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Espectrometria de
massa Imaging
Trabalho de reviso
ndice
1.
2.
1.2.
Instrumentao ............................................................................................................. 5
1.3.
1.4.
Bibliografia .................................................................................................................................. 16
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1.1.
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1.2.
Instrumentao
Relativamente instrumentao necessria para executar a tcnica MSI, tmse verificado inmeros desenvolvimentos ao nvel do equipamento usado de forma a
aumentar o rendimento da anlise, o poder resolvente, a exatido na determinao de
massas, ou ainda a resoluo espacial. Verifica-se que a introduo automtica de
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Figura 2 Comparao entre a tecnologia em modo microssonda e modo microscpio. Adaptado de [5].
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1.3.
Preparao da amostra
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Na primeira, uma camada muito fina (1-5 nm) de metal, normalmente ouro,
colocada a revestir a amostra. Esta camada de metal pode ser rpida e
reprodutivamente aplicada por pulverizao catdica. A utilizao de uma fonte
alternada de frequncia elevada, permite a pulverizao de quase todo o tipo de
materiais. A polarizao alternada do alvo faz com que durante a alternncia negativa,
o ctodo atraia ies do plasma, pulverizando o alvo.
A segunda abordagem usa uma matriz orgnica MALDI depositada na superfcie
do tecido alvo. Esta tcnica permite aumentar o intervalo de massa para 2000 m/z de
forma a que pptidos que no eram detetados, nas preparaes normais para SIMS,
sejam agora observados. Tal como a utilizao de uma matriz uma semelhana entre
o MALDI e o ME-SIMS, tambm os espectros gerados por estes dois mtodos so
muito semelhantes [1].
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Dried-droplet method:
A soluo de matriz aplicada na amostra de forma manual, com recurso a uma
pipeta. Este mtodo rpido e simples, no entanto no est recomendado quando o
propsito o MSI. A difuso pode ocorrer no interior do spot da matriz, sendo que o
tamanho desse spot tipicamente grande e pode, por isso, ocorrer distribuio
irregular dos cristais da matriz.
Pneumatic nebulization:
Neste a soluo de matriz pulverizada na amostra por meio de um spray. Esta
pulverizao feita de forma suave permitindo a formao de uma camada de cristal
homognea na superfcie da amostra. Como o spray tem que ser otimizado para cada
aplicao o que se verifica que surgem, consequentemente, problemas de
reprodutibilidade.
Matrix sublimation:
Uma matriz colocada numa seco especfica de um condensador e a amostra
ligada ao condensador com uma cassete de face dupla condutiva termicamente
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voltada para a matriz slida. A sublimao ocorre sob presses baixas e temperaturas
altas (125C) que permitem matriz condensar na superfcie fria da amostra. Com este
mtodo consegue-se obter uma maior pureza relativamente matriz que aplicada na
amostra, bem como cristais pequenos desta e ainda uma deposio uniforme.
Dry-coating:
Neste mtodo a matriz em estado slido (pequenos gros) filtrada para o
tecido diretamente, passando apenas as partculas de menor dimenso. Esta
metodologia til para uma rpida e reprodutvel aplicao da matriz no que diz
respeito anlise de lpidos. Tal como no mtodo de sublimao, a difuso na
superfcie limitada devido ausncia de solventes na matriz.
De um modo geral mtodos automatizados representam a melhor escolha de
tcnica de deposio de matriz quando se trata de um estudo que envolva grande
nmero de amostras e quando se pretende obter rendimentos maiores neste passo. J
os mtodos manuais so os eleitos quando se esto a testar novos protocolos. Cada
vez mais se tm estudado metodologias para a deposio de matriz, uma vez que se
acredita que este passo seja limitante no rendimento obtido em MSI [1].
1.4.
Anlise de dados
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2. Aplicao biolgica
Com o intuito de demonstrar o potencial em reas biolgicas da tcnica
abordada, ser descrito nesta seco um estudo [9] onde se recorre espectrometria
de massa imaging para a localizao de um frmaco a nvel celular.
O cancro do colo retal (CCR) um dos cancros com maior mortalidade no
mundo. A quimioterapia por si s pode permitir perodos de sobrevivncia mdia at
20 meses, sendo o frmaco mais utilizado o fluorouracil. No entanto, tm surgido
novos frmacos como o cetuximab, o irinotecan ou o oxaliplatin, entre outros. Estes
frmacos atuam por bloqueio da angiognese atravs da inibio do fator de
vascularizao endotelial (VEGF) ou por inibio de fatores de crescimento derivados
de plaquetas (PDGF), de forma a impedir a vascularizao do tumor bem como levar
sua regresso.
O sunitinib um frmaco de administrao oral com ao anti-angiognica, por
inibio de recetores de tirosina cinase, como recetores de PDGF e VEGF. Para alm da
sua utilizao nesta neoplasia ele tem sido testado noutras como meningioma,
carcinoma das clulas renais, cancro da mama metasttico, entre outras.
No desenvolvimento de um frmaco torna-se muito relevante toda a sua
farmacocintica, farmacodinmica bem como a interao deste ao alvo especfico da
via onde se pretende atuar. Esta afinidade ao alvo vai ditar a localizao espacial do
frmaco em estudo. A MALDI-MSI uma tecnologia que permite o mapeamento de
molculas em seces finas de tecido com uma resoluo de 30-50 m. Tem ainda a
vantagem, como j referido na seo anterior, de permitir identificar a massa absoluta
de compostos intactos, dos seus fragmentos moleculares e dos metabolitos
(informao que no se obtm com outras tcnicas de imaging).
A distribuio da droga revela os seus stios de acumulao e d informao
sobre onde esta efetiva ou txica. Como estudos in vivo obrigam a ter um grande
nmero de animais e so mais demorados, o estudo introduz a abordagem in vitro
para comparao com experincias feitas in vivo, de forma a verificar se o mtodo in
vitro permite tirar concluses acerca do que acontece efetivamente em modelos
animais.
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Figura 3 Trs rplicas de tecidos aps colorao com H&E, e observao da localizao do frmaco nos
tecidos a partir das intensidade de io precursor m/z 399,218 e do io produto extrado m/z 326,1 [9].
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Figura 4 Nveis estimados de sunitinib nos tecidos aos dias 1,4,7 e 10, aps administrao de frmaco, por
anlise da mdia de intensidade de sinal do io precursor 399,218 [9].
Este aumento pode dever-se ao facto da entrada do frmaco nas clulas ser
mais rpida do que a velocidade com que estas conseguem metaboliza-la e excreta-la.
Relativamente
metodologia
in
vitro,
foram
aplicadas
diferentes
Figura 5 Seces de tecido analisadas por abordagem in vitro. Observao da localizao do frmaco nos
tecidos a partir da intensidade de io precursor m/z 399,218 [9].
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Bibliografia
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