Biologia Molecular

7. Recombinação molecular

Licenciatura em Biologia
1º ano – 1º semestre

Dora Batista & Leonor Morais Celílio

dorabatista@isa.ulisboa.pt
lmorais@isa.ulisboa.pt
 Recombinação
Processo de interação e troca física de material genético entre
cromossomas homólogos, levando à alteração da sequência de
pelo menos um deles

ü Mecanismo universalmente conservado – aspectos comuns em todos os organismos

• Mecanismo de reparação de DNA (quebras dsDNA, colapso do garfo replicação)
• Papel essencial na reprodução sexuada – meiose – gerador de estabilidade do genoma
e de diversidade genética: adaptação e evolução

ü Eventos moleculares:
• Processo catalisado por enzimas especificamente desenvolvidas e reguladas para este
propósito (clivagem e ligação)
• Diferentes vias e modelos propostos
• A maioria requere homologia entre regiões de DNA
 Recombinação molecular
Recombinação homóloga
Requere sequências de DNA homólogas
Exo Reprodução sexuada (durante a meiose); Mecanismo reparação do
DNA; Transferência genética horizontal (bactérias e vírus)

Recombinação não-homóloga
Recombinação ilegítima, sem similaridade aparente
Exo Translocação de cromossomas e genes diferentes
Reparação NHEJ

Recombinação específica
Site-specific recombination, envolve pequena região de
homologia e uma maquinaria enzimática especial
Exo Integração de fagos em genomas bacterianos

Transposição
Altamente especializada – interação entre elementos
transponíveis e sequências alvo no hospedeiro
Exo Integração de transposões
 Mecanismo de recombinação homóloga
Diferentes modelos que partilham passos chave:
1) Alinhamento de duas moléculas de DNA homólogas

2) Introdução de uma quebra ds no DNA (DBS), seguida

de processamento das extremidades

3) Invasão da cadeia ss - uma das cadeias ss entra no centro

da molécula ds homóloga e emparelha com a sua cadeia
complementar, deslocando a outra cadeia – gera uma
heterodúplice de DNA

4) Formação de um intermediário (junção) de Holliday

– estrutura formada pelo cruzamento das cadeias de DNA, que
se move ao longo do DNA refazendo ligações de pares de
bases – branch migration

5) Resolução da junção de Holliday – Duas vias alternativas

de regenaração das moléculas de DNA
 Modelo de Holliday
Robin Holliday (1960s) – investigação em S. cerevisae
Inter-cruzamento das
cadeias e ligação dos nicks

Branch migration- aumenta em tamanho as

regiões heterodúplice
Moléculas homólogas de DNA
alinhadas com corte ss na
mesma posição

Invasão (strand invasion) e formação da junção de

Holliday
 Resolução do intermediário de Holliday
Corte das cadeias de DNA perto do local de cruzamento: esta reacção separa as duas moléculas recombinantes
e completa a troca de material genético
Heterodúplice de DNA é estabilizada
pelo emparelhamento de bases

A resolução da estrutura pode ocorrer

Várias proteínas, RuvA and RuvB (DNA helicase/DNA translocase) em E. de duas formas dando origem a duas
coli, são responsáveis pelo estabelecimento do cruzamento e branch classes distintas de produtos de DNA
migration
Resolução do intermediário de
Holliday

Corte no site 1 (plano vertical)

Resulta na junção das duas dúplices originais, regiões da
molécula parental estão ligada a uma região da dúplice
híbrida. Rearranjo dos genes que flanqueiam o local de
recombinação – crossover A-C.
Produtos de cross-over

Corte no site 2 (plano horizontal)

Resulta em moléculas de DNA que contêm uma região
de “remendo” de DNA híbrido. Não há rearranjo dos
genes que flanqueiam o local de recombinação
Produtos de não cross-over (”patch” products)

