Trabalho prático 1

Estudo da hidrólise de compostos contendo grupos fosfato

Questões pós-aula
Perguntas de resposta curta (máximo, 1 linha por resposta)
1. Indique o(s) composto(s) que utilizou na aula prática que contem fosfatos lábeis?
ATP e Glucose-1-fosfato.
2. Indique o(s) composto(s) que utilizou na aula prática que contem fosfatos estáveis?
Glucose-6-fosfato.
3. Que tipo de ácido utiliza para remover um fosfato lábil? (dê um exemplo desse ácido)
Um hidrácido, por exemplo o ácido clorídrico, HCl.
4. Que tipo de ácido utiliza para remover um fosfato estável? (dê um exemplo desse ácido)
Um oxoácido, por exemplo o ácido sulfúrico, H2SO4.
5. Quantos fosfatos tem a molécula de ATP? Quantos desses são lábeis? E estáveis?
Uma molécula de ATP tem 3 fosfatos, sendo dois deste lábeis e um estável.
6. Quantos fosfatos tem a molécula de G-1-P? Quantos desses são lábeis? E estáveis?
Uma molécula de G-1-P tem 1 fosfato, sendo este lábil.
7. Quantos fosfatos tem a molécula de G-6-P? Quantos desses são lábeis? E estáveis?
Uma molécula de G-6-P tem 1 fosfato, sendo este estável.
8. Quais as condições determinantes para a realização do método “hidrólise dos 7 minutos”.
Presença de HCl (hidrácido) à temperatura de 100ºC durante 7 minutos
9. Qual a função do HCl (2 M)?
Libertar os fosfatos lábeis, quebrando a ligação destes com o resto da molécula fosfatada.
10. Qual a função do Tris-HCl (pH 8.0)?
Manter o pH da solução relativamente estável, para que a hexocinase tenha atividade ótima.
11. Porque colocou os tubos 1, 3 e 5 em gelo?
Para que não ocorresse a “hidrólise dos 7 minutos”.
12. Porque colocou os tubos 2, 4 e 6 num banho de água a ferver?
Para que ocorresse a “hidrólise dos 7 minutos”.
13. Que lei deve ter em consideração quando determina a absorvância de amostras?
Lei de Lambert-Beer.
14. Para que serve a reta de calibração?
Para obter uma equação que relaciona concentração a absorvância da amostra.
15. Para que serve o branco?
Para calibrar o espetrofotómetro para que ignore a absorvância proveniente dos reagentes.
16. O que se quantifica quando se determina a absorvância das amostras?
A quantidade de luz a um determinado comprimento de onda absorvida pela amostra.
17. Para que serve o ácido molíbdico? E o agente redutor?
O ácido molíbdico reage com os fosfatos livres formando ácido fosfomolíbdico, que é reduzido
pelo agente redutor, obtendo-se um composto colorido.
18. Como pode verificar se as micropipetas estão corretamente calibradas?
Pipetando um composto com densidade conhecida e pesando este de modo a poder calcular o
volume realmente pipetado, que deve ser igual ao definido na micropipeta.
19. Esquematize a reação catalisada pela hexocinase.
Glucose + ATP 🡪 Glucose-6-fosfato + ADP
20. Porque é que os tubos ficam 30 minutos à temperatura ambiente antes de se efetuarem as
leituras de absorvância?
Para que a reação de fosforilação catalisada pela hexocinase tenha tempo de ocorrer.
21. Que valores de absorvância espera obter se as leituras forem efetuadas a 700 nm (maiores,
menores ou iguais, quando comparados com os valores obtidos neste trabalho? Porquê?
Valores menores, visto que o composto formado tem cor azul, cujo comprimento de onda é
mais próximo de 700nm, logo irá absorver menos luz.
Perguntas de resposta longa (máximo, 4 linhas por resposta)
22. Na determinação de fosfatos de uma solução de ATP, a absorvância obtida foi de 1,020.
Sabendo que a equação reta é Y=1X+0,02 (sendo a concentração expressa em mol/L) e que a
solução de leitura foi constituída por 1 mL de ATP, 1 mL HCl, 1 mL de agente redutor, 1 mL de
ácido molíbdico e 16 mL de água destilada, calcule o número de moles de fosfato existentes na
solução inicial de ATP.
A750 nm= 1020
𝑦 = 1𝑥 + 0. 02, logo 𝐴 = 1𝑐 + 0. 02
Vtotal = 20 mL = 0.02 L

