MTODOS FSICOS DE CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO

BAIXAS TEMPERATURAS: Servem apenas como mtodo de preservao de microrganismos, podendo ser realizado em geladeira (0C), congelador (-20C) ou nitrognio lquido (-179C). CALOR: O mtodo mais empregado para matar microrganismos. Quanto maior o nmero de microrganismos, maior dever ser o tempo de exposio ao calor. Os tipos de calor utilizados nos processos de controle microbiolgico so: CALOR MIDO: - Fervura (temperatura x tempo): mtodo de reduo do nmero de microrganismos (100C), este mtodo destroi muitos vrus, fungos e seus esporos em at 15 minutos. Este no um mtodo de esterilizao, mas um mtodo eficiente para tornar alimentos e gua seguros para serem ingeridos. - Autoclavao (presso x temperatura x tempo): Mtodo de esterilizao preferencial, desde que o material ou substncia a ser esterilizada no sofra alteraes pelo calor ou umidade. Quanto maior a presso interna, maior a temperatura atingida. Geralmente utiliza-se como padro, o calor mido de 121C e a presso de 15 lb/pol2 por 15 minutos. A autoclavao empregada para esterilizar meios de cultura, instrumentos cirrgicos, solues e materiais que suportam altas temperaturas e presses. - Pasteurizao (temperatura x tempo): mtodo de preveno da perda da qualidade, atravs da reduo do nmero de microrganismos. Consiste em aquecer o produto a uma dada temperatura, num dado tempo, e a seguir, resfriar bruscamente. CALOR SECO: - Flambagem: forma mais simples de esterilizao por calor seco. Utilizada rotineiramente em laboratrio para esterilizar fios e alas de platina. - Incinerao: mtodo de esterilizao, usado para queimar sacos e copos de papel, plstico, carcaas de animais e materiais descartveis que j foram utilizados. - Estufas (temperatura x tempo): mtodo de esterilizao empregado em laboratrio para vidraria refratria. RADIAES: As radiaes tm seus efeitos dependentes do comprimento de onda, da intensidade, durao e distncia da fonte. H pelo menos dois tipos de radiaes empregadas no controle microbiolgico: - Ionizantes: so utilizados istopos radioativos que emitem radiao, como por exemplo, as radiaes gama. O principal efeito da radiao ionizante a morte ou inativao do microrganismo, atravs da destruio do DNA celular. Produtos hospitalares descartveis como seringas plsticas, luvas, cateteres, fios e suturas so esterilizados por este mtodo. - No-ionizantes: utilizam-se radiaes com comprimento de onda mais longo, como a luz ultravioleta (UV), que provoca alterao no DNA. As desvantagens do uso da UV so: baixo poder de penetrao (atua somente na superfcie dos materiais) e os efeitos nocivos sobre a pele e os olhos.

MTODOS QUMICOS DE CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO

- LCOOIS (age sobre as protenas): possui vrios mecanismos de ao, sendo relativamente eficiente, so solventes de lipdios (ao detergente), so desidratantes (retiram a gua das clulas) e desnaturam protenas. O lcool etlico pode ser usado como desinfetante ou antisptico. O lcool absoluto (no hidratado) fraco germicida. Um lcool parcialmente hidratado (60- 70%) mais ativo que o absoluto, pelo maior poder de penetrao e consequente desnaturao proteica mais rpida. - FENIS (age sobre as protenas): Utilizado para desinfeco de pisos, vasos sanitrios; componentes de sabes. Ex. Creolina. - CLORO / IODO (HALOGNIOS): O Cloro desinfetante de guas, alimentos e pisos. Mecanismo de ao oxidante. Cl2 + H2O HCl + HClO cido hipocloroso instvel, espontaneamente forma mais HCl e oxignio nascente, isso que matar os microrganismos. - O mecanismo de ao do Iodo a sua combinao irreversvel com protenas atravs da interao com aminocidos aromticos, fenilalanina e tirosina, levando desnaturao das mesmas. um dos anti-spticos mais utilizados na prtica cirrgica. - AGENTES DE SUPERFCIE (age sobre a membrana plasmtica): alteram a permeabilidade da membrana, inibem a respirao e a obteno de energia de formas bacterianas vegetativas, tendo tambm ao sobre fungos, vrus e esporos bacterianos. Ex.: Clorexidina, utilizada na anti-sepsia da pele (mos de cirurgies, mdicos e paramdicos em geral), preparao prcirrgica de pacientes, anti-spticos bucais etc. - AGENTES OXIDANTES: age atravs da liberao de oxignio nascente, que extremamente reativo e oxida sistemas indispensveis para a sobrevivncia dos microrganismos. Ex. gua oxigenada (H2O2) em soluo a 3%. Oznio O3, o qual tem sido utilizado em larga escala no tratamento de gua de consumo. - ESTERILIZANTES GASOSOS (agem inativando certas enzimas): O xido deetileno, embora tenha atividade esterilizante lenta, tem sido empregados com sucesso na esterilizao de instrumentos cirrgicos, fios de agulhas para suturas e plsticos.

