Captulo 4 Aminocidos, Peptdeos e Protenas CAPTULO 4 AMINOCIDOS, PEPTDEOS E PROTENAS

1 FUNO DAS PROTENAS As protenas constituem o componente celular mais abundante e so as molculas mais diversificadas quanto forma e funo. Elas desempenham funes tanto estruturais quanto dinmicas. Protenas so componentes do citoesqueleto e de estruturas de sustentao, como, por exemplo, o colgeno, e participam de quase todos os processos biolgicos na forma de enzimas, que so protenas que atuam como catalisadores1 de milhares de reaes qumicas que ocorrem nos organismos. Outra funo dinmica das protenas o transporte de molculas, por exemplo, o transporte de oxignio pela hemoglobina. Outra funo a defesa do organismo, que pode ser feita por tipos especiais de protenas, as imunoglobulinas (anticorpos) e o interferon, que atuam no combate a infeces bacterianas e virais. Muitas protenas participam do controle global do metabolismo, devido sua ao hormonal, como o caso da insulina. So tambm responsveis por mecanismos contrteis responsveis, por exemplo, pelo movimento e fora executados pelos msculos, sendo de particular importncia as protenas actina e miosina, que atuam na contrao muscular. At mesmo a atividade dos genes controlada por protenas: protenas reguladoras ligam-se ao DNA em stios especficos, localizados prximo aos genes, alterando sua expresso2. Estas protenas, no genoma de mamferos, so capazes de reconhecer o sitio regulador de um determinado gene, dentre dezenas de milhares de genes diferentes. Em sntese, podemos listas as principais funes das protenas: Estrutural Formando o citoesqueleto que d forma s clulas; o colgeno, um conjunto de protenas fibrosas que d sustentao ao tecido conjuntivo, atua unindo e fortalecendo os tecidos e d rigidez e forma pele. Cataltica ou Enzimtica Enzimas so molculas que atuam catalisando as reaes qumicas do metabolismo, ou seja, as enzimas aceleram e controlam as reaes metablicas. As Enzimas atuam em milhares de reaes e sem elas as reaes ocorreriam a uma velocidade inadequada ou nem ocorreriam, o que impossibilitaria a vida. Transporte As protenas tambm atuam no transporte de molculas e ons nas clulas e fora delas. Por exemplo, a hemoglobina, que atua no transporte de oxignio. Defesa As imunoglobulinas e o interferon so substncias de natureza protica que atacam protenas estranhas, vrus e bactrias que invadem o organismo. As imunoglobulinas (Ig) tambm denominadas Anticorpos (Ac) so glicoprotenas3 sintetizadas e excretadas por clulas plasmticas derivadas dos linfcitos B, os plasmcitos, presentes no plasma, tecidos e secrees que atacam protenas estranhas ao corpo, chamadas de antgenos, realizando assim a defesa do organismo (imunidade humoral). Depois que o sistema imunolgico entra em contato com um antgeno (proveniente de bactrias, fungos, etc.), so produzidos anticorpos especficos contra ele. O Interferon produzido por todos os animais vertebrados e por alguns invertebrados. Trata-se de uma classe de protenas produzidas pelas clulas do organismo para defend-lo de agentes externos como vrus, bactrias e clulas de tumores. Os interferons induzem um estado de resistncia antiviral em clulas teciduais que ainda no foram infectadas. O vrus, ao replicar-se, vai ativar o gene codificante do interferon. Aps a sntese protica, a protena sai da clula e entra na corrente sangunea, at chegar s clulas vizinhas que ainda no foram atacadas. A protena liga-se membrana celular dessas clulas e ativa o gene codificante de protenas antivirais. Estas protenas virais, por sua vez, vo impedir a replicao do vrus, quando este tentar replicar-se nessas clulas. Os IFN so produzidos na fase inicial da infeco e so a primeira linha de resistncia a muitas viroses. Hormonal Hormnios so substncias que atuam no controle metablico, transferindo informaes e instrues entre as clulas, em animais e plantas. Tambm chamados de mensageiros qumicos do corpo, os hormnios regulam o crescimento, o desenvolvimento, controlam as funes de muitos tecidos, auxiliam as funes reprodutivas, e regulam o metabolismo (o processo usado pelo organismo para produzir energia a partir

Catalisadores so substncias que aceleram a velocidade das reaes qumicas, sem participarem da reao como reagentes. As protenas, alm de tantas outras funes, tambm atuam como catalisadores de reaes do metabolismo. Essas protenas so conhecidas como enzimas. 2 Expresso o termo usado para designar a manifestao de um gene, quando ele ativado e traduzido em um RNAm para a produo de uma protena e esta sintetizada nos ribossomos. Diz-se, nesse caso, que o gene foi expresso. 3 Glicoprotena uma molcula formada por uma poro protica e outra poro acar, ligados entre si por ligao covalente. Bioqumica Geral Prof. Walber Henrique.

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dos alimentos). A maioria dos hormnios so protenas ou peptdeos. Como exemplos, citamos a insulina e o glucagon que atuam no metabolismo dos carboidratos. Contrtil e motora As protenas mais importantes responsveis pelo movimento dos msculos so a actina e miosina. Elas so protenas fibrosas que se deslizam uma sobre a outra, graas ao do ATP4, promovendo o movimento dos msculos.

