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Objectivos: Listar e descrever as ferramentas de estudo da clula Definir e analisar a metodologia usada na: -Microscopia ptica e electrnica; -Microscopia de fluorescncia; -Microscopia de contraste de fase; -Microscopia confocal; Microscopia Electrnica de Transmisso e de Varrimento. Listar e descrever a preparao do material biolgico para a microscopia ptica e electrnica
Poder de resoluo
Microscopia depende de: - tcnicas de preparao das amostras biolgicas - poder de resoluo dos microscpios
1683 - Leeuwenhoek visualiza pela 1x uma bactria 1879 - Flemming descreve o comportamento dos cromossomas na mitose de cl animais. 1881 - Retzius, Cajal e outros desenvolvem tcnicas de colorao e lanaram os fundamentos da anatomia microscpia 1882 a 1899 Klebs e Pasteur utilizando variados corantes identificam importantes agentes patognicos. 1886 Zeiss constroi uma srie de lentes q permite revelar estruturas nos limites tericos da luz visvel
COMO ESTUDAR AS CLULAS MICROSCOPIA Detalhes revelados pelo microscpio ptico O limite mximo de resoluo de 1 microscpio ptico determinado pelo comprimento de onda da luz visvel, q varia de 0,4 m (violeta) a 0,7 m (vermelho).
Detalhes revelados pelo microscpio ptico Limite de resoluo o limite de separao pelo qual 2 objectos podem ser distinguidos.
Limite de resoluo depende de: - comprimento de onda da luz () - abertura numrica do sistema de lentes (an)
A abertura numrica a capacidade do sistema de lentes recolher a luz. - lentes secas - an no pode ser maior que 1 - lentes de imerso an pode chegar a 1,4 Qto > a an > a resoluo e > a luminosidade.
A fixao
imobiliza, mata e preserva e endurece as clulas. torna-as permeveis aos corantes e produz uma ligao cruzada entre as suas macromolculas, permitindo que estas permaneam estabilizadas nas suas posies naturais
Mesmo aps a fixao os tecidos so macios e frgeis e ceras MO precisam de ser embebidos em resinas, ME 1 na forma lquida de seguida na forma slida (por esfriamento ou polimerizao).
Depois de fixado e seccionado, o material biolgico tem que ser corado para poder ser observado ao microscpio.
Uma vez que que os corantes tm diferentes afinidades e poderes de penetrao tm que ser utilizadas em combinaes.
Molculas fluorescentes absorvem luz a 1 determinado e emite um + longo, visualizado atravs de 1 filtro contra um fundo escuro
Os fluorocromos so detectados em microsc de fluorescncia q difere dos normais por ter uma luz + potente q passa por 2 conjuntos filtros:
A fluoresceina emite fluorescncia verde qdo excitada com luz azul A rodamina vermelha amarel/verde
de Contraste
de Fase
a forma + correcta de examinar as clulas seria quando estas ainda estivessem vivas, sem as fixar ou congelar. Qdo a luz atravessa 1a cl viva a fase do alterado de acordo com o ndice de refraco da cl. A luz ao passar atravs do ncleo retardada e deslocada em relao luz que atravessam reas + delgadas. O microsc de contraste de fase explora os efeitos da interferncia qdo estes 2 conjuntos de ondas se recombinam, criando uma imagem da estrutura da clula
A luz q passa atravs de 1a cl no corada sofre pouca alterao de amplitude e os detalhes das estruturas no se conseguem ver
Para a microscopia ptica 1 tecido tem q ser cortado em seces q, qto + fina a seco + ntida a imagem. Neste processo a informao 3D perdida. Com o Mic confucal de varrimento a partir de 1a srie de seces tiradas em s profundidades e armazenadas em computador fcil reconstruir a imagem 3D
o Mic confucal de varrimento para o microscopista o que o CAT scanner para o radiologista. Ambos fornecem imagens seccionadas detalhadas do interior de uma estrutura intacta.
mitocndria vacolo
nuclolo
ribossomas
Golgi RE
Seces finas obtidos por TEM so pedaos bidimensionais de tecidos e no transmitem de imediato a organizao 3D dos componentes celulares
Este conseguido usando o microscpio electrnico de varrimento, q num aparelho <, + simples e + barato do q um TEM.
Utiliza os electres q so dispersos ou emitidos da superfcie da amostra podem ser examinadas e a resoluo atingvel no mto alta
A amostra
fixada, desidratada e coberta com uma camada fina de metal pesado de seguida varrida por um feixe de electres.
A quantidade de electres emitidos medido para controlar a intensidade de um 2 feixe, q se move em sincronia com o 1 e forma a imagem num cran. Como a imagem tem brilhos e sombras d 1a aparncia 3D.