Cromatografia

Lquida de Alta
Eficincia
Carla B. G. Bottoli
Instituto de Qumica
UNICAMP

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

(HPLC)
uma tcnica cromatogrfica que utiliza como FM um
lquido e equipamentos sofisticados para separar os
componentes de uma amostra pela interao com a FE e
com a FM.

Utiliza-se colunas metlicas e FM pressurizada, obtida

com auxlio de bombas de alta presso, para permitir uma
vazo mais rpida da FM.

tambm conhecida como HPLC, ou de Alta Velocidade,

ou de Alta Presso ou de Alto Desempenho ou, ainda, de
Alta Performance. Do Ingls HPLC High Performance
Liquid Chromatography

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

Vantagens

FE utilizada vrias vezes.

Versatilidade: nico requisito a solubilidade da amostra na FM.
Tempo reduzido de anlise.
Alta resoluo.
Boa para anlise qualitativa:
Parmetros para identificao: tR, espectro de absoro no UV (detector
de arranjo de diodos), espectro de massas

Bons resultados quantitativos: desvios inferiores a 5%.

Boa detectabilidade:
Absoro UV-Vis de varivel: 10-10 g;
Fluorescncia: 10-12 g.

Automao.

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

Desvantagens

Alto custo do equipamento.

Alto custo de manuteno do equipamento.

No existe um detector universal com boa detectabilidade e

baixo custo:

ndice de refrao: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco

estvel.
Espectrmetro de massas: ~ US$ 150.000

Experincia do operador.

Aplicabilidade de HPLC
Requer somente que a amostra seja solvel na fase mvel.

Toxicologia

Aminocidos

Pesticidas

Corantes
Polmeros

Cosmticos

Frmacos

Protenas

Alimentos

Vitaminas

Sistema de HPLC

Instrumentos Comerciais

Instrumentos Comerciais

Sistema de HPLC

Reservatrio para Fase Mvel

Bomba

Filtro do Reservatrio:
 Captar

a FM e evitar que
partculas suspensas na FM
obstruam os capilares ou
contaminem a bomba.
 Filtros de 10 a 40 m.

Limpeza peridica do
filtro essencial !!!!

Filtro

Solvente

Fase Mvel - Solventes

DEVE TER ALTO GRAU DE PUREZA.
As impurezas da fase mvel podem absorver e diminuir a
sensibilidade do detector.
DISSOLVER A AMOSTRA SEM DECOMPOR SEUS COMPONENTES.

O solvente da amostra, normalmente, a prpria FM ou um dos seus

componentes.
TER POLARIDADE E VISCOSIDADE ADEQUADAS.
NO DEGRADAR A FASE ESTACIONRIA.

No utilizar fases mveis agressivas.

SER COMPATVEL COM O DETECTOR UTILIZADO.

Fase Mvel - gua

GUA MONO-DESTILADA E DEIONIZADA
COMUM SO INADEQUADAS.
Contaminao de orgnicos volteis e de orgnicos da resina
GUA DEVE SER GRAU HPLC .
Purificada com resinas de troca inica, carvo ativado,
filtros de membrana (livre de bactrias). Produzida no
momento de uso pois facilmente recontaminvel.

Filtrao da Fase Mvel

Essencial.

Degaseificao da Fase Mvel

Indispensvel para o bom funcionamento do sistema.

Garante:



Reprodutibilidade da vazo: retira ar dissolvido na FM e evita

bolhas na bomba;
Estabilidade na linha de base: bolhas no detector causam
instabilidade da linha de base;

Mtodos de Degaseificao

Ultra-Som:


Vcuo + Ultra-Som


Muito lento, pouco eficiente, requer agitao, em geral o pior mtodo quando
usado sozinho.

Rpido, eficiente, refazer de 12 em 12 horas.

Purga com Hlio:

Contnuo, hlio razoavelmente caro, leva a aumento de vazamentos, maior custo
operacional.

Degaseificador on-line:
Contnuo, remove o ar logo antes de entrar na bomba, investimento alto inicial
(melhor opo a longo prazo).

Sistema de HPLC

Bombas de Alta Presso

Tm por finalidade enviar um fluxo constante e

reprodutvel de FM para o sistema
cromatogrfico.

Requisitos:
1.
2.
3.

Ser de material inerte;

Devem gerar altas presses: 0,01 a 35 MPa (para
anlises).
Versatilidade: permitir eluio por gradiente

Eluio
o desenvolvimento da amostra no sistema cromatogrfico.

Isocrtica:


Mesma composio de fase mvel durante a eluio.

Exemplo: Hexano ou Metanol/gua 80:20 (v/v)

Gradiente:



Composio da fase mvel varia durante a eluio.

