MODELOS EXPERIMENTAIS 1) ANIMAL DIABTICO INDUZIDO POR ESTREPTOZOTOCINA A Estreptozotocina (EZT) uma droga de nitrosamido, e tambm um agente quimioterpico,

, utilizado no tratamento de tumores carcinides e endcrinos do pncreas. Atua por meio da diminuio da ao da adenina-nicotinamida das clulas -pancreticas, inibindo a sntese de DNA, consequentemente, bloqueando de forma irreversvel a produo de insulina. A EZT causa grave hiperglicemia, induzindo o Diabetes Mellitus em animais, semelhante ao diabetes tipo 1 em humanos. Uma nica dosagem corporal de 20 a 250mg/kg intraperitonial capaz de induzir diabetes em ratos. A dose destas drogas para induo do diabetes depende da espcie do animal (rato, camundongo e coelho) e do seu peso. Mtodo: O diabetes experimental induzido pela estreptozotocina pode ser obtido pela droga administrada tanto pela via endovenosa quanto intraperitonealmente. Em ratos a injeo endovenosa de SZT frequentemente realizada em uma das veias da cauda, embora possa ser realizada em qualquer outro stio venoso, como por exemplo uma das duas veias sublinguais o que possibilita a visualizao direta dos vasos por transparncia. Aplicaes: No mbito dos transplantes, com a demonstrada cura do diabetes mellitus tipo 1 pelo transplante intraportal de ilhotas pancreticas em humanos permanece o modelo do diabetes experimental pela SZT como ferramenta til para o estudo de vrios aspectos ainda a ser elucidados nesse tipo de transplante. Esse modelo tambm til na rea da reposio da funo endcrina do pncreas por transplante, especialmente com a descrio da capacidade de clulas-tronco embrionrias e secretoras da insulina para normalizar a glicemia em camundongos com diabetes induzida por SZT.

2) ANIMAL DIABTICO GENETICAMENTE MODIFICADO Os modelos genticos de resistncia insulina e obesidade podem ser devidos a alteraes monognicas, polignicas, produo de modelos transgnicos ou knock-out de genes candidatos. Os modelos genticos de resistncia insulina podem ser devidos a maior expresso de genes que determinam a sntese de peptdeos orexgenos e/ou menos produo de anorexgenos; diminuda ou insuficiente ao da leptina, ou ainda, diminuio na resposta da insulina sobre o seu receptor ou deficiente transduo. a) Modelos monognicos

Dentre os modelos de hiperfagia e obesidade com posterior desenvolvimento de resistncia insulina tem-se o camundongo amarelo, onde ocorre uma mutao no cromossomo 2 murino que sintetiza o peptdeo relacionado protena agouti, que quando produzida determina potente resposta orexgena. A produo desta protena tambm diminui a produo de substancias anorexgenas e derivados da proopiomelanocortina, alem de ser antagonista do receptor MC4. Cabe destacar a importncia deste modelo, pois a resposta do hormnio grelina se faz atravs da ativao dos neurnios produtores de protena agouti. Para se esclarecer o mecanismo de ao da leptina e a resistncia insulina associada sua disfuno, a primeira alterao descrita foi uma mutao no cromossomo 6, que codifica o gene de sntese da leptina. A ausncia de leptina em camundongo faz com que este seja hiperfgico, diabtico e obeso. b) Modelos polignicos Um modelo polignico exemplificado pelo rato OLEFT, onde uma analise genomica demonstrou susceptibilidade nos cromossomos 1, 7, 14 e X. A obesidade e hiperfagia destes animais devem-se a um alelo nulo para sntese do receptor de colecistocinina A (substncia anorexgena). Outros modelos que se enquadram nesta mesma categoria so os camundongos KK (diabetes moderado, obesidade, hiperinsulinemia e hiperplasia de clulas beta pancretica), o rato israelense, que quando alimentado com rao para roedores desenvolve obesidade, diabetes, dislipidemia, hiperinsulinemia e hiperleptinemia, e o rato Goto-Kakizaki, que desenvolve hiperglicemia e hiperinsulinemia, principalmente na idade adulta. Outro modelo polignico de resistncia insulina o modelo do rato espontaneamente hipertenso, porm as caractersticas deste animal sero descritas em tpico abaixo. c) Modelos transgnicos e knock-out Diversos centros, atravs de tcnicas de biologia molecular, desenvolveram animais resistentes insulina atravs da produo de animais transgnicos ou knock-out. importante destacar que o primeiro modelo de knock-out para o estudo da resistncia insulina foi o do knock-out para o prprio receptor da insulina. Neste modelo, os animais heterozigotos tinham apenas 50% dos receptores de insulina viveis, enquanto que os homozigotos no possuam este receptor. Na ausncia do receptor de insulina, os animais desenvolviam cetoacidose diabtica e morriam uma semana aps o nascimento, enquanto que os heterozigotos eram capazes de