2 AMINOCIDOS E PROTENAS J foi visto que as protenas so de grande importncia aos organismos vivos por exercerem tantas funes e constiturem a maior classe de biomolculas. Mas, o que so de fato protenas? As protenas, apesar de apresentarem estruturas e funes to variadas, so sintetizadas a partir de apenas 20 aminocidos diferentes. Podemos definir protenas como sendo polmeros de aminocidos. E o que so polmeros? Polmeros toda molcula que formada pela ligao entre duas ou mais molculas menores, que chamamos de monmeros. Os plsticos so exemplos de polmeros. Por exemplo, o polietileno um polmero formado a partir de monmeros do gs etileno, CH2=CH2, empregado na fabricao das garrafas PET de refrigerante. As protenas so polmeros naturais e seus monmeros so molculas de aminocidos. Para formar uma protena, primeiramente os aminocidos ligam-se uns aos outros formando um cordo de aminocidos que pode ser comparado com um colar de contas, tais como o rosrio dos catlicos, ou um colar de prolas (Figura 4-1).

Figura 4-1 Os aminocidos ligam-se uns nos outros formando uma espcie de cordo de aminocidos. Cada aminocido faz duas ligaes, cada uma delas com um aminocido distinto. As ligaes entre os aminocidos so chamadas ligaes peptdicas. So 20 diferentes aminocidos (Figura 4-3) que unidos de diferentes formas e em diferentes combinaes, formam as protenas. Ainda que o nmero de monmeros diferentes parea pequeno, as possibilidades de existirem protenas distintas so espantosamente grandes. Para se ter uma idia do grande nmero de possibilidades, vamos considerar a formao de protenas imaginrias contendo somente 20 aminocidos, um de cada tipo. Mudando apenas a posio desses aminocidos uns em relao aos outros, poderiam ser obtidas 2,4 x 1018 molculas diferentes, ou seja, 2.400.000.000.000.000.000 2 quintilhes e 400 quatrilhes de protenas diferentes! Como as protenas so compostas por centenas de aminocidos, cada um deles podendo estar presente mais de uma vez, a probabilidade de construo de molculas diferentes praticamente infinita. Os aminocidos diferem entre si pela estrutura da cadeia lateral

Os aminocidos so compostos que apresentam, na sua molcula, um grupo amino (NH2) e um grupo carboxila ( COOH); a nica exceo o aminocido prolina, que contm um grupo imino ( NH ) no lugar do grupo amino. Em pH fisiolgico, esses grupos esto na forma ionizada: NH3+, COO e NH2+. Os aminocidos tm uma frmula bsica comum, na qual os grupos amino e carboxila esto COOligados a um carbono central, denominado carbono . Tambm se encontram ligados ao carbono um tomo de hidrognio e um grupo que varia de aminocido para aminocido, chamado cadeia H3N+ C H lateral ou grupo R

R
Figura 4-2 Estrutura bsica de um aminocido. Em cima est a carboxila, esquerda o grupo amino e abaixo o grupo R.

ATP a abreviao de Adenosina trifosfato, a principal molcula responsvel pelo fornecimento e distribuio de energia nas clulas. produzida a partir das reaes do metabolismo fornecem energia (o catabolismo).

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H 20 diferentes tipos de aminocidos porque existem 20 diferentes tipos de grupos R que, conforme suas caractersticas estruturais, conferem aos aminocidos diferentes propriedades. Por exemplo, alguns aminocidos tm afinidade pela gua enquanto que outros no tm e so denominados, por causa disso, aminocidos hidrofbicos5. Essas caractersticas so importantes para a conformao das protenas e, portanto, para suas funes. Os aminocidos podem ser, ento, classificados em dois grandes grupos: os aminocidos polares (aqueles que apresentam grupo R hidroflico) e os aminocidos apolares (grupo R hidrofbico) (Figura 4-3).
Aminocidos Apolares (hidrofbicos)

Aminocidos Polares (hidroflicos)

Figura 4-3 Os aminocidos so classificados em apolares e polares e, tambm, dentro de cada classe, como alifticos e aromticos, e como sem carga, com carga positiva e com carga negativa de acordo com o grupo R que possuem.

Uma substncia hidrofbica (hidro = gua, fobia = medo) quando repele a gua, no sendo, portanto, solvel nela. So exemplos de lquidos hidrofbicos os leos, o querosene e a gasolina.

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Os aminocidos apolares tm grupos R constitudos por cadeias com carter de hidrocarboneto, que no interagem com a gua. Quando a protena assume sua forma espacial, eles ficam localizados no interior da molcula de protena para manterem-se afastados do contato com a gua j que so hidrofbicos. Os aminocidos polares apresentam grupos R com carga eltrica lquida ou grupos R sem carga, mas polares que os capacitam a interagir com a gua. Estes costumam ficar localizados na poro exterior das molculas de protenas.

Dentre os 20 aminocidos, 19 apresentam dois ismeros pticos denominados ismeros L e D (Figura 4-4 ao lado). A existncia de pelo menos dois ismeros para cada aminocido deve-se ao fato de existirem carbonos assimtricos na estrutura. O carbono de todos os aminocidos, com exceo da glicina, assimtrico, j que est ligado a quatro grupos diferentes: NH3+, COO, H e R. Na glicina este carbono no assimtrico porque o grupo R constitudo por H. Os ismeros L e D so imagens especulares um do outro. Apesar da existncia dos dois ismeros pticos para 19 aminocidos, todas as protenas encontradas nos seres vivos so formadas por L-aminocidos. Os D-aminocidos aparecem somente em certos antibiticos e em peptdeos componentes da parede celular de algumas bactrias.

