ISSN 1980-3540

04.02, 09-13 (2009) www.sbg.org.br

TradeScaNTIa PallIda: maIS do que uma lINda flor, um ImPorTaNTe bIoINdIcador da qualIdade ambIeNTal.
Sisenando, H. A.1*; Batistuzzo de Medeiros, S. R.2; Hacon, S. S.1
1- Escola Nacional de Sade Pblica Srgio Arouca ENSP/Fundao Oswaldo Cruz Fiocruz. 2- Departamento de Biologia Celular e Gentica/Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN. * Correspondncia do Autor: Avenida Leopoldo Bulhes n 1480, Manguinhos, ENSP, Sala 620, CEP: 21041-210, Rio de Janeiro/RJ, Brasil. E-mail: herbertsisenando@yahoo.com.br

Palavras-chave: Biomonitoramento, genotoxicidade, microncleo, poluio, Trad-MCN Introduo O desenvolvimento industrial e urbano, observado a partir do sculo XIX, desencadeou uma elevada tendncia de emisso de agentes txicos na atmosfera (Machado, 2008). Entre as diversas fontes de emisso, podemos destacar: o aumento da frota de veculos nas cidades, a explorao industrial desordenada, as extensas reas de queimadas no cerrado e nas florestas e o avano do homem sobre reas nativas de florestas. Os principais agentes txicos envolvidos nos processos de deteriorao ambiental so: dixido de carbono (CO2), hidrocarbonetos policclicos aromticos (Benzopireno), material particulado (MP2,5 e MP10), monxido de carbono (CO), xidos de enxofre (SO2 e SO3), xidos de nitrognio (NO e NO2) e o oznio (O3) (Bernstein et al., 2004; Passarelli, 2003) . Estudos realizados no estado de So Paulo mostraram que a poluio gerada pela ao do homem promove um aumento significativo nas concentraes de diversos compostos txicos, entre eles o material particulado grosso e fino, refletindo em um expressivo aumento do nmero de casos de internaes hospitalares associados a problemas respiratrios (Canado et al., 2006; Carmos et al., in press). Em ambientes onde as concentraes dos poluentes so elevadas, dependendo da toxicidade do mesmo, estes podem induzir efeitos genotxicos no apenas em humanos, mas tambm em animais, plantas e bactrias, podendo comprometer a sade dos ecossistemas (Isidori et al., 2003). O teste de microncleo em Tradescantia (TradMCN) considerado uma valiosa ferramenta por muitos pesquisadores devido simplicidade da metodologia e sensibilidade desta planta exposio aos agentes genotxicos (Guimares et al., 2000; Batalha et al., 1999).

O teste foi desenvolvido, no Brookhaver National Laboratory - EUA, por Ma e colaboradores em 1976, e, inicialmente, utilizava como planta teste a Tradescantia clone 4430 que, posteriormente, foi sendo adaptado para a Tradescantia pallida (Ma et al., 1994; Batalha et al., 1999). A espcie Tradescantia pallida cv. purpurea originria do leste do golfo do Mxico e se caracteriza pela fcil adaptabilidade s condies climticas (Chimpan e Sipos, 2009). A visualizao de microncleo (MCN) a partir do teste Trad-MCN, aps exposio a 140 tipos de substncias, mostrou concordncia de resultado em 67% quando comparado aos obtidos a partir do teste de Ames, nas mesmas condies experimentais (Ma et al., 1984). Os microncleos so pequenos fragmentos do ncleo que se formam a partir da quebra cromossmica (processo clastognico) ou perda de um cromossomo inteiro do fuso celular (processo aneugnico) durante a mitose (diviso celular) refletindo, portanto, a ocorrncia de danos de carter genotxico (Rodrigues et al., 1997). material e mtodos O protocolo seguiu os procedimentos descritos por Ma (1981), Ma e colaboradores (1994), Rodrigues e colaboradores (1997), Alves e colaboradores (2001), Savoia e colaboradores (2009). 1. MODELO EXPERIMENTAL Para desenvolver um experimento com base cientfica, fundamental a adoo de alguns cuidados para que o experimento tenha reprodutibilidade e que os resultados sejam confiveis. No estudo com T. pallida in situ como bioindicador da qualidade do ar se faz necessria a adoo de um ponto referncia, tambm denominado de ponto de comparao negativo; este ponto ser adotado como padro para comparao dos resultados do ponto teste. As plantas expostas nos pontos testes e controle deveram ter sido cultivadas, cuidadas e regadas da mesma forma. de fundamental importncia que a
9