sobreviver. Outros pesquisadores foram capazes de produzir modelos knock-out em camundongos, onde a deleo do gene da insulina se faz em tecidos alvos da insulina, como o msculo esqueltico, no crebro, no fgado e no tecido adiposo. O knock-out dos receptores de insulina nas clulas b do pncreas mostrou o papel contra-regulatrio da secreo de insulina mediado pela prpria insulina. Mais ainda, pode-se estudar o papel regulatrio da glicose sobre a secreo pancretica de insulina atravs de produo de animais knock-out para o substrato do receptor da insulina tipo 1 e da glicoquinase pancretica. Outros modelos de resistncia insulina avaliam a sinalizao intracelular da insulina a partir da ligao da insulina ao seu receptor. Desta maneira, j foram produzidos camundongos onde foi realizada a deleo dos complexos de sinalizao intracelular IRS-1, IRS-2 e IRS-3. Com estes modelos, estudos evidenciaram o papel do IRS-1 em mediar os efeitos fisiolgicos da insulina no msculo esqueltico e do IRS-2 no fgado, msculo, tecido adiposo, clulas bpancreticas e no aparelho reprodutor. Camundongos com deleo do gene para sntese de IRS1 desenvolvem resistncia insulina, principalmente muscular, alm de dficit no desenvolvimento, evidenciando o papel desta protena na homeostase glicdica e na ao do IGF-1. Neste modelo experimental, tambm se observa moderada reduo na tolerncia glicose, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia e menor resposta vascular ao vasodilatadora da insulina, alm de hiperplasia significante das clulas b. A deleo do IRS-2 tambm determina diminuio do crescimento e diminuio da quantidade de clulas b-pancreticas, porm, diferentemente da deleo do IRS-1, nestes animais verifica-se ao aparecimento de diabetes somente quando estes atingem aproximadamente 10 semanas de idade. Estes estudos mostram que ambos IRS-1 e IRS-2 esto envolvidos no crescimento e exercem papel ativo no metabolismo de carboidratos. O IRS-2 tambm atua no desenvolvimento das clulas b e no papel hipoglicemiante perifrico mediado pela insulina. O papel do IRS-3 evidenciado quando se realiza um duplo knock-out do IRS-1 e IRS-3, e nestes animais ocorre, alm de hiperglicemia e hiperisulinemia, lipoatrofia com conseqente diminuio das concentraes de leptina e, portanto, diminuio da resposta anorexgena mediada por este peptdeo. A translocao da protena transportadora GLUT-4 do intracelular para a membrana plasmtica de grande importncia na captao celular de glicose mediada por insulina, e sua supresso pode evidenciar seu papel fisiolgico e na resistncia insulina. O papel no metabolismo glicdico desta protena est bem evidenciado em animais com knock-out desta protena em tecidos insulino-sensveis

como o msculo esqueltico. Nesta situao, verifica-se o aparecimento de resistncia insulina, intolerncia glicose e um aumento significante na sntese heptica de glicognio. Nestes animais, a avaliao do metabolismo glicdico atravs da tcnica de clamp euglicmico hiperinsulinmico confirma que a resistncia insulina e a captao de glicose , conforme esperada, muscular, mas tambm ocorre diminuio da captao heptica e adiposa de glicose, evidenciando o papel desta protena na captao de glicose em todos os tecidos insulino-sensveis. Outro papel para esta protena est na funo cardaca, uma vez que em modelos de camundongos transgnicos ocorre o aparecimento de hipertrofia ventricular esquerda. Mais ainda, estes animais apresentam recuperao diminuda da funo cardaca quando submetidos a um insulto isqumico. Estes dois aspectos evidenciam um importante papel desta protena na funo cardaca normal. O knock-out de protenas inibitrias envolvidas na regulao da transduo do sinal insulnico determina maior sensibilidade insulina, e por vezes hipoglicemia. Desta forma, drogas que atravs de seu mecanismo de ao tivessem a capacidade de promover a inibio destes mecanismos regulatrios poderiam ser teis na teraputica farmacolgica de pacientes resistentes insulina. Entre estas enzimas, que quando inibidas melhoram a resposta ao da insulina, esto a tirosina fosfatase (Ptp1b), as sub-unidades regulatrias da enzima PI3K e a c-Jun quinase amino-terminal. Esto tambm entre as substncias capazes de mediar aumento da sensibilidade insulina, os fatores de transcrio Foxo 1, Ceacam, Jnk1 e IKKb e os salicilatos. 3) TESTE DO NADO FORADO O teste do nado forado um dos modelos mais tradicionais para o estudo da depresso em animais de laboratrio, por apresentar alto valor preditivo devido resposta aos medicamentos antidepressivos existentes. Proposto por Porsolt e colaboradores, em 1977, roedores so expostos a uma situao aversiva, nadar em um tanque cilndrico com gua, onde eles no podem tocar o fundo do cilindro ou fugir (escape). Com o tempo os animais percebem que no tem como sair do local e desenvolvem uma postura de imobilidade. O teste filmado e avaliam-se os perodos de imobilidade e natao. o principal modelo experimental utilizado para avaliao de atividade antidepressiva de novas substncias. Para esse teste, geralmente utilizam-se camundongos ou ratos que so mantidos em biotrio alguns dias antes sob luminosidade, temperatura,