Figura 4-4 Ismeros L e D da alanina, em trs representaes moleculares diferentes. A linha pontilhada indica o plano de um espelho.

3 AMINOCIDOS, PEPTDEOS E PROTENAS A LIGAO PEPTDICA Como j foi dito, os peptdeos e as protenas so polmeros formados pela unio de vrios aminocidos. Um aminocido liga-se a outro aminocido atravs de uma ligao especfica denominada ligao peptdica. Nessa ligao, o grupo amigo ligado diretamente ao carbono de um aminocido liga-se ao grupo carboxila ligado diretamente ao carbono de outro aminocido (Figura 4-5). Na formao de uma ligao peptdica liberada uma molcula de gua. Esse tipo de reao qumica cai dentro daquela classe de reaes denominada condensao (ver pgina 25, Figura 2-22 e).

Figura 4-5 Esquema simplificado mostrando a formao de uma ligao peptdica entre dois aminocidos. Nesta reao ocorre a eliminao de uma molcula de H2O.
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Esta reao, como est escrito na figura acima, jamais ocorre. Nos seres vivos, a unio dos aminocidos por ligao peptdica no feita por reao direta entre eles, mas atravs de um complexo aparato de sntese protica, envolvendo ribossomos, cidos ribonuclicos, vrias protenas e enzimas. A equao apenas um esquema didtico para descrever a formao da ligao peptdica. A unio de vrios aminocidos forma uma cadeia que denominamos cadeia polipeptdica. Uma cadeia polipeptdica pode conter de dois a milhares de aminocidos (ou resduos de aminocidos, termo mais adequado para designar cada unidade de aminocido ligado na cadeia porque, na verdade, o que fica o resduo j que uma parte de dois aminocidos foi eliminada na forma de molcula de gua). Quando o nmero de aminocidos dois, a cadeia chamada dipeptdio, quando so trs, tripeptdio e assim por diante. Polmeros contendo at 30 resduos de aminocidos so chamados de oligopeptdeos ou, simplesmente, peptdeos. Quando o nmero maior, so chamados polipeptdios. Qualquer que seja o nmero de aminocidos, peptdios e polipeptdios apresentam um grupo amino livre em uma das extremidades amino terminal e um grupo carboxila livre na outra carboxila terminal. Muitos peptdeos encontrados na natureza desempenham funes importantes, atuando como hormnios (encefalinas, oxitocina, vasopressina, glucagon), antibiticos (gramicidina), agentes redutores (glutationa) etc. (Tabela 4-1 e Figura 4-6). Peptdios com aplicao teraputica so sintetizados em laboratrios industriais; um exemplo o aspartame, um adoante artificial com alto poder edulcorante6. O aspartame e um dipeptdio modificado, formado por aspartato e fenilalanina, esterificada a um grupo metila. Tabela 4-1 Peptdeos de importncia biolgica. Numero de Glndulas/clulas Peptdeos aminocidos produtoras Hipfise anterior e medula Encefalinas 5 adrenal Oxitocina Vasopressina Glucagon Gramicidina Glutationa 9 9 29 10 3 Hipfise posterior Hipfise posterior Clulas do pncreas Cepas de Bacillus brevis Maioria das clulas

Efeitos principais Analgesia Contrao da musculatura uterina no parto e de glndulas mamrias na lactao. Aumento da presso sangnea e da reabsoro de gua pelo rim. Aumento da produo de glicose pelo fgado no jejum. Antibitico. Proteo de grupos SH de protenas, manuteno do Fe2+ da hemoglobina e destruio de H2O2.

Edulcorante o nome que se d s substncias que apresentam sabor doce (substncias que adoam).

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Leucina Encefalina

Metionina Encefalina

GSSG Glutationa oxidada

Oxitocina

vasopressina

L-Aspartil-L-fenilanina

(metilster):

Figura 4-6 Alguns peptdeos biologicamente importantes e suas seqncias de aminocidos. As protenas podem ser formadas por uma ou mais cadeias polipeptdicas; contm, geralmente, mais de 50 aminocidos (Tabela 4.2) e desempenham uma funo especfica. Todas as protenas, com poucas excees (colgeno, por exemplo), contm todos os 20 aminocidos, em propores que variam muito de protena para protena. Tabela 4-2 Caractersticas de composio de algumas protenas. Protena Nmero de aminocidos Insulina (bovina) 51 Lisozima (clara de ovo) 129 Mioglobina (eqina) 153 Hemoglobina (humana) 574 Aspartato transcarbamoilase (E. coli) 2.700 RNA polimerase (E. coli) 4.100 Apolipoprotena B (humana) 4.536

Nmero de cadeias polipeptdicas 2 1 1 4 12 5 1

4 ESTRUTURA DAS PROTENAS Cada protena apresenta uma estrutura tridimensional definida e caracterstica. Apesar de existirem inmeras conformaes teoricamente possveis, todas as molculas de uma dada protena, ao serem sintetizadas pela clula, assumem a mesma conformao espacial. Esta configurao, entre tanto, no permanentemente fixa, e, muitas vezes, alteraes estruturais transitrias esto relacionadas com o controle da funo desempenhada pela protena. A conformao original de uma protena, ao ser formada nos ribossomos, denominada de conformao ou estrutura nativa. Esta estrutura nativa pode sofrer alteraes em funo do pH do meio ou da temperatura. Uma protena
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cuja estrutura nativa foi alterada pode ter sua funo comprometida ou, inclusive, perder sua funo. Diz-se, nesses casos, que a protena foi desnaturada. A seqncia de aminocidos determina a estrutura espacial das protenas