coleta de todos os pontos seja realizada na mesma poca, para evitar vis no estudo. Dependendo do tipo do estudo, aconselhvel que as coletas sejam realizadas seguindo alguns parmetros, que podem ser do perodo de distribuio de chuva (coleta no perodo seco e chuvoso) at correlacionado s estaes do ano (coleta no inverno, primavera, vero e outono). Caso seja possvel, o experimento pode adotar um ponto, sabidamente afetado pela poluio que se deseja avaliar, e usar como ponto de comparao positivo (controle positivo). 2. PREPARO DOS VASOS Em uma floreira de plstico (com dimenses: 50 cm x 17 cm x 17 cm), mistura-se de forma homognea os seguintes componentes: 2 partes de terra vegetal + 1 parte de substrato (ex.: Plantmax) + 1 parte de vermiculita fina + 1 parte de hmus de minhoca. Cada vaso deve receber no mximo 05 talos de T. pallida. Para melhorar o desenvolvimento das plantas, deve-se aplicar um fertilizante base de NPK 10:10:10 na forma lquida, mensalmente, obedecendo a diluio do fabricante. Geralmente, processa-se a diluio de 1 colher de sopa (15 ml) do produto na sua forma concentrada em um litro de gua. Cada vaso deve receber um volume aproximado de 350 ml de soluo diluda, que deve ser aplicado diretamente sobre o solo e, preferencialmente, num horrio com pouca incidncia de raios solares. 3. SOLUES 3.1 SOLUO DE FIXAO (Soluo de Carnoy) Proporo de 3:1 de lcool etlico absoluto e cido actico 45%. Para 1 litro de soluo: 750 ml de lcool etlico absoluto + 250 ml de cido actico 45%. Misturar e conservar em temperatura ambiente. 3.2 SOLUO DE COLORAO (Carmim actico 2%) 2 g de Carmim + 100 ml de cido actico 45%. Misturar os componentes num condensador de refluxo com o auxlio de bolinhas de vidro durante 3 horas, espera esfriar e filtra a soluo em papel filtro (21 mm). Armazenar em vidro mbar sob refrigerao de 2-5C. 4. FIXAO Retirar a inflorescncia no formato de barquinha sem flor (Fig.1-B) com auxlio de uma pina (Fig.2- G ou I) e armazenar em um recipiente com tima vedao (Ex.: tubo do tipo Falcon ou coletor universal) com soluo de Carnoy por 24 horas. Aps o perodo de fixao, substituir a soluo de fixao por lcool 70% e deixar armazenado por um perodo mximo de 6 meses. 5. CONFECO DAS LMINAS Inicialmente, deve-se montar a bancada de trabalho de acordo com o exposto pela figura 2. Com o auxlio das pinas (Fig.2-G e I) e do explorador (Fig.2-F) re-

