Extrato da planta Hypericum brasiliense neutraliza alguns efeitos biolgicos de Bothrops jararaca.

Tratamentos alternativos para picada de cobra atualmente esto sendo amplamente estudadas, e metablitos so considerados bons candidatos para este efeito. Aqui, a capacidade de um extrato etanlico bruto da planta Hypericum brasiliense em neutralizar Bothrops jararaca foi investigada pelo mtodo in vitro (hemlise de coagulao, ou protelise) e in vivo (letalidade, hemorragia e edema) ensaios biolgicos. Ns descrevemos pela primeira vez a capacidade de H. brasiliense extrai para inibir a alguns efeitos farmacolgicos de um veneno de cobra brasileira. Os ensaios de inibio foram realizados por incubao B. jararaca com extratos H. brasiliense por 30min temperatura ambiente antes de os ensaios foram realizados. Os resultados mostraram que H. brasiliense extrai letalidade prejudicada, edema, hemorragia, hemlise, a protelise, bem como o fibrinognio ou de plasma induzida por coagulao por B. jararaca. Isso indica que os extratos de H. brasiliense pode fornecer agentes promissores para o tratamento de envenenamento B. jararaca. INTRODUO Picadas de cobras representam um grande risco de sade em muitos pases, com a incidncia global de acidentes ofdicos superiores a 5.000.000 por ano (Kasturiratne et al, 2010). Este problema mais profundo nos pases em desenvolvimento, em particular nas reas onde o acesso a servios mdicos e ao tratamento antiofdico um desafio (Pierini et al, 1996). No Brasil, o gnero Bothrops responsvel por 90% dos acidentes registrados, com espcies Bothrops jararaca representam quase 95% desses acidentes. As vtimas apresentam sintomas locais (dor, edema, danos no tecido, mionecrose, e equimoses) e sistmica (hemorragia, incoagulabilidade sangue, nefrotoxicidade). Os venenos de serpentes interferem com o sistema hemosttico, interagindo com fatores de coagulao sangunea e agregao plaquetria levando a sangramento persistente em vtimas (Clemetson et al, 2007). Em muitas partes do mundo, o tratamento regular para acidentes de veneno de serpentes soroterapia, que envolve a administrao parenteral de soro antiofdico (anti-venenos). Esta terapia eficiente neutraliza os efeitos sistmicos txicos, evitando a morte das vtimas. No entanto, antivenenos tm algumas desvantagens, limitando assim a sua utilizao eficiente (Chippaux e Goyffon, 1998; Heard et al, 1999; da Silva et ai, 2007): Por exemplo, eles podem induzir reaes adversas que variam de sintomas suaves para grave (anafilaxia) e, alm disso, eles no neutralizam o dano tecidual local (Gutierrez et al, 2009). Assim, teraputicas complementares precisam ser investigadas, com plantas que esto sendo considerados como uma fonte principal (Soares et al, 2007). Em muitos pases, extratos de plantas tm sido utilizados tradicionalmente para o tratamento de envenenamento (Mors et al, 2000). Os mecanismos exatos da ao dos extratos de plantas permanecem em grande parte ilusria, no entanto, um nmero de relatrios anteriores indica que os compostos derivados de plantas, tais como cido rosmarnico (Ticli et al, 2005; Aung et al, 2010), a quercetina (Nishijima et al , 2009) e glicirrizina (Assafim et al, 2006) pode inibir as atividades biolgicas dos alguns venenos de cobra in vivo e in vitro, incluindo B. jararaca. H. brasiliense (tambm chamado H. laxiusculum; Brando et al, 2009) um arbusto anual conhecida na medicina popular brasileira como "mil facadas" ou "bravo alecrim". Seus extratos tm sido mostrados para exibir propriedades anti-inflamatrias (Perazzo et al, 2008a) e antibacteriano (Rocha et al, 1995; 1996; Frana et al, 2009), a atividade antidepressiva (Perazzo et al, 2008b), os efeitos sobre sistema