Modelo de Holliday não explica todos os

sistemas de recombinação
Resolução do intermediário de Holliday
https://www.youtube.com/watch?v=MvnWxN81Qps
Para A/a e B/b
 Modelo de Meselson-Rading
Meselson & Rading (1975) – Modelo D-loop de recombinação bacteriana

• Corte ssDNA
• Invasão da cadeia pela
ext 5’
• Arranjo assimétrico
das heterodúplices
• Digestão, síntese e
ligação
• Produtos de cross-over
e não cross-over

Modelo de Meselson-Rading não explica reparação de quebras de

dupla cadeia (DSB)
 Modelo de Double Strand Break
Rever modelos: https://www.youtube.com/watch?v=cokhflzjTkA

SDSA (Synthesis-dependent
3’ strand strand annealing) –
invasion recombinantes sem cross-over
(c.o.)

DSBR – recombinantes com c.o. ou sem c.o.

 Passo chave da invasão de cadeias
na recombinação homóloga

ü Passo central na recombinação homóloga

que permite a troca de cadeias e
emparelhamento, resultando na estabilização
das moléculas
ü Reação catalisada por strand-exchange
proteins
ü Dois pontos de “invasão” pelas exts 3’
ü Mismatches devido às diferenças pontuais
nas cadeias homólogas (alelos) podem ser
reparados por MMR
 Troca de cadeias é promovida por RecA/Rad51
RecA – E. coli
Rad51 – virtualmente todos os eucariotas
(Dmc1 – apenas utilizada na meiose)

ü Estas proteínas ligam-se cooperativamente à

cadeia invasora, formando um filamento
DNA-proteína que força o DNA a uma
configuração atípica

ü A cadeia ss invasora procura a

sequência para emparelhamento,
formando temporariamente uma
tripla hélice
ü Necessita da hidrólise de ATP para
associação e dissociação
 Sistema RecBCD da recombinação homóloga em E. coli
Via DBS Elemento de sequência específica
que controla as actividades de
ü DBS tem de estar presente, não se RecBCD – local Chi (“crossover
conhece uma proteína específica para hot spot instigator”) - acelerador
esse efeito em procariotas

Complexo enzimático RecBCD

processa a região quebrada para
gerar ext ss
RecA – promove invasão ss e procura
RecB – helicase, nuclease de homologia
RecD - helicase
RecC – reconhece local Chi – RuvA reconhece e liga-se aos
sequência 5’ GCTGGTGG 3’ intermediários de Holliday
RuvB (helicase) promove branch
migration

RuvC cliva cadeias DNA na

junção de Holliday
https://www.nature.com/articles/s41598-020-73078-0/figures/1
 Reacções de recombinação
RuvC – Finaliza a recombinação - Funciona
concertadamente com RuvA/B e resolve a junção de
RuvA/B – Promove branch migration a partir Holliday – cliva especificamente duas das cadeias
da junção de Holliday homólogas de DNA que têm a mesma polaridade.
Ligação com DNA ligase

Seletividade moderada
da sequência consensus
5’-A/T-T-T-G/C-3’
https://www.youtube.com/watch?v=bAOaVP-ptdc
Enzimas envolvidas na recombinação em procariotas
e eucariotas
Homologous recombination in bacteria is
required
• To repair DSBs in DNA,
• to restart collapsed replication forks, and
• to allow a cell’s chromosomal DNA to recombine with DNA that enters via phage
infection or conjugation

• Homologous recombination in eukaryotes is

required
• For DNA repair
• For restarting of collapsed replication forks
• For meiosis promoting proper chromosome pairing
 Gene conversion
•Quando a proporção de gâmetas formados pelo
heterozigótico Aa é diferente do esperado (½ A; ½ a)
e passa a ser, por exemplo, ¾ A; ¼ a

•Duas formas de obter a conversão génica:

