Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

ISSN 0103-0205
Setembro, 2008
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Centro Nacional de Pesquisa de Algodo

Documentos 191

Conceitos Bsicos de Tcnicas em

Biologia Molecular

Liziane Maria de Lima

Campina Grande, PB.

2008

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Exemplares desta publicao podem ser solicitados :
Embrapa Algodo
Rua Osvaldo Cruz, 1143 Centenrio
Caixa Postal 174
CEP 58107-720 - Campina Grande, PB
Telefone: (83) 3315-4300
Fax: (83) 3315-4367
algodao@cnpa.embrapa.br
http://www.cnpa.embrapa.br
Comit de Publicaes
Presidente: Carlos Alberto Domingues da Silva
Secretrio: Valter Freire de Castro
Membros: Fbio Aquino de Albuquerque
Giovani Greigh de Brito
Joo Luiz da Silva Filho
Maira Milani
Maria da Conceio Santana Carvalho
Nair Helena Castro Arriel
Valdinei Sofiatti
Wirton Macedo Coutinho
Supervisor Editorial: Valter Freire de Castro
Reviso de Texto: Maria Jos da Silva e Luz
Tratamento das Ilustraes: Geraldo Fernandes de Sousa Filho
Capa: Flvio Trres de Moura/Maurcio Jos Rivero Wanderley
Editorao Eletrnica: Geraldo Fernandes de Sousa Filho
1 Edio
1 impresso (2008) 1.000 exemplares
Todos os direitos reservados
A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui
violao dos direitos autorais (Lei n 9.610)
EMBRAPA ALGODO (Campina Grande, PB)
Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular, por Liziane Maria de
Lima. Campina Grande, 2008
27p. (Embrapa Algodo. Documentos, 191)
1. Cronagem molecular. 2. Manipulao de DNA. 3. Extrao de DNA. 4.
Purificao de DNA. 5. Sequenciamento de DNA. I. Lima, L.M. de II. Ttulo.
III. Srie.
CDD 574.88

Embrapa 2008

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Autores
Liziane Maria de Lima
D.Sc. Biloga da Embrapa Algodo, Rua Osvaldo Cruz, 1143,
Centenrio, CEP 58107-720, Campina Grande, PB.
E-mail: liziane@cnpa.embrapa.br

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Apresentao

Objetivou-se com este documento apresentar de forma sucinta alguns

conceitos bsicos em Biologia Molecular a estudantes ainda no graduados
da rea biolgica, no intuito de despertarem para a importncia da
tecnologia do DNA recombinante na biotecnologia. A Biologia Molecular
baseia-se nos conhecimentos produzidos pelas disciplinas de Bioqumica,
Microbiologia, Gentica, Biologia Celular, entre outras, os quais estimulam
o surgimento de idias para projetos inovadores com objetivos que visam,
muitas vezes, a melhoria da produo de alimentos, produtos farmacuticos
e qumicos, alm da aplicabilidade na terapia gnica.
Trata-se de uma apostila oferecida durante o curso de curta durao
"Tpicos Bsicos em Biotecnologia Vegetal", ministrado na Embrapa
Algodo, onde foram apresentadas as teorias de algumas tcnicas
aplicadas a Biologia Molecular, no mdulo destinado a esse fim.

Napoleo Esberard de Macdo Beltro

Chefe Geral da Embrapa Algodo

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Sumrio

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular ......................

