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4.4Espectrofotometria de Absorção Ultravioleta/Visível

Técnica: espectrofotometria UV/VIS Equipamento: espectrofotômetro Determinação: absorção de luz (absorbância)

4.4.1

Introdução:

Os métodos óticos de análise são um conjunto de métodos de análise química que empregam a luz, e se baseiam na interação da luz com a amostra, para quantificar as substâncias. Esses métodos são baseados na medida da quantidade de energia emitida ou absorvida pelas moléculas e pelas espécies atômicas de interesse.

Como são métodos onde se emprega a luz como estímulo à amostra, é necessário recordarmos: O QUE É LUZ?

REM = radiação eletromagnética = energia radiante = LUZ =

Luz ou radiação eletromagnética é uma forma de energia que é transmitida através do espaço a velocidades enormes (velocidade da luz = 300.00 km/s, no vácuo).

Essa

radiação

pode

ser

descrita

como

comprimento de onda (), freqüência (f):

onda

com

propriedades

como

onda (  ), freqüência (f): onda com propriedades como Mas, qual a importância disso? É

Mas, qual a importância disso?

É por que cada substância química presente na amostra interage com um tipo de luz; essa interação se dá na forma de ABSORÇÃO ou EMISSÃO da luz em comprimentos de onda definidos (próprios da substância que está sendo analisada, de acordo com suas propriedades químicas e distribuição eletrônica).

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Parâmetros que caracterizam a luz:

Comprimento de onda (): Distância entre 2 máximos sucessivos (duas cristas ou dois vales da onda), e é medida em metros, centímetros, milímetros, nanômetros (nm = 10 - 9 m), ângstrons (Å = 10 -10 m).

A tabela abaixo mostra a unidade de comprimento de onda para várias regiões

espectrais:

de comprimento de onda para várias regiões espectrais: Energia (E): Quando analisamos as emissões e absorções

Energia (E): Quando analisamos as emissões e absorções de luz por um átomo de determinado elemento químico, a radiação eletromagnética é tratada como pacotes discretos de energia ou partículas chamadas fótons ou quanta.

A energia do fóton é definida pela expressão:

E =

h x c

sendo h a constante de Planck, 6,63x10 -34 J.s , c a velocidade da luz no vácuo (3x10 8 m/s) e o comprimento de onda, em metros.

Como podemos classificar os tipos de radiação (luz) existentes?

Os métodos óticos são classificados de acordo com a região do espectro eletromagnético envolvida na medida da absorção ou emissão da luz, podendo ser os raios X, a luz ultravioleta (UV), a luz visível (composta pelas cores do arco íris), a luz infravermelha (IV), as mais importantes.

O espectro eletromagnético é o arranjo ordenado dos tipos de radiação eletromagnética conforme seus comprimentos de onda, na forma de tabelas ou quadros, como ilustrado nas figuras abaixo:

ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO:

Veja abaixo os tipos de radiação eletromagnética (luz) existentes no planeta, e suas respectivas características:

existentes no planeta, e suas respectivas características: Apostila de Análise Instrumental Aplicada a alimentos

Apostila de Análise Instrumental Aplicada a alimentos

Profª Elaine A. O. Coringa

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Raios gama é uma forma de radiação altamente energética, emitida a partir do núcleo de elementos radioativos.

Raios X - radiação de alta energia que tem a capacidade de penetrar nos organismos, atravessando os tecidos de menor densidade e sendo absorvidos pelas partes densas do corpo, com dentes e ossos. ----

Ultravioleta (UV) é um tipo de radiação proveniente do Sol, retida em parte pela camada de ozônio.

Radiação visível (VIS) é a faixa de radiação que nos permite enxergar o mundo que nos cerca. A decomposição da radiação visível nos mostra que ela é constituída por sete cores: violeta, anil, azul, verde, amarelo, alaranjado e vermelho.

Raios infravermelhos (IV) esse tipo de radiação é emitida por objetos quentes. As chamadas lâmpadas infravermelho são utilizadas para ativar a circulação sanguínea e para diminuir processos inflamatórios.

Raios hertezianos essa forma de radiação apresenta baixa energia e sua recepção e transmissão são feitas por antenas. Estão incluídas as ondas de rádio AM e FM, e as ondas de TV. Não costumam ser estudadas em análises químicas.

Radiação de microondas tem aplicações tecnológicas e analíticas, como o forno de microondas.