A organizao espacial da protena resultante do tipo de aminocidos que a compem e de como eles esto dispostos uns em relao aos outros. A seqncia dos aminocidos ir determinar o tipo de interao possvel entre as cadeias laterais, que, como j exposto, apresentam caractersticas de carga eltrica, volume e interao com a gua que variam muito de aminocido para aminocido. Estrutura Primria, Secundria, Terciria e Quaternria

A organizao tridimensional de uma protena, desde a seqncia de aminocidos, passando pelo enrolamento da cadeia polipeptdica at a associao de vrias cadeias, pode ser descrita em quatro nveis estruturais de complexidade crescente, denominados estrutura primria, estrutura secundria, estrutura terciria e estrutura quaternria.

4.1 Estrutura Primria A estrutura primria a seqncia de aminocidos ao longo da cadeia polipeptdica, que determinada geneticamente, sendo especfica para cada protena. Por conveno, a estrutura primria escrita na direo amino terminal carboxila terminal. Exemplificando, os peptdeos hipotticos Ala Ser Lys e Lys Ser Ala so diferentes, porque no primeiro caso, o grupo amino da alanina que est livre e, no segundo caso, o da lisina. Alm das ligaes peptdicas, h um outro tipo de ligao covalente que costuma ser considerada tambm responsvel pela estrutura primria das protenas. Tratam-se das pontes dissulfeto (SS). Ela formada entre dois resduos de cistena, por uma reao de oxidao catalisada por enzimas especficas (Figura 4-7).

Figura 4-7 Formao da ponte dissulfeto entre dois resduos de cistena.

4.2 Estrutura Secundria A estrutura secundria descreve as estruturas regulares tridimensionais formadas por seguimentos de cadeia polipeptdica. Duas organizaes so particularmente estveis: o enrolamento da cadeia ao redor de um eixo e a interao lateral de segmentos de uma cadeia polipeptdica ou de cadeias diferentes. Estas conformaes so denominadas, respectivamente, -hlice e folha pregueada, porque foram descobertas nesta ordem. A extenso do trecho da cadeia polipeptdica que se organiza nessas duas conformaes pode variar de alguns a dezenas de aminocidos, conforme a protena. A -hlice e a folha pregueada estabilizam-se por pontes de hidrognio entre o nitrognio e o oxignio dos grupos NH e C = O, constituintes das unidades peptdicas. Embora a ponte de hidrognio seja uma ligao fraca, o elevado nmero destas ligaes confere grande estabilidade a essas estruturas.

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A -hlice mantida por pontes de hidrognio entre uma unidade peptdica e a quarta unidade peptdica subseqente; estas pontes de hidrognio dispem-se paralelamente ao eixo da hlice. A -hlice tem um passo de 0,54 nm e apresenta 3,6 resduos de aminocido por volta. A folha pregueada uma estrutura tambm mantida por pontes de hidrognio entre as unidades peptdicas. Neste caso, entretanto, as ligaes so estabelecidas entre cadeias polipeptdicas diferentes ou entre segmentos distantes de uma mesma cadeia. Estas cadeias, ou segmentos de cadeia, exibem conformao mais distendida que a -hlice e dispem-se lado a lado, o que d estrutura formada o aspecto de uma folha de papel pregueada. As pontes de hidrognio so perpendiculares ao eixo das cadeias, e os grupos R dos aminocidos projetam-se para cima e para baixo do plano da olha pregueada (Figura 4-8).

(c)

Figura 4-8 Modelos de folha pregueada e de -hlice. (a) Disposio antiparalela da folha e (b) paralela. As setas apontam no sentido amino terminal carboxila terminal. (c) Na -hlice, a cadeia polipeptdica forma uma espiral, estabilizada por pontes de H entre os grupos C = O e NH das ligaes peptdicas. As cadeias laterais dos resduos de aminocidos (grupos R) dispem-se no exterior da hlice.

4.3 Estrutura Terciria e Quaternria As protenas assumem ainda uma estrutura terciria, que se deve ao enovelamento da cadeia peptdica. Duas ou mais cadeias peptdicas podem se agrupar dando origem a uma protena mais complexa. A esse agrupamento denominamos estrutura quaternria. As quatro estruturas esto ilustradas na figura a seguir:
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Figura 4-9 Ilustrao dos quatro nveis estruturais das protenas. Como podemos observar na figura, a estrutura quaternria devida ao agrupamento envolvendo duas ou mais subunidades polipeptdicas tridimensionais que atingiram sua estrutura terciria. Cada uma dessas subunidades se agrupa de forma a gerar uma organizao mais complexa qual denominamos de estrutura quaternria. Nem todas as protenas apresentam estrutura quaternria. importante frisar que uma cadeia polipeptdica no uma protena. Protena a macromolcula formada por aminocidos que apresenta uma funo biolgica. A forma tridimensional de uma protena, a qual denominamos estrutura terciria e, tambm, quaternria (quando h), determina suas funes biolgicas: estrutural, regulao, enzimtica etc. Muitas vezes, podem-se distinguir na estrutura terciria de uma protena monomrica, ou na estrutura terciria das subunidades componentes de uma protena oligomrica, regies diferenciadas, denominadas domnios. Cada domnio tem uma organizao espacial compacta, com o interior hidrofbico e a superfcie polar. Esses domnios esto associados a funes daquelas protenas e so denominados stios de atividades. A forma desses domnios determina o tipo de substrato que uma enzima ir catalisar. Por exemplo, a reao de fosforilao da glicose na primeira etapa do seu metabolismo (que ser visto mais frente), ocorre mediante a ao de uma molcula protica, a enzima hexoquinase. A interao perfeita entre a glicose e o stio de ao dessa enzima ocorre porque a forma espacial desse stio e as molculas de aminocidos (os resduos de aminocidos) que existem ali so muito especficos e tais que permitem a atrao entre a glicose e o seu encaixe perfeito no lugar certo. Qualquer mudana na conformao espacial da enzima hexoquinase faz com que ela perca a capacidade de ligar a glicose e catalisar a reao. Quando isso ocorre, dizemos que a enzima sofreu desnaturao. Outra importante conseqncia da forma espacial das protenas sua especificidade. A estrutura da protena determina o que ela far e qual reao ir catalisar, no caso de se tratar de uma enzima Assim, cada reao do metabolismo catalisada por uma protena especfica, da mesma forma que uma fechadura s pode ser aberta pela sua prpria chave.