11

1. Conceitos bsicos ......................................................................

11

1.1. Clonagem molecular .............................................................

11

1.2. Enzimas para a manipulao de DNA .....................................

12

1.3. PCR ....................................................................................

14

1.4. Eletroforese em gel de agarose .............................................

16

1.5. Clonagem de produtos de PCR ..............................................

17

1.6. Plasmdeos ou vetores...........................................................

17

1.7. Transformao celular ..........................................................

18

1.8. Extrao e purificao de DNA .............................................

20

1.9. Seqenciamento de DNA ......................................................

21

1.10. Anlise de DNA e RNA em blotting .....................................

22

2. Minidicionrio ............................................................................

24

3. Referncias Bibliogrficas ..........................................................

26

10

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Conceitos Bsicos de Tcnicas em

Biologia Molecular
Liziane Maria de Lima

1. Conceitos bsicos
1.1. Clonagem molecular
A clonagem molecular consiste na difuso de molculas de DNA idnticas e
baseia-se na propagao natural de clulas ou indivduos geneticamente
idnticos ao inicial. O experimento de clonagem gnica consiste em
introduzir o gene dentro de clulas bacterianas e isol-las em colnias. As
clulas de cada colnia so idnticas entre si (NASCIMENTO et al., 1999).
A clonagem gnica consiste em duas etapas bsicas:
a) Na primeira etapa faz-se a ligao entre um fragmento de DNA,
chamado inserto, contendo o gene de interesse com uma outra molcula
de DNA, o vetor, para formar uma quimera ou molcula de DNA
recombinante (figura 1) (BROWN, 2003).

Fig. 1. Ligao do vetor com o inserto para formar a molcula de DNA

recombinante.

11

12

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

b) Na segunda etapa, a molcula de DNA recombinante transportada

para dentro de uma clula hospedeira, em geral uma bactria, ocorrendo
o processo de transformao. A clula que recebeu o DNA
recombinante chamada de clula transformada, a qual sofre muitos
ciclos de diviso, produzindo vrias cpias do DNA recombinante, como
pode ser visto na Figura 2 (BROWN, 2003).

Fig. 2. Transformao de uma clula bacteriana com uma construo de DNA

recombinante.

1.2. Enzimas para a manipulao de DNA

As enzimas modificadoras de DNA so as principais ferramentas da
engenharia gentica e possibilitam a manipulao in vitro de molculas de
DNA ou RNA. A tecnologia do DNA recombinante possvel devido a
descoberta das enzimas bacterianas que catalisam reaes especficas nas
molculas de DNA. As enzimas podem ser agrupadas em cinco classes
(AUSUBEL, et al., 2003; TORRES, 2003).
Nucleases e ribonucleases - clivam a ligao fosfodister do DNA e RNA,
respectivamente, e podem ter atividade exonuclesica 3' - 5' e/ou 5' - 3'
ou endonuclesica. Dentre as nucleases, destacam-se as endonucleases de
restrio, comumente chamadas de enzimas de restrio, que so
importantes para a tecnologia do DNA recombinante. Elas clivam
seqncias de DNA especficas em ambas as fitas, chamadas de stios de
restrio, e podem gerar extremidades abruptas ou coesivas (Tabela 1).

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Tabela 1. Exemplos de endonucleases de restrio com os organismos de origem
e as seqncias de reconhecimento. As setas indicam os stios de clivagem
(NASCIMENTO et al, 1999).

Esse stio de reconhecimento da enzima normalmente uma seqncia

palindrmica, ou seja, a seqncia de bases de uma fita a mesma da fita
complementar, quando lida na direo contrria. As enzimas de restrio
so nomeadas conforme o microrganismo do qual foram isoladas; a
primeira letra representa o gnero, as segunda e terceira letras
representam a espcie, as seguintes, geralmente, representam a linhagem
e a ordem da descoberta.
Ligases - catalisam a formao de uma ligao fosfodister entre grupos 3'OH e 5'-PO4-, unindo covalentemente molculas de DNA de fita dupla,
resultando em uma molcula de DNA recombinante.
Polimerases - catalisam a sntese de molculas de DNA a partir de um
molde, ou seja, sintetizam uma nova fita de DNA, complementar a um
molde de DNA ou RNA preexistente. As polimerases so DNA ou RNAdependentes e so essenciais para a replicao e manuteno de todos os
organismos.
Modificadoras - catalisam reaes que modificam molculas de DNA pela
remoo ou adio de grupos qumicos especficos, como a remoo ou
adio de grupamentos fosfato das extremidades 5'.

