir exons de introns. Esta incapacidade leva as bactrias a
produzir uma protena errada quando h introns presentes no gene que
pretendemos expressar. Nestes casos, o problema pode ser contornado clonando o
cDNA e no o gene inteiro. cDNA uma seqncia de DNA obtida de uma
polimerizao utilizando RNAm como molde e que, portanto, contm somente os
desoxirribonucleotdios correspondentes aos exons.
Aps a obteno do inserto, temos que ter em mos o vetor j pronto para a
clonagem. Os vetores so plasmdios que recebem este nome porque transportam o
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inserto para dentro da bactria. Na verdade, os vetores so plasmdios modificados

pelos cientistas para maximizar suas possibilidades de uso como ferramenta de
Engenharia Gentica. Aos plasmdios foram adicionados alguns acessrios, como
stios mltiplos de clonagem (SMC), cassetes de resistncia a antibiticos,
marcadores para seleo e outros.
O stio mltiplo de clonagem consiste em uma regio que contm stios para
vrias enzimas de restrio, o que permite que este vetor possa ser aberto por
vrias enzimas. importante lembrar que para ligar duas molculas de DNA que
tenham sido clivadas de forma coesiva necessrio que estas duas molculas
tenham sido clivadas com a mesma enzima de restrio.

Cassetes de resistncia a antibiticos so genes que codificam fatores que

bloqueiam a ao de antibiticos como, por exemplo, a enzima -lactamase. Quando
produzida, esta enzima destri os antibiticos que contm em sua estrutura um anel
-lactmico: penicilina, ampicilina e derivados. As bactrias que contm este
cassete so capazes de crescer em meio contendo aqueles antibiticos. Isso nos d
uma grande vantagem, pois permite que cultivemos bactrias em meio de cultura
contendo antibiticos e possamos selecionar somente aquelas que contenham os
vetores que nos interessam. Esta uma estratgia explorada diariamente nos
laboratrios de pesquisa no mundo todo, evitando que bactrias do ar contaminem
experimentos.

Marcadores de seleo so genes que codificam enzimas, como a galactosidade, por exemplo, e que se localizam sobre o stio mltiplo de clonagem
(SMC). Quando um inserto clonado no SMC o gene da -galactosidase
interrompido e deixa de produzir a referida enzima. A -galactosidase uma
enzima que catalisa a converso de substratos cromognicos incolores em
compostos coloridos. Logo, adicionando estes substratos ao meio e observando se a
colnia bacteriana produz compostos coloridos podemos saber quais colnias na
placa contm o vetor recombinante. Esta caracterstica pode ser explorada para a
identificao de vetores que realmente receberam um inserto.
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Agora que j temos vetor e inserto, proceder clonagem uma estratgia

simples. Basta misturar os dois em propores adequadas, adicionar a enzima DNA
ligase e incubar para que a ligao ocorra. Existem clculos que levam em conta a
massa dos DNAs e seu tamanho em pares de base para saber a proporo exata que
deve ser utilizada de vetor e inserto em uma reao de ligao mas, na prtica, uma
dose de empirismo acaba fazendo com que se deixe os clculos de lado.
Aps a reao de ligao temos que fazer cpias desta construo que tanto
trabalho nos deu e para isto utilizamos as bactrias.

III TRANSFORMAO BACTERIANA

A transformao bacteriana o processo de inserir um vetor, recombinante

ou no, em uma bactria e recebe este nome porque geralmente quando realizamos
este processo estamos conferindo caractersticas novas bactria, como por
exemplo, a capacidade de crescer em meio de cultura contendo antibiticos. A
bactria com novas caractersticas dita transformada.
Basicamente, existem dois procedimentos para realizar a transformao
bacteriana: a eletroporao e a transformao com cloreto de clcio.
A eletroporao uma tcnica na qual se misturam bactrias e o vetor em um
nico tubo e aplica-se um choque eltrico na mistura, com o objetivo de
desestabilizar a membrana e permitir a entrada do vetor na bactria. Ela ento
rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a 37C para que possa se
recuperar aps o choque.
A transformao com cloreto de clcio tem o mesmo objetivo. As bactrias e
o vetor so misturados com uma soluo de cloreto de clcio e sofrem um choque
trmico. Os ons clcio tm a funo de neutralizar as cargas negativas do DNA e
da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no

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momento do choque trmico (que, portanto, tem a mesma funo do choque

eltrico).
Aps a transformao, as bactrias so incubadas em condies adequadas
para que possam se multiplicar e, a seguir, plaqueadas em meio slido, para que
colnias possam ser isoladas. A identificao das colnias recombinantes feita
utilizando as caractersticas conferidas pelos plasmdios. Uma vez identificada a
bactria que contm a construo de interesse dentre as vrias plaqueadas, basta
transferir a colnia para meio lquido para que se obtenha milhes de cpias da
bactria e, conseqentemente, da construo.

PERGUNTAs SOBRE PLASMDEO E CLONAGEM MOLECULAR

1. Considerando os esboos de um plasmdeo e de um fragmento de DNA
abaixo, como seria possvel clonar este DNA no plasmdeo?
Leve em conta que o fragmento de DNA foi isolado com os oligos 1 e 2. O
primer 1 foi desenhado com um stio de BamHI e o primer 2 com stio de
XhoI como adapatadores.
Fragmento de DNA
Seqncia do fragmento:
ACTAGTGGATATGACTGGTGGA
CAGCAAATGGGTCGGGATCTGT
ACGACGATGACGATAAGGATCC
AACCCTTATTTTTGTTCCGCAGA
AGACGCAGGTTGTGACAAAAGA
AGAGTCTGAAATTGGAGTGAAA
TTTGCGTTTCTCACACCCTCTC
GACCTCCTTGA
GTGGAT: stio de Bam HI
GACCTC: stio de Xho I

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2. Associar as expresses com as definies.

1 DNA ligase

Antibitico que discrimina bactria com plasmdeo

Fragmento de DNA a ser clonado.

Enzima cuja ao permite identificar bactrias

com inserto.

Regio do plasmdeo com vrios stios de restrio.

Enzima que catalisa a ligao de duas

extremidades de DNA.

6 Ampicilina

Insero de um gene no plasmdeo.

7 galactosidase

Insero do plasmdeo na bactria.

Transformao
bacteriana

3 Inserto
Stio mltiplo de
clonagem
Clonagem
5
molecular
4

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