Micropropagao de Zantedeschia elliottiana, cv.

Black Magic*

Laura Becker1, M. Jos Vieira Rothen1, M. Lcia Lima1, Ivan Moraes de Abreu1, Antonio Fernando Caetano Tombolato1, Jaime Ramos Motos2.
1

Instituto Agronmico de Campinas IAC, Centro de Horticultura, Cx. Postal 28, 13001-970, Campinas (SP).

Flortec Consultoria e Treinamento, Cx. Postal 80, 13825-000, Holambra (SP).

RESUMO:

Um dos maiores problemas da multiplicao convencional do copo-de-leite atravs de rizomas a contaminao endgena, a viabilidade da micropropagao consiste da eliminao destes contaminantes por meio da escolha da metodologia de desinfeco e do explante a ser utilizado na inoculao. Por isso este trabalho teve como objetivo testar uma metodologia alternativa, e eficiente de micropropagao do Zantedeschia elliottiana cv. Black Magic, com custos reduzidos, visando o estabelecimento in vitro da cultura, livre de contaminantes, proporcionando assim uma produo de mudas com padro comercial. Obteve-se a melhor desinfeco das gemas quando foram pr-tratadas com uma soluo de Dithane M 45 (5 g. L-1) durante 24 h. Depois foram lavadas 3 vezes em gua esterilizada destilada e deionizada, e logo aps foram desinfestadas em lcool 70 % por 5 minutos, em soluo de hipoclorito de sdio 2 %, com 3 gotas de Tween 20, por 5 minutos e lavadas novamente, segundo Kritzinger et al. (1998). Ento as gemas foram dissecadas at obter-se o meristema com apenas 1 primrdio foliar. O estmulo brotao foi dado pela adio de 30 mg.L-1 de BAP ao meio MS, segundo Cohen (1981). Depois de 5 repicagens, a cada 30 dias, as plntulas melhor enraizaram no meio MS semi-slido. A melhor aclimatizao ocorreu aos 30 dias sob condies controladas, ficando a temperatura diurna mdia do ar em torno de 27 C, noturna de 20 C e umidade relativa do ar mdia em geral de 80%. Depois deste perodo as mudas aclimatizadas foram transplantadas para vasos maiores por mais 4 meses. Ao final deste perodo as plantas j apresentavam rizomas com at 3 cm de dimetro.1
1 Projeto desenvolvido IAC/Centro de Horticultura (Instituto Agronmico de Campinas) com apoio do CNPq/RHAE (Programa de Capacitao de Recursos Humanos para o Desenvolvimento Tecnolgico) e Flortec Consultoria e Treinamento.

1. INTRODUO:

O gnero Zantedeschia pertencente famlia Araceae, caracterizada por inflorescncia composta de uma espdice (um suporte central para as flores individuais) que esta subtendida a uma brctea simples vistosa conhecida como espata. Zantedeschia apenas um gnero da tribo Zantedeschieae, pertencente a subfamlia Philodendroideae, junto com Dieffenbachia, Aglaonema e Philodendron entre outras (Corr, 1993). O gnero era conhecido anteriormente como Calla e Richardia. Atualmente ele conhecido internacionalmente como Calla Lily. No Brasil, chamada de copo-de-leite colorido. Em reviso mais recente Letty (1973) apresentou 6 espcies botnicas para o gnero : Z. aethiopica (calla branca), Z. rehmannii (calla rosa), Z. jucunda, Z. elliottiana (calla amarela), Z. pentlandii, e Z. albomaculata (com pontuaes) e muitos hbridos. O gnero Zantedeschia nativo de reas do centro-sul da frica, que so sujeitas a secas peridicas (Letty, 1973). Um rizoma espesso a estrutura que sobrevive este perodo seco. Estes rizomas tm tipicamente numerosas gemas que se desenvolvem quando a gua adequada torna-se disponvel. As Zantedeschia so susceptveis a vrias doenas, mas poucas causam danos srios. O fungo Phytophthora erythroseptica tem causado uma doena foliar em Z. rehmannii e Z. elliottiana, caracterizada pela clorose geral das folhas, perda de turgescncia, e uma tendncia para encrespar a borda da folha para cima. O pecolo torna-se descolorido, ento mole com um apodrecimento inodoro. Uma raa diferente desse patgeno causa tambm podrido em rizomas de Z. aethiopica (Tompkins e Tucker 1950). A mais grave doena causada pela Erwinia carotovora, que conhecida como podrido mole. E no existe ainda controle qumico eficiente para essas doenas de solo (Corr, 1993). A Erwinia causa severas perdas, particularmente, durante a propagao vegetativa. Cohen (1981) cita que a contaminao interna dos rizomas o maior problema. Para reduzir esta doena bacteriana, a propagao do copo-de-leite pode ser por cultura de tecidos (Ruiz-Sifre, Rosa-Mrquez e Flores-Ortega, 1996). Como um dos maiores problemas da multiplicao convencional do copo-deleite atravs de rizomas a contaminao endgena, a viabilidade da micropropagao