Utilizado na separao de misturas complexas com diferentes funes
qumicas.
Exemplo:

Tempo

Fluxo

%A

Inicial
10
14
18
25

1.00
1.00
1.50
1.00
1.00

80
0
0
80
80

%B
20
100
100
20
20

Sistema de HPLC

Injetores Manuais

Posio LOAD

Posio INJECT

Sobrecarga de Volume da
Amostra
Para aproveitar de todos o pratos que uma coluna
possui, no se deve injetar um volume maior que 1 % do
volume da coluna vazia.
Vmximo (
L) = (raio)2(comprimento)(0,01)
Dimenso da coluna
7,8 mm x 30 cm
3,9 mm x 30 cm
3,9 mm x 15 cm
4,6 mm x 10 cm

Vmximo de injeo
140 L
35 L
18 L
16 L

Sistema de HPLC

Colunas Cromatogrficas



Localizada entre o injetor e

a coluna de separao.
Colunas de 2 a 5 cm e d.i.
igual ao da coluna de
separao.
Mesma FE da coluna de
separao.
Protege a coluna de
separao,
aumentando
seu tempo de vida.

5 cm

Coluna de Guarda

Coluna de Separao
d.i. > 10 mm

Preparativa

Convencional

Microbore

d.i. 2 - 5 mm

d.i. 1 ou 2 mm

Capilar

d.i. 0,075 0,5 mm

Coluna de Separao

15 cm

Condicionamento da Coluna
Necessrio para que haja um perfeito equilbrio da FM e da FE.

Coluna nova: 4 8 horas.

Coluna parada h alguns dias: 2 horas.
Coluna de uso dirio: 15 minutos.

Coluna deve ser guardada

em solvente orgnico ou fase mvel

Partculas de Recheio


Porosas (3 a 10 m)

No Porosas (1-2 m)

Monolticas Formada cilindricamente em forma de haste.

Partculas No Porosas
Separao de benzodiazepnicos
Condies:
Coluna: 3 cm x 4,6 mm d. i.
FE: ChromSphere UOP C18,
1,5 m (no-porosa)
FM: ACN: H2O (85:15 v/v)
Vazo: 3,5 mL min-1
Temperatura: 35 C
Detector: UV, 254 nm

1: bromazepam, 2: nitrazepam, 3: clonazepam, 4: oxazepam, 5: flunitrazepam,

6: hidroxidiazepam, 7: nordazepam, 8: diazepam

Slica
Ligao de
Hidrognio
Silanis
Vicinais

H
O

H
O

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Ligao
Siloxano

Silanis
Geminais

HO

OH

OH
Si

Si

Silanol
Isolado

O
Si

Si

Si

Si

Si

Si

Cromatografia Lquida com

Fase Ligada

FE:


Suporte (SiO2)

Reao
Qumica

+


Lquido estacionrio

Vantagens:

Alta estabilidade qumica.

Liberdade de escolha da
FM, vazo e temperatura.
Eluio por gradiente.

Desvantagens:

Preparo (sntese) trabalhoso.

Menor
recobrimento
da
superfcie (apenas 50% dos
silanis)



Impedimento estreo.
Mecanismo duplo de reteno.

Restrio ao pH: 2< pH < 8.

Fases Estacionrias
Quimicamente Ligadas
FASE NORMAL

Amino NH2
Diol (CH2OH)2
Ciano CN
Nitro NO2

FE + polar: FM + apolar

FASE REVERSA

N-aquil C18
C8
C4
Fenil

FE + apolar: FM + polar

Superfcie da Slica

Reao Siloxano
OH

Agente sililante
monofuncional

OH
X

Si

CH3
R

OH

Si

CH3

CH3

OH

Si

OH CH3

CH3
OH

CH3

OH CH3
R = C8, C18
X = Cl, OR

Si
CH3

Efeito do Comprimento da
Cadeia na Reteno

(1)acetona, (2) p-metoxifenol, (3) fenol, (4) m-cresol, (5) 3,5-xilenol, (6) anisol, (7) fenilfenol

Fases Mveis
FASE NORMAL

Hexano
Diclorometano

FASE REVERSA

Polaridade alterada com

isopropanol, acetato de etila,
tert-butilmetil ter

Metanol
Acetonitrila
Tetraidrofurano
Polaridade alterada com
gua ou tampo

HPLC Fase Reversa

Vantagens:

Fases Mveis menos txicas e

de menor custo: modificador
orgnico + gua.
Boa estabilidade frente aos
vrios solventes.
Rpido equilbrio aps a troca
do solvente.
Compatvel com gradiente.
Anlises rpidas.
Vasto campo de aplicao.

Desvantagens:

Silanis Residuais:



Mecanismo
duplo
de
reteno.
Problema na separao de
compostos bsicos.

Intervalo de pH: 2<pH<8



Devido ao uso da slica.

