APNDICE B MICROSCPIO

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MICROSCPIOS
1 CONCEITO O microscpio um instrumento de tica que nos mostra ampliadas as dimenses dos objetos que so observados por meio dele e que no podem ser vistos a olho nu, permitindo assim ampliar o poder de resoluo do olho humano.

2 MICROSCPIO PTICO Partes: - Parte mecnica: tubo ou canho, brao, tambor ou revlver das objetivas, mesa ou platina, charriot, parafuso ou condensador, parafusos macro e micromtricos, p ou base. - Parte ptica: lentes oculares, lentes objetivas, prismas pticos, condensador com diafragma, ris, fonte de iluminao, ltros de luz. 2.1 DIVISO DA PARTE MECNICA Tubo ou canho: pea tubular que mantm as oculares e objetivas separadas por uma distncia tima, chamada de longitude do tubo. Os tubos podem ser xos ou extensveis. Os tubos extensveis so utilizados somente para certas tcnicas, como micrometria, correo da grossura das lamnulas etc. Nos tubos encontramos ainda os primas pticos. Brao: serve para transportes do microscpio. Revlver ou tambor das objetivas: nesta pea encontram-se atarraxadas as lentes objetivas, sendo de natureza mvel. Mesa ou Platina: destinada a receber as preparaes a serem examinadas, constituda de um bloco retngular, quadrado ou esfrico. Charriot (com presilhas): funo de prender a preparao sob a platina, realizando movimentos ntero-posterior e latero-lateralmente, permitindo com isso, a observao dos diversos campos de focalizao do objeto em estudo.
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Parafuso ou condensador: pea que permite o deslocamento no sentido vertical do condensador, proporcionando a este uma uniformidade melhor na iluminao do campo microscpio. - Parafuso macromtrico: realiza o deslocamento da platina ou tubo (dependendo da fabricao do microscpio), com a nalidade de focalizar a preparao que deseja observar. - Parafuso micromtrico: pode vir separado ou acoplado ao parafuso macromtrico e permite completar a focalizao iniciada com aquele. - P ou base: pea de sustentao do microscpio.

2.2 DIVISO DA PARTE PTICA Lentes objetivas: a qualidade de um microscpio depende em maior parte da objetiva, que tem a funo de formar a imagem real e aumentada do objeto e a qualidade desta imagem no pode ser melhorada pelos outros elementos. Existem diversos valores de objetivas: 3,2 X, 10 X, 40 X etc. Algumas objetivas, de 40 X e 100 X de microscpios modernos, trazem no seu interior um sistema de mola que realiza o deslocamento da lente frontal ao tocar a preparao, evitando que a lente frontal da objetiva e a preparao sejam danicadas. Lentes oculares: a funo dessas lentes ampliar a imagem formada pela lente objetiva, imagem essa, que projetada por meio de um sistema de prismas pticos, situado no tubo do microscpio. Quando a imagem do objeto cai na distncia focal das oculares, estas a ampliam para poderem ser percebidas pela retina. Prismas pticos: so espelhos de faces polidas, situados nos tubos dos microscpios, com a funo de desviar a imagem para a distncia focal das oculares. Condensador com diafrgma/ris: situado logo abaixo da musa, possui a funo de iluminar uniformemente a preparao, no local enfocado pela objetiva, fazendo com que haja uma iluminao uniforme dos raios luminosos, esta iluminao se faz por meio de raios convergentes que se transformam em divergentes, depois de atravessar o objeto. A
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intensidade luminosa pode ser controlada pelo diafragma/ris, dependendo do tamanho das partculas a examinar, e da lente objetiva utilizada. Temos dois tipos de condensador: o mais comum, dito de Abbe (condensador de campo claro) e o fundo escuro. Fonte de iluminao e filtro de luz: para iluminar a preparao podemos usar tanto a luz natural como a articial. No caso da luz natural, o iluminador muito simples: trata-se de um espelho de duas faces, uma plana e outra cncava. A montagem do espelho torna possvel a sua inclinao em qualquer direo. Emprega-se a face plana do espelho com as objetivas de pequeno aumento e a face cncava com as objetivas de grande aumento. A funo dos ltros de luz a de transformar a luz articial tornando-se semelhante luz natural.

3 AUMENTO DAS ESTRUTURAS FOCALIZADAS Quando se deseja obter um aumento de uma determinada estrutura em foco, o procedimento bastante fcil: basta multiplicar-se o valor da lente da objetiva utilizada pelo valor da ocular. Assim, se estivermos utilizando uma objetiva de 40 X e uma ocular de 10 X, o aumento total ser de 40 X aproximadamente. Geralmente o microscpio possui 4 lentes objetivas presas no revlver. As trs primeiras so de menor aumento e so chamadas de objetivas a seco, porque nada existe entre elas e a preparao, a no ser o ar. A ltima, de 100 X chamada de objetiva de imerso, em razo da existncia no seu uso, de uma substncia chamada de leo de cedro, que colocado sobre a preparao (uma gota).