consiste da eliminao destes contaminantes por meio da escolha da metodologia de desinfeco e do explante a ser utilizado na inoculao. A disponibilidade de rizomas sadios como fonte de explante dificulta o estabelecimento de material livre de contaminantes in vitro. Os mtodos de desinfestao pelo NaOCl (Cohen, 1981; Ruiz-Sifre, Rosa-Mrquez e Flores-Ortega, 1996) no apresentaram sucesso, desde que o rizoma drasticamente danificado durante a longa exposio ao agente descontaminante. Um mtodo no qual e os rizomas foram pr-tratados com calor e fungicidas, seguido de um tratamento com lcool/NaOCl tambm no foi suficiente para livrar o material vegetal dos contaminantes (De Bruyn at al., 1992, segundo Corr, 1993). O pr-tratamento de seces de rizomas infectados com os antibiticos ABM1, contendo 10.000 unidades de penicilina, 10mg. mL-1 de estreptomicina, 25 g. mL-1 de anfotericina B e 0,9 % de cloreto de sdio (Sigma, n de catlogo A9909) e Imipenem mostraram-se eficientes, apresentando uma desinfeco total dos rizomas, segundo Kritzinger et al. (1998). O meio de cultura para a multiplicao do copo-de-leite j foi bem estudado pelos autores Cohen (1981) e Ruiz-Sifre, Rosa-Mrquez e Flores-Ortega (1996), e definido como sendo o MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescido de 3 mg.L-1 de BA; 30 g.L-1 de sacarose; 4,5 g.L-1 de agar e o pH ajustado para 5,7 antes da autoclavagem. O pr-tratamento proposto por Kritzinger et al. (1998) foi eficiente utilizando uma associao de quatro antibiticos; no entanto, de difcil aquisio devido ao preo e tambm pela demora na importao. Por isso este trabalho teve como objetivo testar uma metodologia alternativa, e eficiente de micropropagao do copo-de-leite colorido, com custos reduzidos, visando o estabelecimento in vitro da cultura, livre de contaminantes, proporcionando assim uma produo de mudas com padro comercial.

2. MATERIAL E MTODOS:

Os rizomas de Z. elliottiana cv. Black Magic utilizados para a extrao dos explantes (gemas), foram provenientes do municpio de Andradas MG, do produtor de copo-de-leite Sr. Andr Boersen.

Para selecionar o explante a ser utilizado na micropropagao do copo-de-leite iniciou-se primariamente a partir dos rizomas, os quais foram lavados delicadamente com detergente comercial e enxaguados em gua corrente, depois foram submetidos a um prtratamento, sendo ento imersos em uma soluo de hipoclorito de sdio a 1%, por 15 minutos, enxaguados novamente com gua destilada e mantidos em placas de Petri sobre papel de filtro umedecido, at ocorrer o desenvolvimento das gemas (Foto 1). Foram realizados vrios testes de pr-tratamentos utilizando fungicida e vrios antibiticos, gemas e meristemas apicais, como explantes (Foto 2), visando limpeza e a rpida propagao clonal. Com os brotos extrados dos rizomas foram realizados os seguintes testes de esterilizao superficial: Tratamento 1: As gemas foram mergulhadas em etanol 95% por 1 minuto e flambado duas vezes. O procedimento de desinfestao superficial foi repetido duas vezes durante a dessecao das gemas do rizoma, segundo Ruiz-Sifre, Rosa-Mrquez e Flores-Ortega (1996); Tratamento 2: As gemas foram pr-tratadas com uma soluo de Dithane M 45 (5 g. L-1) durante 24 h. As gemas foram ento lavadas 3 vezes em gua esterilizada destilada e deionizada, e logo depois foram desinfestadas em lcool 70 % por 5 minutos e em soluo de hipoclorito de sdio 2 %, com 3 gotas de Tween 20, por 5 minutos. Ento foram lavadas 3 vezes em gua estril destilada e deionizada, segundo Kritzinger et al. (1998). Tratamento 3: As gemas foram pr-tratadas como no tratamento 2, e depois de lavadas 3 vezes em gua esterilizada destilada e deionizada continuou-se o pr-tratamento com a imerso das gemas em soluo dos antibiticos Cloranfenicol (5 mg. L-1) e Oxitetraciclina (5 mg. L-1) durante 24h. Depois foram desinfestadas seguindo a mesma metodologia do tratamento 2; Tratamento 4: As gemas tambm a mesma metodologia do tratamento 2 e depois de lavadas continuou-se o pr-tratamento com a imerso destas gemas em soluo com os antibiticos ABM1 (5 l. mL-1) e Imipenem (5 mg. L-1) durante 24h. Depois foram desinfestadas seguindo a mesma metodologia do tratamento 2, segundo Kritzinger et al. (1998);

