NOES DE BIOSSEGURANA

1. INTRODUO Laboratrio - manuseio de agentes biolgicos, qumicos e fsicos exposio a riscos de contaminao. Patognicos. Ogm Pacientes e amostras clnicas Doenas infecciosas As atividades de aulas prticas efetuadas no Laboratrio de Microbiologia incluem a execuo de preparaes e observaes microscpicas, preparo e montagem de materiais e instrumentais, preparo de meios de cultura, reagentes, seguido da esterilizao dos mesmos, manipulao de amostras biolgicas e do ambiente, culturas de microrganismos, execuo de tcnicas de cultivo, isolamento, quantificao, caracterizao e identificao de microrganismos. Desta forma, todo pessoal envolvido em sala de aula, inclusive os professores e laboratoristas, devem adotar os procedimentos de boas prticas laboratoriais, inclusive rigorosa assepsia, para evitar riscos de contaminao e acidentes. Por outro lado, h tambm a preocupao de evitar que os experimentos efetuados sejam contaminados ou que o descarte dos materiais contaminados possa vir a contaminar o ambiente e a comunidade envolvida. Muito embora na maioria dos experimentos efetuados emprega-se microrganismos no patognicos ou microrganismos cuja exposio laboratorial raramente produz doena, bom lembrar que um microrganismo pode at ser considerado incapaz de causar doena em indivduos sadios, mas poder causar doena em indivduos com a sade debilitada. Conceito: biossegurana um conjunto de medidas necessrias para a manipulao adequada de agentes biolgicos, qumicos, genticos, fsicos (elementos radioativos, eletricidade, equipamentos quentes ou de presso, instrumentos de corte ou pontiagudos, vidrarias) dentre outros, para prevenir a ocorrncia de acidentes e conseqentemente reduzir os riscos inerentes s atividades desenvolvidas, bem como proteger a comunidade e o ambiente e os experimentos. 2. MICRORGANISMOS E GRUPOS DE RISCO Grupo 1: Microrganismos que, at o momento, no causam doenas para o homem (baixo risco individual e coletivo) e que no representam riscos para o ambiente (Lactobacillus, Lactococcus, Saccharomyces, Bacillus polymyxa, cepas no patognicas de E. coli, dentre outros); Grupo 2: Microrganismos que podem causar doenas no homem, mas a exposio laboratorial raramente produz doena. Mesmo assim, para essas doenas existem medidas profilticas e teraputicas eficientes (Espcies de Salmonella (exceto S. typhi), E. coli patognicas, Proteus, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Listeria, dentre outros); Grupo 3: Microrganismos que podem causar doenas graves no homem e apresentam risco elevado para os laboratoristas. Eles podem apresentar riscos de serem disseminados para a populao, mas para as doenas causadas existem

medidas profilticas e teraputicas eficazes (Mycobacterium tuberculosis, Coxiella burnetti); Grupo 4: Microrganismos que causam doenas humanas severas e apresentam risco elevado para os laboratoristas e para a populao em geral. Eles so agentes altamente infecciosos que se propagam facilmente, podendo causar a morte das pessoas infectadas, pois no existem atualmente medidas profilticas ou tratamentos efetivos. 3. VIAS DE TRANSMISSO DE PATGENOS EM LABORATRIOS DE MICROBIOLOGIA Transmisso oral: os agentes infecciosos so transmitidos por via oral, principalmente quando microrganismos patognicos so isolados em culturas puras e atingem populaes elevadas. Esta uma das razes pelas quais no se deve pipetar com a boca, comer, beber, mascar chicletes, levar a mo ou objetos como caneta ou lpis boca ou fumar no laboratrio. Transmisso area: os microrganismos so transmitidos atravs da inalao de aerossis contendo os agentes infecciosos. Esses microrganismos podem difundir-se no ambiente do laboratrio. As prticas laboratoriais devem ser executadas de modo a minimizar os riscos de formao dos aerossis. De preferncia, os laboratrios devem ter presso negativa e os microrganismos que so veiculados pelos aerossis como M. tuberculosis devem ser manipulados em cabines especiais conhecidas como cabines de segurana biolgica classe III, localizadas em local apropriado dentro do laboratrio. Transmisso cutnea ou parenteral: Esta transmisso ocorre atravs da pele, pela injeo acidental de espcimes ou culturas microbianas com agulhas ou quando ocorrem acidentes com materiais cortantes, tais como vidro quebrado, lminas de bisturi e agulhas. Apenas poucos organismos podem ser adquiridos atravs da pele intacta como Leptospira, Brucella, Treponema e larvas do Strongyloides, dentre outros. Indivduos com solues de continuidade na pele no devem trabalhar no laboratrio. Transmisso ocular: Os organismos podem ser transmitidos atravs da superfcie da mucosa ocular atravs de gotculas ou respingos de culturas que atinjam os olhos. Usualmente so os mesmos tipos de organismos que so transmitidos por via parenteral e tambm algumas toxinas potentes como a do C. botulinum. O respingo na mucosa pode ocorrer quando h manipulao de culturas lquidas, principalmente quando so pipetadas ou quando materiais como placas de micro-titulao contendo microrganismos so submetidos a etapas que envolvem lavagem (teste de ELISA) ou quando so transferidos ou adicionados materiais dentro de lquidos contendo microrganismos. Tambm podem contaminar-se por esta via atravs do contato dos olhos com lentes de microscpios e outros aparelhos oculares contaminados.