alizado o procedimento de dissecao da inflorescncia, tendo como meta a retirada do boto que apresente clulas-me de gros de plen em estgio de ttrades. A escolha do estgio de ttrade para pesquisa de microncleo se d pelo fato de que neste estgio a clula encontra-se em interfase (no diviso), o que facilita a visualizao do ncleo e do possvel MCN existente. Outra vantagem desse estgio celular o tempo de durao (36-48 h), facilitando os procedimentos de anlises. As inflorescncias jovens so as mais indicadas para a anlise, por apresentar clulas em estgio de ttrade em botes de estgio intermedirio. O boto escolhido deve ser dissecado e posteriormente macerado com o auxlio do estereomicroscpio, estilete histolgico, do explorador e de uma gota de carmim actico 2%, devendo ser retirado todos os debris (fragmentos celulares resultantes da macerao do boto) antes de colocar a lamnula. Observar a presena de ttrades com auxlio da objetiva 4 X do microscpio ptico (Fig.4-T), caso seja positivo, deixar a lmina em chapa aquecedora (70C) ou espiriteira por 8-15 segundos a fim de que permita a evaporao do excesso de corante e com isso melhore a visualizao dos componentes celulares na lmina. O processo de aquecimento das lminas deve ser acompanhado com muita ateno, porque um excesso de aquecimento pode promover a abertura das ttrades, formao de micrsporos (Fig.4-S), o que inviabilizaria o teste. Ocorrendo sobreposio de clulas na ttrade ou excesso de corante, a lmina com lamnula pode ser levemente pressionado com um papel absorvente, tomando o mximo cuidado para no quebrar a mesma. 6. ANLISE As lminas devem ser analisadas em microscopia ptica com objetiva de 40 X. Por lmina, deve-se contar um total de 300 ttrades e a ocorrncia de microncleo (Fig.4-P, Q e R) deve ser discriminada de acordo com o nmero total de MCN por ttrade (Fig.3). Para cada ponto de amostragem, deve ser analisado de 5-10 lminas e o resultado expresso conforme a frmula abaixo: onde M o nmero de microncleos contados por lmina do ponto e n o nmero total de lminas analisadas por ponto. O valor deve ser expresso como o nmero de microncleo por 100 ttrades contadas. A grande maioria dos artigos cientficos publica-

dos com tradescantia preconiza a utilizao da anlise de varincia (ANOVA) associada a um teste no-paramtrico (Mann-Whitney, Tunkey ou Dunnet), estando a sua a escolha vinculada ao nmero de pontos e a forma como esses dados sero avaliados. Alguns artigos fazem uso da

10

anlise de regresso linear com o propsito de associar a freqncia de microncleos quantificao de determinados compostos presentes no ar (MP, CO, SO2, O3, outros) ou de determinadas condies ambientes (temperatura, umidade, outras) do local de estudo. consideraes finais A tima adaptao da planta ao clima brasileiro,

a pouca complexidade do experimento e o baixo custo financeiro demonstram que este ensaio tem todo um potencial para se transformar numa valiosa ferramenta para fomentar o conhecimento cientfico, na rea da gentica, nas salas de aula de todo o Brasil. Tambm fortalece a ferramenta do biomonitoramento participativo, onde as comunidades locais podem ter acesso aos resultados de forma simples.

figura 1. Tradescantia pallida Purpurea: Inflorescncia com flores (A), Inflorescncia sem flor (B), vasos de T. pallida em ponto de exposio (C) e Flor (D).

figura 2. Bancada de trabalho: Espiriteira (A), carmim actico 2% (B), Tubos com inflorescncias fixadas e conservadas em lcool 70% (C), Lamnulas (D), Lminas (E), Explorador dental (F), Pina anatmica reta (G), Estilete histolgico (H) e Pina clnica (I).
11

figura 3. Folha para coleta de dados no teste Trad-MCN: Inflorescncia analisada em cada ponto (A), Data da coleta (B), Nmero de MCN encontrados por ttrade analisada (C), Total de MCN encontrados na inflorescncia analisada (D), Total de MCN divididos por 3 (E) e Anormalidades encontradas na lmina (F).

figura 4. Estgios celulares observados no Trad-MCN. Todas as lminas foram coradas com carmim actico 2% e fotografadas em microscpio ptico. As lminas de A at S foram fotografadas em aumento 40 X e a lmina T em aumento 4 X. MCN = Microncleo.