Tratamento 5: As gemas foram tratadas de acordo com a metodologia utilizada no tratamento 4, sendo que foi aumentado o tempo de imerso na soluo com antibiticos para 36h;

Tratamento 6: As gemas foram pr-tratadas seguindo exatamente a mesma metodologia do tratamento 2, ento as gemas foram dissecadas at obter-se o meristema com apenas 1 primrdio foliar.

Foto 1: Rizoma de calla com brotaes.

Foto 2: Gema de calla com 1 ms.

Depois de cada tratamento, os explantes (gemas dos cinco primeiros tratamentos, e meristema do 6 tratamento) foram inoculados em meio bsico inicial MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescido de 3 mg.L-1 de BAP; 30 g.L-1 de sacarose; 4,5 g.L-1 de agar e pH 5,7; segundo Cohen (1981). Os frascos contendo os explantes foram colocados em cmara clara, com 1500 lux e temperatura de 25 C +/- 1C, durante uma semana e avaliados visualmente quanto contaminao. Os explantes sem contaminao foram mantidos na mesma cmara clara anterior. Aps trs meses as brotaes foram repicadas para meio MS acrescido de 30 g.L-1 de sacarose; 4,5 g.L-1 de agar e pH 5,7; mas sem regulador de crescimento. Depois de 5 repicagens, a cada 30 dias, as plntulas foram repicadas para meio de enraizamento. Para o

enraizamento foi realizado teste para definir o melhor meio de cultura, que consistiu dos seguintes tratamentos: E1: Meio MS lquido acrescido de 30 g. L-1 de sacarose e pH 5,7. E2: Meio MS semi-slido acrescido de 30 g. L-1 de sacarose; 4,5 g.L-1 de agar e pH 5,7. E3: Meio MS semi-slido acrescido de 30 g. L-1 de sacarose; 4,5 g.L-1 de agar e pH 5,7. Nesse teste de enraizamento a avaliao foi realizada visualmente. A aclimatizao foi realizada durante 30 dias em duas casas de vegetao em condies ambientais diferenciadas. Na estufa 1 as condies ambientais foram controladas ficando a temperatura diurna mdia do ar em torno de 27 C, noturna de 20 C e umidade relativa do ar mdia em geral de 80%; enquanto na estufa 2 as condies ambientais no foram controladas por isso apresentou picos de temperatura diurna de 37 C e umidade relativa do ar de 48 %, temperatura noturna mnima de 15 C, e umidade relativa do ar de 90 %. Sendo que, todas mudas (os trs tratamentos de enraizamento), tanto da estufa 1 como da 2, foram plantadas em bandejas com 48 alvolos em substrato comercial de granulometria fina, propcio a sementeiras.