5 PROTENAS GLOBULARES E FIBROSAS As protenas podem apresentar aspecto espacial semelhante a uma bola ou a um basto. As protenas do primeiro tipo so denominadas protenas globulares, enquanto as do segundo tipo so as protenas fibrosas. As protenas globulares apresentam uma ou mais cadeias polipeptdicas organizadas em uma forma final aproximadamente esfrica. So geralmente solveis e desempenham vrias funes dinmicas, como transporte e enzimtica. As protenas fibrosas tm forma alongada, so geralmente insolveis e desempenham papel basicamente estrutural nos sistemas biolgicos. Diferentemente das globulares, so formadas pela associao de mdulos repetitivos, possibilitando a construo de grandes estruturas. O componente fundamental das protenas fibrosas so cadeias polipeptdicas muito longas com estrutura secundria regular: alfa-hlice nas alfa-queratinas, folha beta-pregueada nas beta-queratinas e uma hlice caracterstica no colgeno. 52

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O Colgeno

O colgeno a molcula mais abundante dos vertebrados. Suas fibras so responsveis pelas funes mecnicas e de sustentao do tecido conjuntivo, que se distribui por cartilagens, tendes, matriz ssea e pele; mantm, ainda, a estrutura e a elasticidade do sistema vascular e de todos os rgos. O nmero de ligaes covalentes do colgeno varia conforme a atividade fisiolgica do tecido considerado e aumenta com a idade do animal (o que explica a maior rigidez da carne de animais mais velhos). A estrutura do colgeno rompida por aquecimento, originando uma protena desenrolada, mais solvel, a gelatina. Este o princpio da fabricao industrial desta protena, muito frequente na dieta humana.

6 PROTENAS COM AMINOCIDOS MODIFICADOS E PROTENAS CONJUGADAS As protenas podem apresentar aminocidos modificados ou componentes no-proticos. 6.1 Protenas com Aminocidos Modificados Muitas protenas contm resduos de determinados aminocidos modificados, alm dos 20 usuais. Esses aminocidos exticos formam-se por alterao enzimtica de aminocidos comuns, aps incorporao na cadeia polipeptdica, durante a sntese da protena. No colgeno frequente a hidroxilao da cadeia lateral de prolina A reao enzimtica que produz essa modificao requer a presena de cido ascrbico (vitamina C), por isso que essa vitamina importante na dieta humana e sua deficincia causa enfraquecimento do colgeno levando a uma hipovitaminose denominada escorbuto, As manifestaes clnicas desta doena correlacionam-se com a sntese de molculas de colgeno menos estveis e com a sua distribuio nos tecidos, causando: interrupo do crescimento dos ossos em crianas, m cicatrizao de ferimentos e aumento da fragilidade de vasos sanguneos, o que resulta em hemorragias na pele e gengivas, principalmente. Em outras protenas, pode ocorrer acetilao do grupo amino ou fosforilao do grupo hidroxila de serina, treonina e tirosina (Figuras 4-10 e 4-11 a seguir). A adio e a remoo de grupo fosfato um fenmeno cclico frequentemente encontrado em protenas com funo enzimtica. A fosforilao altera profundamente a atividade destas enzimas.

COOH H 2N C H
Figura 4-10 Fosforilao de um resduo de Serina.

COOH + HPO42H2 N C H H O O P O O + H 2O

H C OH

H C

COOH H2N C CH2 CH2 CH2 CH2 H N H + CH3C OH H O H2N

COOH C CH2 CH2 CH2 CH2 H N O CCH3

Grupo Acetil

H2O

Figura 4-11 Acetilao do grupo amino presente na Lisina. 53

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6.2 Protenas Conjugadas As protenas podem, ainda, apresentar molculas no-proticas ligadas cadeia polipeptdica Estes componentes so designados de grupos prostticos e as protenas, neste caso, so chamadas protenas conjugadas. O grupo prosttico de natureza varivel, podendo ligar-se cadeia polipeptdica covalente ou nocovalentemente. Na mioglobina (Figura 4-12) a cadeia polipeptdica liga-se no-covalentemente a um grupo prosttico chamado heme, o mesmo acontecendo com cada uma das quatro cadeias da hemoglobina (Figura 4-13).

(a)

(b)

(c)

Figura 4-12 Modelos da mioglobina mostrando: (a) os diversos trechos em alfa-hlice (representados por espirais), alternados pos seguimentos desenrolados; (b) os dobramentos da cadeia da mioglobina, onde as esferas representam o carbono alfa dos resduos de aminocidos; (c) O grupo heme, destacando o tomo de ferro ligado, em cima, a uma molcula de oxignio. A cadeia polipeptdica da mioglobina liga-se ao grupo heme - vermelho em (a) e preto em (b).

(a)

(b)

(c)

Figura 4-13 Estruturas da hemoglobina representadas de duas formas: (a) com destaque s quatro subunidades polipeptdicas que forma a estrutura quaternria; (b) com destaque a uma das duas subunidades alfa e a uma das duas subunidades beta, destacando tambm o grupo heme. Ao lado, encontra-se a frmula estrutural do grupo heme (c) evidenciando a ligao ao resduo Histidina.
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O grupo prosttico pode ser um carboidrato ou um lipdio, covalentemente ligados, e a protenas conjugada chamase glicoprotena ou lipoprotena, respectivamente. Glicoprotenas

Glicoprotenas so encontradas em todos os compartimentos celulares, mas constituem, principalmente, as protenas secretadas pelas clulas e aquelas localizadas na sua superficie externa. Exemplos de glicoprotenas secretadas so as mucinas7 das secrees mucosas e muitas protenas do sangue, como as que participam da coagulao sangunea e as imunoglobulinas8. As glicoprotenas da membrana plasmtica funcionam como marcadores biolgicos, que permitem a comunicao entre as clulas. Protenas estruturais importantes, como o colgeno, contm carboidratos; o interferon9 e alguns hormnios tambm so glicoprotenas. A prpria hemoglobina pode ligar-se glicose, formando a hemoglobina glicosilada; a reao de glicosilao noenzimtica, A concentrao de hemoglobina glicosilada aumenta quando a concentrao de glicose no sangue (glicemia) anormalmente elevada Esta condio (hiperglicemia) ocorre em pacientes com diabetes. Lipoprotenas

Podemos distinguir, dentro da classe das lipoprotenas, dois grupos de lipoprotenas: As lipoprotenas conjugadas no sentido estrito, em que uma protena encontra-se ligada covalentemente a algumas molculas de lipdios, e as lipoprotenas plasmticas. Como exemplos do primeiro grupo, encontramos as lipoprotenas da parede celular de certas bactrias que contm molculas de cidos graxos unidos por ligaes covalentes. Por outro lado, as lipoprotenas plasmticas so partculas de alto peso molecular, formadas por inmeras molculas de lipdios e algumas poucas molculas de protena, associadas por ligaes no-covalentes. Elas atuam no transporte de lipdios pelo sangue.

7 ALTERAES ESTRUTURAIS DAS PROTENAS Independentemente da funo que desempenhe no organismo, uma protena tem uma estrutura espacial e conformao muito especficas para que possa exercer sua funo. essa estrutura e arranjo espaciais denominamos estrutura ou arranjo nativo. Quando uma protena sintetizada na clula, sua estrutura primria dobra-se espontaneamente, originando as estruturas secundria e terciria Se a estrutura em questo possuir estrutura quaternria, esta tambm se organiza espontaneamente, assim que a estrutura terciria das subunidades componentes formada. A protena assume sua conformao nativa Esta a conformao mais estvel que a molcula pode assumir naquelas condies e reflete um equilbrio delicado entre as interaes ocorridas no interior da molcula protica e entre esta e seu meio ambiente. As interaes existentes no interior da prpria molcula e entre esta e suas vizinhanas so interaes ou ligaes do tipo no covalentes, denominadas de interaes intermoleculares. Tratam-se de atraes devidas existncia de grupos carregados (ons) ou dipolos nas molculas (molculas polares), ou pontes de hidrognio (ligaes hidrognio) ou foras de Van der Waals. Todas as interaes somadas (so milhares por causa do tamanho da molcula protica e da grande quantidade de aminocidos) levam estabilizao da forma nativa da molcula. A desnaturao de uma protena a perda da sua forma espacial nativa, devido ao de agentes fsicos, qumicos ou biolgicos. Os agentes fsicos principais causadores da desnaturao de uma protena so a temperatura e o pH. A
Mucinas so compostos pertencentes a um grupo de glicoprotenas que so as principais constituintes do muco. Apresentam esqueleto peptdico rico em serina, treonina e tirosina. So secretadas no estmago e apresentam a forma de gel que recobre a mucosa do estmago, protegendo-o contra a ao do cido clordrico, HC, que muito corrosivo. 8 Imunoglobulinas so anticorpos.
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O interferon uma glicoprotena produzida pelas clulas de todos os animais vertebrados e por alguns invertebrados e que tem como funo defend-los de agentes externos como vrus, bactrias e clulas de tumores. Os interferons induzem um estado de resistncia antiviral em clulas e tecidos no infectados. O vrus, ao replicar-se, vai ativar o gene codificante do interferon. Aps a sntese protica, a protena sai da clula e entra na corrente sangunea, at chegar s clulas vizinhas que ainda no foram atacadas. A protena do interferon liga-se membrana celular dessas clulas e ativa o gene codificante de protenas antivirais. Estas protenas antivirais, por sua vez, vo impedir a replicao do vrus, quando este tentar replicar-se nessas clulas. Os interferons so produzidos na fase inicial da infeco e constituem a primeira linha de resistncia a muitas viroses.

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temperatura uma medida da energia trmica do sistema, e essa energia est associada ao grau de vibrao e movimentao das molculas. Quanto maior a temperatura, maior a agitao trmica das molculas, o que pode deformar a protena alterando-lhe a forma espacial ativa. por isso que se recomenda aquecer os alimentos, tais como o leite, para matar possveis agentes patolgicos existentes. por isso, tambm, que a febre preocupa tanto, porque acima de uma determinada temperatura, as enzimas comeam a desnaturar e perder sua capacidade cataltica, causando convulses e podendo levar morte. O pH tambm pode desnaturar porque a concentrao de H+ no meio altera as cargas eltricas existentes nos resduos de aminocido, alterando-lhes o perfil eletrosttico e as interaes entre eles. Como a estrutura espacial da molcula depende das interaes entre os arninocidos, explica-se a mudana na forma nativa da protena e consequente perda da atividade. A desnaturao pode ser reversvel ou irreversvel. Um exemplo de desnaturao irreversvel o que ocorre com a albumina do ovo quando este cozido. Quando aquecida, a albumina torna-se insolvel. O mesmo ocorre com a casena do leite, quando este acidificado por bactrias que crescem nele (fermentao do leite) e por isso que se forma a coalhada, alimento to apreciado. Retiradas as condies desnaturantes, muitas protenas podem assumir sua conformao nativa - este processo chama-se renaturao. A renaturao demonstra que a estrutura tridimensional de uma protena conseqncia de sua estrutura primria, ou seja, determinada, unicamente, por sua sequncia de arninocidos. Substituio de Aminocidos pode Alterar a Funo das Protenas

A desnaturao, como descrito anteriormente, o rompimento da estrutura nativa, que leva perda da funo da protena, Todavia, alteraes menos drsticas da estrutura da protena podem inativ-la, Uma mutao que resulte na substituio de um aminocido em uma posio crtica na molcula pode ter consequncias danosas para o desempenho da sua funo. O exemplo clssico a substituio, nas cadeias beta da hemoglobina, de um resduo de glutamato, cujo grupo polar negativo localiza-se na superfcie externa da molcula, por valina, com grupo R apoiar. As molculas da hemoglobina substituda, quando desoxigenadas, agregam-se devido a ligaes hidrofbicas envolvendo os grupos apoiares da valina, Os agregados formam um precipitado fibroso que distorce as hemcias, que adquirem forma de foice sickle em ingls - e, por isso, a hemoglobina alterada chamada de hemoglobina S, em contraposio hemoglobina normal, a hemoglobina A. Estas clulas deformadas obstruem os capilares, impedindo a oxigenao adequada dos tecidos; tambm so mais frgeis que as normais, ocasionando anemia grave. A doena conhecida como anemia falciforme, e manifesta-se somente quando a mutao ocorre em homozigose: indivduos heterozigotos so normais.

8 PURIFICAO DE PROTENAS (Material Opcional) A purificao ou o isolamento de uma protena consiste em obt-Ia, a partir das clulas onde produzida, na forma pura para identificao de suas estruturas e estudos posteriores. Como uma clula um complexo organismo em que existem, misturados, milhares de diferentes substncias, e tambm devido ao fato de a protena de interesse muitas vezes existir em uma quantidade muito pequena, purific-la no tarefa das mais simples e normalmente envolve vrias etapas. Etapas da Purificao de Protenas Passo 1: Liberao do Material Intracelular

A purificao de uma protena inicia-se com a liberao da protena do material biolgico onde ela ocorre - rgos, tecidos ou clulas isoladas como hemcias, bactrias e leveduras - pelo rompimento destas estruturas, que pode ser obtido por metodologias diversas, uma das quais denominada homogeneizao mecnica. A homogeneizao mecnica em meio isotnico, por exemplo, produz o maceramento dos tecidos (ou rgos) e a lise das clulas, originando um extrato celular, constitudo por pedaos de membrana plasmtica, organelas (ncleos, mitocndrias etc.) e o citossol. Os diversos componentes celulares podem ser separados por um procedimento denominado fracionamento celular, que consiste em centrifugar o extrato celular em velocidades progressivamente maiores. Geralmente, quanto menor for uma estrutura, maior ser a fora centrfuga necessria para sediment-Ia; como os 56

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componentes celulares diferem em tamanho, eles sedimentaro em velocidades diferentes, podendo, assim, ser separados uns dos outros. Quando a protena desejada localiza-se apenas em uma das fraes obtidas mitocndrias, por exemplo - o fracionamento celular propicia uma purificao inicial considervel. Passo 2: Separao Baseada em Propriedades Especficas

Uma vez consegui da uma preparao contendo a protena, esta pode ser separada de outras protenas e de outros tipos de molculas por mtodos que se baseiam em propriedades especficas, tais como: solubilidade, tamanho, carga eltrica e afinidade por determinados compostos. O mtodo de purificao a ser escolhido depende da particular protena que se pretende isolar e, usualmente, empregam-se combinaes sequenciais de diferentes mtodos. Frequentemente, o primeiro passo empregado para a separao de protenas de extratos brutos e a precipitao por adio de sais (sulfato de amnio, por exemplo) ou solventes orgnicos miscveis com gua - a separao, neste caso, baseia-se em diferenas de solubilidade apresentadas pelas protenas. Todavia, estas tcnicas permitem apenas uma purificao parcial e devem ser seguidas de outras, mais seletivas, como cromatografia e eletroforese. Cromatografia em Coluna