4 OBSERVAO DO MATERIAL PREPARADO Procure estudar sentado e de frente para o microscpio. Nunca debruado ou de lado. Sente-se em posio correta: as pernas para frente e o tronco erguido, nem agachado, nem estirado para ver o microscpio. Gradue o tamborete giratrio at a posio ideal. No tora a cabea para o lado. Estas recomendaes visam sua comodidade durante os trabalhos e um bom rendimento no estudo. O material, depois de convenientemente preparado, colocado sobre a platina do microscpio e preso a ela por meio de ganchos do charriot. H platinas
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mveis que permitem um deslocamento da preparao em sentido ntero-posterior e latero-lateral. Quando a platina xa o charriot, faz com que a preparao tambm possa ser movimentada. O movimento facilita o exame total da mesma, resta apenas focaliz-lo corretamente. Isto feito com os dois parafusos de focalizao, o macro e micromtrico, que movimentam o tubo ou platina no sentido vertical. custa desse movimento, a objetiva aproximada ou afastada da preparao. Para colocar-se a preparao em foco, devemos levantar sucientemente o tubo, com o movimento do parafuso macromtrico, olhando-se pela ocular, at que o material entre em foco. Em alguns microscpios o perigo de se quebrar a lmina de preparao foi reduzido ao mnimo, pela introduo de uma trava que no permite a platina ou tubo deslocar-se acima de um determinado ponto, marcado previamente. Ainda assim, aconselhvel aproximar-se primeiro a objetiva da preparao, o mximo possvel, para depois proceder a focalizao, abaixando-se a platina lentamente. Com a objetiva na imerso, coloca-se primeiro uma gota de leo de cedro sobre a preparao, depois faz-se a objetiva de imerso mergulhar sua ponta no meio da gota. A focalizao feita tambm abaixando-se a platina at que a imagem do objeto entre em foco. O parafuso micromtrico, que imprime um movimento lento platina, usado para completar a focalizao. No caso de preparao em que vamos usar as objetivas a seco, focalizaremos primeiramente com o menor aumento. Foque com todo o cuidado para no partir a lmina. Quando se trabalha com as objetivas de 40 X e 100 X, nunca se deve olhar pela ocular, enquanto se pretende aproximar a objetiva da preparao; observa-se lateralmente com os olhos a altura da extremidade livre da objetiva, e vai-se girando lentamente o parafuso macromtrico. Caso o pequeno aumento no seja suciente sua observao, gire o tambor das objetivas e passe ao aumento seguinte. Comumente os exames a fresco e as estruturas microscpicas maiores so vistas com estas objetivas, isto , com o pequeno (10 X) ou grande (40 X) aumento a seco. Habitue-se desde cedo a segurar com uma das mos o parafuso micromtrico e com a outra os parafusos do charriot. Quando deixar de usar a objetiva de imerso, retire-lhe o leo de cedro, com pano discretamente embebido em xilol ou benzina, mas no use pano grosseiro, sujo ou sem a primeira lavagem e, jamais embebido em lcool, o qual dissolve a substncia que une as lentes da objetiva, danicando-as em denitivo. Evite tambm transportar o microscpio, mas se necessrio, segure-o rmemente pelo brao e faa-o repousar sobre a mesa.