nervoso central (Mendes et al, 2002), e proteo de camundongos contra a letalidade de B. jararaca (Rocha et al, 1991). O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade do extrato de H. brasiliense para inibir o edema, letalidade, hemorragia, hemlise, coagulao e protelise induzida pelo veneno da cobra B. jararaca. MATERIAIS Fibrinognio bovino e azocasena foram adquiridos da Sigma Chemical Co (St. Louis, Missouri, EUA). Todos os outros reagentes foram da melhor qualidade disponvel. Materiais vegetais e preparao de extrato de H. brasiliense padronizado H. brasiliense foram coletados a partir da cidade de Nova Friburgo, RJ, Brasil, em 2001. Uma exsicata (n 19980) foi depositada no herbrio do Museu Nacional da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Brasil). Extrato H. brasiliense padronizada (HBSE) da planta inteira foi preparado por extrao seletiva de compostos de flavonoides e derivados de xantonas (Rocha et al, 1995), a fim de conter, aps hidrlise, e no menos do que 6,5% de flavonoides totais, expressos como quercetina. O extrato em bruto etanlico foi ainda dissolvido em uma soluo de 30% sulfxido de dimetilo (DMSO) para realizar os ensaios biolgicos. Veneno e animais Liofilizado B. jararaca foi gentilmente fornecido pela Fundao Ezequiel Dias, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil. O veneno foi preparado em soluo salina fisiolgica a uma concentrao 1mg/ml e foi armazenado a -20 C at ser utilizado. Ratos Balb/c (18-20gm) foram obtidas a partir do Centro de Animais de Laboratrio (LNA) da Universidade Federal Fluminense (UFF). Foram alojados em condies controladas de temperatura (24 1 C) e luz. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comit Institucional para a UFF de tica em Experimentao Animal (protocolo n 00029) que estavam de acordo com as diretrizes do Comit Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA). Os ensaios biolgicos Atividade Antirpoteoltica Atividade proteoltica de B. jararaca foi determinada de acordo com o mtodo de Garcia et al (1978), utilizando azocasena como substrato (0,2%, w/v, em 20 mM Tris-HCl, CaCl 8 mM, pH 8,8). Alquotas de B. jararaca (5-50g/ml) foram incubadas com 0,4 ml azocasena a 37C durante 90min, num volume total de 1,2 ml. A reao enzimtica foi parada pela adio de cido tricloroactico (5%, v/v, concentrao final). Os tubos foram centrifugados a 15.000xgs durante 2 minutos. O sobrenadante foi removido e misturado com NaOH 2N. Aps 10min, os tubos foram lidos a 420nm A. Uma concentrao eficaz (CE) foi definida como a quantidade de veneno (g/ml) capaz de produzir uma variao de ~0.2OD unidades em A 420nm. Para as experincias de inibio, de duas CE de B. jararaca (24g/ml) foram misturados com quantidades variadas de HBSE (120-480g/ml) para se obter quatro diferentes propores (w/w) peso/peso- de veneno: planta, 1:5, 1: 10; 1:15 e 1:20. Em seguida, a atividade proteoltica foi determinada.

Atividade anticoagulante Um pool (conjunto) de plasma normal humano citratado (diludo com um volume igual de soluo salina) de voluntrios saudveis ou de fibrinognio (2mg/ml, concentrao final) foi misturado com B. jararaca (2.5-70g/ml) e o tempo de coagulao foi avaliada em um coagulmetro Amelung, modelo KC4A (Labcon, Alemanha). A concentrao de veneno (g/ml) que o plasma coagulado ou de fibrinognio em 60sec foi designada a Dose Mnima Coagulante (DMC). Para avaliar o efeito inibitrio, HBSE foi pr-incubada durante 30 min temperatura ambiente com um MCD de veneno. A mistura foi ento adicionada ao plasma ou fibrinognio e do tempo de coagulao foi gravada. Experincias de controle negativos foram realizados em paralelo por HBSE mistura ou soluo salina com plasma sozinho. Atividade Anti-hemoltica Hemlise de B. jararaca foi determinada pelo teste de indireta hemoltica utilizando eritrcitos humanos e de emulso de gema de ovo de galinha como substrato (Fuly et al, 1997). Uma dose mnima indireta Hemoltica (MIHD) foi definida como a quantidade de B. jararaca (g/ml) capaz de produzir hemlise de 100%. Para verificar a ao inibitria da HBSE, o extrato (150-1500g/ml) foi pr-incubada com um MIHD (30g/ml) e o ensaio foi realizado hemoltica. O efeito mximo (100% de hemlise) foi obtido aps a lise de eritrcitos com gua destilada para constituir o controle. Experincias de controlo foram realizadas por incubao B. jararaca quer com soluo salina ou DMSO. Atividade anti-hemorrgica Leses hemorrgicas produzidas por B. jararaca foram quantificados conforme descrito por Kondo et al, (1960), com pequenas modificaes. Resumidamente, as amostras foram injetadas por via intradrmica (id) na pele abdominal de ratinhos. Duas horas mais tarde, os animais foram pele, sacrificados abdominal removido, esticados e inspecionadas para alteraes visuais no aspecto interno a fim de localizar focos hemorrgicos. Hemorragia foi quantificada como a dose mnima hemorrgica (DMH), definida como a quantidade de veneno (mg/kg) capaz de produzir um halo hemorrgico de 10 milmetros (Nikai et al, 1984). O efeito inibitrio do HBSE foi investigado por incubao das plantas (800mg/kg) com duas DMH de B. jararaca (100mg/kg) durante 30 min temperatura ambiente e, em seguida, a mistura foi injetada em ratinhos e hemorragia foi medida. Atividade hemorrgica foi expressa como o dimetro mdio (em milmetros) do halo hemorrgico induzida por B. jararaca na ausncia e na presena da planta. Experincias de controle negativo foram realizadas por injeo de DMSO (1%, v / v, concentrao final) ou salina. Anti-letalica Grupos de cinco ratinhos foram injetados intraperitonealmente (ip) com B. jararaca (70mg/kg), e observao foi seguido durante 24 horas. O experimento antilethality foi realizado por mistura B. jararaca com HBSE (1140mg/kg) ou com a quercetina (1140mg/kg) durante 30 min. a 37C, e, em seguida, as misturas foram injetados i.p. em camundongos. Experincias de controle foram realizadas por incubao veneno com DMSO (1%, v / v, concentrao final) ou com soluo salina. O volume da injeo foi de 0,5 ml.