13

14

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Topoisomerases - modificam a conformao do DNA circular pela induo

ou remoo de superenrolamento.

1.3. PCR
A reao em cadeia da polimerase (PCR) um procedimento rpido que
possibilita a amplificao in vitro de fragmentos de DNA especficos,
partindo-se de uma quantidade mnima de DNA alvo ou de RNA
previamente convertido em cDNA. Para a aplicao da tcnica, so
necessrios trs segmentos de cidos nuclicos: a dupla fita de DNA para
servir de molde e a construo de dois oligonucleotdeos (primers)
especficos - de fita simples e complementares as duas fitas molde de
DNA -, desenhados de modo a flanquear a seqncia a ser amplificada.
Alm disso, so necessrios DNA polimerase, dNTPs, tampo e sais
(MgCl). A tcnica consiste de ciclos repetitivos; cada ciclo est dividido
nos passos apresentados na Figura 3 (AUSUBEL, et al., 2003; WEAVER,
2001).
1 passo (94-96C) - Desnaturao do DNA a alta temperatura, devido ao
rompimento das pontes de hidrognio que unem as duas fitas.
2 passo (30-60C) - Anelamento dos primers em posies especficas (essa
temperatura definida em funo da seqncia nucleotdica dos primers).
3 passo (72-75C) - Extenso da seqncia a ser amplificada pela ao da
DNA polimerase.
Durante cada ciclo, as fitas complementares de DNA so copiadas pela
extenso dos primers que se anelam em posies opostas. Desta forma,
cada fita de DNA recm amplificada usada como molde no ciclo seguinte,
resultando assim, no acmulo exponencial do fragmento de DNA
flanqueado pelos dois primers (Figura 4).
Para o isolamento de um gene especfico podem ser utilizadas diferentes
estratgias de PCR (S et al., 2002; WEAVER et al., 2001): RT-PCR

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Fig. 3. Etapas da PCR - Reao
em Cadeia da Polimerase.

Fig. 4. Esquema de
amplificao exponencial
de um gene por PCR.

(amplificao de seqncias de cDNA); RACE-PCR (amplificao das

extremidades 3' e 5' de seqncias de cDNA); Tail-PCR (isolamento de
segmentos de DNA adjacentes a seqncias conhecidas) e PCR inverso
(isolamento de seqncias que flanqueiam uma regio genmica conhecida).

15

16

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

1.4. Eletroforese em gel de agarose

A eletroforese em gel de agarose um mtodo simples e eficiente que
permite separao, identificao e purificao de molculas de DNA. As
molculas so separadas atravs da migrao de partculas no gel, com a
aplicao de uma diferena de potencial eltrico, onde as molculas de
menor massa migram mais rpido. O protocolo padro de gel de agarose
permite separar fragmentos de DNA entre 0,5 a 25 kb. A eletroforese
tambm pode ser utilizada para separar protenas e molculas de RNA. A
agarose utilizada no gel um polissacardeo que forma uma rede e permite
regular a velocidade da migrao das molculas durante a separao. A
adio de corante fluorescente (brometo de etdio ou sybr), que se
intercala entre as bases do DNA, e o uso de radiao ultravioleta permitem
a visualizao e a fotografia, conforme Figura 5 (NASCIMENTO et al.,
1999; SOUZA, 2003).

Fig. 5. - Eletroforese de fragmentos de PCR amplificados; (M - marcador de peso

molecular).

