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NVEIS ENDGENOS DE AIA, CITOCININAS E ABA EM UMA ORQUDEA ACAULE E UMA BROMLIA SEM 1 RAIZ, DETERMINADOS POR HPLC e ELISA
Lzaro E. P. Peres 2 , Helenice Mercier 3 , Gilberto B. Kerbauy 3 e Gilmar R. Zaffari 4 Laboratrio de Fisiologia Vegetal, Departamento de Botnica, Universidade de So Paulo, C.P. 11461, So Paulo, SP, 05422-970, Brasil.
RESUMO- Campylocentrum burchellii e Tillandsia recurvata tratam-se respectivamente de uma orqudea acaule e de uma bromlia com sistema radicular extremamente reduzido. Os nveis de AIA e citocininas (Cks) verificados nestas duas epfitas levaram proposio de que as mesmas possuem capacidades biossintticas igualmente elevadas desses dois hormnios num nico rgo. O balano AIA/Cks foi favorvel auxina nas razes de Campylocentrum e s Cks no eixo caulinar de Tillandsia. O contedo de ABA em Campylocentrum foi cerca de 12 vezes superior ao verificado em Tillandsia. A correlao observada entre os nveis endgenos de AIA, ABA e Cks e a organognese incomum de Campylocentrum e Tillandsia corroboram os efeitos organogenticos conhecidos pare estas trs classe hormonais. Para a determinao dos niveis endgenos de AIA, ABA, zeatina (Z), zeatina ribosdeo [9R]Z, isopenteniladenina (iP) e isopenteniladenosina [9R]iP, utilizou- se um ELI SA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) com fracionamento prvio dos extratos em HPLC (High Performance Liquid Chromatography). A boa separao dos padres hormonais em HPLC permitiu que, num mesmo extrato, as fraes correspondentes a cada padro fossem recolhidas e quantificadas, sem interferncias, em ELISA. O ELISA indireto empregado possibilitou uma sensibilidade e preciso adequadas s dosagens hormonais de rotina. Termos adicionais pare indexao: cido abscsico, anlise hormonal, auxina e hormnios vegetais.
1 Recebido em 27/10/1997 e aceito em 12/12/1997. 2 Eng. Agr., Bolsista CNPq - USP. Lazaropp@ib.usp.br 3 Bilogo(a), Dr(a)., Depto. de Botnica, IBUSP. Hmercier@usp.br 4 Eng. Agr., MSc., Pesquisador EPAGRI. gzaffari@usp.br

ENDOGENOUS LEVELS OF IAA, CYTOKININS AND ABA IN A SHOOTLESS ORCHID AND A ROOTLESS BROMELIAD DETERMINED BY MEANS OF HPLC AND ELISA
ABSTRACTCampylocentrum burchellii and Tillandsia recurvata are, respectively, a shootless orchid and a bromeliad with an extremely reduced root system. Both, endogenous IAA and Cks levels of these two epiphytic plants provided evidence of their high biosynthetic capacity for these two hormonal classes in a single organ. The IAA/Cks ratio was favorable to auxin in the roots of Campylocentrum and to Cks in the shoots of Tillandsia. The ABA content in Campylocentrum was about 12 times higher than that observed in Tillandsia. The relationship between the endogenous levels of IAA, ABA and Cks of Campylocentrum and Tillandsia pointed out to the known organogenetic effects of these three hormonal classes. After separation of the extracts in HPLC (High Performance Liquid Chromatography) the dosages of IAA, ABA, zeatin (Z), zeatin riboside [9R]Z, isopentenyladenine (iP) and isopentenyladenosine [9R]iP were obtained by using ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). The good separation obtained with the hormonal standards in HPLC enables us to quantify in ELISA, without interference, the hormones found in a same plant extract. The indirect ELISA presented the suitable sensitivity and precision for the routine hormonal dosages. Additional index terms: auxin, abscisic acid, hormonal analysis and plant hormones.

lNTRODUO
Nos vegetais superiores os stios de sntese hormonal no so to estruturalmente definidos e localizados como nos animals (Trewavas, 1981). No obstante, h fortes evidncias de que a auxina,