4.4.2 Análise quantitativa por medidas de absorção/emissão de luz:

Vamos entender agora como podemos quantificar uma substancia em uma amostra material somente pela quantidade de luz absorvida ou emitida.

Cada faixa de comprimento de onda da luz que uma substância absorve, por exemplo, fornece um tipo de informação diferente, que pode ser usada por diferentes técnicas instrumentais óticas. Veja:

- A absorção/emissão de luz de comprimentos de onda das microondas e do infravermelho dá informações sobre a estrutura molecular da substância química de interesse (quem está ligado com quem e com que tipo de ligação química).

- A absorção/emissão de luz de comprimentos de onda da luz visível pode dar valiosas informações quantitativas, pois quanto mais colorida for uma substância, mais concentrada ela está naquela substância.

- Do ultravioleta em diante, podemos obter informações sobre a composição elementar, a nível de grupos funcionais de uma molécula orgânica (se é ácido carboxílico, álcool, cetona, amina, etc.);

Num raciocínio intuitivo, a concentração de uma substância colorida, dissolvida num solvente incolor (como a água),é proporcional à intensidade de cor da solução. Desse modo, a intensidade de cor é uma medida da concentração da solução.

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Como medir quantitativamente a intensidade da cor de uma solução? Como é a relação exata disso com a concentração?

Analisemos por que certas substâncias são coloridas e também por que as substâncias podem ter cores diferentes.

As substâncias são coloridas porque emitem luz visível. Desse modo, a luz que é emitida por uma substância só vai ter os comprimentos de onda que ela não absorveu (ou seja se o objeto parece amarelo é porque ele refletiu a luz visível no comprimento de onda da cor amarela, e absorveu todas as outras cores).

A retina do nosso olho verá, então, mais fortemente as cores que deixam de ser absorvidas. O preto existirá quando a substância (ou mistura de) absorve todas as cores da luz visível.

(ou mistura de) absorve todas as cores da luz visível. A proporcionalidade entre concentração da substância

A proporcionalidade entre concentração da substância e absorção de luz também é válido na emissão de luz: quanto mais concentrada for uma amostra em determinado composto químico, mais luz este composto químico emitirá quando excitado.

É o que acontece no teste de chama: se colocarmos uma solução de um composto metálico (o sódio, por exemplo) para aquecer em uma chama de bico de Bunsen, ele emitirá uma luz amarela, no mesmo comprimento de onda que ele absorveria se estivesse em contato com uma lâmpada de radiação visível.

Cor Intervalo de comprimentos de onda vermelha 780 – 622 alaranja 622 – 597 amarela
Cor
Intervalo de comprimentos de onda
vermelha
780 – 622
alaranja
622 – 597
amarela
597 – 577
verde
577 – 492
azul
492 – 455
violeta
455 – 380
Elemento
Comprimento de onda (em nm)
Na
589
Li
671
Ca
616
Sr
707
Ba
624

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Portanto, quanto mais concentrado ele estiver naquela substância, mais luz (radiação eletromagnética) ele irá emitir ou absorver.

da

transformação da interação da luz (por absorção ou emissão) em concentração de uma substancia

na amostra material.

Essa

é

a

base

de uma substancia na amostra material. Essa é a base A luz pode interagir com a

A luz pode interagir com a matéria (amostra) por vários processos, iremos

citar os mais importantes:

Absorção espectrofotometria de absorção UV/Vis e Absorção Atômica

Emissão espectrofotometria de emissão de chama (Fotometria de chama)

Refração Refratometria

Polarização Polarimetria

Iremos detalhar nos capítulos seguintes cada técnica instrumental acima citada, para compreender como conseguimos medir a concentração de um composto químico somente pela interação do mesmo com a luz.

A palavra espectrofotometria designa um método de análise baseado em

medidas de absorção de radiação eletromagnética.

A técnica que aqui se descreve está restrita a uma pequena região de

comprimento de onda da radiação eletromagnética, que corresponde à luz visível e o ultra-violeta, cuja faixa está entre aproximadamente 200 e 760 nm.

Desta forma, podemos então dividir a espectrofotometria de acordo com sua faixa de comprimento de onda de absorção em:

- Espectrofotometria UV: absorve radiações com comprimento de onda entre 180 a

340nm;

- Espectrofotometria Visível: absorve radiações com comprimento de onda entre 340 a 760nm;

A análise na região do UV é aplicada para compostos orgânicos onde a

absorção de energia é uma função direta do grupo funcional que a identifica. Exemplo:

álcool, cetona, amina, ácido carboxílico.

A análise na região do visível é aplicada para compostos inorgânicos que

possam desenvolver cor após tratamento químico adequado, mesmo em soluções muito

diluídas. Exemplo: ferro, fósforo.

O espectrofotômetro é um instrumento que permite determinar a concentração

de uma substância de acordo com o seu grau de absorção de luz, através da comparação

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da radiação absorvida ou transmitida por uma solução amostra de concentração desconhecida, e uma quantidade conhecida da mesma substância (solução padrão).

4.4.3 Teoria da espectrofotometria Lei de Beer-Lambert:

A base da técnica é que a concentração de uma substância colorida, dissolvida num solvente incolor (como a água),é proporcional à intensidade de cor da solução.

Desse modo, a intensidade de cor é uma medida da concentração da solução. Como medir quantitativamente a intensidade da cor de uma solução? Como é a relação exata disso com a concentração?

Para podermos quantificar a luz que é absorvida por uma substância química, é necessário relacionar essa quantidade empírica em uma quantidade numericamente palpável.

Na tentativa de explicar essa relação quantitativa entre luz concentração, um pesquisador chamado Lambert estudou a transmissão de luz por sólidos homogêneos, e Beer estendeu o trabalho de Lambert ao estudo de soluções.

da

Espectrofotometria, com a chamada Lei de Beer-Lambert.

Através dessa lei, intensidades da luz incidente (que chega na amostra) e emergente (que sai da amostra = transmitida) podem ser relacionadas com as concentrações da substância presente na solução. Para que esta lei tenha efeito, é necessário que a radiação incidente (a luz) seja monocromática, quer dizer, de um comprimento de onda definido.

Para medir a concentração mede-se a luz absorvida e não a refletida. Mas, o que se mede diretamente não é a quantidade de luz absorvida. Só se poderá fazer isto se houvesse um detector de luz junto a cada molécula da substância química, para ver se ela absorveu ou não o fóton de luz. O que se faz normalmente é medir a luz que consegue passar pela amostra, e não a luz que é absorvida.

Para entendermos com mais detalhes esse fenômeno, observe a seguinte figura:

As

conclusões

destes

dois

pesquisadores

deram

origem

à

lei

Considere uma solução colorida dentro de uma cubeta (porta-amostra), que recebe certa quantidade de luz
Considere uma solução colorida dentro
de uma cubeta (porta-amostra), que
recebe certa quantidade de luz
incidente:
= Luz transmitida Luz incidente = b
= Luz transmitida
Luz incidente =
b

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Quando se incide um feixe de luz com intensidade I 0 (100%) em uma amostra liquida, após passar pela amostra ele terá uma intensidade menor (I 1 < 100%), pois uma parte da luz foi absorvida pela substância química.

A quantidade de luz que passou pela amostra chama-se TRANSMITÂNCIA, cujo valor é percentual, e é detectada no aparelho espectrofotômetro. A quantidade de luz que é absorvida pela substância na amostra chama-se ABSORBÂNCIA, cujo valor é logarítmico.

• TRANSMITÂNCIA = qtde. de luz que passou pela amostra (%T) • ABSORBÂNCIA = qtde.
• TRANSMITÂNCIA = qtde. de luz que passou pela amostra (%T)
• ABSORBÂNCIA = qtde. de luz absorvida pela amostra (A)
• ABSORBÂNCIA = qtde. de luz absorvida pela amostra (A) Como a TRANSMITANCIA de uma substancia

Como a TRANSMITANCIA de uma substancia é mais fácil de ser quantificada pelo aparelho, para determinar a ABSORBÂNCIA da amostra é preciso fazer uma conversão matemática, empregando a seguinte equação:

A = -log (T/100)

Desta forma, podemos fazer as seguintes aproximações:

Se uma amostra transmite 50% da radiação incidente nela, quanto ela absorve?Desta forma, podemos fazer as seguintes aproximações: A transmitância é igual a 50%  T =

A transmitância é igual a 50% T = 50

Quanto será a absorbância? A = ?

A = - log T/100 = - log 50/100 = - log 0,5 = - (-0,30) = +0,30

Verifique agora se os valores de absorbância da escala acima são condizentes com os valores de transmitância. Faça esse exercício!= - log T/100 = - log 50/100 = - log 0,5 = - (-0,30) =

Podemos relacionar a quantidade de luz absorvida (Absorbância) de uma substância com a sua concentração na amostra. Essa relação é expressa matematicamente pela equação:

A = a . b. C

A = absorbância (varia de 0 a 2)

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a ou = absortividade específica constante que indica o grau de absorção da

substância naquele comprimento de onda (valor tabelado ou determinado através de

uma solução padrão);

b = espessura do caminho ótico, em cm. É a espessura da cubeta que contém a amostra (valor dado pelo fabricante do espectrofotômetro)

C = concentração da substância na amostra, em mol/L ou g/L.

Por esta equação, vemos claramente que a concentração de uma substância é diretamente proporcional à ABSORÇÃO DE LUZ pela mesma substância, em uma cubeta de espessura definida e em determinado comprimento de onda de absorção.

Veja como podemos utilizar essa equação para determinar a concentração de uma substancia colorida:

Uma substância de absortividade igual a 970 L.mol - 1 cm - 1 apresentou uma absorbância de 0,15 num comprimento de onda igual -1 cm -1 apresentou uma absorbância de 0,15 num comprimento de onda igual a 590 nm, em uma cubeta de 1cm de caminho ótico. Calcule a concentração dessa substância na solução amostra.

Dados:

Absorbância A = 0,15 Absortividade molar = 970 M -1 cm -1 Caminho ótico b = 1 cm Concentração C = ? Aplicando a equação da lei de Beer, temos: A = . b . C 0,15 = 970 x 1 x C Isolando C (concentração), fica:

C = 0,15 / 970 x 1 = 1,55.10 -4 mol/L = 0,000155 mol/L

4.4.4 Validação da Lei de Beer-Lamber a curva de calibração:

Para verificar se a Lei de Beer-Lambert está sendo cumprida para determinada substância, devemos fazer um gráfico utilizando uma série de soluções padrão de concentrações conhecidas da substância, e determinar suas absorbâncias no comprimento de onda de máxima absorção.

Então, de posse dos dados de absorbância e concentração das soluções padrão, plotamos um gráfico de Ap (absorbância padrão) x Cp (concentração padrão), chamado CURVA DE CALIBRAÇÃO.

Veja um exemplo de curva de calibração da substância KMnO 4 (permanganato de potássio), onde foram utilizadas 9 soluções padrão (observe os pontos no gráfico) 4 (permanganato de potássio), onde foram utilizadas 9 soluções padrão (observe os pontos no gráfico) com suas respectivas absorbâncias medidas a um comprimento de onda de 545 nm em uma cubeta de 1 cm de caminho ótico:

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Cuiabá Bela Vista Curso de Engenharia de Alimentos 83 Uma relação linear (reta) no gráfico indica

Uma relação linear (reta) no gráfico indica que a substância em solução obedece a Lei de Beer nas condições da análise, e pode servir de curva de calibração para a determinação da concentração de soluções de mesma natureza. Isso significa dizer que ao aumentar-se a concentração da substância, sua absorbância aumenta proporcionalmente (por ex., se duplicarmos a concentração, a absorbância duplica).

4.4.5

Determinação

experimental

da

concentração

da

substância

na

amostra:

Vamos supor agora que você queira determinar a concentração da vitamina C em suco de laranja industrializado. Você pode fazer isso de duas formas:

PELO FATOR DE CALIBRAÇÃO método simplificado (1 solução padrão): através de uma solução padrão de concentração conhecida da substância que se quer determinar na amostra (nesse caso, vitamina C): prepara-se em laboratório uma solução de vitamina C com uma concentração exatamente conhecida, por exemplo, 0,0004 mol/L (ou 4.10 -4 mol/L), e determina-se a sua absorbância no comprimento de onda de máxima absorção. Desta forma, temos dois dados importantes:

Ap = absorbância da solução padrão

Cp = concentração da solução padrão (0,0004 mol/L)

Com esses dados, calcula-se o fator de calibração da vitamina C (Fc):

Fc = Cp / Ap

Supondo que a absorbância da solução padrão fosse 0,89, o fator de calibração seria igual a: Fc = 0,0004 / 0,89 = 4,5

Para calcular a concentração de vitamina C na amostra (Ca), multiplica-se o valor da sua absorbância (Aa) por esse fator de calibração:

Ca = Aa x Fc

Se a absorbância da amostra for igual a 0,67, a sua concentração será igual a:

Ca = 0,67 x 4,5 = 0,0020 mol/L

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Viu como é fácil? Agora tente você:

Para determinar o ácido fosfórico em uma amostra de refrigerante, preparou-se uma solução padrão de ácido fosfórico de concentração igual a 1,45 x 10 -3 mol/L, e sua absorbância foi lida no espectrofotômetro a 378 nm, cujo valor foi igual a 0,35. A amostra de refrigerante foi colocada no mesmo espectrofotômetro, e mostrou uma absorbância igual a 0,12. Calcule a concentração do acido fosfórico na amostra de refrigerante. (R = 4,97 x 10 -4 mol/L)

PELA CURVA DE CALIBRAÇÃO: a curva de calibração é um gráfico construído com pelo menos 5 soluções padrões de concentrações conhecidas (Cp) e crescentes da substancia de interesse. Determina-se a absorbância (Ap) de todas essas soluções padrões e plota-se Cp (eixo x) x Ap (eixo y), desta forma:

padrões e plota-se Cp (eixo x) x Ap (eixo y), desta forma: Construído o gráfico, podemos

Construído o gráfico, podemos determinar a concentração da substância de interesse na

amostra pela regressão linear dos dados, obtendo-se a EQUAÇAO DA RETA do

tipo
tipo

y = ax + b,

onde:

y

= Aa (absorbância lida da amostra)

x

= Ca (concentração da substancia na amostra)

a e b = coeficientes de ajuste dados pelo método dos mínimos quadrados (constantes numéricas )

Substitui-se o valor de y (leitura de A da amostra) na equação e calcula-se o valor de x (Ca). É um método muito mais preciso e exato.

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Agora, faça os exercícios:

Determine a concentração de uma substância na amostra (Aa = 0,90) através do uso de uma solução padrão, cujos dados foram: Apadrão = 0,73 e Cpadrão = 0,00046 mol/LDetermine a concentração de uma substância na amostra (Aa = 0,158) através da curva de

Determine a concentração de uma substância na amostra (Aa = 0,158) através da curva de calibração, cujos dados estão na tabela abaixo:(Aa = 0,90) através do uso de uma solução padrão, cujos dados foram: Apadrão = 0,73

Padrão nº

Concentração

Absorbância

01

1,0

0,056

02

2,0

0,129

03

3,0

0,209

04

4,0

0,313

4.4.6 Instrumentação o espectrofotômetro:

Vamos estudar agora como determinamos a concentração de uma substância utilizando o ESPECTROFOTÔMETRO.

Um espectrofotômetro é um equipamento utilizado para se determinar quantidades muito pequenas de substâncias em uma amostra, da ordem de 0,01 mol/L ou menor. Para isso, utiliza a Lei de Beer para determinar a concentração (Absorbância é proporcional à concentração da substancia na solução).

É um aparelho que apresenta boa sensibilidade, baixo custo relativo, fácil operação, e possui aplicações analíticas variadas, em análise química quantitativa de várias amostras materiais (solo, água, alimentos, líquidos biológicos).

O esquema dos componentes do espectrofotômetro pode ser descrito da seguinte maneira:

do espectrofotômetro pode ser descrito da seguinte maneira: Apostila de Análise Instrumental Aplicada a alimentos
do espectrofotômetro pode ser descrito da seguinte maneira: Apostila de Análise Instrumental Aplicada a alimentos

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Cuiabá Bela Vista Curso de Engenharia de Alimentos 86 Figura 1.7 Esquema óptico dos principais componentes

Figura 1.7 Esquema óptico dos principais componentes do espectrofotômetro. As letras representam: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora de X, (e) compartimento de amostras com cubeta contendo solução, (f) célula fotelétrica, (g) amplificador.