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

1.5. Clonagem de produtos de PCR

A Taq DNA polimerase adiciona um resduo de deoxiadenosina (A)
extremidade 3' das fitas de DNA, durante a amplificao por PCR. Esse Aprotuberante permite ligar o fragmento de DNA a vetores especficos,
especialmente preparados, contendo um resduo de deoxitimidina (T)
protuberante na extremidade 3'. A molcula do vetor tem somente um stio
de clivagem para uma determinada enzima de restrio que abre o vetor na
seqncia onde o inserto ser inserido. Os fragmentos de DNA oriundos
da reao de PCR so misturados ao vetor linearizado juntamente com a
enzima T4 DNA ligase, a qual permite a ligao entre eles, gerando uma
molcula de DNA plasmidial, contendo o gene de interesse. Este plasmdeo
pode ser inserido dentro de uma bactria por transformao e, ento, ser
replicado. Alm do fragmento de PCR, outras molculas de DNA podem ser
inseridas em vetores previamente clivados com enzimas de restrio. A
DNA ligase pode atuar em ligaes de fragmentos com extremidades
coesivas ou abruptas (BROWN, 2003; NASCIMENTO et al., 1999).

1.6. Plasmdeos ou vetores

Os plasmdeos so molculas de DNA fita dupla extracromossomal
encontrados em todas as espcies de bactrias. Os plasmdeos variam em
estrutura, tamanho, modo de replicao, nmero de cpias por clula e
habilidade para propagarem-se em diferentes bactrias. Todos contm trs
caractersticas comuns: marca seletiva, origem de replicao e stio
mltiplo de clonagem (NASCIMENTO, 1999). A marca seletiva refere-se a
genes que conferem resistncia a antibiticos e que proporcionam a
seleo dos clones transformados daqueles no transformados. Para essa
seleo, adicionado ao meio de cultura o antibitico adequado, em
concentraes que permitam diferenciar a clula no-transformada
(sensvel ao antibitico) da clula transformada (resistente ao antibitico).
Os principais antibiticos utilizados nos meios de cultura para a seleo de
transformantes esto apresentados na Tabela 2. A origem de replicao
autnoma ou ori o stio em que se inicia a replicao do DNA, podendo se

17

18

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Tabela 2. Principais antibiticos utilizados como agentes seletivos e a
concentrao final utilizada.

Fonte: MARANHO (2003).

replicar independentemente da replicao bacteriana e produzir milhares

de cpias do plasmdeo dentro da clula hospedeira. A replicao dos
plasmdeos pode ser sincronizada com o ciclo celular, resultando em baixo
nmero de cpias, ou ser independente do ciclo da clula hospedeira,
permitindo a proliferao de centenas de cpias por clula. O stio mltiplo
de clonagem ou polylinker um stio de clivagem de endonucleases de
restrio no qual inserido um fragmento de DNA de interesse sem
interferir na funcionalidade do plasmdeo (BROWN, 2003; WEAVER,
2001).

1.7. Transformao celular

O processo de transformao consiste na introduo de um DNA exgeno
em clulas hospedeiras, que podem ser: bactrias, leveduras, fungos
filamentosos, clulas vegetais e clulas de mamferos. A clula mais
comumente utilizada a clula bacteriana de Escherichia coli. O processo
de transformao bacteriana utilizada na Biologia Molecular ocorre in vitro,
e pode ser afetado pelo tamanho e conformao da molcula de DNA a ser
introduzida na clula. Plasmdeos pequenos incorporam-se mais facilmente
clula bacteriana competente. A transformao bacteriana utilizada
para a preparao de DNA plasmidial, em larga escala, e para a seleo de
clones recombinantes (BROWN, 2003; MARANHO, 2003a).

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

A atrao do DNA pelas clulas bacterianas, em condies naturais, um

evento muito raro, devido ocorrncia da repulso eletrosttica entre as
cargas negativas dos fosfolpideos da membrana e as cargas negativas dos
grupamentos fosfatos da molcula de DNA, esquematizada na Figura 6
(MARANHO, 2003a).

Fig. 6. Representao esquemtica da repulso eletrosttica entre as cargas

negativas da molcula de DNA e a camada fosfolipdica da membrana celular.