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hormnio associada iniciao de razes (Wightman et al., 1980), predominantemente produzida nos caules (Davies, 1995) e que, de modo inverso, as citocininas so produzidas principalmente nas razes (Itai & Birnbaum, 1996) estimulando a iniciao de gemas caulinares (Pillary & Railton, 1983). As diferenas na capacidade de biossntese hormonal entre os sistemas caulinar e radicular, associadas ao transporte baspeto das auxinas (Goldsmith, 1977) e ao acrpeto das Cks (Van Staden & Davey, 1979), podem contribuir para um desenvolvimento integrado do vegetal. Sendo assim, um intenso crescimento do sistema radicular implicaria numa elevada produo/transporte de citocininas, estimulando a iniciao de gemas caulinares. Por outro lado, as novas gemas formadas garantiriam o suprimento de auxina necessria iniciao de mais razes. Tambm o cido abscsico tem se mostrado um importante mensageiro quimico entre estas duas regies distintas das plantas (Zhang & Davies, 1989) podendo favorecer o crescimento das razes, em detrimento do sistema caulinar, em condies de estresse hdrico (Saab et al., 1990). H contudo certas orqudeas praticamente acaules e algumas bromlias com sistema radicular rudimentar que no se enquadram, de forma plena, neste contexto de desenvolvimento integrado. Nestas, a sobrevivncia depende em grande extenso da capacidade de realizar simultaneamente as funes de ambos os sistemas, tornando-se assim materiais interessantes para estudos de diferentes aspectos fisiolgicos. O presente trabalho teve como objetivo comparar os nveis hormonais endgenos entre Campylocentrum burchellii, uma orqudea acaule, na qual as razes desempenham as principais funes vitais e Tillandsia recurvata, uma bromlia com sistema radicular extremamente reduzido. Para a determinao dos niveis endgenos de AIA, ABA e quatro citocininas (Cks): zeatina (Z), zeatina ribosdeo [9R]Z, isopenteniladenina (iP) e isopenteniladenosina [9R]iP, desenvolveu-se a dosagem desses hormnios em ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) com fracionamento prvio dos extratos em HPLC (High Performance Liquid Chromatography). As condies de fracionamento das trs classes hormonais em HPLC, bem como a preciso, sensibilidade seletividade alcanadas no desenvolvimento do ELISA tambm foram discutidas.

de vegetao e no jardim do Departamento de Botnica (IBUSP). Reagentes: pare estudar as condies de separao em HPLC e obteno das curves padro em ELISA, utilizaram-se o s padres hormonais cis,trans()-ABA, AIA, iP, [9R]iP, t-Z, t-[9R]Z, (diH)Z (SigmaMR) e cis()-ABA (FlukaMR). Os padres de AIA-metil (AM-Me) e cis()-ABA-metil (ABA-Me) foram sintetizados utilizando-se diazometano etreo, como descrito por Weiler et al. (1981). Os padres e radioativos, 3H-AIA (27 Ci. mmol-1) 3 -1 cis,trans() H-ABA (64 Ci. mmol ), foram adquiridos da AmershamMR. Utilizaram-se anticorpos policlonais anti-AIA, anti-[9R]Z e anti-[9R]iP e anticorpos monoclonais anti-ABA, todos doados gentilmente pelo Dr. Bruno Sotta (Universit P. et M. Curie, Frana). Para revelao do ELISA, utilizaram-se anticorpos anti-IgG de coelho ou anti-IgG camundongo, ambos conjugados com peroxidase de horseradish (SigmaMR). Todos os solventes utilizados na separao cromatogrfica foram grau HPLC Fracionamento dos extratos em HPLC: as amostras foram maceradas com metanol (MeOH) 80% + butil hidroxi tolueno (BHT) 0,18 mM gelado e agitadas durante 60 horas no escuro, sob 4 C. Durante a macerao, adicionaram-se em cada amostra 100 L de uma soluo estoque, contento cerca de 0,5 Ci de 3 HAIA e 0,5 psi de cis,trans()3H-ABA pare o clculo do rendimento de extrao. Cada extrato foi ento passado em filtros de nitrocelulose de 0,45 m e 0,22 m e em cartucho sep-pak C-18 (WatersMR) previamente ativado com MeOH 80%. Secaram-se os filtrados em rotavapor a 45 C e retomou-se em 500 L de gua cida (gua + cido frmico, pH 3,0). Devido s baixas concentraes dos hormnios vegetais, foi necessrio a injeo de todo o extrato retomado (500 L) em HPLC, empregando-se uma coluna preparative (Waters Bondapak C18, 19 mm DI x 300 mm) a qual permite maiores volumes de injeo. Aps separao em HPLC, as fraes correspondentes ao AIA e ABA foram ento liofilizadas e metiladas com 250 pL de diazometano pare permitir uma melhor interao com os anticorpos utilizados no ELISA (Maldiney et al., 1986). O diazometano foi obtido por destilao a 65 C de uma soluo contendo 2,14 g de ptolilsulfonilmetilnitrosarnida ou Diazald MR, 30 mL de ter gelado, 10 mL de etanol 96% e 0,4 g de KOH, conforme descrito por Vogel (1956). Aps metilao, as fraes correspondentes ao AIA e ABA e aquelas correspondentes s Cks foram liofilizadas, retomadas em 2 mL de gua ultrapurificada adicionada de um agente anti bacteriano (NaN3 2,53 mM), sendo, ento, utilizadas nas dosagens em ELISA e no clculo do rendimento de extrao. O rendimento da extrao do