3. RESULTADOS E DISCUSSO:

Aps uma semana de cultivo, os explantes dos tratamentos T.1, T.2, T.3 e T.4 apresentaram 100 % de contaminao, contendo fungo ou bactria ou os dois juntos. O teste de descontaminao s mostrou-se efetivo nos tratamento 5 e 6, com 100% de descontaminao. Os resultados obtidos no tratamento 5 foram os mesmos encontrados por Kritzinger et al. (1998). Entretanto, as gemas no se desenvolveram, depois de 30 dias necrosaram e morreram. Uma explicao plausvel para esse resultado negativo deve ter sido devido ao tempo de imerso (36h) na soluo pr-tratamento com antibiticos, sem a utilizao de um agitador mecnico. A agitao facilita a oxigenao, sem ela os tecidos vegetais intoxicam-se e morrem.

Inicialmente a regenerao das plntulas a partir dos meristemas (tratamento 6) foi lenta, provavelmente devido ao tamanho do explante inicial. Quanto menor o explante (meristemas com 1 a 2 primrdios foliares, sem vascularizao ainda, segundo Torres; Teixeira e Pozzer, 1998) maior a probabilidade da extrao sem contaminao. Que no caso da calla mostrou-se vivel, pois esta espcie no apresenta oxidao dos tecidos vegetais na extrao e cultivo in vitro. De fato aps 3 meses o desenvolvimento de mltiplas brotaes foi rpido (Foto 3), mesmo sendo feito 5 repicagens em meio MS sem adio de reguladores de crescimento. Estes resultados foram semelhantes aos obtidos por Ruiz-Sifre, Rosa-Mrquez e Flores-Ortega (1996). As plntulas do tratamento E1 do teste de enraizamento no enraizaram. Enquanto o enraizamento dos tratamentos E2 e E3 foi de 100 % aos 30 dias com razes principais longas, contendo razes secundrias tambm. Um meio de cultura estruturado, gelatinizado, parece ser melhor para o desenvolvimento de razes da Z. elliottiana. Durante a aclimatizao as mudas dos tratamentos E2 e E3, do ensaio de enraizamento, apresentaram ndice de sobrevivncia semelhante, em torno de 95 %; mas o desenvolvimento das plantas foi considerado melhor na estufa 1 (Foto 4), devido ao menor nmero de folhas iniciais com clorose e necrose nas duas primeiras semanas. Com 30 dias as plantas das duas estufas j tinham seu desenvolvimento normal, com a emisso de novas folhas. Depois deste perodo as mudas j aclimatizadas foram transplantadas para vasos maiores usando-se o mesmo substrato e todas permaneceram na estufa 2 por mais 4 meses (Foto 5). Ao final deste perodo as plantas j apresentavam rizomas com at 3 cm de dimetro.

Foto 3: Mltiplas brotaes do copode-leite.

Foto 4: Aclimatizao de mudas de copo-de-leite na estufa 1.

Foto 5: Mudas de copo-de-leite aclimatizadas em potes maiores.

Referncias bibliogrficas:

COHEN, D. Micropropagation of Zantedeschia hybrids. Comb. Proc. Intl. Plant Pro. Soc., 31: 312-316. 1981. CORR, B. E. Zantedeschia research in The United States: past, present and future. Acta Horticulturae, 337: 117-188. KNEIFEL, W. e LEONHARDT, W. Testing of different antibiotics against Gram-positive and Gram-negative bacteria isolated from plant tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 29: 139-144, 1992. KRITZINGER, E. M; VUUREN, R. J. V.; WOODWARD, B.; RONG, I. H.; SPREETH, M. H. e SLABBERT, M. M. Elimination of external and internal contaminants in rhizomes of Zantedeschia aethiopica with commercial fungicides and antibiotics. Plant Cell, Tissue and Organ Culture .52:61-65, 1998. LETTY, C. The genus Zantedeschia. Bothalia, v. 11, n. 1 e 2: 5-26. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. v. 15, p. 473-497, 1962.

RUIZ-SIFRE, G.; ROSA-MRQUEZ, E. e FLORES-ORTEGA, C. Zantedeschia aethiopica propagation by tissue culture. J. Agric. Univ. Puerto Rico, 80(3): 193-194, 1996. TOMPKINS, C. M.; TUCKER, C. M. Leaf blight of pink calla caused by Phytophthora erythroseptica. Phytopathology, 37: 382-389. 1950. TORRES, A. C.; TEIXEIRA, S. L. e POZZER, L. Cultura de pices caulinares e recuperao de plantas livres de vrus. In: Cultura de tecidos e transformao gentica de plantas. V. 1. Embrapa SPI / Embrapa CNPH, Braslia, 1998.