Psicologia e Sade

Unidade curricular: Biologia Humana I 6 aula PL

TCNICAS CITOLGICAS
INTRODUO: Entende-se por tcnicas citolgicas o conjunto de operaes a que preciso submeter o material biolgico para ficar em condies de ser observado ao microscpio. Estas tcnicas podem ser divididas em dois grandes grupos de preparaes: para microscopia ptica e para microscopia electrnica.

Microscopia ptica
So variados os mtodos de preparao de material citolgico para ser observado ao microscpio ptico. Podemos considerar 3 grandes tipos de preparaes: I. Preparaes a fresco ou extemporneas II. Preparaes definitivas sem incluso III. Preparaes definitivas com incluso (incluso uma das etapas da tcnica, que consiste em colocar a pea citolgica num bloco constitudo por uma substncia protectora e de suporte, que permita efectuar facilmente o corte)

I - Preparaes a fresco
um tipo de preparao que pode ser utilizada a qualquer momento, porque permite uma observao rpida e imediata. Tambm designada por preparao extempornea. A este tipo de preparao se devem as primeiras descobertas cientficas, pois permite a observao de peas ou microorganismos em condies de vida, apesar de ser por um curto perodo. Habitualmente, uma preparao constituda por uma lmina de vidro na qual se coloca o material biolgico a observar, sobrepondo-se a este uma lamela de vidro. Por vezes usam-se outros tipos de lminas na observao de preparaes a fresco, como as lminas escavadas, que tm no centro uma cavidade. O material fica, assim, rodeado de maior quantidade de lquido e ao mesmo tempo no h compresso da lamela sobre as estruturas a observar.

Observao in vivo e in vitro A observao in vivo corresponde ao estudo das clulas no seu prprio meio. um mtodo muito utilizado para o estudo dos seres vivos de pequenas dimenses (protozorios e bactrias). A observao in vitro permite o estudo das clulas vivas, sendo estas previamente retiradas do meio natural em que vivem e colocadas em solues com composio qumica bem definida, de forma a que se processe sem qualquer alterao o metabolismo celular.

A Lquidos fisiolgicos Quando h a preocupao de se observar todas as manifestaes vitais do material em estudo, procura-se rodear a pea de lquidos favorveis sua vivncia, cuja osmolaridade deve igualar aquela em que o ser vivo habitualmente vive. Esses lquidos ou meios denominam-se fisiolgicos ou isotnicos e os mais usados so: Lquido fisiolgico (artificial) Soluo aquosa de cloreto de sdio a 9 /1000, para clulas de mamferos e a 7/1000 para clulas de animais poiquilotrmicos. Lquido fisiolgico do tecido sanguneo (plasma sanguneo) obtido por coagulao do sangue, seguida de centrifugao, adio anticoagulante, centrifugao e colheita do sobrenadante plasma sanguneo. Lquido de Ringer geralmente utilizado para exame de clulas de vertebrados poiquilotrmicos e invertebrados. Alm da isotonia, visa fornecer s clulas os elementos minerais existentes nos meios em que vivem e cuja iria prejudicar o seu metabolismo e estrutura. Esta soluo pode apresentar diferentes composies quantitativas, nomeadamente quando so utilizadas em clulas de animais homeotrmicos (mamferos e aves) ou poiquilotrmicos. gua do mar ou do rio natural e filtrada ou artificial.

B Colorao vital Quando h necessidade de pr em evidncia certas estruturas celulares, procede-se sua colorao. Os corantes so substncias que aumentam o contraste e permitem distinguir regies com igual ndice de refraco. Porm, tem de haver uma precauo se queremos que o protoplasma no morra. Para isso so usadas solues muito diludas de corantes vitais, tais como: azul de metileno, vermelho neutro, azul do Nilo, vermelho do Congo, azul brilhante de cresilo, verde Janus, castanho de Bismark, azur I, azur II, etc., em concentraes da ordem de 1/10.000 a 1/50.000. Com as coloraes vitais no s observamos as clulas e microorganismos como tambm granulaes de secreo, vacolos digestivos, grnulos, organelos citoplasmticos e ainda partes do ncleo como, por exemplo, o nuclolo e cromossomas. 2

Muitos corantes coram certas estruturas celulares de uma cor diferente da sua. Estes corantes reveladores de reaces qumicas so chamados metacromticos. Por exemplo: o vermelho neutro, solvel em gua destilada com cor vermelho-violcea, vira para vermelho-cereja sob a influncia de vestgios de cidos e para amarelo-acastanhado ou alaranjado pela aco das bases. Alguns corantes vitais podem mesmo indicar o grupo qumico a que pertence um determinado elemento da clula, o que se utiliza em tcnicas de histoqumica. Por exemplo, o Sudo III cora as granulaes de gordura nas clulas vivas.