MATERIAL E MTODOS
Materiais vegetais: utilizou- se 1 g de matria fresca de plantas adultas de Tillandsia recurvata (eixo caulinar) e de Campylocentrum burchellii (razes esverdeadas) crescidas, respectivamente, em casa

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FIGURA 1- Separao de trs classes hormonais em HPLC por meio de um gradiente de eluio linear. 1 = t-Z; 2 = (diH)Z; 3 = contaminante de t-Z; 4 = t-[9R]Z; 5 = AIA; 6 = iP; 7 = cis(+)ABA; 8 = [9R]iP. Coluna Bondpak C-18 (19 mm DI x 300 mm), detector: UV: Modelo 486 (Waters). TR= tempo de reteno, Abs = absorbncia. Condies de separao: fluxo 5,00ml.min -1, tempo zero 5% MeOH; 15min 30%MeOH, 30 min 45% MeOH e 45% MeOH e aos 45min 50%MeOH em todos os casos completados para 100% cido frmico pH 3,0. AIA e ABA foi obtido atravs da contagem radioativa (em cintilmetro) das suas fraes correspondentes e o das Cks foi inferido a partir do rendimento obtido com esses dois hormnios, j que padres radioativos no so disponveis comercialmente para as Cks. referncia da curva padro (10 diluies de 0 a 100 pmoles), ora pelo hormnio presente na amostra vegetal. A competio comeou quando foram acrescentados 50 L por orificio do anticorpo correspondente, diludo em tampo PBS + NaN 3 0,253 mM + 0,1 mL.L-1 de Triton 100x. Incubaram-se as places no escuro a 4 C durante 2 horas. Revelao: Aps lavagem e secagem das placas, foram depositados 200 L por orificio de um segundo anticorpo (AC2) ligado enzima peroxidase e diludo em tampo tris-HCl (pH 8,0) + 0,2 rnL. L-1 de Triton 100x. As placas foram incubadas por 1 h a 40 C, sendo, em seguida, lavadas e secas. Depositou-se o volume de 200 L por orificio do substrato ABTS (2, 2 - Azino-bis-(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid)) dissolvido a 0,5 g.L-1 em tampo perborato (pH 4,4). A seguir, as placas foram incubadas por 60 min a 40 C, antes da leitura das densidades pticas (DO) a 405 nm.

Dosagem dos hormnios vegetais em ELISA: o ELISA indireto utilizado compreendeu trs etapas principals: fixao, competio e revelao. Fixao: foram adicionados 200 L do conjugado hormnio-ovoalbumina (OVA) em cada um dos 96 orificios (8 x 12) da placa de imunotitulao. Os conjugados (ABA-OVA, AIA-OVA, [9R]Z-OVA ou [9R]iP-OVA) foram diludos em tampo carbonato/bicarbonato (pH 9,6) + NaN 3 0,253 mM e incubados por 12 h no escuro, a 4 C. Em seguida, removeram-se os conjugados no fixados lavando-se as placas 5 vezes com o detergente Tween 20 a 0,05%. Os conjugados que se ligaram placa foram denominados AgF. Competio: foram adicionados 100 L de antgeno livre ou AgL por orificio, sendo Por meio das DO obtidas calcularam-se as DO esse antgeno constitudo ora pelo hormnio relatives pela expresso: R. Bras. Fisiol. Veg., 9(3):169-176, 1997.