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4.1 PODER RESOLUTIVO de grande importncia em microscopia a noo de poder separativo ou resolutivo de uma lente. Embora se possa pensar que no h limitao para o aumento de um microscpio, isto no verdade. A natureza ondulatria da luz, interfere com a eccia do mesmo, impondo um limite ao seu poder de ampliao. O poder de resoluo de um microscpio determinado pela capacidade de sua objetiva. O olho humano tem poder de resoluo de 0,25 a 1mm, o que signica que dois pontos situados abaixo desses valores no podem ser distinguidos a olho nu, pois aparecero fundidos em um s. Para resolver este problema, utiliza-se o microscpio, cujas lentes tem poder de separao de dois pontos muito prximos. Chama-se poder de separao resoluo de uma lente a sua capacidade de separar nitidamente as imagens de dois pontos muito prximos. Chama-se poder de separao ou de resoluo de uma lente a sua capacidade de separar nitidamente as imagens de dois pontos muito prximos. Tem valor na abertura numrica de uma lente, o ndice de refrao do meio, isto , do espao entre a preparao e a lente. Nas objetivas a seco o meio o ar, cujo ndice de refrao igual unidade. Nas objetivas de imerso, uma gota de leo de cedro colocada entre a preparao e a objetiva. O leo de cedro tem ndice de refrao igual a 1.151, que o mesmo ndice de refrao do vidro. Como se pode ver, o leo de cedro faz com que o ngulo de abertura (formado pelos raios mais externos que penetram na objetiva, vindos de um ponto do objeto) se torne maior e, conseqentemente, a abertura numrica. Para calcular o valor do limite inferior do poder de separao, emprega-se a seguinte frmula: ndice de refrao do meio n. Sen. Esse valor depende, alm do comprimento de onda do foco luminoso ( ), do ndice de refrao do meio (n), e do semi-ngulo da abertura do cone luminoso que penetra na objetiva ( ), Quanto menor for o comprimento de onda, maior ser esse poder, o produto n.sen, que aparece no denominador da frmula citada conhecido como abertura numrica, nos d o poder de resoluco de uma objetiva e, quanto maior for essa abertura, maior ser o poder de resoluo das lentes.
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5 OUTROS TIPOS DE MICROSCPIOS A microscopia usual que os alunos praticam chamada de microscopia de campo claro. possvel acrescentar diferentes acessrios ao M.O, que permitem outros tipos de microscopias, tais como: de campo escuro, de contraste de fase, de interferncia, de uorescncia e de polarizao. 5.1 MICROSCPIO DE CAMPO ESCURO Para se obter esse efeito necessrio impedir a entrada de raios luminosos centrais na objetiva. Usa-se a iluminao oblqua, ou a interposio de um condensador especial, parabolide, em vez de Abbe, ou mais simplesmente, interposio de diafragmas de campo escuro, colocados no suporte porta ltro abaixo do condensador de Abbe. Assim suprime-se os raios centrais, e os raios perifricos s penetram na objetiva quando reetidos e desviados por partculas existentes na preparao. Estas aparecem como pontos brilhantes em fundo escuro. Com essa tcnica possvel ver detalhes estruturais de clulas no coroadas, visualizar bactrias e corpsculos no visveis em campo claro. O efeito comparvel conhecida visualizao de partculas de poeiras num feixe luminoso que penetra em quarto escuro. 5.2 MICROSCPIO DE CONTRASTE DE FASE A maioria dos componentes celulares muito transparente, absorve pouca luz, por isso pouco visvel ao M.O. in vivo e em clulas mortas xadas. Comumente, recorre-se a tcnicas de colorao para evidenci-los em cores contrastantes. Na microscopia de contraste de fases tais componentes tornamse perfeitamente visveis nas clulas vivas, sem recorrer a qualquer artifcio de tcnica. A razo dessas estruturas terem pequenas diferenas de densidade e de ndice de refrao, evidenciados na microscopia de contraste de fase. Esclarecendo melhor, convm lembrar que os raios luminosos que chegam ao objeto esto na mesma fase. Isto , as cristas e vales de suas ondas coincidem perfeitamente ao atravessarem o objeto, encontram estruturas com aquelas pequenas diferenas de densidade e ndice de refrao, e, conforme a densidade de tais componentes, sofrem atrasos maiores ou menores na travessia. Evidentemente os raios que atravessam a membrana plasmtica e a matriz citoplasmtica so menos retardados que os que atravessam mitocndrias. Esses, por sua vez, sofrem um atraso menor do que os que atravessam tudo isso
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mais o ncleo. Em conseqncia, ao sarem do objeto, tais raios esto em fases diferentes, ou seja, fora de fase ou defasado. Isto , as cristas e depresses de suas ondas no coincidem mais. Diferenas de fases no so visveis a olho nu. A viso humana percebe apenas diferenas de amplitude ou intensidade (altura) das ondas luminosas e diferenas de certos comprimentos de onda responsvel pela cor. No microscpio de fase (Zernicke, 1935), h acessrios que convertem diferenas de fases em diferenas de amplitude ou intensidade perceptveis viso. 5.3 MICROSCPIO DE FLUORESCNCIA semelhante a um M.O. comum, exceto que a luz utilizada para iluminao possui uma fonte muito poderosa, passa por dois conjuntos de ltros um para ltrar a luz antes que ela atinja a amostra e outro para ltrar a luz obtida da amostra uma vez que os corantes uorescentes utilizados para a colorao de clulas so detectados com o auxlio deste microscpio. A microscopia de uorescncia utilizada mais freqentemente para a detectao de protenas especcas ou de outras molculas nas clulas ou tecidos. Sua principal aplicao ocorre, portanto, em combinao com mtodos imunolgicos, nas tcnicas imunocitoqumicas que utilizam anticorpos conjugados a compostos uorescentes. Dois corantes uorescentes normalmente usados so a uorescena, que emite uma uorescncia verde intensa, quando excitada com a luz azul e a rodamina, que emite uorescncia vermelha quando excitada com luz amarelo esverdeada. Tambm um dos corantes uorescentes bastante utilizados o alaranjadode-acridina, que se combina com cidos nuclicos permitindo sua localizao. Alguns constituintes celulares como a riboavina (vitamina B12), vitamina A, e as porrinas, so uorescentes e podem ser identicados e localizados com este tipo de microscopia. 5.4 MICROSCPIO DE POLARIZAO Por meio do emprego de um feixe luminoso polarizado permite estudar certos aspectos da organizao molecular dos constituintes celulares. Ao atravessar a clula, o feixe de luz pode passar por estruturas cristalinas, ou constitudas por molculas alongadas e paralelas, que dividem o feixe polarizado em dois, cujos planos so perpendiculares. Essas estruturas so chamadas anisotrpicas e so birrefringentes, pois apresentam dois ndices de
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refrao diferentes, conforme a incidncia da luz. Estruturas celulares que no apresentam esta propriedade so denominadas isotrpicas. O microscpio de polarizao semelhante ao M. O. acrescido de dois prismas ou discos polarides. Um acoplado ao condensador e funciona como polarizador, o outro colocado na ocular e chamado analisador. A funo do polarizador iluminar a clula com o feixe de luz polarizada. O analisador verica o efeito das estruturas celulares sobre o feixe polarizado. Quando analisador e polarizador esto com seus planos de polarizao perpendiculares (cruzados), s as estruturas anisotrpicas podem ser vistas.