Na cromatografia em coluna, uma amostra da mistura de protenas e aplicada no topo de uma coluna formada por uma matriz hidratada, que pode ser constituda de diversos tipos de materiais, denominados conjuntamente resinas. A coluna , ento, eluda (lavada) com uma soluo apropriada para a separao da protena de interesse. As diferentes protenas migraro atravs da coluna com velocidades diferentes que dependero do grau de interao com a matriz, o que permite a sua separao. Os vrios mtodos de cromatografia em coluna disponveis diferem quanto matriz utilizada e so classificados de acordo com a propriedade das protenas que discriminada pela matriz: tamanho (cromatografia de excluso), carga inica (cromatografia de troca inica) e especificidade de ligao (cromatografia de afinidade). Cromatografia de Excluso

A cromatografia de excluso, tambm chamada de cromatografia por filtrao em gel, separa molculas que diferem quanto ao tamanho, como acontece com as protenas, cuja massa molar varia de alguns milhares (5.733 Daltons para insulina) a milhes (2.800.000 Daltons para hemocianina, uma protena transportadora de oxignio de certos invertebrados). A matriz, nesta tcnica um gel constitudo por esferas com poros de tamanho definido. As molculas menores do que o dimetro dos poros podem penetrar nas esferas, ao passo que as maiores, no: so "excludas". Deste modo, as molculas menores percorrem, ao longo de uma coluna com esse material, um trajeto muito maior do que as molculas maiores, que sairo da coluna em primeiro lugar (Figura 4-14).

Figura 4-14 - Filtrao em gel. Uma mistura formada por duas protenas (A e B, bolinhas pretas e bolinhas vermelhas maiores), com massas molares diferentes, aplicada sobre uma coluna de gel formada por esferas porosas (polmeros porosos). As molculas da protena menor podem penetrar nos poros das esferas, percorrendo a coluna mais lentamente. A proteina maior , ento, eluda primeiramente e aparece logo nas primeiras fraes, enquanto a menor elui depois. 57

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Cromatografia de Troca Inica

Tabela 4-3 Algumas resinas utilizadas para cromatografia de troca As resinas de troca inica comum ente inica de protenas. utilizadas para protenas so formadas por Resina Grupo Ionizvel celulose ligada covalentemente a grupos com Fosfocelulose PO32 carga positiva ou negativa (Tabela 4-3 ao lado). Carboximetilcelulose CH2 COO Molculas com carga de mesmo sinal que a Dietilaminoetilcelulose CH2CH2N+ H(CH2CH3)2 resina so eludas primeiramente, seguidas por molculas com carga oposta, em uma ordem definida pela magnitude da carga apresentada pela protena nas condies da cromatografia. Geralmente, escolhem-se valores de pH e de concentrao salina que determinem a ligao da protena de interesse resina escolhida; seguem-se alteraes dessas condies que levem eluio da protena (Figura 4-15 a) . Cromatografia de Afinidade

Muitas protenas ligam-se especifica e no-covalentemente a determinadas molculas: enzimas, hormnios e anticorpos ligam-se, respectivamente, a substratos, receptores ou antgenos. Tais protenas podem ser purificadas por cromatografia de afinidade. O princpio do mtodo consiste em ligar a molcula pela qual a protena tem afinidade (ligante) a uma matriz insolvel, sendo a mais utilizada a agarose, um polmero de acares encontrado em algas vermelhas. A mistura de protenas passada por uma coluna preparada com esse material: a protena de interesse fica adsorvida a coluna, graas interao com o ligante, e as outras protenas passam livremente. A protena adsorvida pode ser eluda da coluna por adio de soluo concentrada do ligante (Figura 4-15 b). Se a protena for uma enzima, o ligante pode ser o substrato, o produto ou o inibidor competitivo. No caso de purificao de anticorpos, o ligante utilizado o antgeno. O receptor de insulina, uma protena da superfcie celular, foi isolado por cromatografia de afinidade em agarose contendo insulina covalentemente ligada A cromatografia de afinidade tem, obviamente, um poder de resoluo muito maior do que os outros mtodos cromatogrficos, embora seja restrita a uma classe especial de protenas.

Figura 4-15 (a) Cromatografia de Troca Inica; (b) Cromatografia de Afinidade. 58

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Eletroforese

Em um mesmo pH, protenas diferentes apresentaro cargas liquidas diferentes, o que determinar velocidades de migrao diferentes, se as protenas forem submetidas a um campo eltrico. Este o princpio da eletroforese. As diferentes tcnicas de eletroforese empregam, invariavelmente, um suporte slido - como papel ou gel - que evita a mistura das protenas por conveco e permite utilizar pequenas quantidades de material. A eletroforese em gel um dos mtodos mais utilizados para analisar misturas de protenas ou outras macromolculas. Os gis utilizados como suporte - agarose e poliacrilamida - podem ser preparados com poros idade varivel, propiciando separao das molculas segundo o seu tamanho, alm da sua carga. Protenas menores migram mais depressa que as maiores, formando uma srie de bandas definidas, que podem ser visualizadas por colorao especfica (Figura 4-16).

Figura 4-16 Eletroforese em gel. As amostras so colocadas em pequenas depresses (poos) formadas na parte superior do gel, contido entre placas de plstico e imerso em tampo. (a) O aparato submetido a um campo eltrico e as protenas migram, formando bandas: quanto menor a massa molar da protena, maior a distncia migrada. Em (b), o resultado obtido, aps revelao das bandas formadas no gel por colorao especfica para protenas. Nesta eletroforese, foram utilizadas amostras contendo diferentes misturas de protenas.

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