Para a transformao bacteriana, podem-se utilizar dois diferentes mtodos

de transformao:
Choque trmico - Comumente chamado transformao com cloreto de
clcio, um mtodo fcil e relativamente barato de transformao.
Consiste na preparao das clulas, para torn-las competentes, por
tratamento com cloreto de clcio ou outro on divalente (cloreto de ltio ou
magnsio). Os ons atuam neutralizando as cargas negativas da membrana
e do DNA. Aps um choque trmico na temperatura de 37 a 42C, criamse poros na membrana e o DNA pode alcanar o interior da clula
(MARANHO, 2003b; NASCIMENTO et al., 1999).
Eletroporao - um mtodo mais eficiente para transformao de clulas
com DNA plasmidial. Consiste, inicialmente, na preparao das clulas com

19

20

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

uma soluo aquosa para torn-las competentes e aptas a receber o DNA.

As clulas so submetidas a alta voltagem (choque eltrico) que provoca
uma desestabilizao da membrana externa e a formao de poros,
possibilitando a entrada do DNA para o interior da clula. Esse tipo de
transformao, que requer um equipamento - denominado eletroporador -,
pode ser utilizado para a transformao de bactrias gram positivas e
negativas, leveduras, fungos filamentosos, clulas animais e vegetais. O
eletroporador deve ser ajustado para cada tipo celular, considerando os
seguintes parmetros: capacitncia, intensidade e durao do pulso eltrico
(AUSUBEL et al., 2003; MARANHO, 2003b).

1.8. Extrao e purificao de DNA

O isolamento de DNA cromossomal ou plasmidial um procedimento bsico
e fundamental para a clonagem molecular. Existem muitas tcnicas
disponveis que permitem o isolamento de DNA, porm esses mtodos
possibilitam o isolamento de apenas um tipo de DNA por extrao. A
purificao consiste na separao do DNA a partir dos restos celulares e
das protenas, principalmente as DNases que degradam as molculas de
DNA, tanto em clulas bacterianas como em clulas eucariticas.
Diferentes reagentes e substncias so combinados e utilizados para esse
procedimento de acordo com o tipo celular. No caso das bactrias gram
negativas (E. coli), a combinao de detergentes e substncias alcalinas
removem as camadas lipdicas da membrana externa e da parede celular
expondo o DNA para a purificao. As protenas podem ser removidas
eficientemente com a utilizao de uma mistura dos solventes orgnicos
fenol e clorofrmio. Esses solventes atuam como agentes
desproteinizantes, rompendo rapidamente a integridade celular e
desnaturando as protenas, deixando os cidos nuclicos em soluo aquosa
(BROWN, 2003; MARANHO; MORAES, 2003). O procedimento de
preparao de DNA, a partir de uma cultura de clulas bacterianas, pode
ser resumido da seguinte maneira:
1 - As clulas so cultivadas em meio de cultura, depois recuperadas por

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

centrifugao, a partir da cultura, e concentradas no menor volume

possvel.
2 - As clulas so rompidas e seu contedo liberado, formando um extrato
celular.
3 - Esse extrato celular tratado e todos os seus componentes so
removidos, exceto o DNA.
4 - O DNA resultante concentrado por precipitao e mantido em
soluo aquosa.