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B/Bo = (B - D)/(Bo - I) B/Bo = DO relative; B = DO na frao dosada; I = DO inespecfica lida em excesso de AgL (100 pmoles); Bo = DO correspondente ausncia de AgL (0 pmoles). As curvas padro foram elaboradas a partir dos valores de B/Bo das diluies do AgL padro. Testes preliminares evidenciaram que a regresso de maior correlao com a curva padro foi a do modelo polinomial de quarto grau. Montou-se uma planilha eletrnica em Microsoft ExcelMR pare os clculos de dosagem. Estes levaram em conta 4 parmetros: 1) os valores obtidos nas dosagens (comparao com a curva padro); 2) o rendimento da purificao dos extratos (obtido atravs do emprego de padres radioativos); 3) a massa inicial do material vegetal e 4) o fator de diluio na ressuspenso das fraes separadas em HPLC.

com Z (Maldiney et al., 1986), fez-se necessria uma boa separao entre esses dois hormnios (picos 1 e 4). De igual modo, os anticorpos desenvolvidos pare [9R]iP reagem com iP (Sotta et al., 1987), estando essas duas formas citocinincas, tambm, suficientemente separadas (picos 6 e 8). A injeo de cada padro de Cks revelou um contaminante no padro de t-Z (pico 3). Considerando-se que o padro de t-Z possua 18% do seu ismero cis, e sendo possvel a separao de ismeros geomtricos de Cks em C18 (Holland et al., 1978; Andersen & Kemp, 1979), provavelmente o contaminante corresponde a c-Z. Os anticorpos desenvolvidos para AIA e ABA podem apresentar reaes cruzadas com algumas de suas respectivas formas conjugadas (Maldiney et al., 1986; Weiler, 1980). Como os conjugados de AIA e ABA apresentam pouca reteno em C-18 (Horgan, 1995), procurou-se condies de separao que levassem a uma maior reteno de suas formas livres (Fig. 1, picos 5 e 7). Desse modo, a boa separao de AIA, ABA, Z, [9R]Z, iP, e [9R]iP em HPLC permitiu que, em cada extrato, suas fraes correspondentes

RESULTADOS E DlSCUSSO
Fracionamento dos extratos em HPLC Observa-se (Fig. 1) que os padres de Cks do tipo Z apresentaram tempos de reteno (TRs) relativamente baixos (picos 1, 2 e 4) quando comparados com os TRs das Cks do tipo iP (picos 6 e 8). Esta pouca interao com a fase estacionria apolar (C-18), deve-se, provavelmente presena de OH nas Cks do tipo Z. Como os anticorpos desenvolvidos pare [9R]Z possuem reao cruzada

FIGURA 2- Percentuais de radioatividade, correspondente ao AIA e ao ABA, recuperados aps extrao e fracionamento de um extrato vegetal em HPLC. Alquotas de 0,05 psi de 3H-AIA e 3H-ABA foram adicionadas no incio da extrao. O percentual de radioatividade foi calculado com relao quantidade inicialmente adicionada. As condies de separao em HPLC foram iguais s descritas na figuraa 1. TR = tempo de reteno.

FIGURA 3- Resumo das etapas do ELISA indireto utilizado nas dosagens. A) = amostra com grande quantidade de hormnios; B) = amostra com pequena quantidade de hormnios; 1 = fixao do conjugado (AgF); 2 = competio do AgF e do antgeno livre (AgL) pelo primeiro anticorpo (AC1); 3 = lavagem do AC1 que no se ligou ao AgF; 4 = deposio do segundo anticorpo (AC2) ligado enzima (peroxidase); 5 = adio de substrato (ABTS) e reao enzimtica. Baixa DO na etapa 5 (poucos retangulos escuros) indica pequena quantidade do complexo AC2-peroxidase ligado place atravs do complexo AC1-AgF e, conseqentemente, grande quantidade inicial de hormnios vegetais ou AgL na amostra (etapa 2 de A). De modo inverso, alta DO indica pequena quantidade de hormnios vegetais presentes inicialmente na amostra (etapa 2 de B). Entre as etapas 1 e 2 e as etapas 4 e 5 a placa foi lavada, como tambm ocorreu na etapa 3, para retirada de material no adsorvido a ela.

