ESTUDO HISTOPATOLGICO E HISTOQUMICO DE MASTOCITOMAS NA REGIO DE ESPRITO SANTO DO PINHAL Histopathogical and Histochemical Study of Mast Cell Tumors

from Espirito Santo do Pinhal Region

Jussnia Pereira Pinto
Graduanda de Cincias Biolgicas, Unipinhal, Esprito Santo do Pinhal - SP. e-mail: poetisadoamor1@hotmail.com

Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira

Mdico Veterinrio, M. Sc., Prof. da Unipinhal, Esprito Santo do Pinhal - SP. e-mail: leandro-vet@ig.com.br

Arnaldo Rodrigues dos Santos Jnior

Prof., Dr. de Cincias Biolgicas da Unipinhal, Jaboticabal - SP. e-mail: arsantosjr@yahoo.com.br

Resumo
Mastocitomas so as neoplasias de pele mais comuns nos ces. O objetivo do presente estudo foi a anlise histoqumica e histopatolgica dos mastocitomas. Foi levantada a incidncia dos mastocitomas de 1998 a 2005 no Hospital Veterinrio do UNIPINHAL. Aleatoriamente, foram selecionadas amostras dos 3 graus cutneos para realizao de mtodos histoqumicos: hematoxilina/eosina (HE), azul de toluidina pH 4,0 (AT), Xylidine Ponceau pH 2,5 (XP) e Azul de Alcian pH 2,5 (AA). Foram identificados 103 animais com diagnstico de mastocitoma. Com a HE foram observadas poucas informaes a respeito do tumor. O AT mostrou, no grau I, forte basofilia metacromtica nas clulas tumorais. Com grau II, foram detectadas clulas fortemente metacromticas e clulas com basofilia moderada. Com grau III, foram encontradas clulas em intensa degranulao, com forte reatividade do estroma. O AA mostrou dados semelhantes aos registrados com AT. O XP mostrou clulas acidfilas nas amostras de mastocitoma grau I. Maior quantidade de clulas acidfilas foi achada em grau II. Com grau III foram identificadas clulas altamente acidfilas, invadindo um estroma fortemente acidfilo. possvel concluir que o mtodo mais utilizado rotineiramente em histopatologia no cora os grnulos dos mastcitos e as tcnicas que assim o fazem no evidenciam os limites celulares adequadamente. Palavras-chave: Mastocitoma; Histologia; Histoqumica; Histopatologia.

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Abstract
Mast cell tumors are the more common skin cancer in dogs. The objective in this study was the histochemistry and histopathological analysis of mast cell tumors. It was raised the incidence of the mast cell tumors from 1998 to 2005 in the Veterinary Hospital of the UNIPINHAL. Randomly, there were selected samples of the 3 skin levels for the histochemical approaches: hematoxilin/ eosin (HE), toluidin blue pH4.0 (TB), Xylidine Ponceau pH2,5 (XP) and Alcian Blue pH2.5 (AB). It was found 103 animals with diagnosis of mast cell tumors. With the HE it was observed few information of the tumor. The TB showed in rank I a strong one basophilic methacromasy in tumor cells. With rank II, it was observed cells strongly methacromasy and cell with moderated basophil. With rank III it was observed cells with strong strome reativity. The AB showed similar results to TB. The XP showed acidophilic cells in the mast cell tumors I rank. A great quantity of acidophilic cells was found in rank II. With rank III it was observed high acidophilic cells invading an strome strongly acidophil. It was concluded that the approach more utilized routinely in histopathology not stain the granules of the mast cell tumors and the techniques that stain them, do not show the cellular limits adequately. Keywords: Mast cell tumor; Histology; Histochemistry; Histopathology.