12

referncias
Alves ES, Giusti PM, Domingos M, Saldiva PHN, Guimares ET, Lobo DJ (2001) Estudo anatmico foliar do clone hbrido 4430 de Tradescantia: alteraes decorrentes da poluio area urbana. Rev Bras Bot 24: 597-576. Batalha JRF, Guimares ET, Lobo DJA, Lichtenfels AJFC, Deur T, Carvalho HA, Alves ES, Domingos M, Rodrigues GS, Saldiva PHN (1999) Exploring the clastogenic effects of air pollutants in So Paulo (Brazil) using the Tradescantia micronuclei assay. Mutat Res 426: 229-232. Bernstein JA, Alexis N, Barnes C, Bernstein IL, Bernstein JA, Nel A, Peden D, Diaz-Sanchez D, Tarlo SM, Williams PB (2004) Health effects of air pollution. J Allergy Clin Immunol 114:1116-1123. Canado JE, Braga A, Pereira LA, Arbex MA, Saldiva PH, Santos UP (2006) Clinical repercussions of exposure to atmospheric pollution. J Bras Pneumol 32 (2): S5-S11. Carmo CN, Hacon SS, Longo K, Freitas S, Ignotti E, Leon AP, Artaxo P (in press) Associao entre material particulado de queimadas e doenas respiratrias na regio sul da Amaznia Brasileira. Rev Panam Salud Publica. Chimpan C, Sipos M (2009). Anatomy of the vegetative organs of Tradescantia pallida Purpurea. Biharean Biologist 3: 1-4. Guimaraes ET, Domingos M, Alves ES, Caldini N, Lobo DJA, Lichtenfels AJFC, Saldiva PHN (2000) Detection of the genotoxicity of air pollutants in and around the city of So Paulo (Brazil) with the Tradescantiamicronucleus (Trad-MCN) assay. Environ Exp Bot 44: 1-8. Isidori M, Ferrara M, Lavorgna M, Nardelli A, Parrella A (2003) In

situ monitoring of urban air in Southern Italy with the Tradescantia micronucleus bioassay and semipermeable membrane devices (SPMDs). Chemosphere 52: 121-126. Ma TH, Cabrera GL, Chen R, Gill BS, Sandhu SS, Vandenberg AL, Salamone, MF (1994) Tradescantia micronucleus bioassay. Mutat Res 310: 221-230. Ma TH, Harris MM, Anderson VA, Ahmed I, Mohammad K, Bare JL, Lin G (1984) Tradescantia-Micronucleus (Trad-MCN) tests on 140 health-related agents. Mutat Res 138: 157-167. Ma TH (1981) Tradescantia micronucleus bioassay and pollen tube chromatid aberration test for in situ monitoring and mutagen screening. Environ Health Perspect 37: 85-90. Machado ACFE (2008) Avaliao da viabilidade de utilizao de Tradescantia pallida cv. Purpurea no biomonitoramento de fontes estacionrias de contaminao atmosfrica. Instituto de Botnica. http://www.biodiversidade.pgibt.ibot.sp.gov.br/teses_dissert/teses_ dissert.htm. Passarelli MM (2003) Toxicologia Ambiental. IN Oga S (ed.) Fundamentos de Toxicologia. 3nd edio. Editora Atheneu, So Paulo, capitulo 2. Rodrigues GS, Ma TH, Pimentel D, Weinstein LH (1997) Tradescantia bioassays as monitoring systems for environmental mutagenesis: A review. Crit Rev Plant Sci 16: 325-359. Savoia EJ, Domingos M, Guimaraes ET, Brumati F, Saldiva PH (2009) Biomonitoring genotoxic risks under the urban weather conditions and polluted atmosphere in Santo Andre, SP, Brazil, through TradMCN bioassay. Ecotoxicol Environ Saf 72: 255-260.

13