1.9. Seqenciamento de DNA

A seqncia do DNA um pr-requisito para a anlise detalhada de um
gene. O mtodo de seqenciamento de DNA mais utilizado o automtico,
baseado no mtodo de Sanger-Coulson, desenvolvido em 1979, tambm
conhecido como mtodo de terminao de cadeia, que permite determinar
a ordem exata dos nucleotdeos em um segmento de DNA. No
seqenciamento automtico, os nucleotdeos so marcados com quatro
fluorocromos diferentes, um para cada nucleotdeo (A, C, G, T). Esse
mtodo necessita de um DNA de fita simples e, normalmente, clonado em
um vetor M13 ou outro vetor comercial. O mtodo baseia-se na sntese de
uma segunda fita de DNA complementar ao DNA molde, na presena de
um primer complementar seqncia adjacente ao stio mltiplo de
clonagem do vetor. O fragmento de Klenow da DNA polimerase I inicia o
elongamento da cadeia complementar a partir da extremidade 3' do primer;
os deoxinucleotdeos - dNTP - (dATP - deoxiadenosina trifosfato -, dTTP deoxitimidina trifosfato -, dGTP - deoxiguanosina trifosfato -, dCTP deoxicitosina trifosfato) so selecionados de acordo com o pareamento ao
molde e ligados a cadeia por ligaes fosfodister (AUSUBEL et al., 2003;
NASCIMENTO et al., 1999).
Como, para cada dNTP, utiliza-se um fluorocromo diferente, a eletroforese
realizada em um nico canal do gel de seqenciamento. medida que os
fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos so excitados e a

21

22

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

luz emitida, em diferentes comprimentos de onda, detectada por um

fotomultiplicador. Esta informao traduzida na forma de seqncia por
meio de um computador e apresentada no eletroferograma, apresentado na
Figura 7 (AUSUBEL et al., 2003; NASCIMENTO et al., 1999).

Fig. 7. Sequenciamento automtico utilizando todos os dNTP marcados com

fluorescncia
(Fonte: http://educacao.genesisdbm.com.br/sequenciamento.shtml).

1.10. Anlise de DNA e RNA em blotting

As tcnicas de blotting baseiam-se nas propriedades de hibridizao das
molculas de cidos nuclicos. Algumas tcnicas foram criadas propondose localizar a posio de um gene em uma molcula de DNA. Para a anlise
de DNA, utiliza-se a tcnica de Southern blotting. Primeiramente, o DNA
digerido com uma ou mais enzimas de restrio e separado em uma
eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos de DNA fita dupla so

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

desnaturados in situ e transferidos para uma membrana de nylon ou

nitrocelulose, na qual so imobilizados no mesmo padro de bandeamento
do gel. A imobilizao realizada com radiao UV, para as membranas de
nylon, e calor, para as membranas de nitrocelulose. A membrana
colocada sobre o gel e um tampo de alta concentrao salina adicionado
e, por capilaridade, passa atravs do gel, promovendo a transferncia dos
fragmentos de DNA para a membrana. A membrana resultante uma
rplica do gel de agarose. Sondas de RNA ou DNA marcadas com
radioatividade so utilizadas, a hibridizao com o DNA fixo na membrana
ocorre e uma auto-radiografia revela qual fragmento de restrio contm o
gene clonado, conforme pode ser visto na Figura 8 (AUSUBEL et al., 2003;
HARWOOD, 1996; WEAVER, 2001).

Fig. 8. Southern blotting. Um fragmento de DNA especfico pode ser

identificado separando a mistura de fragmentos por eletroforese, transferindo
para a membrana e hibridizando a seqncia com uma sonda molecular
complementar e marcada com 32P

23

24

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Para a anlise de RNA, a tcnica, que anloga ao Southern blotting,

recebeu o nome de Northern blotting. Um RNA extrado submetido
eletroforese em gel de agarose, transferido para uma membrana e
hibridizado com sondas radioativas de RNA ou DNA. Esta tcnica permite
identificar em qual tecido ou tipo celular um determinado gene expresso.
Para um experimento de Northern blotting, alguns cuidados para manter as
solues e os materiais do experimento livres de RNases devem ser
adotados at a transferncia do RNA para a membrana (HARWOOD, 1996;
KYAN, 2003).