4. CONDUTAS, BARREIRAS, EQUIPAMENTOS E INSTRUMENTAIS DE PROTEO INDIVIDUAL E AMBIENTAL PARA MINIMIZAR OS RISCOS Assepsia um conjunto de procedimentos utilizados para impedir a penetrao de microrganismos em objetos ou ambientes estreis ou at mesmo quando se est trabalhando com culturas puras. Esses procedimentos envolvem o uso de ambiente apropriado, meios de cultura e instrumentais estreis. Caso necessrio usar luvas, mscaras e culos protetores. Pipetar usando pipetadores automticos ou pras de borracha. Flambar as alas e agulhas, boca dos tubos, limpar e desinfetar periodicamente a bancada e o ar do ambiente de trabalho. Todas as operaes envolvendo manipulao de culturas e meios de cultura devero ser efetuadas na rea de proteo conferida pela chama do bico de Bunsen. Figura 1. Bico de Bunsen. O Bico de Bunsen constitudo de uma base e dois tubos (um vertical e outro horizontal). Pelo tubo horizontal entra o combustvel (gs de cozinha ou butano) que se desloca at o vertical, em cuja extremidade se instala a chama, a qual regulada atravs de um pequeno cilindro (superposto ao tubo vertical) com orifcios que graduam a entrada de ar. A chama tem trs zonas: duas internas, mais frias, formadas por um gs que no entrou em plena combusto; a ltima a zona oxidante da chama, sendo a que mais se emprega em microbiologia. A transmisso oral reduzida pela separao entre as reas de trabalho (laboratrio) e as reas de lazer. Da mesma maneira, as reas laboratoriais devem ser separadas das reas de alimentao, onde so ingeridos os alimentos. No se deve fumar, mascar ou beber no laboratrio. Tambm, cosmticos no devem ser aplicados nas reas laboratoriais. A pipetagem pela boca no permitida e onde for necessrio deve-se usar luvas. Usar sempre avental de laboratrio, de preferncia do tipo Howie (avental com gola fechada atravs de botes de presso e de mangas com elstico nas extremidades) e gorros, se necessrio. O pessoal do laboratrio deve lavar e/ou fazer a correta anti-sepsia das mos sempre que houver suspeita de contaminao e antes de deixarem o laboratrio. A transmisso por aerossis pode ocorrer durante o uso de alas bacteriolgicas, principalmente se so muito longas e de grande dimetro, devido a vibrao durante o uso. Para minimizar esse risco a ala deve ter de 2 a 3 mm de dimetro e devem estar completamente fechadas e, de preferncia, deve-se usar agulhas ou alas de platina, pois vibram menos que a de nquel-cromo. A flambagem das alas pode gerar aerossis, razo pela qual deve ser utilizado micro-incineradores, especialmente se o microrganismo envolvido transmitido pela via ocular ou trato respiratrio. Tambm podem ser gerados aerossis quando alas ou agulhas quentes so contatadas com culturas. O uso de microincineradores para flambagem de instrumentais contendo microrganismos patognicos como as micobactrias (ou outras bactrias que apresentam elevado

