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Imunohematologia

Reviso: Julho/2011

Sistema ABO
A definio do grupo sanguneo de um indivduo se d por duas provas: Prova Direta (ou Beth-Vincent): pesquisa dos antgenos fixados nas hemcias do paciente. Deve ser feita com soros Anti-A, Anti-B e Anti-A,B. Prova Reversa (ou prova de Simonin): pesquisa do anticorpo no soro do paciente. Deve ser feita com hemcias tipadas A e B, com ateno para o fato de que o anticorpo B costuma ser mais fraco (ttulo fraco) que os demais anticorpos. A prova reversa uma contra-prova fundamental para a concluso do exame. Os resultados destas duas provas devem ser interpretados da seguinte forma:
Prova Direta (Antgeno) Antgeno A Antgeno B Antgeno A e B Ausncia de Antgenos A e B Prova Reversa (Anticorpo) Anticorpo b Anticorpo a Ausncia de Anticorpos a e b Anticorpo a e b Sistema ABO Grupo Sanguneo A Grupo Sanguneo B Grupo Sanguneo AB Grupo Sanguneo O

Os anticorpos do Sistema ABO aparecem espontaneamente aps 3-6 meses de idade, com pico de produo no perodo entre 5-10 anos e diminuio progressiva na velhice. Uma das provveis explicaes para esse aparecimento a ampla distribuio de estruturas semelhantes a esses antgenos na natureza, principalmente nas bactrias, e por isso esses anticorpos so chamados de ocorrncia natural. As bactrias presentes no trato intestinal, na poeira e em alimentos promoveriam uma exposio constante de todos os indivduos estas estruturas (semelhantes aos acares A e B presentes nas hemcias). Assim, a presena ou ausncia dos antgenos A e/ou B na membrana das hemcias (prova direta) e a deteco ou ausncia dos anticorpos contra os antgenos que no possuem (prova reversa) est no incio e no final da vida do indivduo. Sua ausncia poder estar relacionada com a patologia apresentada. Os subgrupos do Grupo A apresentam diferenas antignicas quantitativas e qualitativas, embora sejam formados pelo mesmo acar do componente antignico. Sabe-se que o gene A1 difere do gene A2 por uma deleo de base na regio C-terminal, alm de uma mutao que determinar uma substituio de aminocidos (prolina para leucina) na glicosiltransferase resultante. Quando um anticorpo presente no identificado, deve-se verificar a funcionalidade das hemcias usadas na realizao das provas. Lembrando que as hemcias, comerciais ou preparadas pelo laboratrio, devem ser fenotipadas para os principais sistemas sanguneos (ABO, Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Luth e Xg). Quando um anticorpo ausente identificado, deve-se verificar a lavagem dos tubos e se as hemcias so especficas para o tipo de grupo sanguneo.

Sistema Rhesus Rh (D)


A determinao do Sistema Rhesus de um indivduo se d por: Determinao Rh: determinao do antgeno D do Sistema Rhesus nas hemcias do paciente. Controle Rh: um reativo controle com ausncia de anticorpo Anti-D e de qualquer outro tipo de anticorpo para todos os sistemas eritrocitrios. Este reativo controle tem por finalidade detectar erros ou patogenias existentes no paciente que resulte numa reao positiva do controle. (Exemplo: casos de hiperproteinemia). Contudo, diversos laboratrios no fazem uso deste controle em sua rotina ou no valorizam resultados positivos obtidos com o mesmo arriscando assim a confiabilidade dos seus resultados finais. Para liberar um resultado com o Controle de Rh positivo deve-se fazer um estudo mais aprofundado da imunohematologia do paciente, o que inclui a observao de autoanticorpo frio ou quente (principalmente se a autoprova for positiva), hiperproteinemia, etc. Em caso de dvidas, deve-se encaminhar a amostra ou o prprio paciente para um servio especializado. bom lembrar que no se deve usar albumina bovina, 22% ou 30%, em substituio esse reativo controle. O correto usar o Reativo Controle Rh comercial, no importando se ele produzido com plasma ou albumina, desde que tenha os mesmos conservantes e estabilizadores do reativo do soro Rh (D) e seja do mesmo fabricante.