Link de um video mostrando todos os componentes do espectrofotômetro e seu funcionamento: http://www.youtube.com/watch?v=R4ZT3g2-Ryg

1. Fonte de luz: é a lâmpada do aparelho, responsável por enviar a luz de comprimento de onda desejado à amostra. Pode ser uma lâmpada de tungstênio (luz visível) ou de hidrogênio / deutério (luz ultravioleta), dependendo do aparelho. Deve ter uma intensidade constante durante a analise, e tem uma vida útil pré-definida pelo fabricante.

analise, e tem uma vida útil pré-definida pelo fabricante. 2. Selecionador de comprimento de onda :

2. Selecionador de comprimento de onda: chama-se monocromador, isola o comprimento de onda de máxima absorção da substância que se deseja determinar, o qual é informado pelo operador. Este componente pode ser de dois tipos: um prisma (que divide a luz em vários comprimentos de onda individuais mais preciso) ou um filtro (que divide a luz em intervalos ou faixas de comprimentos de onda menos preciso). É uma peça importante e que define o preço do espectrofotômetro.

importante e que define o preço do espectrofotômetro. Apostila de Análise Instrumental Aplicada a alimentos

Apostila de Análise Instrumental Aplicada a alimentos

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Cuiabá Bela Vista Curso de Engenharia de Alimentos 87 3. Porta-amostra: chama-se cubeta, o recipiente

3. Porta-amostra: chama-se cubeta, o recipiente transparente à luz em que será colocada a solução a ser analisada ou as soluções padrão, para ser feita a leitura. Tem-se cubetas de vidro e plástico (utilizada para medidas na região do visível) e de quartzo (utilizada para medidas na região do ultravioleta). Deve-se tomar muito cuidado no seu manuseio, pois qualquer impressão digital, riscos, sujeiras, pode barrar a passagem de luz através da cubeta, prejudicando a leitura da absorbância ou transmitância. Geralmente tem forma retangular e largura ótica de 1cm (espessura da cubeta), determinada pelo fabricante.

de 1cm (espessura da cubeta), determinada pelo fabricante. 4. Detector de radiação : é o “coração”
de 1cm (espessura da cubeta), determinada pelo fabricante. 4. Detector de radiação : é o “coração”

4. Detector de radiação: é o “coração” do espectrofotômetro, responsável por converter a luz transmitida através da amostra em um sinal analítico numérico, tal como os valores de absorbância, transmitância ou concentração. O sinal resultante do detector é proporcional à concentração da substância na amostra. É

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um componente responsável pela sensibilidade do aparelho, e por isso também define o seu preço.

do aparelho, e por isso também define o seu preço. 4.4.7 Operação do instrumento: 1º Passo:

4.4.7 Operação do instrumento:

define o seu preço. 4.4.7 Operação do instrumento: 1º Passo: Ligue o aparelho 2º Passo: Mude

1º Passo: Ligue o aparelho

2º Passo: Mude o comprimento de onda do aparelho para o indicado na análise.

3º Passo: Coloque a cubeta com o “branco” na abertura do espetrofotometro.

4º Passo: Clique no botão de zerar o aparelho (Abs = 0 e %T = 100)

5º Passo: Leitura das soluções padrões construção da curva de calibração (opcional)

6º Passo: Coloque a cubeta com a amostra para ler a sua absorbância

4.4.8 Calibração:

O espectrofotômetro precisa ser calibrado com uma solução de referência (solução padrão) antes de ser utilizado. A calibração deve ser feita para verificar se a substancia que se deseja analisar obedece ou não a Lei de Beer.

Solução padrão: solução preparada pelo analista contendo a substância que se deseja determinar na amostra, em uma concentração exatamente conhecida.

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Devemos fazer dois tipos de calibração:

-Calibração com o “branco”

-Calibração com a solução padrão ou Curva de Calibração.

1º) Calibração com o “branco”: deve ser usada toda vez em que se liga o espectrofotômetro. A solução “branco” deve ser o mesmo solvente em que se empregou para diluir a solução amostra e os padrões, geralmente é a água destilada. Se na solução amostra se empregou algum reagente para desenvolver cor ou purificar a solução, esse reagente também deve ser adicionado ao “branco” e às soluções padrão, na mesma quantidade em que foi adicionado à amostra.

A finalidade da calibração com o “branco” é de eliminar toda absorção de luz que não seja devida somente à substancia que se quer determinar. Isso inclui a absorção de luz pelo solvente e pelos reagentes empregados na preparação da solução amostra.

Para “zerar” esses interferentes, calibra-se o espectrofotômetro da seguinte maneira:

-Encher a cubeta com a solução “branco” (água destilada, por ex.)

-Calibrar Absorbância = 0 e/ou Transmitância = 100%, de acordo com as instruções do fabricante do aparelho.