INTRODUO
Mastocitomas so as neoplasias de pele mais comuns nos ces e tambm esto presentes em vrias espcies de animais domsticos e representam cerca de 16 a 21% de todas as neoplasias cutneas e 11 a 27% de todo o tumor maligno canino. As neoplasias podem ser focais ou multicntricas na pele e podem envolver vsceras internas, ocasionalmente, como bao, fgado e intestino. As raas mais predispostas ao desenvolvimento destes tumores cutneos so: Bxer, Pug, Boston Terrier, Weimaraner e Labrador. A maioria dos tumores aparece em ces de meia-idade. No h nenhuma predileo de sexo. No foi encontrado um padro hereditrio no mastocitoma e sua etiologia desconhecida. S se sabe que provm de eventos genticos e moleculares, desenvolvendo-se em stios de inflamao crnica ou irritao (MEUTEN, 2002). A causa dos mastocitomas no est completamente elucidada, mas recentemente se indicou que h mutaes no ponto do gene c-kit, que codifica o domnio justa membrana do receptor tirosinaquinase do stem cell factor (SCF), em mastcitos neoplsicos de ces (REGUERA et al., 2000). Sugere-se uma possvel transmisso hereditria de seqncias gnicas nas raas mais predispostas, mas o desenvolvimento do tumor provavelmente depende de outros fatores carcinognicos irritantes ou de vrus (MACY, 1985; PULLEY; STANNARD, 1990). Nos ces, a pele o local mais comum de desenvolvimento, mas os mastocitomas podem se desenvolver no intestino, fgado, bao ou em outros rgos. Mastocitomas tm aparecimento altamente varivel, mas muitos so eritematosos, alopcicos e formam massas edematosas ou placas (LAVALLE; ARAJO; CARNEIRO, 2004). A maioria dos tumores de cor branco-amarelada, mas muito da cor e consistncia dessa neoplasia dependente do grau de degranulao e inflamao secundria que acontecem nos tumores. Ulcerao comum em tumores maiores. Tumores bem diferenciados (grau 1) tm pequena evidncia de recidiva depois de uma exciso cirrgica. Tumores moderadamente diferenciados (grau 2) tm um moderado potencial de metstase. Como esperado, tumores pouco diferenciados (grau 3) tm o mais alto potencial de metstase. A recidiva ps-cirrgica bastante comum em graus 2 e 3 (MEUTEN, 2002). O exame histopatolgico de extrema importncia no diagnstico, no planejamento da terapia e na determinao do prognstico. A vantagem principal de seu uso a preservao da arquitetura tecidual, necessria para a correlao do tipo de tecido neoplsico com o seu comportamento biolgico e resposta terapia (VAIL, 1996).
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A graduao histolgica do mastocitoma confusa pela existncia de 2 mtodos opostos de classificao (STREFEZZI, 2001). Bostock (1973) classificou os mastocitomas como Grau I aqueles pobremente diferenciados; Grau II, de diferenciao intermediria; e Grau III, neoplasias bem diferenciadas. J na classificao de Patnaik, Ehler e Macewen (1984), o mastocitoma Grau I compreende mastcitos maduros neoplsicos ou bem diferenciados; o Grau II constitudo por clulas moderadamente diferenciadas e o Grau III por mastcitos pobremente diferenciados, anaplsicos ou imaturos (ROCHA et al., 2004). A raridade do mastocitoma em seres humanos e outras espcies animais dificulta a comparao entre os dados obtidos na presente pesquisa e os da literatura. Considerando sua grande importncia na Medicina Veterinria e a incidncia relativamente baixa deste tipo de tumor em humanos, existe uma carncia de dados sobre essa forma de manifestao de cncer que necessita ser preenchida. O objetivo deste estudo foi analisar histolgica e histopatologicamente os diferentes graus de mastocitomas dos animais domsticos, utilizando tcnicas especiais de anlise, processamento e coloraes para se conseguir o mximo possvel de informao sobre o tema.