Limitaes do exame a fresco S se aplica a materiais suficientemente transparentes A nutrio das clulas no suficiente e, dentro de horas, as clulas comeam a mostrar sinais de degenerescncia, acabando por morrer. As observaes tm, assim, uma durao muito limitada sendo, portanto, preparaes efmeras que no se podem conservar.

II e III - Preparaes definitivas

Fixadores So substncias ou agentes que induzem precipitao (cloreto de mercrio e cido pcrico) ou coagulao (aldedo frmico, tetrxido de smio e glutaraldedo) das protenas, tornando-as insolveis. Estes agentes so utilizados em tcnicas citolgicas para inibir a actividade enzimtica da clula, para impedir a actividade e a proliferao das bactrias, para endurecer as clulas de modo a que resistam melhor s etapas seguintes da tcnica citolgica e para aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes citolgicos, tornando-as assim mais facilmente corveis, mantendo-lhes, tanto quanto possvel, a sua morfologia e estrutura. Submergindo um pedao de tecido num lquido fixador, a morte da clula no ocorre instantaneamente. O fixador penetra na pea por difuso, de tal maneira que a maioria das clulas perifricas fixa mais rapidamente e melhor do que as centrais. A rapidez da fixao depende da barreira proteica que se origina na periferia do tecido.

Tipos de fixadores Agentes fsicos usados como agentes fixadores: Pelo calor seco (chama, ex.: bactrias) ou hmido (fervura). De um modo geral, so mtodos grosseiros e violentos que alteram profundamente a estrutura das clulas. Dessecao temperatura ambiente em que h uma rpida evaporao da gua das clulas e dos lquidos intersticiais. 3

Agentes qumicos usados como agentes fixadores: Metanol, etanol, acetona, cido sulfrico, cido clordrico, cido tricloroactico, cido pcrico, tetrxido de smio, cido actico, formaldedo, cloreto de mercrio, etc. Misturas de fixadores mais usados em microscopia ptica Lquido de Bouin (cido pcrico + formol + cido actico) Lquido de Carnoy (etanol + clorofrmio + cido actico) Lquido de Fleming (trixido de crmio + tetrxido de smio + cido actico + gua destilada)

Colorao Consiste em corar a totalidade da pea ou algumas partes especficas, dando-lhes tonalidades diferentes. Usam-se solues de corantes naturais ou artificiais. Corantes naturais - Hematoxilina (extrada de uma leguminosa), Carmin (extrado do ovrio da fmea de um hemptero), anil (extrado de uma leguminosa), etc. Corantes artificiais Azul de metileno, azul de toluidina, Azur I e II, Sudo, vermelho neutro. Os corantes so geralmente constitudos por misturas de sais, que podem apresentar um pH cido (pH = 0 6,9), neutro (pH = 7,0) ou alcalino (pH = 7,1 14). Os diversos mtodos de colorao assentam na afinidade particular que certos elementos ou estruturas possuem em relao a determinados corantes que sobre eles se fixam electivamente.

Tipos de corantes artificiais: cidos eosina, fucsina cida, vermelho do Congo Bsicos vermelho neutro, verde de metilo, azul de metileno Neutros eosinato de azur de metileno Consoante a afinidade de determinadas estruturas das clulas ou tecidos para com um dado tipo de corantes as estruturas podem ser designadas por: Acidfilas se coram com um corante cido (citoplasma) Basfilas se coram com um corante bsico (cromatina)

Protocolo a efectuar na 6 aula prtica laboratorial (1 parte)

I - Observao de fenmenos de isotonia, turgidez celular, lise celular, plasmlise e desplasmlise

Para que a morfologia das clulas permanea intacta, devem ser utilizadas solues isotnicas na observao de clulas a fresco. Uma soluo isotnica aquela cuja concentrao igual do meio no qual as clulas vivem. Quando se utiliza uma soluo hipotnica (menos concentrada), a gua do meio difunde para o interior das clulas, aumentando o seu tamanho e provocando turgidez celular. Se esta soluo for muito hipotnica, as clulas podem mesmo sofrer lise celular, uma ruptura em certos pontos da membrana (apenas no caso das clulas animais). Se, pelo contrrio, se utilizar uma soluo hipertnica, a gua migra do interior das clulas para o meio extracelular, originando clulas desidratadas e de menor tamanho, que se dizem plasmolisadas.