1020 = c + 0.02 ⇔ c = 1019.08

𝑛 𝑛
c = 𝑉 ⇔ 1019.08 = 0.02 ⇔ n = 2.3816 mol
23. Em relação à parte B do protocolo (estudo da fosforilação da glucose catalisada pela
hexocinase), esboce o gráfico de quantidade de fosfato libertado em função do tempo de
reação (tempo de incubação com a enzima). Justifique.

A relação entre tempo de reação e quantidade fosfato libertado não é linear pois a velocidade
de reação depende da concentração de substrato da hexocinase (glucose), além disso esta
quantidade nunca chega a 0 pois apesar de um dos fosfatos lábeis do ATP se tornar estável na
molécula de G-6-P não podendo ser libertado, um dos produtos da reação é ADP, que possui um
fosfato lábil que será libertado durante a “hidrólise dos 7 minutos”.
24. Tendo em conta a aula prática, o que indica a variação da energia livre de Gibbs? (Comente
tendo em conta as moléculas fosfatadas usadas na aula prática)
A variação da energia livre de Gibbs indica a facilidade com que os grupos fosfato são
libertados das moléculas fosfatadas, sendo mais fácil quanto mais negativo for o valor.
25. Qual o método que usou para quantificar os fosfatos libertados. Descreva, sucintamente,
como o realizou em termos laboratoriais.
Espetrofotometria: foram preparadas várias soluções progressivamente mais diluídas de padrão
fosfato com ácido molíbdico e agente redutor e foi preparada uma solução com água em vez
de padrão fosfato (“branco”), sendo a absorvância de todas as soluções lida após calibração
com o “branco”. Por fim foi lida a absorvância da solução de concentração desconhecida.
26. Quais as condições para que a enzima tenha atividade?
Condições fisiológicas, visto que esta é uma enzima presente no organismo humano, logo pH=7
e T=37ºC.
27. Na parte B do protocolo, com que intuito fez uma incubação a 37 ºC? E a 100 ºC?
A incubação a 37ºC tem como intuito promover a ação da hexocinase, visto que esta é a
temperatura ideal para a sua atividade e a incubação a 100ºC tem como intuito promover a
hidrólise dos grupos fosfato lábeis, na “hidrólise dos 7 minutos”
28. Qual dos compostos estudados liberta mais fosfatos lábeis? Justifique.
O ATP, visto que possui 3 fosfatos, sendo 2 deles lábeis, e, por isso, libertados durante a
“hidrólise dos 7 minutos” enquanto a G-1-P apenas possui um fosfato lábil e a G-6-P possui
zero.
29. Como se quantifica o ATP gasto na reação?
Realizando a diferença entre a quantidade de fosfatos em solução após ocorrer a reação e
hidrólise e a quantidade de fosfatos numa solução em que apenas ocorreu hidrólise.
30. Maior tempo de incubação do ATP e glicose com a enzima hexocinase implica maior ou
menor quantidade de fosfatos inorgânicos? Justifique.
Maior tempo de incubação implica menor quantidade de fosfatos inorgânicos visto que haverá
maior quantidade de G-6-P sintetizada, sendo uma maior quantidade de grupos fosfato lábeis
do ATP convertidos em fosfatos estáveis nesta molécula, levando a uma menor quantidade de
fosfato inorgânico libertado durante a “hidrólise dos 7 minutos”.