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Imunohematologia
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Pesquisa D fraco e Controle: devem ser feitas quando na classificao do Rh (D) existir ausncia de aglutinao (negativa). Sua finalidade detectar o anticorpo fracamente formado, devido a sua transmisso gentica. Nesta prova necessrio usar tcnicas mais sensveis (Tcnica do Coombs Indireto - TCI) para confirmar sua positividade ou negatividade. A metodologia em Gel no dispensa a realizao desta prova. Os fabricantes tm adotado a incluso desta prova no carto. Neste caso, o laboratrio est realizando a prova no carto automaticamente. Os resultados destas determinaes devem ser interpretados da seguinte forma:
Determinao Rh Positiva Negativo Negativo Positivo ou Negativo Controle Rh Negativo Negativo Negativo Positivo Pesquisa D fraco --Negativo Positivo Positivo ou Negativo Controle D fraco --Negativo Negativo Negativo Sistema Rhesus Rh(D) Positivo Negativo Positivo Indeterminado

O principal antgeno do Sistema Rh o D, que pode se manifestar de diversas formas: D positivo: possui o antgeno D completo na sua estrutura, tanto quantitativo como qualitativo; D fraco: uma variante de D que apresenta reao mais fraca, possuindo alterao no ponto de vista quantitativo; D mosaico: falta um ou mais determinantes do mosaico que constitui o antgeno D. Possui alterao qualitativa; D categoria: falta um ou alguns dos aminocidos que formam a molcula do antgeno D e poder ser tambm imunognico e se apresentar como D positivo. Possui alteraes qualitativas. Atualmente existem kits para caracterizar as categorias de D.

Cuidados Adicionais: Se para um D fraco positivo o laboratrio encontrar negativo, deve-se: (1) verificar se a potncia (ttulo) do Reativo Rh(D) est de acordo; (2) observar se a temperatura do banho-maria est calibrada e constante; (3) fazer a lavagem das hemcias corretamente e dentro da tcnica exigida, tendo o cuidado de no perder material durante o procedimento, pois perda de hemcias significa perda de antgeno; (4) verificar se a Antiglobulina Humana (AGH) est dentro das conformidades do seu controle de qualidade; (5) verificar a limpeza da vidraria (existncia de resduos qumicos e biolgicos); (6) observar presena de umidade na vidraria. Se o resultado permanecer negativo, deve-se usar Hemcias Controle de Coombs, a fim de se detectar provveis erros tcnicos ou do reativo usado, pois com a adio do Controle a reao dever ser sempre positiva.

Pesquisa Anticorpo Intra-Vascular - AIV (Coombs Direto)


Determinao da Amostra: Nesta determinao usada a suspenso de hemcias do paciente a 5% com o soro de Coombs ou o soro da Anti-Globulina Humana (AGH). Determinao do Controle: O controle feito com o soro de Coombs (AGH) e o reativo de Hemcias Controle de Coombs. Este reativo composto por hemcias sensibilizadas com anticorpo IgG, devendo dar sempre positivo. Em caso negativo deve-se verificar se o soro de Coombs est funcionando ou se h alguma impureza (sujeira) no tubo do teste. Cuidados: Em caso de dvida, deve-se levar o tubo viso microscpica para se certificar de positividade. Os resultados destas determinaes devem ser interpretados da seguinte forma:
Determinao Amostra Positivo Negativo Positivo ou Negativo Determinao Controle Positivo Positivo Negativo AIV (Coombs Direto) Positivo Negativo Indeterminado (verificar rotina)

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Pesquisa Anticorpo Extra-Vascular - AEV (Coombs Indireto)