2. Minidicionrio
Atividade exonuclesica - a propriedade da enzima em clivar ligao
fosfodister na extremidade de uma molcula de DNA.
Atividade endonuclesica - a propriedade da enzima em clivar ligao
fosfodister no interior de uma molcula de DNA.
Bactria competente - uma bactria apta a receber DNA exgeno.
Extremidade abrupta - produzida por algumas enzimas de restrio, tambm
chamada de extremidade cega por no apresentar nucleotdeos em cadeia
simples.
Extremidade coesiva - produzida por algumas enzimas de restrio,
apresenta um pequeno nmero de nucleotdeos em cadeia simples e
permite a ligao a outro fragmento de DNA pela complementariedade das
bases.
Fluorocromo - corante fluorescente usado para corar amostras biolgicas,
emite energia luminosa quando excitado por radiao luminosa adequada.
Fragmento Klenow - fragmento protico da DNA polimerase I com
capacidade de polimerizao e atividade exonucleotdica 3' - 5'.

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Transformao bacteriana - o processo que envolve a introduo de

DNA exgeno na bactria competente.
Vetor circular - um vetor fechado, no permite a ligao a um fragmento
de DNA.
Vetor linearizado - um vetor digerido por uma enzima de restrio
especfica, permite a ligao a um fragmento de DNA compatvel com as
extremidades.
Quimera - molcula de DNA recombinante que contm seqncias gnicas
de origens diferentes.

25

26

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

3. Referncias Bibliogrficas
AUSUBEL, F. M.; BRENT, R.; KINGSTON, R. E.; MOORE, D. D.; SEIDMAN,
J.G.; SMITH, J.A.; STRUHL, K. Current protocols in molecular biology,
New York: John Wiley , 2003. 4755 p.
BROWN, T. A. . Clonagem gnica e anlise de DNA. Porto Alegre: Artmed,
2003. 376 p.
SOUZA, M. T. de. Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose. In:
AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRGIDO, M. M.; MARANHO, A. Q.;
SOUZA, M.T. de. Tcnicas bsicas em biologia molecular. Braslia, DF:
Universidade de Braslia, 2003. 211 p.
S, M. F. G. de; BATISTA, J. A. N.; OLIVEIRA NETO, O. B.; FRAGOSO, R.
R.; MONTEIRO, A. C. Clonagem e expresso de genes. Braslia, DF:
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2002, 52 p. Apostila.
HARWOOD, A. J. Basic DNA and RNA protocols. London: Human Press,
1996. 528 p.
KYAN, C. M. Northern blot: deteco de RNA por hibridizao em
membranas. In: AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRGIDO, M. M.;
MARANHO, A. Q.; SOUZA, M. T. de. Tcnicas bsicas em biologia
molecular. Braslia, DF: Universidade de Braslia, 2003. 211 p.
MARANHO, A. Q. Transformao bacteriana. In: AZEVEDO, M. O.;
FELIPE, M. S. S.; BRGIDO, M. M.; MARANHO, A. Q.; SOUZA, M. T. de.
Tcnicas bsicas em biologia molecular. Braslia, DF: Universidade de
Braslia, 2003a. 211 p.
MARANHO. A. Q.; MORAES, L. M. P. Extrao e purificao de DNA. In:
AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRGIDO, M. M.; MARANHO, A. Q.;

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

SOUZA, M. T. de. Tcnicas bsicas em biologia molecular. Braslia, DF:

Universidade de Braslia, 2003b. 211 p.
NASCIMENTO, A. A. C.; ESPREAFICO, E. M.; LARSON, M. L. P.; MONESI,
N.; ROSSI, N. M. M.; RODRIGUES, V. Tecnologia do DNA recombinante.
Ribeiro Preto: Universidade de So Paulo, 1999. 85 p. Apostila.
TORRES, F. A. Principais enzimas modificadoras de cidos nuclicos. In:
AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRGIDO, M. M.; MARANHO, A. Q.;
SOUZA, M. T. de. Tcnicas bsicas em biologia molecular. Braslia, DF:
Universidade de Braslia, 2003. 211 p.
WEAVER, R. F. Molecular biology. Lawrence: University of Kansas, 2001.
880 p.

27

28

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular