PRODUO BIOTECNOLGICA DE XILITOL A PARTIR DA PALHA DE ARROZ

PESQUISA
Ilustraes cedidas pelas autoras

Aproveitamento de resduo agrcola para gerao de um edulcorante de elevado valor agregado

arroz um dos alimentosmaisconsumidosno s no Brasil como em quase todos os pases do mundo. Entretanto, sua plantao s pode ser feita em locais com condies adequadas de clima e de solo, condies estas que podem ser encontradas em quase todas as regies do Brasil. No mundo todo, mais de 50 pases contribuem com uma produo de cerca de 100 milhes de toneladas de arroz anualmente (Kadam et al., 2000). No Brasil, segundo dados do IBGE, a produo de arroz com casca na safra 2000/2001 foi de, aproximadamente, 11,1 milhes de toneladas, quantidade suficiente para gerar um resduo de cerca de 15 milhes de toneladas de palha de arroz (Mussatto, 2002). O acmulo de grandes quantidades desse resduo no solo pode causar mudanas no ecossistema (Sun et al., perodo de vrios anos (Jacobs et al., 1997). Uma forma de contornar esses problemas a retirada desse resduo dos campos e sua utilizao na gerao de produtos que sejam benficos para o homem. Isso possvel devido palha de arroz ser um material lignocelulsico fibroso, de elevado valor nutritivo. Em sua composio, a palha de arroz apresenta um teor de cinzas de 11,4 % (Mussatto, 2002), e essas cinzas geralmente contm (%): SiO2 (75), K2O (10), P2O5 (3), Fe2O3 (3), CaO (1,3) e pequenas quantidades de Mg, S e Na (Kadam, 2000). Contudo, seus principais componentes orgnicos so a celulose, a hemicelulose e a lignina, nas propores (%) apresentadas na Figura 1. A frao hemicelulsica desse resduo composta basicamente por polmeros heterogneos com cadeias lineares que apresentam ramificaes laterais, sendo constitudas, principalmente, por pentoses (D-xilose e L-arabinose) e, em uma menor proporo, hexoses (D-glicose, Dmanose e D-galactose), cidos Dglucurnicos e grupos acetilas (Kuhad e Singh, 1993). Uma estrutura tpica da hemicelulose encontrada na palha de arroz est apresentada na Figura 2. Por ser um material lignocelulsico fibroso, a palha de arroz pode ser utilizada na gerao de energia, alimentao animal, produo de combustveis domsticos (gs metano) e produo de fibras de papel e celulose. Alm de todas essas aplicaes, esse resduo pode ser tambm utilizado como matria-prima para a produo biotecnolgica de xilitol, devido ao seu elevado contedo de pentosanas (frao hemicelulsica) for-

Solange Ins Mussatto

Engenheira Industrial Qumica, Mestre em Biotecnologia Industrial Professora do Departamento Bsico da Faculdade de Engenharia Qumica de Lorena FAENQUIL Lorena SP solangemussatto@hotmail.com

Ins Conceio Roberto

Doutora em Tecnologia BioqumicoFarmacutica pela USP Professora e Pesquisadora do Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Qumica de Lorena FAENQUIL Lorena SP ines@debiq.faenquil.br

Figura 1. Composio da palha de arroz (%)(Mussatto, 2002)

2000), e, segundo alguns mdicos, a prtica de queimadas como forma de sua eliminao pode provocar ataques de asma, no somente em crianas, mas tambm em adultos, durante um

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Tabela 1. Valores de pH, concentrao (g/L) de glicose, xilose, arabinose, furfural, hidroximetilfurfural (HMF) e cido actico, e estimativa dos produtos derivados da lignina (PDL), do hidrolisado de palha de arroz em sua forma original, concentrado e tratado Caracterizao Glicose Xilose Arabinose Furfural HMF cido Actico PDL* pH * absortividade a 280 nm Original 3,29 18,33 3,40 0,10 0,17 1,05 0,16 1,22 Hidrolisado Concentrado 19,80 119,90 22,90 0,07 0,32 2,28 0,52 0,40 Tratado 18,75 117,39 21,78 0,00 0,11 1,97 0,38 0,40

necer um hidrolisado susceptvel ao de microrganismos (Roberto et al., 1996; Silva e Roberto, 1999). O xilitol um polilcool de estrutura aberta e frmula molecular C5H12O5 (sua estrutura molecular pode ser observada na Figura 3). Esse polilcool de valor calrico igual a 2,4 Kcal/g apresenta caractersticas relevantes que permitem seu uso na manufatura de alimentos, em produtos farmacuticos e em cosmticos. O xilitol considerado ainda como um adoante perfeitamente capaz de substituir com vantagens a sacarose. Isso porque, alm de poder adoante, apresenta propriedade anticariognica e possui vrias aplicaes clnicas que o

indicam no tratamento de pessoas com diabetes, desordem no metabolismo de lipdeos, leses renais e parenterais, na preveno de otite, infeces pulmonares e osteoporose (Mkinen, 2000). O xilitol pode ser encontrado na natureza em muitas frutas, vegetais e cogumelos, porm, em quantidades inferiores a 900 mg/100 g, o que torna sua extrao um processo antieconmico e impraticvel (Paraj et al., 1998b). Uma alternativa extrao do xilitol diretamente dessas fontes naturais a sua obteno pela hidrogenao da D-xilose presente na matria vegetal, seja por via qumica, seja por via biotecnolgica.

O processo qumico o nico atualmente utilizado para produo de xilitol em larga escala. Esse processo realizado em vrias etapas, e entre essas, a purificao da xilose presente no hidrolisado considerada a mais crtica, pois, alm de requerer uma elevada eficincia (para que no ocorram problemas posteriores na produo), a etapa mais dispendiosa de todo o processo. De uma forma geral, quando comparada produo de sacarose ou sorbitol, a produo de xilitol por processo qumico apresenta um custo cerca de 10 vezes maior (Heikkil et al., 1992). Na tentativa de desenvolver uma tcnica menos dispendiosa e que tam-

Figura 2. Estrutura da hemicelulose (Software ACD / ChemSketch vs.4.55)

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Tabela 2. Fatores de Converso: Substrato em Produto (YP/S), Substrato em Clulas (YX/S), Clulas em Produto (YP/X), Produtividade Volumtrica (QP), e eficincia (, em % do mximo terico que pode ser alcanado) obtida para o processo fermentativo de produo de xilitol, a partir de hidrolisado de palha de arroz Parmetros Fermentativos Hidrolisado Tratado YP/S (g/g) 0,72 QP (g/L.h) 0,57 YP/X (g/g) 6,08 YX/S (g/g) 0,11 (%) 79 Fator de Converso de Substrato em Produto - Mximo Terico = 0,917 g/g

frao hemicelulsica da biomassa vegetal, j se encontra em fase avanada, apresentando resultados promissores. Metodologia Para ser utilizada como substrato na produo de xilitol, a palha de arroz (obtida localmente) foi submetida a um processo de hidrlise cida (H2SO4 1% p/v) sob condies brandas (120 oC, por 30 minutos) visando recuperao de uma frao hemicelulsica contendo xilose como maior constituinte. O hidrolisado obtido foi submetido a um processo de concentrao sob vcuo a uma temperatura de 70 5 oC, com vistas a aumentar a concentrao de xilose, pois esse um dos principais fatores que afetam o rendimento em xilitol por leveduras. Em processos de hidrlise de materiais lignocelulsicos, alm da liberao dos acares, comum ocorrer a formao de compostos provenientes da degradao da glicose, da xilose (hidroximetilfurfural e furfural, respectivamente) ou da lignina (aromticos, fenlicos e aldedos). Tambm comum ocorrer a liberao de substncias provenientes da prpria estrutura lignocelulsica (extrativos e cido actico) ou dos equipamentos de hidrlise (ons ferro, cromo, nquel e cobre). Todos esses compostos atuam como potentes inibidores da ao microbiana, interferindo negativamente no rendimento do processo fermentativo (Palmqvist e Hahn-Hgerdal, 2000). Dessa forma, para tornar o hidrolisado obtido mais susceptvel ao do microrganismo, esse foi tratado com carvo ativo em p, na proporo: 1 grama de carvo : 40 gramas de hidrolisado, nas condies: pH 2,0, agitao 150 rpm, tempo 60 minutos e temperatura 45 C (Mussatto, 2002). Aps a etapa de tratamento, o hidrolisado obtido j pode ser utilizado como meio de fermentao para a produo de xilitol. O microrganismo empregado nesse trabalho foi a levedura Candida guilliermondii (FTI 20037), proveniente da coleo de culturas do Grupo de Processos Fermentativos do Departamento de Biotecnologia da Fa-

bm possa ser utilizada em escala industrial, a Faculdade de Engenharia Qumica de Lorena (Faenquil) vem potencialmente estudando o processo biotecnolgico de produo de xilitol, aproveitando resduos agrcolas e florestais como a palha de arroz (Mussatto, 2002), o bagao de cana-de-acar (Marton, 2002), a palha de trigo (Canilha, 2002), e a madeira de eucalipto (Cannettieri, 2001), que so encontrados facilmente e em grandes quantidades no Brasil. Esses resduos apresentam uma frao hemicelulsica rica em xilose, que pode ser convertida em xilitol, atravs da ao de microrganismos (processo biotecnolgico). O processo biotecnolgico tem-se mostrado, por diversas razes, uma boa alternativa ao processo qumico, pois, alm de dispensar a purificao da xilose, pode utilizar enzimas ou microrganismos especficos que atuam somente na converso de xilose em xilitol, o que leva a um maior rendimento em produto e, conseqentemente facilita a sua separao. Vale a pena destacar que, entre os microrganismos, as leveduras (especialmente as que pertencem ao gnero Candida) tm sido consideradas mais aptas que as bactrias e os fungos para produzir esse edulcorante (Mayerhoff et al., 1996). A Figura 4 apresenta um esquema geral de como ocorre o metabolismo de xilose no processo biotecnolgico de produo de xilitol . A obteno de xilitol por via biotecnolgica est associada capacidade dos microrganismos em sintetizar a enzima xilose redutase (XR). Inicialmente, essa enzima catalisa a reduo de xilose a xilitol com a participao
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dos cofatores NADPH ou NADH (Roseiro et al., 1991). O xilitol, composto relativamente estvel, ou excretado da clula, ou oxidado a xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (XDH), cuja atividade requer os cofatores NAD ou NADP. A fosforilao da D-xilulose a Dxilulose-5-fosfato catalisada pela enzima xilulose quinase e envolve gasto de energia na forma de ATP. A Dxilulose-5-fosfato formada, pode, subseqentemente, ser convertida a piruvato, atravs da conexo da via das

Figura 3. Estrutura qumica do xilitol (Mkinen, 2000)

fosfopentoses (onde gerado o NADH necessrio nas vias biosintticas) com a via Embden - Meyerhof - Parnas (EMP) (Webb e Lee, 1992; Nolleau et al., 1993). O piruvato obtido pode ser descarboxilado e reduzido a etanol, ou pode entrar no ciclo dos cidos tricarboxlicos que, acoplado com a cadeia de transporte de eltrons, regenera NAD+ e ATP. Atualmente o processo biotecnolgico de produo xilitol por leveduras, a partir de hidrolisados oriundos da

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Tabela 3. Fator de Converso de Substrato em Produto (YP/S) e Produtividade Volumtrica em Xilitol (QP), em processos fermentativos a partir de hidrolisado de diferentes matrias-primas Matria-prima Farelo de cevada Sabugo de milho Sabugo de milho Bagao de cana-de-acar Folhas de milho Madeira de eucalipto Madeira de eucalipto Palha de arroz YP/S (g/g) 0,61 0,71 0,52 0,79 0,64 0,63 0,04 0,72 QP (/L.h) 0,33 0,60 0,26 0,52 0,36 0,41 0,02 0,57 Referncia Cruz et al., 2000 Kim et al., 1999 Cruz et al., 2000 Alves et al., 1998 Cruz et al., 2000 Converti et al., 2000 Cruz et al., 2000 No presente trabalho

enquil, selecionada por Barbosa et al. (1988), para produo de xilitol. Inicialmente foi preparado um inculo da levedura cultivada em meio contendo xilose, extrato de farelo de arroz, sulfato de amnio e cloreto de clcio, em frascos incubados a 30 C, em agitador rotatrio a 200 rpm, por

24 horas. Aps esse perodo, as clulas foram separadas e inoculadas no meio de fermentao contendo o hidrolisado de palha de arroz tratado com carvo ativo. A fermentao foi conduzida em frascos Erlenmeyer de 125 mL, contendo 50 mL do meio de fermentao, inoculados com uma con-

centrao celular de 3 g/L, e incubados a 30 C em agitador rotatrio a 200 rpm, durante 116 horas. Durante a fermentao, foram retiradas amostras, periodicamente, para acompanhamento do processo. As concentraes de glicose, xilose, arabinose, xilitol, furfural, hidroximetilfurfural e cido actico foram determinadas por Cromatografia Lquida de Alto Desempenho (HPLC). A determinao dos produtos derivados da lignina foi feita de acordo com a metodologia descrita por Rocha (2000), baseada na leitura de absorbncia em espectrofotmetro em um comprimento de onda de 280 nm. O pH foi determinado por potenciometria em um aparelho com correo de temperatura. Os clculos dos fatores de converso e produtividade do processo fermentativo foram feitos de acordo com Moser (1985). Resultados e Concluses O hidrolisado hemicelulsico de palha de arroz obtido nesse trabalho foi caracterizado fsico-quimicamente, em suas formas original, concentrado e tratado, para determinao dos teores de glicose, xilose, arabinose, furfural, hidroximetilfurfural e cido actico, e absortividade a 280 nm (estimativa dos produtos da degradao da lignina - PDL). Os dados referentes a essas determinaes esto apresentados na Tabela 1. A anlise desta tabela mostra que o processo de hidrlise foi capaz de promover o fracionamento seletivo dos acares presentes na frao hemicelulsica da palha de arroz, libe37

Figura 4. Metabolismo de xilose em leveduras (adaptado de Paraj et al., 1998a)

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Figura 5. Processo fermentativo de produo de xilitol por Candida guilliermondii, em hidrolisado hemicelulsico de palha de arroz: A-) Consumo de Acares (%); B-) Produo de xilitol e Clulas (g/L) durante o decorrer do processo fermentativo rando dentre estes, a xilose, como principal constituinte. Em respeito s concentraes de cido actico, furfural e hidroximetilfurfural, pode-se dizer, com base em dados da literatura, que os teores desses compostos presentes no hidrolisado de palha de arroz concentrado, encontram-se abaixo dos nveis capazes de inibir o metabolismo da levedura Candida guilliermondii. J os compostos provenientes da degradao da lignina (PDL) s se enquadraram nesses nveis aps o tratamento do hidrolisado com carvo ativo, devido remoo parcial ocorrida. Contudo, pode-se afirmar que as propriedades fsico-qumicas desse hidrolisado apresentam caractersticas favorveis sua utilizao no processo de bioconverso de xilose em xilitol. A confirmao disso s pde ser obtida aps a fermentao desse hidrolisado. Na Figura 5, nota-se que o microrganismo foi perfeitamente capaz de produzir xilitol a partir da xilose presente no hidrolisado de palha de arroz, confirmando que esse hidrolisado hemicelulsico pode ser empregado em processos de bioconverso, atingindo resultados satisfatrios. Durante o processo fermentativo, observou-se um consumo simultneo da glicose e da xilose presente no hidrolisado. Entretanto, a glicose por estar em uma concentrao cerca de 6,5 vezes menor, foi totalmente esgotada
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at as primeiras 24 horas do processo, estandoseuconsumorelacionadocom o aumento da concentrao celular. Ao contrrio da glicose, a xilose a fonte de carbono utilizada principalmente para a bioconverso em xilitol. A eficincia desse processo de bioconverso pode ser melhor observada atravs dos valores dos parmetros fermentativos mostrados na Tabela 2. Nota-se nessa tabela que o hidrolisado de palha de arroz mostrou ser um meio perfeitamente favorvel ao do microrganismo, que foi capaz de produzir xilitol com uma elevada eficincia. importante ressaltar que o hidrolisado utilizado nesse trabalho foi empregado como meio de fermentao sem a adio de nutrientes, ou seja, o hidrolisado de palha de arroz foi capaz de promover ao microrganismo todos os compostos necessrios para o seu crescimento e bioconverso. Dentre as matrias-primas normalmente empregadas na produo de xilitol (bagao de cana-de-acar, palha de trigo, madeira de eucalipto, sabugo de milho...) a palha de arroz a nica que tem sido capaz de gerar um hidrolisado com caractersticas nutricionais que suprem a necessidade de suplementao adicional, para que possa ser empregado em processos de bioconverso. Esse fato de extrema importncia pois acarreta uma reduo no custo global do processo. As pesquisas de produo de xili-

tol realizadas at hoje com outras matrias-primas tm apresentado resultados similares ou at inferiores aos obtidos nesse trabalho, contando sempre com um meio de cultivo adicionado de nutrientes. Alguns exemplos de trabalhos de produo de xilitol a partir de outros resduos lignocelulsicos so dados na Tabela 3. Em todos esses casos foram, adicionados nutrientes para que o processo de bioconverso ocorresse com maior eficincia. Com base nos resultados obtidos nesse trabalho, podemos concluir que, alm de contribuir na soluo de possveis problemas ambientais, a utilizao da palha de arroz no processo de bioconverso de xilose em xilitol surge como uma alternativa interessante de produo desse edulcorante, pois apresenta resultados promissores e que podem ser ainda melhorados. Estudos de outras variveis de grande efeito em processos fermentativos, como a transferncia de oxignio em biorreator, por exemplo, esto sendo realizados no Departamento de Biotecnologia da Faenquil, e esperamos, em um futuro prximo, aumentar ainda mais os resultados dessa bioconverso, e estabelecer, de uma forma geral, a melhor tecnologia para produo desse edulcorante, que, cada vez mais, vem apresentando propriedades e efeitos benficos para a sade do homem. Agradecimentos Os autores agradecem FAPESP e ao CNPq pelo apoio financeiro concedido para execuo deste trabalho. Referncias Bibliogrficas ALVES, L.A., FELIPE, M.G.A., SILVA, J.B., SILVA, S.S., PRATA, A.M.R. Pretreatment of Sugar Cane Bagasse Hemicellulose Hydrolysate for Xylitol Production by Candida guilliermondii. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 70-72, p. 89-98, 1998. BARBOSA, M.F.S., MEDEIROS, M.B., MANCILHA, I.M., SCHNEIDER, H., LEE, H. Screening of Yeasts for Production of Xylitol from D-Xylo-

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