gua e alimentao controlados. O cilindro onde o animal ser submetido ao teste, deve ser alto, para que o animal no consiga tocar o fundo, e cheio de gua, mas em uma altura que ele no consiga fugir. O comportamento do animal avaliado por cerca de 5 minutos, para registro de tempo de cada comportamento: natao, escalada e mobilidade. Geralmente usa-se um controle, e aps esses primeiros dados coletados que se inicia o tratamento com a medicao no animal, para posterior comparao. Os parmetros analisados so quanto ao tempo e freqncia de imobilidade total, mobilidade total, mergulhar e agitar a cabea ("head shake"). A imobilidade total resultado da soma dos movimentos de congelamento (freezing) e flutuao. O congelamento considerado quando o rato bia na gua sem executar qualquer movimento, como se estivesse congelado e a flutuao considerada quando o rato faz movimentos apenas para se manter com a cabea fora da gua. O comportamento de mobilidade sub-dividido em nado e escalar (climbing). O escalar considerado quando o rato nada ativamente tentando fugir pelas paredes do aqurio enquanto que o nado considerado a tentativa de fuga no centro do aqurio. O mergulhar avaliado pela tentativa de fuga pelo fundo do aqurio e o agitar a cabea a observao de movimentos bruscos da cabea na tentativa de retirar gua do ouvido 4) TESTE DO CAMPO ABERTO um teste comportamental empregado na avaliao do comportamento explora-trio de ratos. O objetivo deste teste avaliar a locomoo de animais ou a reatividade emocional de ratos tratados com diferentes frmacos. Maior emocionalidade dos animais se manifesta em ambiente amplos, onde os roedores por instinto, se locomovem perto das paredes, onde se sentem mais protegidos. Agentes ansiolticos aumentam a passagem dos animais pelo centro desta arena e diminui a defecao. O animal colocado no centro da arena (pode ser uma espcie de caixa com marcaes) e exposto, individualmente, ao campo aberto por um perodo de 5 minutos, durante os quais os comportamentos so preferencialmente registrados por uma filmadora. Na anlise etolgica dos comportamentos so avaliados: a freqncia e a durao do andar, levantar e limpar, alm do nmero de bolos fecais. O andar medido pelo nmero de retngulos invadidos, com as 4 patas, pelo animal. O levantar considerado como o apoio apenas sobre as patas traseiras. O limpar ("grooming") considerado pelos movimentos dirigidos cabea ou ao corpo, efetuados com as patas dianteiras. Os bolos fecais so contados aps a retirada do animal da arena. Entre a exposio de um

rato e outro necessrio a limpeza do cho da arena com lcool, secando bem e deixando circular um pouco de ar.

5) TESTE DO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO O objetivo deste teste avaliar o efeito ansioltico de frmacos e tambm o comportamento tipo ansiedade em animais com doenas crnicas. O labirinto consiste de 2 braos abertos, sem qualquer anteparo, dispostos em oposio um ao outro e 2 braos fechados, tambm opostos, formando uma cruz. O animal colocado no centro da cruz, com a cabea voltada para o brao fechado, e os seus movimentos observados e preferencialmente gravados por um perodo de 5 minutos. Entre a exposio de um rato e outro necessrio a limpeza do LCE com lcool, secando bem e deixando circular um pouco de ar. Os parmetros avaliados posteriormente so: o tempo de permanncia nos braos fechados e nos braos abertos, freqncia de entradas nos braos abertos ou fechados, levantar, limpar, esticar e espiar. Considera-se que o rato entra num dos brao quando ele est com as 4 patas fora do centro da cruz (rea neutra). O limpar considerado pelo nmero de vezes ou tempo que o animal executa movimentos dirigidos cabea ou ao corpo com as patas dianteiras. O movimento de esticar observado quando o rato, estando na rea neutra, estica seu corpo em direo ao brao aberto, introduzindo nele apenas as patas dianteiras. O espiar considerado quando o rato, estando no brao aberto, inclina sua cabea alm da borda aberta, para o vo.