1. envolve a reparação de mismatches que ocorrem nos

intermediários de recombinação. Por exemplo, se a
invasão da cadeia ou a migração de ramificação
incluírem o gene A/a, poderá formar-se um segmento
de DNA heteroduplex com a sequência A numa cadeia e
a sequência a na outra. Esta região do DNA que com o
mismatche poderá ser reconhecida e ser alvo das
enzimas de reparação que retiram uma pequena zona 2. Quando o gene A está muito próximo do local do
de DNA de uma das duas cadeias. Seguidamente esse DSB. As extremidades 3’ das ssDNA invadem as
local é preenchido com a sequência de DNA dúplices homólogas e são alongadas, elas podem
complementar sendo escolhida aleatoriamente qual a copiar a informação a, que poderia substituir a
cadeia a reparar. informação A após a conclusão da recombinação.
 *
Mecanismos de
transferência genética em
bactérias

Se depois da transferência não *

ocorrer recombinação na célula
receptora, a informação é
perdida

O processo de recombinação em
bactérias não é recíproco, é *
unidirecional e assimétrico

* Recombinação
 Bacteriophage infection of bacteria
E. coli T4
Bacteriophage = eater of bacteria
(infects, multiply and kill)

Most bacteria are susceptible to one or more such

viruses widely distributed in nature

More commonly, when a

bacteriophage injects its
DNA into a bacterial cell,
the phage DNA takes
over the cell’s protein
synthesis and DNA During infection, some phages
replication machinery, are able to pick up a piece of
forcing it to express the the bacterial chromosome and
phage genes, produce introduce it into other host
phage proteins, and cells during subsequent
replicate the phage DNA rounds of infection, a process
known as transduction
 Transduction
Lytic and lysogenic cycle of bacteriophages

Generalized Specialized
transduction transduction

Virulent phages Temperate phages

Generalized
Specialized
transducing phages
transducing phages
carry random parts of
carry only certain
the bacterial
specific parts
chromosome
 Recombinação genética
Processos de recombinação que
rearranjam sequências de DNA
levando a uma estrutura
genómica mais dinâmica

Recombinação específica (site-specific

recombination) – Ocorre entre sequências
definidas – inserção de genoma viral no DNA de
uma célula hospedeira durante infecção

Transposição – Ocorre entre sequência

específicas e locais do DNA não específicos –
movimento de elementos transponíveis
Site-specific recombination
Locais de
recombinação
específicos no fago
e na bactéria

Structures involved in SSR. The

pair of symmetric recombinase
recognition sequences flanks
the crossover region where
recombination occurs. The
subunits of the recombinase
bind these recognition sites.
Note that the sequence of the
crossover region is not
palindromic, resulting in an
intrinsic asymmetry to the
recombination sites.
 Integração do DNA do fago l no cromossoma de E. coli
Locais específicos de integração
(att - attachment, sites)

Integração – Depende de uma

enzima de integração específica –
integrase (lInt) – catalisa
recombinação entre dois locais att

Excisão – Depende de uma

attL attR
enzima de excisão específica –
Xis – reconhece motivos presentes
no attR; só é produzida quando o Profago
fago é induzido a entrar no ciclo
lítico

Integration host factor (IHF)

 Rearranjos produzidos por recombinação específica
Insertion occurs Integração Excisão Inversão
when
recombination
sites on two
different Recombination
molecules are occurring
brought together between sites
for DNA exchange organized as
direct repeats Recombination
deletes the DNA between a pair of
segment inverted sites will
between the two invert the DNA
sites segment between
the two sites

A sequência nuclear assimétrica de um local de recombinação confere-lhe uma orientação

dentro do DNA envolvente
Dependendo da posição e orientação relativa dos dois locais de recombinação, pode ocorrer
integração, excisão ou inversão
 Aplicações da recombinação específica em engenharia genética
Estudos de função génica
usando recombinases bacterianas
Por ex. a Recombinase Cre (site-specific
recombination enzyme) é usada para
deleção de genes específicos