contedo de lipdios) reduz a contaminao do laboratorista e do ambiente. Os micro-incineradores atuais so constitudos de um cone contendo resistncia eltrica que atinge temperaturas de cerca de 850C. Tambm podem formar aerossis quando so realizados movimentos bruscos na homogeneizao durante realizao de reaes de aglutinao ou na preparao de esfregaos. A centrifugao de amostras de pacientes suspeitos de albergar microrganismos do Grupo 3, bem como o manuseio de culturas desses microrganismos devem ser efetuados em capines de classe biolgica III, cujo ar drenado para a cabine e exaurido por um filtro HEPA. As reas de trabalho devem ser desinfetadas com soluo de hipoclorito a 0,5%, glutaraldedo ou salina-formol (10%) para reduo de riscos. Tabela 1. Classificao das cabines de laboratrio com relao a biossegurana
Classe I II III Patgeno 2,3 2,3 2,3,4 Origem do fluxo de ar Ar ambiente Ar ambiente Filtrado HEPA Idem Sada do ar Filtrao HEPA idem idem Proteo do experimento +/++ ++ Proteo do laboratorista ++ + +++

Os riscos de transmisso de microrganismos (Vrus da Hepatite B, HIV e Tripanosomas) por via parenteral so minimizados atravs do uso de luvas de ltex para manuseio dos materiais ou culturas contendo esses microrganismos. Restringir o uso de agulhas, lminas de bisturi e objetos cortantes e, quando possvel substituir vidro por plstico, descontaminar amostras com glutaraldedo ou hipoclorito, sem comprometer os resultados da investigao. Manter frascos quebrados ou objetos agudos descartados em recipientes resistentes de plstico ou de papelo especial e que possam reter lquidos, i.e., impermeveis a lquidos. Uso de culos e/ou mscara protetoras para os olhos e narinas no sentido de evitar contaminao pelas vias area e ocular (toxina botulnica e microrganismos relacionados acima). 5. DESCONTAMINAO Autoclaves um dos principais problemas nos laboratrios de microbiologia a grande quantidade de resduos contendo microrganismos infecciosos. Todos os materiais devem tornar-se seguros antes de deixarem o laboratrio. Para resduos slidos, isso pode ser mais facilmente atingido atravs da autoclavao. Registros adequados das temperaturas de autoclavao e durao dos ciclos devem ser mantidos juntamente com os testes biolgicos empregando esporos na autoclave, para assegurar que todos os materiais descartados do laboratrio sejam adequadamente descontaminados. Aps a esterilizao os resduos devem ser transportados para a incinerao. Esse procedimento de transporte deve ser supervisionado por um membro do laboratrio especificamente treinado para manusear materiais microbiolgicos. O funcionamento e manuteno adequados da autoclave exigem controle especial.

Desinfeco qumica: os recipientes que acondicionam material com perigos microbiolgicos devem conter um desinfetante na diluio de uso apropriada. Esse desinfetante deve ser trocado, de preferncia, diariamente. Os desinfetantes mais comumente utilizados so compostos base de fenol 5% , hipocloritos (gua sanitria a 2%) e glutaraldedo 2%, formaldedo (soluo alcolica 8% e soluo aquosa 10%). A tabela 3 mostra o espectro de atividade dos mesmos.
Tabela 2 . Desinfetantes qumicos mais utilizados em laboratrio de microbiologia Agentes Atividade contra microrganismos Bactrias Fungos Vrus Micobactrias Fenis +++ +++ +/+++ Hipocloritos ++ ++ +++ Aldedos (Formaldedo) +++ +++ +++ +++* Glutaraldedo +++ +++ +++ +++**