Ajuste da Fora Cromatogrfica

Separao de lcool benzlico (1), fenol (2), 3,4-dimetoxiacetofenona (3),

benzona (4), benzoato de etila (5), tolueno (6), 2,6-dimetoxitolueno(7), o-metoxibifenila (8).
B refere-se ao solvente orgnico Acetonitrila

Ajuste da Fora Cromatogrfica

Baixa resoluo entre
os picos 2 e 3

Ajuste da Fora Cromatogrfica

Boa resoluo mas tempo
de anlise muito longo

Ajuste da Fora Cromatogrfica

com Gradiente

FE

Aplicao de FEQL

C4-Butil

Separao de Peptdeos e protenas

C8 -Octil

Solutos pouco ou altamente polares (peptdeos

pequenos, protenas, esterides, nucleosdeos, frmacos
polares, etc... )
Solutos apolares ou moderadamente polares, cidos
C18 -Octadecil
graxos, glicerdeos, hidrocarbonetos aromticos
polinucleares, estres, vitaminas solveis, aminocidos,
frmacos, etc...
-C6H5 Fenil
Compostos moderadamente polares
-CN Ciano ou
Nitrila
-NH2 Amina

FN :comportamento semelhante slica

FR : seletividade diferente de C8, C18, ou fenil
FN : compostos polares (anilinas substitudas, steres,
pesticidas, etc.)
FR :carboidratos

Separao de carotenides da
pimenta vermelha
Condies cromatogrficas:
Coluna (25 cm x 4,6 mm d. i.)
Fase estacionria: Spherisorb 5 m
Fase mvel: ter de petrleo acetona,
gradiente linear de 5 a 25 % acetona
em 30 minutos, 1 mL min-1
Detector: UV-Vis 460 nm.

1 = -caroteno, 2 = criptocapsina
3 = criptoflavina, 4 = -criptoxantina
5 = anteraxantina, 6 = capsolutena,
7 = luteoxantina, 8 = zeaxantina,
9 = mutatoxantina, 10 = capsantina,11
= capsantina-5,6-epoxido,
12 = violaxantina, 13 = capsorubina,
14 = isomro capsorubina,
15 = neoxantina

Separao de Antidepressivos Tricclicos a Partir do Extrato de

Soro de um Paciente que Recebeu Clomipramina

Condies cromatogrficas: coluna (25 cm x 4,6 mm) Zorbax cianopropila,

fase mvel: 1,2 mL min-1, gua-acetonitrila-cido actico-n-butilamina 600:400:2,5:1,5, v/v/v/v,
temperatura: 45 C, detector: UV, 254 nm.
M = metablitos da clomipramina, 1 = trimipramina (padro interno) 2 = metilclomipramina,
3 = clomipramina

Separao de Tranquilizantes

Condies cromatogrficas: coluna (25 cm x 4 mm) LiChrosorb RP-8, 10 m,

Fase mvel: eluio por gradiente, 30 % acetonitrila em gua at 90 % de acetonitrila em
gua, 16 min, detector: UV 254 nm.
1 = bromural, 2 = carbromal, 3 = acetocarbromal, 4 = benzil mandelato

Sistema de HPLC

Detectores

Dispositivos que examinam continuamente o

material eludo, gerando sinal quando da
passagem de substncias.

Idealmente:
cada substncia
separada aparece
como um PICO no
cromatograma.

Detectores

Absoro:
 Fotomtrico:

fixo.
 Espectrofotomtrico: varivel.
 Espectrofotomtrico por arranjo de diodos.

ndice de Refrao
Fluorescncia
Espalhamento de Luz
Espectrometria de Massas
Dicrosmo Circular
Eletroqumico
70 % de anlises publicadas utilizam HPLC com detectores UV/Vis

Detectores: Absoro
Espectrofotomtrico por Arranjo de Diodos
ESPECTROS TRIDIMENSIONAIS

Detectores: Absoro
Espectrofotomtrico por Arranjo de Diodos
DETERMINAO DA PUREZA DO PICO

Comparar os espectros
de absorvncia do
composto obtidos no
incio, mximo e fim
do pico.

Dicas do que no fazer

em HPLC!
Lavar um sistema com tampo usando orgnico puro: precipitao.
Injetar amostras que podem precipitar na fase mvel: testar miscibilidade.
Usar HCl, H2SO4 ou CCl3 degradado em sistema de ao inox: corroso
do sistema.
Deixar a bomba trabalhar seca: danificao dos selos.
Usar fita de Teflon para vedar conexes: sem efeito e pode causar
entupimento.
Deixar o sistema parado com fase mvel contendo tampo ou cidos/bases
fortes: cristalizao = danificao dos selos da bomba, injetor, entupimento
do detector.
PERDER A PACINCIA!!!!

Referncias

CAROL H. COLLINS, GILBERTO L. BRAGA, PIERINA S. BONATO (coordenadores),

Fundamentos de Cromatografia, Editora da Unicamp, Campinas, 2006.

L.R. SNYDER, J. J. KIRKLAND, J. L. GLAJCH, Practical HPLC Method Development, 2 ed.,

John Wiley & Sons, 1997.

V.R. MEYER, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4o ed., John Wiley & Sons,
2004.

D. A. SKOOG, F. J. HOLLER, T. A. NIEMAN, Princpios de Anlise Instrumental,

Bookman, 2002.

F.R. de AQUINO NETO, D.S.S. NUNES, Cromatografia Princpios Bsicos e Tcnicas Afins,
Intercincia, Rio de Janeiro, RJ, 2003.

D. C. HARRIS. Anlise Qumica Quantitativa, LTC, Rio de Janeiro, 2005.

5 ed.,