Transformação de ratinhos com o gene

que codifica enzima Cre e introdução
dos locais de reconhecimento da enzima
a flanquear o gene de interesse

Torna possível estudar o efeito da deleção de

genes específicos em diferentes alturas do
desenvolvimento de cada tecido através da
activação da enzima Cre por um promotor
específico de um tecido
 Elementos transponíveis (ET) / transposões

Ø Transposões são elementos de DNA que

“saltam” ou transpõem para diferentes locais
do genoma – não requerem similaridade entre
sequências do ET e DNA alvo
Ø Normalmente transportam um único conjunto
de genes, em que um deles catalisa o
“movimento” permitindo a recombinação
transposicional
Ø A transposição requer proteínas específicas
para cortarem a molécula de DNA-alvo e
permitirem a entrada/ligação do transposão

Transposase
 Tipos de transposição
A maioria dos transposões empregam um de dois modos de transposição

Replicativa
Uma cópia é gerada no
novo local e outra
permance no local de
origem

Conservativa (“cut”
and “paste”)
Não há replicação; o
transposão é excisado
de um plasmídeo ou
cromossoma e
integrado num novo
local
https://www.youtube.com/watch?v=xfN8eFwzoK0
 Transposição simples “corta e cola”
Altera-se a informação contida na molécula “dadora” e na
molécula “receptora” do ET

Reparação DBS/NHEJ

DNA-only transposons

Complexo
sináptico ØA transposase identifica pequenas sequências
de nucleótidos com cerca de 20 bp presentes
nas extremidades do ET e remove o segmento

ØA inserção do ET noutro local é também

mediada pela transposase
DNA pol e ligase reparam
os gaps criados
Ø Esta reação produz uma pequena duplicação
do DNA alvo no local de inserção –
assinaturas moleculares
Assinatura molecular da
integração de um
transposão

Repetições
invertidas no ET

Repetições
directas no DNA
alvo
 Transposição replicativa
Só altera a informação presente na molécula
“receptora”

ØA sequência do ET é copiada através da

replicação do DNA pelo que o produto final
é idêntico ao ET original

ØA transposase possibilita a integração da nova

cópia do ET num outro local

Cada tipo de transposão utiliza normalmente

só um dos processos referidos:
Transposição conservativa
Transposição replicativa
https://www.youtube.com/watch?v=CroyUMRpbxg
Mecanismos de mobilidade dos transposões
Transposões de Transposões de
DNA RNA
Retrotransposões
Os retrotransposões codificam
uma enzima específica, a
transcritase reversa, que utiliza
como molde moléculas de RNA
para a síntese de moléculas de
DNA que se inserem nos
cromossomas.

O mecanismo de movimento dos

retrotransposões pode induzir a
alteração de múltiplos loci das
moléculas receptoras
 Retrovírus
Certos vírus usam mecanismos
de transposição para integrarem A molécula de DNA viral
os seus genomas nos genomas sintetizada é posteriormente
das suas células hospedeiras integrada no cromossoma
hospedeiro através da enzima
integrase (tipo de transposase)

Integração ocorre por um

mecanismo semelhante ao
“cut and paste”

Transcriptase reversa
 Classes de elementos transponíveis

Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

 Efeitos da integração de
transposões
C gene – pigment gene

Ac activates
Ds loss from
C gene

Resistência a antibióticos em bactérias

São largamente responsáveis pela disseminação
de resistência a antibióticos em estirpes
bacterianas

c-m(Ac) is always unstable

Elementos autónomos vs Elementos não-autónomos

 How can organisms have very
Expansão de genomas similar gene content but differ
dramatically in the size of their
genomes?

Verde – clusters de transposões

Laranja - genes
 Incidência de elementos transponíveis/repetitivos no genoma
humano

LINEs (long interspersed nuclear elements)

SINEs (short interspersed nuclear elements)
 HIV life cycle

https://www.biointeractive.org/classroom-resources/hiv-life-cycle