* Fumigao de cabines de segurana **Desinfeco de superfcies de equipamentos e utenslios fundamental que estejam facilmente acessveis e imediatamente disponveis os desinfetantes apropriados na necessidade de utilizao, em casos de derrame ou vazamento acidental dentro do laboratrio e para a desinfeco das superfcies de bancadas de trabalho antes e, principalmente, aps a jornada diria. Anti-sepsia o processo utilizado para inibir o crescimento de formas vegetativas de microrganismos patognicos na superfcie corporal do homem e animais. Muitas vezes a anti-sepsia destoe formas vegetativas de microrganismos patognicos, mas usualmente no elimina esporos. As substncias qumicas usadas so chamadas anti-spticas. Um bom anti-sptico para as mos deve destruir a microbiota patognica ou inibir a sua multiplicao bem como deve reduzir a microbiota total em cerca de 99,9%, i.e., 3 a 5 redues decimais. obrigao da instituio em que se trabalha fornecer um ambiente seguro. Isso inclui o fornecimento de procedimentos gerais de biossegurana, manuteno da organizao escrita e todos os arranjos necessrios para implementar os procedimentos de segurana. Para tanto, cada laboratrio deve criar suas normas locais prprias, de acordo com o tipo de trabalho desenvolvido, seguindo as recomendaes dos rgos e comisses de biossegurana.
6. LABORATRIO E INSTRUMENTAL

Todo o pessoal envolvido nas prticas microbiolgicas, inclusive os alunos, deve ser capaz de caracterizar a estrutura e funcionamento de um laboratrio de Microbiologia, identificando os materiais, instrumental e aparelhos empregados. Alm disso, as diversas operaes devem ser efetuadas adequadamente para evitar riscos de contaminao ao estudante, seus colegas e laboratoristas.

Lay-0ut do Laboratrio A segurana laboratorial facilitada pelo design apropriado do laboratrio, presena de pisos antiderrapantes, impermeveis e de fcil limpeza e drenagem. O laboratrio deve apresentar ventilao apropriada e gua em abundncia. As paredes e pisos do laboratrio devem ser de material resistente, impermevel e de fcil limpeza. As bancadas devem ser recobertas de material resistente a substncias qumicas, de fcil limpeza, tamanho e altura que permitam trabalhar comodamente. A iluminao natural ou artificial tem que ser abundante e difusa. As correntes de ar devem ser evitadas e a ventilao tem que ser controlada. O laboratrio deve possuir dependncias adequadas, tais como sala de microscopia, cmara assptica ou capela de fluxo, de preferncia classe II ou biolgica (mais apropriada para trabalhos com microrganismos patognicos), sala de preparo de meios de cultura, reagentes e solues, sala de lavagem, secagem, montagem e esterilizao de vidraria e outros materiais, biotrio, dentre outros. A execuo de experimentos com material txico ao ambiente e aos operadores ou cuja mistura reativa exalem gases txicos (amnia, metano, hidrognio ou derivados fenlicos e aldedos) devero ser procedidos em capelas ou cabines dotadas de exausto e caso utilizem substncias como brometo de etdio, cloreto mercrico e nitrato de prata, devem utilizar luvas apropriadas e dispens-los em recipientes prprios. Caso trabalhem com luz ultravioleta devem estar protegidos com mscaras apropriadas e estes raios no devero ser dirigidos para qualquer regio do corpo. Assim, as capelas e equipamentos de transiluminao com luz ultravioleta devero estar protegidas com vidro. Quando h possibilidades de contaminao das paredes por respingos, jatos ou esguichos de gua contendo materiais biolgicos, as paredes devem ser impermeveis para permitir a limpeza e descontaminao das mesmas. O mesmo deve ser observado para as bancadas. Em muitos laboratrios comum a utilizao de laminados plsticos impermeveis para proteo das bancadas. Deve ser levado em considerao que todos os ambientes devem permitir o conforto do laboratorista durante o trabalho, pois acidentes ocorrem com mais freqncia em ambientes desconfortveis. Uma pia para lavagem das mos e suportes para jalecos devem ser previstos prximos sada do laboratrio. Se possvel, as torneiras devem ser acionadas sem o uso das mos. O acesso ao laboratrio deve ser restrito ao pessoal envolvido com os trabalhos do mesmo. Requerimentos laboratoriais adicionais de biossegurana devem ser atendidos para trabalhar com organismos do grupo 3. O laboratrio deve ser situado isolado das demais reas de trabalho do departamento e o acesso limitado a pessoas autorizadas, que devem ter treinamento especfico para a manipulao de organismos do grupo de risco 3; as portas devem ser trancadas e o laboratrio deve ter presso negativa, i.e., deve existir fluxo de ar do ambiente para o laboratrio, quando em funcionamento; deve ser equipado com exaustores para evitar pressurizao positiva; preciso dotar o laboratrio com painel de vidro transparente para que o laboratorista seja facilmente visto em caso de ocorrer acidente; o laboratrio deve possuir logotipo de identificao de risco biolgico e