TCNICA E PROCESSO DE ASSEPSIA

importante ter claro os procedimentos que se devem adotar na manipulao segura dos meios, culturas bacterianas, entre outros, de modo a evitar qualquer tipo de contaminao. Tais procedimentos so denominados genericamente de tcnicas de assepsia e incluem: 1- fazer a desinfeco da rea de trabalho e a antissepsia das mos sempre antes e depois de trabalhar; 2- trabalhar sempre na rea de segurana (aproximadamente 10cm) em volta da chama do bico de Bunsen; 3- esterilizar adequadamente alas e agulhas de inoculao antes e depois do seu uso, evitando a criao de aerossis, para isso aquecendo sempre da base para a ponta; 4- flambar a boca dos frascos e tubos antes e depois das inoculaes.

SEMEADURA
o processo de isolamento de um material suspeito de contaminao por algum microrganismo. Esse isolamento deve proporcionar as condies ideais de crescimento e desenvolvimento do microrganismo, caso este esteja presente. O processo feito quando se espalha uma quantidade (conhecida) do material sobre o meio de cultura em Placa de Petri, e incub-la em temperatura ideal (geralmente em estufa a 37C por 12, 24 ou 48 h). Aps o perodo de incubao, realiza-se a leitura da placa.

TCNICAS DE SEMEADURA
TCNICA I - MEIO SLIDO (GAR EM PLACA DE PETRI): SEMEADURA POR ESGOTAMENTO. 1- Mergulhe a ala de platina esterilizada na amostra que lhe apresentada. 2- Encoste a ala carregada de bactrias na superfcie do gar e inicie movimentos de ziguezague retilneos, uniformes e bem prximos. 3- Desencoste levemente a ala de platina da superfcie, gire a placa ( 90), encoste novamente a ala de platina no final da primeira semeadura e inicie nova semeadura com movimentos em zigue-zague, retilneos, uniformes e um pouco mais espaados. 4- Desencoste levemente a ala de platina da superfcie, gire a placa ( 90), encoste novamente a ala de platina no final da segunda semeadura e inicie nova semeadura com os mesmos movimentos, mas desta vez, bem espaados. 5- Incube em estufa para crescimento, com o tempo e temperatura estabelecidos pelo laboratrio.

TCNICA II - MEIO LQUIDO (CALDO NUTRITIVO) 1- Mergulhe a ala de platina esterilizada na cultura de isolamento bacteriano. 2- Mergulhe a ala carregada de bactrias no tubo com o meio de cultivo lquido (caldo) e agite a ala. 3- Incube em estufa para crescimento. Geralmente o tempo de crescimento varia de 4 - 6 h. Dependendo da bactria, pode levar de 18 a 24 h. Visualize o caldo aps incubao. Um caldo turvo demonstra crescimento bacteriano.

TCNICA III - MEIO SEMI-SLIDO 1- Mergulhe o fio de platina esterilizado na cultura bacteriana que lhe fornecida. 2- Inocule o fio de platina carregado com bactrias no centro do meio de cultivo semi-slido. 3- Incube em estufa para crescimento sob temperatura e tempo sugeridos.