MATERIAIS E MTODOS
Foi realizado um levantamento da casustica dos mastocitomas nos trs diferentes graus (I, II e III) no perodo de 1998 at 2005, nos arquivos de Hospital Veterinrio do Centro Regional Universitrio de Esprito Santo do Pinhal (UNIPINHAL). Foram avaliados os casos com diagnstico definitivo para mastocitoma, sendo registrados parmetros como: raa, sexo, idade, tipo de exame utilizado para o diagnstico e grau de classificao morfolgica. Foram aleatoriamente selecionadas amostras dos 3 Graus de mastocitomas cutneos diagnosticados, para realizao dos respectivos mtodos histoqumicos: hematoxilina e eosina (HE), azul de toluidina pH 4,0 (AT), Xylidine Ponceau 2,5 (XP) e Azul de Alcian, 2,5 (AA), com o objetivo de avaliar o grau histolgico e a presena de grnulos metacromticos. Para avaliar o grau histolgico, foram obtidas seces de 4 m de cada tumor, coradas com HE, segundo a tcnica de Culling (1985). Cada mastocitoma foi graduado de acordo com os critrios propostos por Patnaik, Ehler e Macewen (1984). Esses critrios incluem quantidade de citoplasma, forma e diferenciao celular, colorao e forma do ncleo, nmero de nuclolos, nmero de figuras mitticas e outras alteraes, como edema e necrose. Esses dados permitiram diferenciar os mastocitomas em trs graus: grau I (bem diferenciado), grau II (moderadamente diferenciado) e grau III (pouco diferenciado). O mesmo mtodo rotineiro foi utilizado para as tcnicas com Azul de Toluidina, em pH 4,0, Azul de Alcian pH 2,5 e Xylidine Ponceau pH 2,5. Aps esse procedimento, as lminas foram lavadas em gua, desidratadas, clarificadas e montadas (CULLING et al., 1985).

RESULTADOS
Anlise da incidncia dos mastocitomas Foram selecionados 103 animais com diagnstico definitivo de mastocitoma no perodo citado anteriormente. A mdia de idade desses foi de 7,5 anos, dos quais 54% eram fmeas e 46% machos, sendo que 50,5% foram diagnosticados por exame histopatolgico e 49,5% por exame citopatolgico. A distribuio das raas mais acometidas e dos graus de classificao cito-histopatolgicos esto apresentados na Figura 1a e Tabela 1. A distribuio de classificao dos tumores, quanto ao grau, pode ser visualizada na Figura 1b e Tabela 2, demonstrando a alta incidncia de tumores de grau III e uma significativa quantidade de tumores no-classificados, podendo ser este o motivo da diferena deste estudo retrospectivo comparado aos dados da literatura consultada.

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Anlise histopatolgica Mastocitoma grau I Corte histolgico apresenta proliferao de clulas de morfologia arredondada, em derme superficial, profunda e panculo adiposo. As clulas apresentam citoplasma amplo e basoflico, variando de arredondado a fusiforme, bem como ncleos grandes, centrais, com cromatina frouxa e nuclolos evidentes. As clulas invadem a matriz extracelular, causando colagenlise. No citoplasma das clulas, observam-se grnulos que so corados pelo Azul de Toluidina e essa proliferao celular acompanhada de infiltrado inflamatrio eosinoflico. Clulas apresentam-se com pouca anisocitose e anisocariose. Mastocitoma grau II Corte histolgico de pele apresenta proliferao de clulas de morfologia arredondada, em derme superficial, profunda e panculo adiposo. As clulas apresentam citoplasma amplo e basoflico, variando de arredondado a fusiforme, bem como ncleos grandes, centrais, com cromatina frouxa e nuclolos evidentes. As clulas invadem a matriz extracelular, causando colagenlise. No citoplasma das clulas, observam-se grnulos que so corados positivamente pelo Azul de Toluidina e essa proliferao celular acompanhada de infiltrado inflamatrio eosinoflico. Mastocitoma grau III Corte histolgico apresenta proliferao de clulas de morfologia arredondada circundada por intensas reas de necrose de coagulao. As clulas apresentam citoplasma amplo, com intensa anisocitose e anisocariose, cromatina frouxa e nuclolos evidentes. H presena de clulas neoplsicas no interior dos vasos. O citoplasma das clulas corado fracamente pelo Azul de Toluidina. Anlise morfolgica e histoqumica Com a utilizao da colorao HE foram observadas poucas informaes a respeito dos mastocitomas. Com grau I de classificao, foram visualizadas agrupamentos de poucas clulas fortemente acidfilas no estroma invadido (FIGURA 2A e 2B). Nos mastocitomas grau II, foram observadas clulas em maior nmero e fortemente acidfilas (FIGURA 2C e 2D). Finalmente, com o grau III, foi encontrado um grande nmero de clulas, com menor acidofilia em relao s amostras com grau I e II (FIGURA 2E e 2F). Aparentemente, ao redor das clulas tumorais, a quantidade de linfcitos aumenta de acordo com o grau do tumor observado. A colorao com AT mostrou, no grau I, uma forte basofilia metacromtica nas clulas presentes no mastocitoma. Por outro lado, o estroma ao redor das clulas tumorais mostrou-se fracamente corado (FIGURA 3A e 3B). Com grau II, possvel observar clulas fortemente metacromticas ao lado de clulas com basofilia moderada. Novamente, o estroma mostrou-se fracamente corado (FIGURA 3C e 3D). Com grau III, foram observadas clulas em intensa degranulao, mostrando forte reatividade do estroma ao AT. Os dados obtidos com o AA mostraram alguma semelhana com os registrados com AT. Nos tumores grau I, foram observadas clulas fortemente marcadas com AA (FIGURA 4A e 4B). Com grau II, foram observadas clulas com moderada marcao (FIGURA 4C e 4D). Com grau III, foram observadas clulas com marcao muito fraca (FIGURA 4E e 4F). Aparentemente, observou-se colorao mais evidente no estroma ao redor das clulas tumorais com grau III. A colorao com XP mostrou clulas com leve acidofilia nas amostras de mastocitoma grau I (FIGURA 5A e 5B). Uma maior quantidade de clulas ligeiramente acidfilas pde ser visualizada nas amostras com grau II (FIGURA 5C e 5D). Finalmente, com grau III, pde ser visualizada grande quantidade de clulas altamente acidfilas invadindo o estroma. Neste ltimo caso, o estroma apresentou-se tambm fortemente acidfilo.