6 PREPARAO DE LMINAS PARA OBSERVAO NO MICROSCPIO PTICO Aps a remoo do rgo realiza-se as seguintes etapas: Fixao tratamento do rgo com agentes qumicos para preservar a morfologia e composio do tecido. Utiliza-se formaldeido a 4% em soluo tamponado (pH 7,5), e o lquido de Bouin que xam protenas, ou seja, insolubilizam as protenas dos tecidos. Durao de cerca de 12 horas Desidratao retirada de gua do tecido, pela passagem em banhos de concentrao crescentes de etanol, geralmente de 70%, at etanol puro 100%. Durao de 6 a 24 horas, dependendo do tamanho da pea. Clareamento ou Diafanizao a pea embebida em benzol, xilol ou tuluol, solventes do lcool e da parana. Os tecidos tornam-se translcidos. Durao de 1 a 6 horas. Impregnao mergulha-se a pea em resina plstica temperatura ambiente ou em parana fundida, geralmente em estufa a 60C. Devido o calor o xilol evapora e os espaos, antes por ele ocupado, so ocupados pela parana. Durao de 30 minutos a 6 horas.
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Incluso coloca-se o tecido em bloco retangular contendo parana

fundida. Recentemente tem-se utilizado a incluso em resinas sintticas para possibilitar cortes mais nos. Microtomia corte da preparao no micrtomo. Para M. O. a espessura de cada corte deve ser de 5 a 10m.

7 COLORAO A colorao para M. O. realizada com corantes hidrosolveis. Deste modo a parana deve ser removida dos cortes e ento o tecido reidratado e corado. Aps colorao o corte desidratado, de modo que a lamnula possa ser xada. A colorao feita usando-se em geral misturas de substncias qumicas denominadas corantes. A maioria dos corantes utilizados em histologia comportamse como cidos ou bases e, tendem a formar reaes salinas com radicais ionizveis presentes nos tecidos . Os componentes dos tecidos que se coram facilmente com corantes bsicos so chamados baslos, sendo chamados acidlos os que se ligam a corantes cidos. O azul-de-toluidina e azul-de-metileno so exemplos de corantes bsicos. A hematoxilina comporta-se principalmente como um corante bsico, ligando-se a estruturas baslas dos tecidos. Os mais importantes componentes teciduais que reagem com corantes bsicos so as nucleoprotenas e as glicoprotenas cidas, devido a grupamento cidos ionisveis que apresentam. Corantes cidos, tais como orange G, a eosina, a fucsina cida, coram principalmente componentes bsicos das protenas citoplasmticas. A colorao dupla pela hematoxilina e eosina (HE) a mais utilizada na rotina da Histologia.