TCNICA IV - MEIO SLIDO (GAR INCLINADO) 1- Em estria sinuosa: semear com ala de platina, em ziguezague, partindo da base para a extremidade da superfcie inclinada do meio Este tipo de semeadura permite a obteno de melhor massa de microorganismos. 2 - Em estria reta: semear com agulha de platina, em estria reta, partindo da base para a extremidade da superfcie inclinada do meio, ou em profundidade e superfcie. Este tipo de semeadura utilizada em provas bioqumicas para identificao bacteriana. 1- Mergulhe o fio de platina esterilizado na cultura bacteriana que lhe fornecida. 2- Inocule o fio de platina carregado com bactrias na parte mais baixa do gar inclinado at quase encostar o fundo do tubo. 3- Durante a retirada do fio de platina, quando este atingir a superfcie, suba fazendo estrias na superfcie do gar. 4- Incube em estufa para crescimento na temperatura e tempo sugeridos.

MEIOS DE CULTURA
Sistema utilizado para isolar microrganismos em laboratrios, que permite o crescimento e a multiplicao dos agentes. Um bom meio de cultura deve preencher todas as necessidades nutricionais dos agentes, ser estril e possuir pH adequado. Os meios de cultura podem ser lquidos ou slidos. Podem ser ainda: - NO SELETIVOS: permitem crescimento de um grande nmero de espcies - SELETIVOS: meio geral no qual so adicionadas substncias que inibem ou reduzem certos grupos, salientando outros. Os meios de culturas possuem como principais componentes: H2O destilada, fonte de carbono (energia - CO2, lipdeos, acar, lcool e outras substncias), fonte de nitrognio, fatores de crescimento (vitaminas que variam de espcie para espcie), extratos (de carne, levedura, casena de leite, hidrolisado de protena de soja), minerais (P, Fe, Zn, Mn, Ca, Cu, Na em baixas concentraes). Eles se apresentam na forma desidratada, devendo ser diludos em H2O deionizada (sem ons) e esterilizados. A esterilizao um processo que elimina todos os contaminantes provenientes da gua ou do prprio meio de cultura. Esse processo feito em autoclave 121C por 15 minutos e o pH do meio deve ser ajustado conforme indicado pelo fabricante, ou de acordo com o microrganismo pesquisado.

TIPOS DE MEIOS
. MEIOS SLIDOS: Onde so adicionados geralmente de 1,0 g a 3,0 g % de gar (podem ser liquefeitos se aquecidos). A maioria dos microrganismos cresce formando colnias. Ex: gar nutritivo. . MEIOS SEMISLIDOS: Onde so adicionados, geralmente, de 0,1g a 0,7g% de gar. Servem, por exemplo, para visualizar a motilidade bacteriana ou, muitas vezes, como base de meio de transporte. Ex: Meio SIM e Cary & Blair. . MEIOS LQUIDOS: Sem adio de gar. So os chamados caldos. Sua turvao sinal de crescimento bacteriano. Ex: Caldo nutritivo, caldo simples e caldo Casoy.

DE ACORDO COM O OBJETIVO DA UTILIZAO

. MEIOS BSICOS: So os de uso geral e podem ser usados como base no preparo de outros meios. O caldo simples o exemplo mais comum. . MEIOS ENRIQUECIDOS OU RICOS: Nestes meios, a adio de sangue, soro, extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo, ou gar nutritivos, proporciona nutrientes acessrios, passando a permitir o crescimento de organismos heterotrficos fastidiosos (mais exigentes). Um exemplo clssico o gar chocolate, que permite o crescimento de diversas bactrias exigentes. No confundir meios enriquecidos com meios de enriquecimento, como os caldos tetrationato de Kauffman e selenito, que geralmente possuem produtos seletivos ou proporcionam somente o crescimento de determinado grupo bacteriano.

