UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUIMICA
BQA7016-08108 (20111) - Métodos Analíticos em Bioquímica

Determinação de GSH Fluorimétrico

e
Peroxidação Lipídica

Alunos: Gianni Mancini

Josiane Budni
Introdução
Introdução

Estresse
Oxidativo
 Introdução
RADICAIS LIVRES

Espécies Reativas de Oxigênio (ERO’s)

-Ânion superóxido (O2•)
-Peróxido de hidrogênio (H2O2)
-Radical hidroxila (OH•)

Espécies Reativas de Nitrogênio (ERN’s)

-NO
-peróxido nitrito (ONOO-)
 Introdução
GERAÇÃO DE RADICAIS LIVRES

GERAÇÃO DE RL NA CADEIA DE TRANSPORTE DE ELETRONS

 Introdução
GERAÇÃO DE RADICAIS LIVRES
Introdução
 Introdução
Defesas Celulares:
• Sistemas Antioxidantes:
o Não Enzimáticos
o Enzimáticos
 Introdução
Sistemas Antioxidantes:
Não Enzimáticos

Vitamina C Vitamina E

Selênio
Beta-caroteno Flavonóides

Glutationa
 Introdução
Sistemas Antioxidantes:
Enzimáticos

Superóxido Dismutase (SOD)

Catalase (CAT)
Glutationa Peroxidase (GPx)
Glutationa Redutase (GR)
Tioredoxina Redutase (TRxR)
Introdução
 Metodologia
Níveis de GSH
1. Método: GSH Fluorimétrico (Hissin and Hilf (1976) Analytical
Biochemistry 74 214–226)

Fundamento:
Formação de um produto fluorescente pela reação entre
os grupos tióis (SH) e o o-ftalaldeído (OPT) durante uma
excitação de 350 nm e emissão de 420 nm.
 Metodologia
Níveis de GSH
1. Método: GSH Fluorimétrico (Hissin and Hilf (1976) Analytical
Biochemistry 74 214–226)

Amostra Separar as Proteínas

Ácido Perclórico 0,6 M

Grupos SH
não Protêicos
 Metodologia
Níveis de GSH
1. Método: GSH Fluorimétrico (Hissin and Hilf (1976) Analytical
Biochemistry 74 214–226)

Grupos SH
não Protêicos

Grupos SH reduzidos
Tampão Básico pH= 8,0
(Tampão Fosfato de sódio 100mM)

OPT

OPT 1mg/mL (O-Ftalaldeído)

 Metodologia
Cálculo:
A concentração de glutationa reduzida é estimada apartir de uma curva
de calibração utilizando GSH padrão.
b 1 2 3 4 5 6
ug de GSH 0 0,025 0,15 0,25 0,5 0,75 1
Sol. Stock (GSH padrão) 0 5 30 50 100 150 200
Tampão Fosfato de Sódio
100mM pH=8,0 1,9 1,985 1,87 1,85 1,8 1,75 1,7
OPT 1mg/ml 100 100 100 100 100 100 100

uMols de GSH/ mg de proteínas

 Metodologia
Peroxidação Lipídica
1. Método: TBARs (Esterbauer and Cheeseman (1990) Methods
Enzymol. 186 407-421)

Fundamento:
Formação de um complexo de coloração rosa pela
reação entre o TBA e produtos de peroxidação lipidica
como o MDA, observados a 540 nm.
 Metodologia
Peroxidação Lipídica
1. Método: TBARs (Esterbauer and Cheeseman (1990) Methods
Enzymol. 186 407-421)

Amostra Meio Ácido

TCA 10%

TBA 0,67%
 Metodologia
Peroxidação Lipídica
1. Método: TBARs (Esterbauer and Cheeseman (1990) Methods
Enzymol. 186 407-421)

Produtos da Peroxidação
Lipídica – Malondialdeido (MDA)

TBA MDA TBA MDA

TBA MDA TBA MDA

TBA 0,67% TBA MDA TBA MDA

 Metodologia
Cálculo:
Os níveis de peroxidação lipídica é estimada a partir de uma curva de
calibração utilizando MDA padrão.
b 1 2 3 4 5
uM de MDA 0 1,5 3 4,5 6 10
sol. MDA 60 nmol/ml 0 7 14 28 43 75
TFK 20 mM 75 68 61 47 32 -
Ác. Acético pH= 3,5 100 100 100 100 100 100
TBA 0,67 % 100 100 100 100 100 100

nMols de MDA/ mg de proteínas

 Procedimento
Amostras:
Homogeneizados de cérebro
e fígado

Ensaio de oxidação:

Controle

2 Grupos
Incubação por 1 hora
Oxidante a 37C

Peróxido de
T-butil 500 uM