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FIGURA 4- Curvas padres pare Z e [9R]Z (A); iP e [9R]iP (B); ()cis,trans ABA-Me e (+)cis ABA-Me (C) e AIA-Me (D). As curvas de correlao entre a densidade ptica relativa (% B/Bo) e a concentrao dos hormnios (em Log. de fmoles) foram ajustadas segundo as seguintes equaes de regresso: Z [9R]Z iP [9R]iP ()cis,trans-ABA-Me (+)cis-ABA-Me AIA-Me y = 100,49 - 1,09 x + 0,90 x2 - 2,71x3 + 0,35 x4 y = 99,86 + 7,62 x - 15,05 x2 + 1,75 x3 + O,03 x4 y = 100,14 - 7,82x + 6,23 x2 - 4,86 x3 + 0,63 x4 y = 98,65 + 18,10 x - 22,77x2+ 3,53 x3 - 0,09 x4 y = 98,05+12,85 x - 3,18 x2 - 4,66 x3 + 0,81 x4 y = 95,93 + 39,37 x - 28,72 x2 + 1,94 x3 + 0,30 x4 y = 99,72 - 7,69x + 7,81x 2 - 5,35x3 + 0,66x4 O ELISA desenvolvido para dosagem de AIA, ABA e quatro citocininas foi do tipo indireto. No ELISA indireto, h uma competio entre dois tipos de antgenos (AgF e AgL) por uma quantidade limitada de anticorpos (ACT) e o emprego de um segundo anticorpo (AC2) pare revelao da competio (Fig. 3). Nesse tipo de ensaio verifica-se uma correlao inversa entre a concentrao de hormnios presente na amostra ou nas diluies padro e a DO relativa (Fig. 4). Os valores de sensibilidade, preciso e seletividade dos ensaios implementados esto resumidos na tabela 1. Quanto sensibilidade, os resultados aqui apresentados esto dentro da faixa de valores j

fossem recolhidas e quantificadas em ELISA. No radiograma (Fig. 2) o rendimento de extrao do AIA (28,58%) foi menor que o do ABA (60,81%). Tal caracterstica foi uma constante em nossas condies, confirmando a alta degradao das auxinas nos processos de extrao (Durley et al., 1982). Alm disso, os TRs dos padres radioativos tambm confirmaram os TRs do AIA e do ABA, previamente apresentados na figura 1, sendo utilizados pare o monitoramento das condies de separao de cada extrato. Dosagem de trs classes hormonais em ELISA

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conseguida por outros autores na implementao de dosagens por RIA (Radio Immuno Assay) e/ou ELISA (Caruso et al., 1995), podendo ser adequados, conforme o caso, para dosagens em extratos de at 0,1 g de matria fresca. Em todas as curvas padro apresentadas na figuras 4, observou-se que os valores das quatro repeties, para cada ponto de diluio, esto relativamente prximos. Essa preciso, adequada s dosagens hormonais de rotina, evidenciada pelos valores de coeficiente de variao (CV %) apresentados na tabela 1. TABELA 1- Sensibilidade (pmol), preciso e seletividade do ELISA utilizado para a quantificao de AIA, ABA e quatro citocininas. A seletividade foi expressa atravs da porcentagem de reao cruzada. A preciso foi expressa pelo coeficiente de variao (CV, %), n= 4. Hormnios [9R]Z Z [9R]iP iP pmol 0,01 0,01 0,02 0,02 CV 12,4 10,0 10,0 10,7 9,8 5,0 13,8 Reao Cruzada (%)
anti-[9R]Z anti-[9R]iP anti-ABA