. MEIOS SELETIVOS: A adio de substncias qumicas especficas ao caldo ou ao gar nutritivo previne o crescimento de um grupo de bactrias sem agir sobre outro. Ex1: Cristalvioleta impedindo o crescimento de Gram-positivos, sem afetar o desenvolvimento dos Gramnegativos. Ex2: Alguns antibiticos adicionados podem inibir um grupo de bactrias sensveis e no afetar outro (resistentes). . MEIOS DIFERENCIAIS OU INDICADORES: A adio de certos reagentes ou substncias no meio pode resultar num tipo de crescimento ou reao, aps a inoculao e a incubao, que permite ao observador distinguir diferentes tipos de bactrias. Ex: Incorporao de lactose e um indicador de pH: fermentadores ou no deste acar, lactose (+) e lactose (-) formaro colnias com cores distintas. . MEIOS DE DOSAGEM: Meios de composio definida (meios sintticos). So empregados para dosar vitaminas, aminocidos e antibiticos. . MEIOS PARA CONTAGEM: Tipos especficos de meios so indicados para determinar o contedo bacteriano de materiais, como por exemplo, gua, urina, leite, etc. (podem ser ricos, seletivos ou diferenciais). . MEIOS DE ESTOCAGEM OU MANUTENO: Geralmente meios mnimos. A manuteno da viabilidade e caractersticas fisiolgicas de uma cultura pode exigir um meio diferente do recomendado para um bom crescimento timo. Na preparao de um meio de estocagem, prefervel omitir a glicose e utilizar uma substncia tampo, evitando variaes de pH. . MEIOS DE TRANSPORTE: Geralmente semisslidos, para evitar o extravasamento. So semelhantes aos meios de manuteno e devem ter o mnimo de nutrientes para a manuteno das bactrias sem que estas se reproduzam ou acidifiquem o meio. Um ponto importante neste tpico o controle de qualidade dos meios, onde devemos observar os possveis erros na sua preparao e seu armazenamento de forma ideal.

SELEO DOS MEIOS DE CULTURA PRIMRIOS

Para um timo isolamento bacteriano essencial inocular a amostra no meio de cultura primrio apropriado; porm, h vrias centenas de meios disponveis no mercado. Na seleo para o uso rotineiro deve-se optar por um nmero relativamente pequeno de meios seletivos e no seletivos. Um exemplo de meio no seletivo muito utilizado o gar sangue (permite o crescimento da maioria das bactrias). Podemos fazer outras opes mais seletivas, com base na fonte ambiental ou anatmica do material e no conhecimento das espcies bacterianas comumente encontradas nas amostras, observando sempre se h suspeita de algum microrganismo em particular. Uma populao microbiana, em condies naturais, contm muitas espcies diferentes. Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar e identificar as bactrias da amostra para ento classific-las e caracteriz-las.

ISOLAMENTO E CULTIVO DE CULTURAS PURAS

Para determinarmos as caractersticas de um microrganismo, identific-lo e apont-lo como suspeito de causar ou no uma patologia, ele deve estar em cultura pura. Para realizar o isolamento, devemos optar pelo meio de cultura mais adequado no deixando de considerar os fatores-chave para esta escolha: Consideraes sobre a origem do material a ser analisado. A espcie que se imagina estar presente nesta amostra. As necessidades nutricionais dos organismos.

MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAO

Cary Blair Salina Tamponada Meio Stuart gar nutriente

MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO

gar Chocolate gar Thayer-Martin Chocolate gar Salmonella-Shigella (ss) Caldo Selenito Caldo Tetrationato Caldo Tioglicolato com indicador Caldo Tioglicolato sem indicador gar Mac Conkey gar Sangue gar CLED cystine lactose electrolyte deficient Caldo BHI brain heart infusion Lwenstein Jensen

MEIO BIFSICO:
Lwenstein e Middlebrook gar Mycosel gar Sabouraud

MEIOS COMERCIAIS PARA PROVAS DE IDENTIFICAO

Base de nitrognio para leveduras Yeast Nitrogen Base gar Citrato Simmons gar Blis-Esculina gar Sangue - CAMP Caldo base de Moeller gar Dnase gar Esculina gar Fenilalanina CTA Cystine Tryticase Agar Caldo Triptona e SIM Meio Caldo Triptona Caldo Malonato Caldo Nitrato

MEIO BASE PARA OXIDAO E FERMENTAO - OF

gar TSI triplo acar ferro gar base uria (christensen)