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FIGURA 1 - Incidncia de mastocitomas no Hospital Veterinrio do Unipinhal. A) Distribuio das raas mais acometidas por mastocitoma. B) Distribuio da classificao dos mastocitomas quanto ao grau Figure 1 - Mast cell tumor incidence in the Unipinhal Veterinary Hospital. A) Distribution of the races more attacked by mast cell tumor. B) Distribution of the classification of mast cell tumor as regards the rank TABELA 1 - Distribuio das raas mais acometidas por mastocitoma Table 1 - Distribution of the races more attacked by mast cell tumor

TABELA 2 - Distribuio por grau dos mastocitomas encontrados Table 2 - Distribution by rank of the mast cell tumor found

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FIGURA 2 - Mastocitoma canino corado com Hematoxilina e Eosina. Em A) e B) grau I; C) e D) grau II; E) e F) grau III. Aumento final: 100x para A, C e E; 200x para B, D e F Figure 2 - Canine mast cell tumor stained with Hematoxilin and Eosin. In A) and B) rank I; C) and D) rank II; E) and F) rank III. Final magnification: 100x for A, C and D; 200x for B, D and F
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FIGURA 3 - Mastocitoma canino corado com Azul de Toluidina pH 4,0. Em A) e B) grau I; C) e D) grau II; E) e F) grau III. Aumento final: 100x para A, C e E; 200x para B, D e F Figure 3 - Canine mast cell tumor stained with Toluidin Blue at pH 4.0. In A) and B) rank I; C) and D) rank II; E) and F) rank III. Final magnification: 100x for A, C and D; 200x for B, D and F
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FIGURA 4 - Mastocitoma canino corado com Azul de Alcian em pH 2,5. Em A) e B) grau I; C) e D) grau II; E) e F) grau III. Aumento final: 100x para A, C e E; 200x para B, D e F Figure 4 - Canine mast cell tumor stained with Acian Blue at pH 2.5. In A) and B) rank I; C) and D) rank II; E) and F) rank III. Final magnification: 100x for A, C and D; 200x for B, D and F
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FIGURA 5 - Mastocitoma canino corado com Xylidine Ponceau em pH 2,5. Em A) e B) grau I; C) e D) grau II; E) e F) grau III. Aumento final: 100x para A, C e E; 200x para B, D e F Figure 5 - Canine mast cell tumor stained with Xylidine Ponceau at pH 2.5. In A) and B) rank I; C) and D) rank II; E) and F) rank III. Final magnification: 100x for A, C and D; 200x for B, D and F
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DISCUSSO
Os dados encontrados no presente estudo retrospectivo esto de acordo com os resultados encontrados na literatura, diferindo apenas entre as raas mais acometidas, que so os ces sem raa definida (SRD) e Bxer, e quanto distribuio de classificao quanto ao grau, em que os mastocitomas grau III so mais comuns que o grau II, sendo que a literatura consultada aponta o contrrio. Estes fatos podem ser explicados pela grande quantidade de animais SRD atendidos no HOVET e pelo nmero de tumores noclassificados. Assim, possivelmente, a real distribuio dos animais quanto graduao foi mascarada. OKeefe (1990) e Abadie, Amardeilh e Delverdier (1999) consideram a anlise histopatolgica das leses como no sendo sempre capaz de diferenciar tumores clinicamente benignos e malignos, apenas determinando, com um pouco mais de preciso, a probabilidade de recidiva e de metstase. Pulley e Stannard (1990) afirmam que, pela grande variao no comportamento entre os ces, todos os mastocitomas devem ser considerados potencialmente malignos. Macy (1985) classifica a histopatologia como o mtodo mais controverso para a previso do comportamento biolgico dessas neoplasias. Variveis responsveis por isso incluem a heterogenicidade do tumor, estgio clnico e extenso microscpica