listagem para identificao das pessoas que podem utiliz-lo; o laboratrio deve possuir todos os equipamentos e materiais necessrios para as tcnicas utilizadas (centrfugas com fechamento hermtico, incubadoras, e freezer); tambm devem ser previsto locais de armazenamento de meios, reagentes e demais materiais necessrios ao trabalho de modo a evitar constante movimentao de entra e sai; uma cabine ou capela de biossegurana classe I ou III deve estar disponvel para operaes com culturas ou espcimes, ou amostras clnicas, durante a manipulao; o ar deve ser exaurido atravs de filtro HEPA para o meio exterior; o laboratrio deve permitir o fechamento hermtico de modo que possa ser fumigado com gases microbicidas. O sistema de ventilao da sala de trabalho restrito do nvel de segurana 3 deve apresentar design de tal forma que ele no competir com o fluxo de ar que cruza a parte frontal das cabines de segurana em uso na sala. 7. NORMAS BSICAS A SEREM SEGUIDAS NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA 1. Os alunos somente podero assistir ou participar dos experimentos prticos protegidos com avental apropriado (uso obrigatrio); Para aqueles alunos que apresentem problemas de sade recomendamos consultar o servio mdico da universidade para orientao apropriada; Aos alunos que se apresentam gripados recomendvel utilizar mscaras protetoras apropriadas, as quais podem ser adquiridas em casas que comercializam produtos mdicos ou de outra forma no participar diretamente dos experimentos; 2. Os alunos que apresentem solues de continuidade (ferimentos ou cortes) na pele no devem participar diretamente da prtica; 3. Os objetos pessoais, exceto aqueles utilizados em experimento da prtica, devem ser colocados bancada situada ao fundo do laboratrio ou em local distinto daquele onde se vai conduzir a prtica; 4. Os alunos devem, de preferncia, ocupar um lugar especfico na bancada e mant-lo fixo por todo o curso; 5. Os estudantes devem evitar conversas paralelas e circulao entre as bancadas para diminuir os riscos de contaminao; 6. Antes de iniciar os trabalhos, os auxiliares do laboratrio procedero desinfeco da bancada utilizando algodo ortopdico embebido em solues de lcool a 70% ou de hipoclorito de sdio a 1000 ppm, ou outro agente, por um perodo adequado; Apesar de no trabalharmos com amostras clnicas ou microrganismos virulentos, convm considerar que todo material biolgico infeccioso; 7. Todo experimento deve ser efetuado com o mximo de cuidado e ateno; 8. No permitido fumar, beber ou comer no laboratrio; 9. Manter a bancada arrumada e colocar papis no lixo; 10. No permitido assistir aulas de chinelos, shorts ou camisetas;

11. No permitido aplicar cosmticos no laboratrio, nem mastigar lpis, canetas ou roer unhas, nem colocar os dedos na boca ou narinas; 12. Ao receber o material para a prtica verificar se est devidamente ntegro, tubos tampados adequadamente, se no h vazamentos; 13. Ao utilizar alas e agulhas de platina as mesmas devem ser esterilizadas por flambagem antes e aps cada operao efetuada com culturas microbianas; 14. Colocar os instrumentos e materiais utilizados inclusive vidraria, em recipientes apropriados existentes nas bancadas, ao final do experimento; 15. Caso ocorra algum acidente comunicar imediatamente ao Professor Responsvel que tomar as providncias cabveis; Ao final dos experimentos envolvendo microscopia, as objetivas devem ser limpas, o condensador deve ser deixado na posio original e o equipamento devidamente protegido; 16. Os alunos devem trazer canetas tipo Pilot para identificar devidamente os materiais utilizados na prtica, facilitando o reconhecimento posterior; 17. No permitido pipetar com a boca, em vez disso usar pras ou pipetadores apropriados; 18. No tentar recapear agulhas; 19. Ao final da aula prtica envolvendo culturas microbianas, lavar as mos com sabo lquido contendo anti-spticos e enxugar com papel toalha; 20. Aps o trmino da aula, o aluno dever retirar o jaleco e acondicion-lo apropriadamente, pois no ser permitido que o aluno circule pelas dependncias do Instituto com o avental utilizado na aula prtica; Aps os trabalhos de laboratrio, o recolhimento do material e o descarte das culturas so feitos por tcnicos do laboratrio.