limites de deteco do AIA-Me e do cis(+)ABA-Me (Tab. 1, sensibilidade) e por isso no foram considerados no clculo final dos nveis endgenos destes hormnios nos tecidos vegetais. A metodologia empregada neste trabalho, alm de sensvel e precisa, permitiu um estudo quantitativo de trs classes hormonais num mesmo extrato. Esta caracterstica foi relevante pois muitos processos fisiolgicos so resultantes da interao entre diferentes classes hormonais e no da ao de uma s delas (Brenner et al., 1981). Entre esses processos so includos os organogenticos, como a formao de gemas caulinares e/ou de raizes, os quais esto associados a duas classes hormonais (auxinas e Cks) numa interao quantitativa (Skoog & Miller, 1957). O estudo do papel dos hormnios vegetais atravs aplicao dos mesmos nos tecidos das plantas est sujeito a limitaes tais como a falta de conhecimento (controle) quanto a absoro, transporte e metabolismo do hormnio aplicado e das alteraes que o mesmo pode provocar no nvel hormonal endgeno (Label et al., 1989; Etienne et al., 1993). A tcnica de dosagem desenvolvida neste trabalho poder ser utilizada na complementao de tais estudos atravs do conhecimento do contedo hormonal endgeno envolvido em cada processo fisiolgico. Nveis hormonais endgenos em Campylocentrum burchellii e Tillandsia recurvata. Apesar de Campylocentrum burchellii e Tillandsia recurvata apresentarem uma organognese inversa, com formao predominante de folhas em Tillandsia e de razes em Campylocentrum, observou-se que ambos materiais possuem as trs classes hormonais (Tab. 2). Pouca diferena foi verificada quanto ao contedo total das Cks dosadas entre as duas espcies, salvo o fato de Campylocentrum burchellii apresentar Cks, predominantemente, do tipo iP e Tillandsia recurvata do tipo Z. No obstante, Campylocentrum apresentou uma concentrao de AIA cerca de duas vezes superior ao de Tillandsia. Esses resultados conduziram a um balano AIA/Cks favorvel a AIA em Campylocentrum e favorvel s Cks em Tillandsia. As diferenas na proporo AIA/Cks so interessantes, sobretudo ao considerar que este balano fator determinante na formao de razes ou de gemas caulinares, conforme mostrado por Skoog & Miller (1957). O contedo de ABA em Campylocentrum burchellii foi cerca de 12 vezes superior ao verificado em Tillandsia recurvata (Tabela 2), concordando com a sugesto de que este hormnio seria indispensvel para o crescimento de razes sob estresse hdrico

100,0 18,7 -

100,0 32,7 -

100,0 49,7 -

c(+)ABA-Me 0,02 c,t()ABA-MEAIA-Me 0,20

Os valores de reao cruzada (tabela 1) em conjunto com as figuras 4A e B, observe-se que, na faixa linear das respectivas curvas de dosagem, a quantidade de hormnios necessria pare se ligar a 50% dos anticorpos (porcentagem de B/Bo = 50%) para as formas ribosdicas de Cks, [9R]Z e [9R]iP, foi menor que a necessria para as formas no ribosdicas (Z e iP). Estes resultados confirmam a alta especificidade (Tab. 1, maior % de reao cruzada) dos anticorpos pelas formas ribosdicas, para os quais foram desenvolvidos (Maldiney et al., 1986 e Sotta et al., 1987). Do mesmo modo, quanto ao anticorpo desenvolvido para o (+)cisABA-Me, observe-se que a quantidade de (+)cisABA-Me necessria pare se ligar a 50% desses anticorpos foi bem menor que a quantidade necessria pare se ligar ao padro contendo (+)cis,trans-ABA-Me (Fig. 4C), o qual possui menor reao cruzada (Tab. 1). Aps o fracionamento em HPLC, a metilao e a diluio das fraes, os padres de 3H-AIA e 3H-ABA, adicionados no comeo da extrao, resultaram em aproximadamente 0,09 pmoles de 3H-AIA-Me e 0,01 pmoles de cis(+)-3H-ABAMe por alquota de 100 pL utilizada no ELISA. Estes valores esto fora dos

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(Sharp et al., 1994) favorecendo o desenvolvimento das mesmas em detrimento do sistema caulinar (Saab et al., 1990). conhecido que a falta de gua representa condio comum nos locais onde as razes de orqudeas epfitas normalmente se fixam (Benzing, 1996). TABELA 2- Nveis endgenos de seis hormnios presentes em plantas de Campylocentrum burchellii e Tillandsia recurvata. O valves correspondem mdia + o erro padro (n = 4). Cks = Z +[9R]Z + iP + [9R]iP. Hormnios Z [9R]Z iP [9R]iP AIA ABA CKs AIA/CKs Dosagens (moles.kg. MF-1) Campylocentrum 2,48 0,12 2,10 0,20 10,55 0,44 13,46 1,76 52,50 4,14 231,75 5,00 28,59 1,84 Tillandsia 9,88 0,39 10,89 1,02 5,18 0,47 5,76 0,11 26,53 2,10 18,07 1,99 31,72 0,82