das massas. Foram utilizados vrios mtodos histoqumicos para a anlise dos mastocitomas presentes nos arquivos do Hospital Veterinrio da Unipinhal. Foram utilizadas as coloraes HE, padro na maioria dos laboratrios de histopatologia, alm de outras coloraes rotineiramente no-usuais, como o AT, AA e o XP. Com a HE, os grnulos dos mastcitos no so corados, enquanto que isso ocorre em outras coloraes como Pantico rpido, Azul de Toluidina e Azul de Alcina. A presena dos grnulos na imagem dificulta a individualizao das margens de cada ncleo, levando o observador a traar um contorno menos preciso. Na colorao HE, nos tumores de grau I, pode-se observar a baixa celularidade com mastcitos bem diferenciados, quase sem degranulao, arranjados em pequenos grupos de clulas, citoplasma amplo e limite bem visvel, sem sinais de edema ou necrose e figuras mitticas ausentes. Nos tumores de grau II, h moderada taxa de celularidade, onde as clulas mostram um ligeiro pleomorfismo. O citoplasma dos mastcitos do tumor grau II no diferencia muito do grau I, pois tambm so distintos. Algumas clulas binucleadas so observadas, assim como reas de necrose e algumas raras figuras de mitose. Nos tumores de grau III, foi encontrada alta celularidade com mastcitos pleomrficos, citoplasma indistinto e grnulos no evidenciados neste tipo de colorao. Apesar de sua grande utilizao, a HE fornece poucas informaes para mastocitomas menos diferenciados. O AT cora estruturas cidas das clulas, sendo muito utilizado para o estudo de DNA e RNA e um corante bsico que forma ligaes eletrostticas com os radicais cidos presentes nos tecidos. As estruturas cidas dos tecidos (DNA, RNA, polissacardeos cidos) coram-se em azul com esse mtodo. Isso permite visualizar grnulos citoplasmticos metacromticos em mastcitos. Com o Azul de Toluidina (AT), observam-se clulas com uma leve basofilia metacromtica. O AT se liga aos grupos PO4-, SO4-, COO-, que em pH 4,0 esto presente em DNA, RNA e glicosaminoglicanos. O AT tem a vantagem de fornecer informaes sobre atividade celular, uma vez que um citoplasma altamente basfilo indica normalmente grande quantidade de RNAr citoplasmtico encontrado no retculo endoplasmtico rugoso (TOBOGA; VILAMAIOR, 2007; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Foram observados nos tumores de grau I grnulos citoplasmticos metacromticos e nuclolo evidente. A degranulao quase nula. Nos tumores de grau II notam-se mastcitos bem agrupados, com o limite citoplasmtico, fica difcil de ser observado devido grande degranulao. Nos tumores de grau III, a alta celularidade e a grande quantidade de mastcitos degranulandos j no permitem limitar as clulas umas das outras, formando uma rea de clulas multinucleadas, pleomrficas e muitas clulas gigantes presentes. O AA o mtodo utilizado para evidenciar polissacardeos cidos. Existe uma superposio nos pH, o que impossibilita a separao ntida de polissacardeos fortemente e fracamente sulfatados. Os polissacardeos cidos coram-se em azul celeste (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Pode-se observar os polissacardeos cidos mais fortemente corados por este mtodo nos tumores de grau I, moderadamente corados nos tumores de grau II e pobremente corados nos tumores de grau III. Esse resultado observado devido aos grnulos presentes nos mastcitos, uma vez que existem glicosaminoglicanos em seu interior.