I A - Observao em clulas epidrmicas de Allium cepa (n. v. cebola) 1. Cortar uma cebola e, com uma pina, puxar um pedao de uma escama delgada e transparente do interior do bolbo. 2. Deitar uma gota de gua sobre a lmina e colocar nela um fragmento da escama de cebola. Cobrir com uma lamela. 3. Observar com a obj. de 10x que no se verificam alteraes nas clulas e seleccionar o campo de observao mais favorvel. 4. Aps ter verificado este fenmeno de isotonizao, fazer penetrar por difuso uma soluo de sacarose 1 M (soluo hipertnica) com o auxlio de papel de filtro e de uma pipeta (no esquecer que a imagem final obtida no microscpio invertida). Lentamente, verifica-se uma exosmose e d-se o fenmeno de plasmlise; observar tambm com a obj. de 40x. 5. Em seguida, pelo mesmo processo de difuso, retirar a soluo de sacarose e fazer penetrar gua (sol. hipotnica). Verifica-se uma endosmose e d-se o fenmeno de desplasmlise.

I B - Observao em eritrcitos humanos in vitro 1. Limpar a polpa do dedo indicador com algodo embebido em lcool; deixar secar ao ar agitando o dedo; colocar o dedo para baixo e garrote-lo com a outra mo, de modo a aumentar a quantidade de sangue na polpa do dedo. 5

2. Utilizando uma lanceta estril, fazer a colheita de uma gota de sangue, a qual sem perda de tempo, se coloca entre lmina e lamela numa gota de sol. de NaCl 0,9% (soro fisiolgico). 3. Focar primeiro com as obj. de 4x e de 10x e observar com a obj. de 40x. 4. Repetir 2 e 3 utilizando uma soluo de NaCl 1,5% (sol. hipertnica). Os glbulos vermelhos tornam-se globosos e eriados plasmlise (Fig. 11)

Fig. 11 - Eritrcitos na presena de diferentes concentraes de NaCl. 5. Repetir o procedimento utilizando NaCl 0,6%. A clula aumenta de volume devido a uma endosmose, mas a presso exercida no interior da clula no suficiente para a fazer rebentar, verificando-se o fenmeno de turgidez celular (Fig. 11). 6. Com uma soluo de NaCl 0,4%, a quantidade de gua que penetra no interior da clula exerce uma presso que faz romper a membrana celular, libertando a hemoglobina e ficando a clula mais plida e transparente, designada vulgarmente por fantasma. (O meio que a rodeia apresenta-se com uma tonalidade avermelhada.) Contudo, a clula mantm a sua forma circular, devido presena do citosqueleto submembranar, que responsvel pela forma dos glbulos. O fenmeno de lise celular em glbulos vermelhos designa-se por hemlise (Fig. 11).

Nota: Na clula vegetal no se verifica a lise celular pelo facto de possuir uma parede celular que, no s confere proteco clula, como faz com que ela suporte presses elevadas.

6 aula prtica laboratorial (II parte)

III - Preparaes definitivas com incluso

Incluso uma das etapas da tcnica, que consiste em colocar a pea citolgica num bloco constitudo por uma substncia protectora e de suporte, que permita efectuar facilmente o corte.

Preparaes definitivas com incluso (tcnica usual de microscopia ptica)

Etapas: 1. Colheita Cortar em pequenos pedaos, com o auxlio de material de disseco, o material biolgico a fixar. 2. Fixao - Depois da colheita, a pea deve rapidamente ser colocada no fixador para se evitar a autlise e a permanecer durante algumas horas e, em certos casos, alguns dias ou semanas (em formol, as peas so preservadas indefinidamente). Se necessrio, efectua-se uma descalcificao - a dissoluo dos sais de clcio que se encontram, por exemplo, nos ossos e no exosqueleto de muitos animais. 3. Desidratao - Consiste em substituir a gua das clulas e dos espaos extracelulares de um tecido por um solvente miscvel com o solvente do meio de incluso. Em MO compreende uma passagem pela srie ascendente dos lcoois (por ex., 50, 70, 90, 95, 100I, 100II, xilol I e xilol II), cujo tempo de passagem varia, de igual modo, com vrios factores. Vulgarmente, usa-se 30 a 60 minutos em cada passo. Como nos passos seguintes se utiliza a parafina, que insolvel em gua mas solvel em certos compostos orgnicos, necessrio terminar a desidratao com 2 banhos de xilol para substituir o etanol por este solvente da parafina. 4. Impregnao - A impregnao consiste em impregnar os espaos intra- e extracelulares com parafina. Para isso, inicia-se a impregnao com um banho de 1 a 2 horas de durao numa mistura de xilol/parafina (1:1) temperatura de 55C (a parafina s fica lquida a esta temperatura). De seguida, a pea histolgica imersa em parafina pura, mesma temperatura, efectuando-se dois banhos de 1 a 2 horas cada. 5. Incluso - Nesta etapa habitual efectuar-se o registo do material processado, ao qual atribudo um nmero para posterior identificao. Para se incluir a pea histolgica num bloco de parafina utilizam-se moldes especiais, os moldes de Leuckart, que se enchem com parafina lquida, nos quais se introduz a pea histolgica e, por ltimo, uma etiqueta. A parafina temperatura ambiente solidifica e a pea fica assim totalmente includa na parafina. Nesta etapa procede-se separao do molde e o bloco fica em condies de