2º) Calibração com solução padrão:

Método direto utiliza somente uma solução padrão de leitura (A) próxima à leitura da amostra. Trata-se de um método rápido de análise mas apresenta pouca precisão e exatidão. Por este método determina-se a concentração de uma amostra levando-se em consideração um ponto de concentração conhecida.

Construção da Curva de Calibração método mais preciso e exato para determinar a concentração da amostra, pois utiliza no mínimo 5 soluções padrões. A construção da curva de calibração é necessária em casos em que se deseja uma maior exatidão e precisão dos resultados analíticos, para comparação com laudos ou padrões previstos em legislação específica, como é o caso de alimentos.

4.4.9 Tipos de espectrofotômetros UV/Visível:

Os componentes ópticos descritos na Figura 25-1 têm sido combinados de várias formas para produzir dois tipos de instrumentos e permitir a obtenção de medidas de absorção. Os espectrofotômetros permitem a medida da razão entre as potências de dois feixes, uma exigência para se medir a absorbância. Os espectrofotômetros oferecem a vantagem considerável de que o comprimento de onda pode ser alterado continuamente tornando possível registrar-se um espectro de absorção.

Várias dezenas de modelos de espectrofotômetros estão disponíveis comercialmente. A maioria dos espectrofotômetros cobre a região do UV/visível e, ocasionalmente, a região do infravermelho próximo, enquanto os fotômetros são quase

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exclusivamente utilizados na região do visível. Os espectrofotômetros podem ser encontrados nas variedades de feixe único ou duplo.

Instrumentos de Feixe Único:

Esse instrumento surgiu inicialmente no mercado em meados dos anos 1950 e a versão modificada, que está representada na figura, ainda é produzida e bastante vendida. O número de instrumentos desse tipo que está correntemente em uso ao redor do mundo é maior que o de qualquer outro modelo de espectrofotômetro.

maior que o de qualquer outro modelo de espectrofotômetro. de tungstênio passa através de uma fenda
maior que o de qualquer outro modelo de espectrofotômetro. de tungstênio passa através de uma fenda

de

tungstênio passa através de uma fenda de entrada para o monocromador. Uma rede refletora difrata a radiação e uma faixa selecionada de comprimentos de onda passa através da fenda de saída para a câmara da amostra. Um detector de estado sólido converte a intensidade de luz em um sinal elétrico que é amplificado e apresentado em um mostrador digital.

Para obter uma leitura da porcentagem de transmitância, o dispositivo de leitura é inicialmente zerado com o compartimento da amostra vazio de forma que o obturador bloqueie o feixe e nenhuma radiação atinja o detector. Esse processo é denominado calibração de 0% T ou ajuste de 0% T. Uma célula contendo o branco (geralmente o solvente) é então inserida no compartimento de medida e o mostrador levado a ler 100% de T ajustando-se a posição da abertura de controle de luminosidade e, portanto, a quantidade de luz que atinge o detector. Esse ajuste é chamado calibração de 100% T ou ajuste de 100% T. Finalmente, a amostra é colocada no compartimento da célula e a porcentagem de transmitância ou absorbância é lida diretamente no mostrador de LED.

Esse equipamento funciona

assim:

A radiação

de uma fonte de filamento

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Os instrumentos de feixe único do tipo descrito são adequados para as medidas quantitativas de absorção em um único comprimento de onda. Neste caso, a simplicidade do instrumento, o baixo custo e a facilidade de manutenção oferecem vantagens importantes.

Instrumentos de Feixe Duplo

Dois feixes são formados por um espelho em forma de V denominado divisor de feixe. Um dos feixes passa através da solução de referência para um fotodetector e o segundo passa, simultaneamente, pela amostra para um segundo fotodetector casado.

Os instrumentos de feixe duplo oferecem a vantagem de compensar qualquer flutuação na potência radiante da fonte, exceto aquelas de duração mais curta. Eles também compensam amplas variações na intensidade da fonte em função do comprimento de onda. Além disso, o desenho de duplo feixe é muito adequado para o registro contínuo de espectros de absorção.

para o registro contínuo de espectros de absorção. 4.4.10 Aplicações em análise de alimentos:  análise

4.4.10 Aplicações em análise de alimentos:

análise de componentes do alimento que absorvem na região UV ou Vis (corantes, nutrientes inorgânicos, vitaminas);

análise de moléculas orgânicas por fluorescência (detecção de contaminantes como bactérias e alguns resíduos de pesticidas).