Objetivo

Tivemos como objetivo a realizao de um estudo sobre o efeito citotxico de diferentes concentraes
da Hidroxiapatita estequiomtrica aplicadas a cultura de clulas osteoblsticas.
Materiais
Laboratrio de Cultura Celular realizado pelo monitor

Garrafa com clulas;

Tripsina;
Tubo Falcon;
Cultura de clulas osteoblsticas em placas de cultura de 96 poos;
Centrfuga clnica;
Fluxo laminar;
Incubadora;
Microscpio invertido;
Cmara de Neubauer;
Meio de cultura DMEM;
Tripsina;
Biomaterial (Hidroxiapatita estequiomtrica) diludo em meio de cultura em diferentes
concentraes: 4mg/ml 2mg/ml 1mg/ml.

Sala de aula prtica realizado pelos alunos

Cultura de clulas osteoblsticas tratadas com diferentes concentraes de biomaterial ou com

controle;
Pipetas automticas e ponteiras;
Espectrofotmetro com filtro de 540nm;
Micro tubos;
Cristal Violeta;
Soluo Solubilizante;
Soluo PBS

Procedimentos:
Laboratrio de Cultura Celular realizado pela monitora
1 Etapa - Preparo do Biomaterial:
O biomaterial, no caso a Hidroxiapatita estequiomtrica, foi pesado em diferentes concentraes
de 4g, 2g e 1g em tubos Falcons. Em seguida foram dluidos separadamente em 10ml cada de meio de
cultura DMEM e colocados na estufa a 37C por 24h.
2Etapa Plaqueamento:
Uma garrafa com as clulas confluentes foi retirada da incubadora para, em seguida serem
tratadas com tripsina com o objetivo das mesmas se soltarem da garrafa. Aps esse processo, com as

clulas j soltas da garrafa, elas foram coletadas e centrifugadas. Com isso, foi adicionado 1mL de meio
para que as clulas fossem ressuspensas e assim serem transferidas para uma placa de 96 poos na
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densidade 2x 10 clulas por poo. Os poos foram completados com DMEM + soro Fetal Bovino
(SFB)10% at 200ul. Foi levado incubadora a 37C em 5% CO 2 / 24h at subconflunciar.
3 Etapa Teste do Efeito Citotxico
Nesta etapa, a placa constituida das clulas e os extratos que foram levados ao fluxo retirada
da incubadora. Em seguida, foi retirado cautelosamente o meio de cultura de todos os poos para que os
mesmos fossem completados com seus respectivos extratos:

Controle Positivo (C+): Ltex 100%

Controle Negativo (C-): 100% de Poliestireno
Controle do Experimento (C): Meio de cultura
Teste : Extrato do Biomaterial
Aps serem completados com os seus extratos, foram levados mais uma vez incubadora
37C/ 5% CO2 por 24 horas.

Sala de aula prtica realizado pelos alunos

1. 4Etapa: Determinao da sobrevivncia celular:
Nesta etapa, realizada a retirada do meio de cultura da placa pelo processo de inverso;
2. feito o procedimento da lavagem dos poos com 200ul de PBS apenas uma vez;
3. Em seguida, colocado 100ul de soluo Cristal Violeta em cada poo e incubado, em
temperatura ambiente, por 10 minutos;
4. Com isso, os poos so lavados 4 vezes com 200ul de PBS at sairem completamente lmpidos;
5. Nesse momento, esperamos a placa secar;
6. Aps a secagem, colocado 100ul de Soluo Solubilizante e a placa agitada
cuidadosamente;
7. transferido o contedo da placa para um microtubo que em seguida completado com 900ul
de PBS. Feito isso, o microtubo agitado;
8. Com isso, feita a transferncia para a cubeta e a mesma levada ao espectrofotmetro - ler a
540 nm;
9. Concluindo, aps feita a leitura, realizada a retirada da mdia das amostras de mesma
concentrao.