Antiedema Edema indutor de atividade de B. jararaca foi determinada de acordo com Yamakawa et al (1976). Grupos de cinco ratinhos receberam por via subcutnea (sc) 50l de B. jararaca (7mg/kg) na pata direita, enquanto que a pata esquerda recebeu 50l de soluo salina ou DMSO. Uma hora aps a injeo, edema foi avaliado como a percentagem de aumento no peso da pata direita em comparao com a da esquerda. Atividade antiedematognica foi realizada por incubao de HBSE (140mg/kg) ou quercetina (140mg/kg) com B. jararaca durante 30 min temperatura ambiente e, em seguida mistura foi injetada em ratos. Experincias de controle foram realizadas por incubao B. jararaca com DMSO ou soluo salina. A anlise estatstica Os resultados so apresentados como mdia S.E.M (desvio padro). A significncia estatstica das diferenas entre os testes foi avaliada usando Student t-teste desemparelhado. Valores de p <0,05 foram considerados estatisticamente significativos. RESULTADOS Composio qumica do extrato de H. brasiliense A composio qumica do extrato etanlico de H. brasiliense foi testada por RP-HPLC cromatografia. Como mostrado na Figura 1, sete picos principais de fitoqumicos foram obtidos e em relao aos tempos de eluio seus foram registadas como se segue, quando comparado com uma mistura de padres de peso molecular (Rocha et al, 1995): cido clorognico (1), hiperosdeo (2 ), isoquercitrina (3), guaijaverin (4); quercitrina (5), a quercetina (6), kaempferol (7). Figura 1. A cromatografia do perfil HBSE: Extrato etanlico de H. brasiliense (HBSE) foi injetado numa MN Nucleosil coluna de slica C18 120-5 montado sobre um aparelho de HPLC. A eluio foi realizada temperatura ambiente utilizando um gradiente linear de 10-60% de acetonitrilo/gua mistura em cido trifluoractico (0,05%, v / v) a um caudal de 1mL/min em 30 min. Picos foram monitorados a 254nm e foram indicadas como se segue: pico 1, cido clorognico, pico 2, hiperosdeo; pico 3, isoquercitrina; pico de 4, guaijaverin; pico de 5, quercitrina; pico de 6, quercetina; pico de 7, kaempferol. Atividade antiproteolticas de H. brasiliense Veneno bruto B. jararaca foi capaz de hidrolisar azocasena de uma maneira dependente da concentrao com um CE de 12g/ml (dados no mostrados). Dois CE de B. jararaca (24g/ml) foram misturados com HBSE para dar veneno final: rcio da planta (w/w) de 1:5, 1:10, 1:15 e 1:20, respectivamente. Como mostrado na Figura 2, HBSE inibiu a atividade proteoltica de B. jararaca com potncias diferentes, a razo de 1:20 sendo o mais eficaz, onde uma inibio completa foi observada.

Em contraste, a razo de 1:5 inibiu cerca de 60% da protelise (Figura 2). HBSE sozinho (500g/ml) no hidrolisam azocasena ou DMSO (1%, v / v, concentrao final) no interfiram na atividade proteoltica de B. jararaca. Figura 2. Efeito inibitrio do HBSE sobre a protelise induzida por B. jararaca. B. jararaca (24g/ml) foi misturado com diferentes concentraes de HBSE (120-480g/ml) para dar veneno: razo de planta (w/w) de 1:5 (coluna 1); 1:10 (coluna 2) ; 1:15 (coluna 3); e 1:20 (coluna 4), respectivamente. Os dados so expressos como mdias SEM de trs experincias individuais (n = 3). * Nvel de significncia (p <0,05) quando comparados com a coluna 1. Efeito anticoagulante de H. brasiliense HBSE foi capaz de inibir B. jararaca-induzida de coagulao sobre plasma humano (Figura 3A) ou mediante fibrinognio purificado bovina (Figura 3B) de um modo dependente da concentrao. O MCD foi 25g/ml ou 40g/ml de plasma ou ensaio de fibrinognio, respectivamente. Como se pode observar, a razo de 1:50 (veneno: planta) (Figura 3A, coluna 4) e 1:0,25 (Figura 3B, coluna 4), no plasma ou fibrinognio no coagular. No entanto, a 1:10 ou 1:0,05, HBSE no tem qualquer efeito, independentemente do mtodo de coagulao empregue (Figura 3, coluna 2). O HBSE ou DMSO sozinho no interferiu nos tempos de coagulao (dados no mostrados). Figura 3. Efeito inibitrio do HBSE na coagulao induzida por B. jararaca. AB jararaca (25g/ml) foi misturado com HBSE (250-1250g/ml) para dar veneno diferente: razo de planta (w / w): coluna 2 (01:10); coluna 3 (01:20); coluna 4 (1:50), respectivamente. BB jararaca bruto veneno (40g/ml) foi misturado com HBSE em veneno: razo de planta, coluna 2 (1:0,05); coluna 3 (1:0.15); coluna 4 (1:0,25). Coluna 1, em ambos os painis representa um MCD de B. jararaca misturado com DMSO, em vez de HBSE. Os dados so expressos como mdias SEM de duas experincias individuais (n = 4). # #, Significa que o plasma no coagular para o 800sec observada. * Nvel de significncia (p <0,05) quando comparados com a coluna 1.

Efeito Anti-hemolitico de H. brasiliense HBSE completamente inibida a hemlise causada por uma MIHD de B. jararaca veneno (30g/ml) com o veneno de 1:50: razo de planta (Figura 4, coluna 4), enquanto que uma inibio de 30% a 80% foi obtida com menor veneno: rcios de plantas (Figura 4, as colunas 1, 2 e 3). Nem HBSE sozinho induzir hemlise, nem a atividade hemoltica induzida por B. jararaca misturado com DMSO foi afetada (dados no mostrados). Figura 4.

Efeito inibitrio do HBSE na hemlise induzida por B. jararaca. B. jararaca (30g/ml) foi misturado com HBSE (150-600g/ml) para dar veneno diferente: razo de planta (w / w), como segue: coluna 1 (1:5); coluna 2 (01:10 ); coluna 3 (01:20) e coluna 4 (01:50), respectivamente. O ensaio hemoltica foi realizada como descrito nos mtodos. Os dados so expressos como mdias SEM de duas experincias individuais (n = 3). Efeito anti-hemorrgica de H. brasiliense O efeito de HBSE sobre a atividade hemorrgica de B. jararaca foi avaliada (Figura 5). Injeo intradrmica de B. jararaca (100mg/kg) induziu um halo de 20mm hemorragia em ratos que corresponde a dois MHD. Como mostrado na Figura 5, quando HBSE (800mg/kg) foi pr-incubada com B. jararaca (razo de 1:8, veneno: HBSE, w/w), no foi detectada hemorragia (Figura 5, coluna 3). DMSO no interferiu no B. jararaca induzida por hemorragia (Figura 5, coluna 2) e HBSE no induziu hemorragia em ratos (dados no mostrados). Figura 5. Efeito inibitrio do HBSE na hemorragia induzida por B. jararaca. B. jararaca (100mg/kg) foi pr-incubada durante 30 min temperatura ambiente com soluo salina (coluna 1), com DMSO (coluna 2) ou com 800g/ml HBSE (coluna 3). As misturas foram injetadas em ratos e ensaio realizado hemorragia. Os dados so expressos como mdias de SEM de duas experincias individuais (n = 3).

Efeito Anti-letlica de H. brasiliense B. jararaca (70mg/kg) foi injetado i.p. em ratinhos, e cem por cento de letalidade foi observada dentro 3hr (dados no mostrados). Quando a dose tal de B. jararaca foi misturado com H. brasiliense (1140mg/kg) dando um veneno de 1:16: razo de planta (w/w), no foi observada morte (dados no mostrados). Por outro lado, a quercetina (1140mg/kg) no protegeu ratinhos da morte causada por B. jararaca. HBSE ou quercetina tambm no foi letal para camundongos. Efeito antiedematognica de H. brasiliense B. jararaca (7mg/kg) produziu um rpido incio de edema de pata de ratos dentro de 60min aps a injeo. HBSE (140mg/kg) misturado com veneno (rao 1:2, veneno: planta, w/w) aboliu a sua atividade edematognica (dados no mostrados).

DISCUSSO O H. brasiliense Choisy planta pertence famlia Guttiferae e do gnero Hypericum compreende cerca de 380 espcies em todo o mundo (Santos et al, 2004). No Brasil, 17 espcies so encontradas, principalmente em regies do Sudeste e Sul (Slusarski et al, 2007). Uma grande variedade de propriedades farmacolgicas e aplicaes medicinais tm sido indicadas para esta planta, como a preveno, adstringente das doenas do trato alimentar, antimicrobiana, cicatrizao de feridas, anticancergeno, anti-inflamatrio, antiespasmdico, antidepressivo e tambm antiofdico (Rocha et al,

1994,1995; Apaydin et al, 1999; Perazzo et al, 2008a; 2008b, Frana et al, 2009). Essas atividades biolgicas so devidas a diversos compostos bioativos, tais como flavonides, xantonas, phloroglucinols e terpenos que so produzidos por seu metabolismo (Abreu et al, 2004). Os relatrios anteriores mostraram que H. brasiliense extrato (HBSE) tinha uma ao anti-inflamatria e analgsica perifrica potente provavelmente devido inibio da produo de derivados de cido aracdnico (Perazzo et ai, 2008a). Estudos pr-clnicos demonstraram que o extrato de H. brasiliense baixa toxicidade exposio a doses menores 1000mg/kg (Rieli et al, 2002), e sem efeitos genotxicos em sistemas in vivo (Espsito et al, 2005). de notar que as doses utilizadas no presente trabalho foram menores do que aqueles utilizados por Rieli et al (2002). A busca de molculas bioativas em plantas utilizadas na medicina popular tem sido crescente nos ltimos anos. Aqui, relataram que HBSE neutraliza alguns efeitos biolgicos de B. jararaca, chamado hemlise, coagulao, protelise, a letalidade, edema e hemorragia. Essas reaes realmente contribuir significativamente para os sintomas que seguem uma mordida por este cobra. Vrios trabalhadores estudaram a capacidade de plantas, bem como as suas fraes purificadas para inibir as atividades biolgicas dos venenos de cobra (Melo et al, 1994; Maiorano et al, 2005; Oliveira, et al, 2005; Cavalcante et al, 2007; Lomonte et al , 2009; de Paula et al, 2010). No entanto, poucos tm investigado o mecanismo de neutralizao de sua ao. Em alguns casos, uma interao direta com stios catalticos de enzimas ou com ons metlicos que so essenciais para as atividades de enzima pode estar envolvida (Borges et al, 2005; Nez et al, 2005). Independentemente dos mecanismos precisos, HBSE parece ser um agente clnico promissor para uso como tratamento de primeiros socorros, ou em combinao com anti-soro. Curiosamente, a quercetina - um dos compostos presente mais abundantes no planta (Abreu e Mazzafera, 2005; Abreu et al, 2004), que tem sido demonstrado para exibir algumas propriedades farmacolgicas, tais como anti-inflamatrio de reduo, na insuficincia cardaca e propriedades anticancergenas (Lee et al, 2011; Xavier et al, 2011) - no inibiu a letalidade, hemorragia e edema induzido por B. jararaca. Isto sugere que a propriedade de soro de HBSE no pode ser atribudo a quercetina sozinho; outros flavonides, dianthrones, e hyperforin pode ser quer isoladamente ou em combinao com a quercetina. No entanto, isto exige uma investigao mais aprofundada.

CONCLUSES Uma vez que H. brasiliense extrato inibiu vrias atividades biolgicas de B. jararaca, ela tem o potencial de uma estratgia de tratamento alternativo ou complementar de envenenamento por B. jararaca. No entanto, estudos mais especficos precisam ser realizados para descobrir os compostos exatos responsveis por essas observaes, a sua eficcia, segurana e os mecanismos de ao antiofdicos.