8. PROCEDIMENTOS DE CONTROLE DE MICRORGANISMOS E SOLUES TXICAS Os laboratoristas sero instrudos a trabalhar de forma segura e assptica, i.e., usaro jalecos, luvas descartveis, culos e mscaras protetoras quando for o caso, efetuaro regularmente limpeza, desinfeco das cabines e bancadas com desinfetantes apropriados e na concentrao correta (com segurana da presena do princpio ativo, concentrao apropriada e dentro do prazo de validade); A segurana biolgica das cabines dever ser avaliada periodicamente de acordo com instruo dos fabricantes; As operaes envolvendo pipetagem, homogeneizao e centrifugao das culturas microbianas sero efetuadas de modo a evitar a contaminao (assepsia apropriada) das mesmas, do experimento, contaminao do ambiente (superfcies das bancadas e ar) e do laboratorista; Todas as operaes envolvendo descarte e/ou disposio de materiais contaminados sero efetuadas prevendo-se a correta desinfeco e/ou o acondicionamento em recipientes apropriados. Em caso de derramamento acidental de culturas proceder-se- descontaminao apropriada (anti-sepsia, desinfeco ou esterilizao quando for o caso); As solues anti-spticas e desinfetantes estaro fcil e prontamente disponveis para o caso da necessidade de uso. As autoclaves e estufas sero avaliadas periodicamente com relao ao perfeito funcionamento, atravs do uso de indicadores fsicos, qumicos e biolgicos; Os procedimentos de limpeza do laboratrio envolvero uso de detergentes com panos midos descartveis ou esterilizados em autoclave; no sero utilizados procedimentos que envolvam movimentao de poeira ou formao de aerossis, i.e., no ser empregada limpeza a seco, exceto em circunstncias especiais. As formulaes devem prever uso de substncias com atividade antimicrobiana; O uso de glutaraldedo (2%) ser utilizado para a desinfeco qumica de materiais biolgicos e contaminados; Para desinfeco do ar da capela e cabines de segurana biolgica ser empregado formaldedo semanalmente; Os pisos e bancadas sero desinfetados com hipoclorito a 1000ppm ou compostos fenlicos; Os materiais contaminados sero descontaminados com soluo desinfetante, quando for o caso, ou, preferencialmente, autoclavados a 121oC por tempo mnimo de 30 minutos ou maior, de acordo com o tipo e carga microbiana. Os materiais plsticos descartveis, gis, placas, pipetas, papis e membranas filtrantes, frascos contaminados sero colocados em recipiente de plstico de biossegurana e autoclavados. Posteriormente, sero lacrados, acondicionados em caixas de papelo apropriadas, lacradas e levadas para local apropriado onde sero coletadas por pessoal qualificado em caminhes especializados com lixo de risco biolgico, que proceder a incinerao. Os materiais reutilizveis sero primeiramente descontaminados em autoclave e em seguida submetidos ao descarte dos resduos em recipientes plsticos de segurana biolgica, aps o que se far a lavagem, detergncia, enxge, preparo e esterilizao apropriada. Para a anti-sepsia das mos far-se- uso de anti-spticos, por ordem de preferncia, do grupo dos iodforos, clorexidina ou compostos fenlicos.

As solues qumicas txicas, particularmente brometo de etdio, nitrato de prata ou resduos destas e outros metais pesados, sero mantidos em recipientes individuais, hermeticamente fechados, devidamente identificados e o seu descarte ser feito de acordo com recomendao da Comisso de Recursos Ambientais do Governo do Estado da Bahia.