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O XP consiste em usar um corante acidfilo, que cora radicais positivos NH3+, que em pH 2,5 so encontrados em protenas totais (LISON, 1960; MELLO, 1997). Pde-se observar nos tumores de grau I as protenas totais fortemente coradas por XP nos tumores de grau II moderadamente coradas e, nos de grau III, pobremente coradas. possvel que existam proteoglicanos nos mastcitos. Os proteoglicanos tm um centro protico onde os glicosaminoglicanos se ligam. Isso explicaria a sua colorao com AT, AA e XP. Alm disso, pode haver outras protenas nesses grnulos citoplasmticos. Num estudo da matriz extracelular e grnulos citoplasmticos de mastocitomas caninos por mtodos histoqumicos foi verificado o aparente aumento da degradao de colgenos e fibras reticulares conforme o aumento da anaplasia dos mastocitomas; os grnulos citoplasmticos so menos expressos com o aumento da graduao dos mastocitomas. O mtodo utilizado nesse estudo foi o da aldedo-fucsina de Gomori, que apresentou melhores resultados para a marcao de granulaes citoplasmticas, principalmente em mastocitomas de grau III (MOTA et al., 2003). Foram observados eosinfilos isolados ou agrupados em todos os graus dos mastocitomas estudados. Nos mastocitomas, os eosinfilos contribuem para a formao do estroma e na angiognese (CHNIER; DOR, 1998). Em tumores cutneos de ces, como histiocitomas, a P-selectina no est envolvida e os eosinfilos no so relatados (CHNIER; DOR, 1998). Os resultados do presente estudo mostram grande quantidade de eosinfilos nos graus I e II, indicando menor malignidade dos tumores e/ ou resposta do organismo hospedeiro s clulas tumorais invasivas. Segundo Goldschmidt e Hendrick (2002), a presena de eosinfilos pode auxiliar no diagnstico de mastocitomas pouco diferenciados, para evitar o diagnstico de tumor de clulas redondas, sem especificao da clula de origem. A interleucina 5 (IL-5), produzida por mastcitos e por eosinfilos, pode ter papel fundamental na atrao dessas ltimas clulas para o local da leso (LALANI; SIMMONS; AHMED, 1999). Os resultados da presente pesquisa esto de acordo com os dados da literatura citados acima. Foram observadas grandes reas de necrose e degenerao tecidual nos animais onde ocorreu o diagnstico de mastocitomas grau III. Foram identificadas grandes reas de hemorragia ao redor das clulas tumorais invasivas. importante criar condies no sentido de que sejam desenvolvidos trabalhos de acompanhamento da evoluo de cada paciente, com o objetivo de testar o valor prognstico em relao aos mastocitomas, independentemente da graduao histopatolgica, correlacionando-a com o tempo de sobrevivncia, recidiva, e presena ou no de metstases no animal. Os mtodos histoqumicas fornecem informaes adicionais aos dados normalmente utilizados em histopatologia.

CONCLUSES
Os mtodos histoqumicos fornecem informaes adicionais aos dados normalmente utilizados em histopatologia. Alm disso, comparando os resultados ora obtidos com os dados da literatura, verificou-se uma srie de similaridades, sejam morfolgicas, histoqumicas ou clnicas, entre os osteossarcomas e outras patologias sseas caracterizadas por alteraes na ossificao.

REFERNCIAS
ABADIE, J. J.; AMARDEILH, M. A.; DELVERDIER, M. E. Immunohistochemical detection os proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 in mast cell tumors from dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association, Schaumburg, v. 125, n. 11, p. 1629-1634, Dec.1999. BOSTOCK, D. E. The prognosis following surgical removal of mastocytomas in dogs. J. Small Animal Practice, England, v. 14, p. 27-40, 1973. CHNIER, S.; DOR, M. P- selection expression in canine cutaneous inflammatory diseases and mast cell tumors. Veterinary Pathology, Stanford, v. 35, p. 85-93, 1998.

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Jussnia Pereira Pinto; Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira; Arnaldo Rodrigues dos Santos Jnior

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Rev. Acad., Curitiba, v. 5, n. 3, p. 265-276, jul./set. 2007