permanecer armazenado (at por anos, se for caso disso) at se proceder etapa seguinte, o corte. 6. Corte - efectuado por meio de uma faca de ao ou de uma lmina colocada num aparelho especial chamado micrtomo de Minot, no qual se regula a espessura do corte, de acordo com a natureza do tecido e do estudo que se pretende realizar. Na maior parte dos casos utiliza-se o corte com 7 a 8 m de espessura. 7. Colagem - As seces so coladas numa lmina de vidro lavada e desengordurada. A colagem efectua-se numa platina aquecida entre 40 e 50C, utilizando-se gua albuminada como cola. 8. Secagem - De seguida as lminas so colocadas na estufa a 40C durante 1 a 2 dias para completarem a secagem. 9. Desparafinao - Como os corantes so, de um modo geral, hidrossolveis, as seces tm de sofrer uma sequncia de tratamentos que culmina na sua hidratao. O passo inicial consiste em retirar a parafina. Para este efeito, as lminas so mergulhadas numa tina de ranhuras com xilol, durante 10 minutos. 10. Rehidratao - Os cortes so transferidos de tina em tina, percorrendo a srie descendente dos lcoois at ao lcool a 50, durante 3 minutos em cada passo. Por fim, so colocados em gua destilada durante 5 minutos. 11. Colorao - Depois de o material estar bem rehidratado, procede-se colorao por meio de corantes aquosos. Se o corante for alcolico deve-se proceder rehidratao at ao grau da escala do lcool correspondente riqueza alcolica do corante. Geralmente, utiliza-se a associao de dois corantes aquosos: as lminas contendo os cortes so colocadas em tinas de ranhuras contendo hemalmen (de cor azul arroxeada) durante 10 a 15 minutos. Segue-se uma lavagem em gua corrente durante cerca 5 minutos. Depois coram-se nas mesmas condies com a eosina (de cor avermelhada) durante 2 a 3 minutos, seguindo-se uma lavagem durante cerca de 5 minutos. 12. Desidratao - Uma vez corados os cortes, estes tm de sofrer um determinado tratamento que lhes permita serem conservados indefinidamente, o que se consegue atravs da adio de uma resina transparente. Esta substncia hidrofbica, logo os cortes tm de ser desidratados (srie ascendente dos lcoois) at ao lcool a 100, durante 1 minuto em cada passagem. Por fim, os cortes so diafanizados, o que significa conferir transparncia, com xilol durante 3 minutos. 13. Montagem - Aps a diafanizao, os cortes so cobertos com uma gota do meio de montagem (resina) podendo ser blsamo do Canad ou DPX e, por fim, coloca-se uma lamela. O ndice de refraco do meio de montagem tem de ser igual ao do vidro.

14. Secagem, Lutagem e Etiquetagem Para a preparao histolgica secar mais rapidamente colocada na estufa a 40C, durante 24 horas, para que o meio de montagem endurea. A lutagem uma etapa muitas vezes no efectuada, que consiste em cobrir os bordos da lamela com um meio totalmente impermevel ao ar. Usa-se geralmente verniz ou betume. Para finalizar, coloca-se num dos lados uma etiqueta, na qual se identifica o material, a fixao e a colorao utilizadas. As preparaes devem ser guardadas ao abrigo da humidade e da luz. As etapas da tcnica usual da MO iro ser observadas e explicadas atravs de um filme. Numa das aulas prticas sero executadas as etapas 7 a 14.