Metacromasia signica mudana de cor. uma propriedade de certos corantes, geralmente bsicos. Algumas substncias e/ou estruturas, como os grnulos citoplasmticos dos mastcitos so metacromticos. Por exemplo, quando o azul-detoluidina est ligado a uma substncia que ocorre em altas concentraes, cora esta substncia em prpura.

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CORANTES E REAES HISTOLGICAS DE ROTINA RESULTADO Hematoxilina REAGENTE AZUL: ncleo, regies acidlas do citoplasma; matriz da Cartilagem. ROSA: regies baslas do citoplasma; bras colgenas. MARROM bras elsticas. AZUL bras elsticas. NEGRO bras reticulares. NEGRO estriaes do msculo, ncleos, eritrcitos. MAGENTA- molculas ricas em glicognio e carboidrato de Schiff. AZUL ESCURO ncleos; VERMELHO msculo, queratina e citoplasma, AZUL-CLARO; mucinognio e colgeno. Colorao diferencial de clulas sangineas. Rosa eritrcitos, grnulcitos eosinlos; Prpura ncleo dos leuccitos, baslos, Azul citoplasma dos moncitos e linfcitos.

Eosina Orcena Weigert Prata Hematoxilna frrica

cido Peridico reativo

Tricmico de Masson

Colorao de Wright e Giemsa

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MICROSCPIO ELETRNICO DE TRANSMISSO (TEM) A fonte de iluminao um lamento ou ctodo que emite eltrons do topo de uma coluna cilndrica de cerca de 2m de altura. Os eltrons passam por uma bobina ou lente magntica, chamada condensadora, que dirige os eltrons em feixe uniforme at o objeto. Aps atravessar o objeto, onde muitos eltrons so desviados, o feixe passa por outra bobina, que corresponde a objetiva do microscpio ptico. Por m, uma terceira bobina projeta os eltrons sobre uma tela uorescente onde eles formam uma imagem visvel ou sobre um lme fotogrco. Os eltrons desviados por certas estruturas celulares no iro contribuir para formar imagem. Essas estruturas apareceram escuras e so chamadas eltrondensas. Os componentes celulares que desviam uma pequena percentagem de eltrons aparecero em diversas tonalidades de cinza. No MET todo o trajeto de eltrons feito no vcuo, condio necessria para a obteno de um feixe de eltrons, que seriam desviados ao colidirem com tomos do ar. Por isso, no podem ser examinadas clulas vivas.

PREPARAO DE CLULAS PARA MICROSCOPIA ELETRNICA DE TRANSMISSO (TEM) Fixao: utiliza-se soluo de glutaraldedo tamponado a pH 7, 2. Usase tambm xao tetrxido de smio. Na maioria das vezes so utilizados os dois xadores na seqncia. Estruturas que se combinam com smio aparecem escuras. Seguida a xao com smio, pode-se passar ainda as clulas por solues de sais de urnio ou chumbo. Contudo, a xao ideal deve usar solues xadoras adequadas que levem em considerao os detalhes que se buscam analisar, onde e como sero analisadas, os tipos celulares, as velocidades de penetrao, as coloraes ou reaes histoqumicas e imunocitoqumicas que sero utilizadas antes da anlise. Desidratao e incluso: antes de serem observadas realiza-se a desidratao da amostra e permeao desta com uma resina monomrica, que se polimeriza formando um bloco slido de plstico, que ento cortado com lmina de vidro especial ou diamante, em um micrtomo especial. (No se realiza incluso em microscopia eletrnica de varredura SEM).

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Microscopia Eletrnica de Varredura (SEM) Enquanto a TEM utiliza os eltrons que atravessam a amostra para formar a imagem, o micoscpio eletrnico de varredura utiliza os eltrons que so dispersos ou emitidos da superfcie da amostra. A amostra a ser examinada xada, desidratada e coberta com uma camada na de metal pesado e ento a amostra varrida por um feixe estreito de eltrons. A quantidade de eltrons dispersos ou emitidos com esse feixe primrio, bombardeia cada ponto sucessivo da superfcie metlica. medido e usado para controlar a intensidade de um segundo feixe, que se move em sincronia com o primeiro e forma a imagem em uma tela de televiso. A SEM permite obter uma imagem tridimensional, entretanto apenas caractersticas de superfcie so obtidas. Portanto, mais utilizada para se estudar clulas intactas e tecidos do que organelas subcelulares.

REFERNCIAS

BRUCE, Alberts et al. Biologia molecular da clula. 3. ed. Porto Alegre: Artes Mdicas, 1997. CARNEIRO, Jos; JUNQUEIRA, L. C. Biologia celular e molecular. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara, 2001. GARTNER, Leslie. P.; HIATT, James L. Tratado de Histologia. Rio de Janeiro : Guanabara, 1997.

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