de inibir a iniciao de razes, estimulariam a formao de novas gemas caulinares, as quais continuariam o processo, produzindo mais Cks. De modo anlogo, plantas expressando os genes de produo de auxinas de A. tumefaciens ( iaaM e iaaH) possuem inibio da iniciao de gemas caulinares e ampla iniciao de raIzes (Klee et al., 1987). No entanto, neste ltimo exemplo, no foi possvel encontrar um maior desenvolvimento do sistema radicular em detrimento do caulinar, j que o teor de auxina produzido inibiu o crescimento das novas raizes formadas (Klee et al., 1987). Os resultados aqui apresentados, tomados como um todo, corroboram a hiptese de que nos vegetais, ao contrrio dos animais, no existem rgos especializados para biossntese hormonal, embora possam existir diferenas na capacidade biossinttica Tillandsia recurvata e de cada rgo. Campylocentrum burchellii , espcies que no possuem um crescimento proporcional entre raizes e caules, parecem possuir capacidade biossinttica de auxina e citocininas igualmente elevadas num nico rgo.

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Bruno Sotta pela doao dos anticorpos Embora o sistema caulinar tenha sido considerado, utilizados no ELISA, bem como ao Conselho de por um bom tempo, como o principal centro produtor Desenvolvimento Cientifico e Tecnolgico (CNPq) e a de AIA, j se evidenciou a biossntese desse Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So hormnio em razes isoladas (Feldman, 1980 e Ribaut Paulo (FAPESP) pelo suporte financeiro. et al., 1993). De igual modo, a biossntese de Cks tambm pode se dar tanto nos caules quanto nas REFERNCIAS razes (Chen & Petschow, 1978). Os resultados ora apresentados sugerem que as razes de ANDERSEN, R. A. & KEMP, T. R . Reversed-phase highCampylocentrum burchellii, alm de sintetizarem Cks, performance liquid chromatography of several plant possuem uma capacidade biossinttica de AIA cell division factors (cytokinins) and their cis and relativamente elevada. No entanto, como as bans isomers. Journal of Chromatography, dosagens no foram realizadas em plantas crescidas 172:509-512, 1979. sob condies asspticas, uma eventual biossntese BENZING, D. H. Aerial roots and their environments. In: de AIA por microorganismos no pde ser descartada WAISER,Y; ESHEL, A. & KAFKAFI, U. (Ed). Plant (Normanly et al., 1995). Quanto Tillandsia, seu eixo roots the hidden half. New York, Marcel Dekker, caulinar parece ser capaz de sintetizar auxina, teem 1996. p. 875 - 894. como produzir Cks em quantidades equivalentes a BRENNER, M. L. Modern methods for plant growth aquelas encontradas nas dosagens do sistema substance analysis. Annual Review of Plant radicular de Campylocentrum burchellii. Physiology, 32:511 - 538, 1981. Vegetais com capacidade biossinttica CARUSO, J. L.; PENCE, V. C. & LEVERONE, L. A. Immunoassay methods of plant hormone analysis. relativamente elevada de Cks nos caules e de auxinas In: DAVIES, P. J. (Ed). Plant hormones: nas raIzes podem apresentar um crescimento physiology, biochemistry and molecular biology. desproporcional entre estas duas partes, j que cada Dorderecht, Kluwer Acad. Publi., 1995. p. 433 - 447. uma delas estaria produzindo a classe hormonal estimulatria de sua formao. A exemplo disto, CHEN, C.M. & PETSCHOW, B. Cytokinin biosyntheis in cultured rootles tobacco plants. Plant Physiology, plantas transgnicas de tabaco com alta produo de 62: 861-865, 1978. Cks no caule, devido expresso do gene ipt de Agrobacterium tumefaciens, possuem considervel DAVIES, P.J. The plant hormones: their nature, occurrence, and functions. In: DAVIES, P. J. (Ed.) formao de gemas caulinares e pouca ou nenhuma Plant hormones: physiology, biochemistry and formao de razes (Medford et al., 1989). Nestas plantas as Cks produzidas no sistema caulinar, alm R. Bras. Fisiol. Veg., 9(3):169-176, 1997.

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