Roteiro de Aula Prtica

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

Para a separao das protenas, pode ser empregada a tcnica de eletroforese

em gel de poliacrilamida a 10 %, vertical, em sistema descontnuo de tampes,
segundo HAMES & RICKWOOD (1990).

1. Preparao das Placas

Placas de vidro medindo 18 16 cm so lavadas com detergente e enxaguadas
em gua corrente, sendo em seguida secas e limpas com lcool 70%. Espaadores de
plstico com 0,1 cm de espessura e vaselina slida (colocada entre os espaadores e as
placas de vidro para a perfeita vedao) so utilizados na montagem das placas.

2. Preparo do Gel de Separao

O gel de separao preparado utilizando-se as solues 1, 3, 4, 6 e TEMED

descritas na Tabela 1. Estas solues devem ser misturadas nas quantidades descritas
na Tabela 2 e em seguida colocadas cuidadosamente nos moldes de vidro. Uma fina
camada de gua deve ser colocada sobre esta soluo, evitando-se assim a formao
de um menisco cncavo, efeito este provocado pela tenso superficial do gel. O
conjunto deve ser mantido em ambiente escuro at a polimerizao do gel.

3. Preparo do Gel de Empilhamento

O gel de empilhamento, preparado com as solues 1, 2, 5,

6 e TEMED

(Tabela 1) nas devidas quantidades (Tabela 2), deve ser colocado sobre o gel de
separao (j polimerizado), formando uma camada de aproximadamente 1,0 cm de
altura. Um molde de plstico (pente com 10 dentes) deve ser introduzido nesta

camada para a formao dos poos de aplicao, sendo a polimerizao efetuada sob
luz fluorescente.

4. Preparao da Cuba Vertical

Aps a preparao dos gis, as placas so fixadas em cubas verticais com o

auxlio de prendedores metlicos (Grampomol).
Nos reservatrios das cubas colocado tampo Tris-Glicina (Tabela 3), pH 8,6,
diludo 1:10. No tanque superior ainda so colocadas aproximadamente 5 gotas de
soluo de Azul de Bromofenol (0,05%) como indicador da frente de corrida.

5. Aplicao das Amostras

Para a corrida eletrofortica do plasma sangneo so aplicados diferentes

volumes das amostras diludas de cada animal, de maneira que em cada ponto de
aplicao seja colocada uma soluo contendo aproximadamente 30 g de protena
plasmtica total.
No

caso

das

hemoglobinas

devem

ser

aplicados

volumes

contendo

aproximadamente 20 g da protena.
Estas quantias so determinadas previamente, tomando-se uma amostra diluda
e realizando uma corrida eletrofortica com diferentes concentraes

(150 15 g no

caso do plasma e 50 5 g no caso da hemoglobina), sendo assim possvel determinar

a concentrao que produz a melhor definio das bandas das protenas em estudo.

6. Corrida Eletrofortica

Aps a aplicao das amostras, conecta-se a cuba a uma fonte estabilizadora de

eletroforese ( Pharmacia - EPS 600 ), fixando-se a voltagem em 125 V e a amperagem
em 5 mA. A corrida pode ser realizada overnight, durante aproximadamente 16 horas,
40 C.

7. Colorao e Descolorao

Aps a corrida eletrofortica, os gis so retirados dos moldes de vidro e

imersos em soluo fixadora de metanol, cido actico e gua, 400:70:530 (v/v)
durante 40 minutos. Em seguida so colocados em soluo corante

Coomassie Blue

R250 durante 3 a 4 horas.

Transcorrido o tempo de colorao, o gel deixado em soluo descorante de
lcool etlico, cido actico e gua, 200:50:250 (v/v), at a completa evidenciao das
bandas.

TABELA 1- Solues estoques utilizadas no preparo do gel de separao e do gel de

empilhamento.
SOLUES

COMPONENTES
Acrilamida

30,0g

Bis-Acrilamida

q.s.p. 100 mL

TRIS

6,0g

HCl 1N

48,0 mL

gua

40,0 mL

TRIS

36,3g

gua

q.s.p. 100 mL

25,5 mL

Riboflavina
gua

48,0 mL

Perssulfato de Amnio 0,375 mg

gua

0,8g

gua

HCl 1M

pH DA SOLUO

4,0 mg
q.s.p. 100 mL

Uria 5M

Onde: Tris: Tris (hidroximetil) aminometano

HCl: cido Clordrico
Bis-Acrilamida: N,N - Metilene Bis-Acrilamida

6,8

8,8

TABELA 2 - Solues e quantias utilizadas na preparao do gel de separao

(10%) e gel de empilhamento.
GEL DE SEPARAO
Soluo

Quantidade

GEL DE EMPILHAMENTO
Soluo

Quantidade

6,6 mL

5,0 mL

2,5 mL

5,0 mL

1,0 mL

2,5 mL

9,8 mL

7,5 mL

TEMED

0,015 mL

TEMED

0,015 mL

TEMED: N,N,N,N - Tetrametiletilenodiamino

TABELA 3 - Composio da soluo tampo.

Componentes para 100 mL da soluo
TRIS
GLICINA
GUA

pH da soluo

6,0 g
28,8 g
q.s.p.

8,6