Hemcias: O soro do paciente deve ser pesquisado com hemcias de fentipos conhecidos para os principais sistemas eritrocitrios (tipadas ou fenotipadas), formando assim um painel de seleo ou triagem. Normalmente so adotadas duas hemcias, mas o uso de uma terceira pode ocorrer para complementar as duas hemcias normalmente usadas. O importante que as hemcias usadas contenham os principais antgenos que caracterizam os anticorpos dos principais sistemas eritrocitrios (Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Luth e Xg). Com isto, j se obtm um resultado satisfatrio. Em anexo ao Painel de Seleo h um diagrama que deve ser avaliado em cada lote recebido e onde se deve colocar os resultados da Pesquisa. O profissional que vai fazer uso deste diagrama deve ser treinado e receber informaes tcnicas que possam facilitar o seu manuseio e sua interpretao. Auto-prova: A auto-prova visa avaliar a formao de auto-anticorpos produzidos, sejam eles frio ou quente, pelo prprio paciente (sistema imunolgico) ou por um medicamento que est sendo ministrado, funcionando como um complemento e auxiliando no diagnstico e possvel tratamento. Este teste realizado tambm pela Tcnica do Coombs Indireto, usando o soro e a suspenso de hemcias a 5% do prprio paciente. Cuidados: Deve-se usar nestes testes, ao final da tcnica, o Controle de Hemcias de Coombs para prevenir possveis erros tcnicos ou humanos. Em caso de possveis dvidas na interpretao fazer visualizao microscpica. Exemplo: Um indivduo em tratamento com L-Dopa (dopamina) reproduz nas hemcias uma simulao de um autoanticorpo, pois a substncia medicamentosa envolve as hemcias reproduzindo uma reao similar a de um anticorpo, atravs de uma auto-aglutinao. A simples retirada do medicamento suficiente para que no haja mais esta reao. Os resultados destas determinaes devem ser interpretados da seguinte forma:
Hemcias Negativo para todas as Hemcias testadas. Positivo para alguma das hemcias testadas. AEV (Coombs Indireto) Negativo Positivo

Algumas dicas para garantir os resultados de Coombs Indireto e Direto: Hemcia: verificar se as hemcias usadas so tipadas, pois tanto as comerciais quanto as feitas pelo laboratrio, podem no estar contemplando todos os antgenos dos principais sistemas sanguneos; sendo preciso analisar bem a hemcia no momento da compra ou na fenotipagem; este ltimo, no caso de ser preparada pelo laboratrio; Caso as hemcias sejam tipadas corretamente, verificar se esto dentro do prazo de validade, pois com o tempo os antgenos ficam fracos; Soro de Coombs: verificar a sua potncia, pois pode estar diminuda para a captao do anticorpo. Alm disso, poder estar inespecfico, contendo uma contaminao para outro anticorpo. Isto acarreta um falso positivo, dependendo do anticorpo contaminante. Tubo: Aps a lavagem pode ficar com resduo de detergente ou com gua destilada residual, o que interfere na realizao da prova. aconselhvel rinsar com salina fisiolgica caso permanea umidade no tubo; Soro fisiolgico (Tubo): observar se o soro fisiolgico usado na lavagem das hemcias no apresenta contaminao fngica pois sua presena interfere no teste, acarretando em resultados falso negativos; Gel: Para a metodologia em Gel, fazer o controle dos cartes usando o Controle de Coombs. Este controle, como j foi mencionado, tem um anticorpo irregular fixado em sua hemcia, devendo dar positivo tambm no carto. preciso ter cuidado com as hemcias lavadas em tubo, no somente na boa lavagem das mesmas como na sua secagem, no interferindo no momento da adio do soro de Coombs. Lavagem sem tcnica adequada ou resqucios de resduos de salina podem comprometer a reao final.

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Consideraes sobre as metodologias O estudo imunohematolgico realizado em tcnica de lmina no mais aceito atualmente, sendo utilizadas hoje em dia as tcnicas em tubo, gel centrifugao e PCR (ainda pouco utilizado no Brasil). A tcnica em lmina, por no reproduzir o mesmo nvel de confiabilidade que os demais, no deve ser usada como mtodo conclusivo para liberao de resultados de grupos sanguneos. Para melhor confiabilidade prtica em Imunohematologia o laboratrio deve dispor de duas tcnicas para liberao dos resultados, podendo ser dois mtodos distintos ou dois kits de marcas diferentes. ATENO: A Portaria 1376 de 19/11/1993 define como obrigatria a realizao da prova direta e reversa para Sistema ABO, a Pesquisa do D fraco para o Sistema Rhesus e o uso de hemcias tipadas (com fentipo conhecido) para a Tcnica de Coombs Indireto.

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