MEIOS PARA TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

HTM haemophilus test mdium gar Mueller Hinton gar Mueller Hinton Sangue

MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAO CARY BLAIR PRINCPIO - Meio de Cary Blair foi formulado partir do meio de Stuart, uma vez que microrganismos patognicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio. - A carncia de uma fonte de nitrognio impede consideravelmente a multiplicao de microrganismos e a composio nutritiva garante a sobrevivncia deles. - O que difere este meio do meio de Stuart, a adio de uma soluo salina balanceada de tampo fosfato inorgnico e omitindo da frmula o azul de metileno. UTILIDADE Transporte de material fecal e conseqente conservao dos microrganismos INOCULAO - Introduzir um "swab" estril de madeira nas fezes recm coletadas; - Aps a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contm o algodo fique no meio de cultura; - Fechar o tubo; - Manter em temperatura ambiente at o momento de semear nos meios seletivos adequados. INTERPRETAO - Cor original do meio: Branco opalescente. - Como este um meio de transporte, no h evidncia de crescimento bacteriano. RECOMENDAES - No deixar o meio com a tampa aberta ou semiaberta aps a semeadura. - No semear fezes coletadas com mais de 6 horas. MEIO STUART PRINCPIO - A carncia de uma fonte de nitrognio impede consideravelmente a multiplicao de microrganismos e a composio nutritiva garante a sobrevivncia deles. UTILIDADE - Transporte de diversos materiais e consequente conservao dos microrganismos. - Conservao de microrganismos patognicos como: Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp., entre outros.

INOCULAO - O material biolgico deve ser coletado com auxlio de um "swab" estril com haste de madeira; - Aps a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contm o algodo fique no meio de cultura; - Fechar o tubo; - Manter em temperatura ambiente at o momento de semear nos meios seletivos adequados. INTERPRETAO - Cor original do meio: Branco opalescente. - Como este um meio de transporte, no h evidncia de crescimento bacteriano. RECOMENDAES - No deixar o meio com a tampa aberta ou semiaberta aps a semeadura.

MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO GAR CHOCOLATE PRINCPIO - Meio de gar Chocolate amplamente utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes, embora cresam neste meio quase todos os tipos de microrganismos. - base do meio, adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemcias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes. Observao: se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os suplementos a base de NAD (coenzima I) e cistena aps resfriar a base achocolatada aproximadamente 50C. UTILIDADE - Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp. INOCULAO - Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura para isolamento; - Incubar a 35C por 24 horas. INTERPRETAO - Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). - Colnias de tamanho pequeno a mdio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp, Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. - Colnias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp.

RECOMENDAES - Lembrar que um meio rico e crescem vrios tipos de microrganismos. Fazer esfregao de todas as colnias suspeitas e corar pela tcnica de Gram, para confirmar se trata-se ou no de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. (cocos Gram negativos reniformes) ou Haemophilus spp. (bacilos Gram negativos delicados e pleomrficos). - No usar sangue de cavalo vencido. - Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma ser abundante. Sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de trabalhar com cepas misturadas.

GAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS) PRINCPIO - gar SS possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sdio) que inibem microrganismos Gram positivos. - A incorporao de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo lactose positiva (bactrias que fermentam a lactose produzem cido que na presena do indicador vermelho neutro resultando na formao de colnias de cor rosa), e bactrias que no fermentam a lactose formam colnias transparentes. - Tissulfato de sdio e o citrato frrico permitem a deteco de HS evidenciado por formao de colnias de cor negra no centro. UTILIDADE - Selecionar e isolar espcies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e gua. INTERPRETAO - Cor original do meio: vermelho alaranjado. - Colnias com centro negro (HS) ou colnias incolores: suspeita de Salmonella. - Colnias incolores: suspeita de Shigella spp. - Colnias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp. - As bactrias no fermentadoras de lactose so incolores. - As bactrias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa. RECOMENDAES - Ausncia de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais 24 horas. - No autoclavar, pois a alta temperatura degrada o acar contido no meio.

CALDO TIOGLICOLATO COM INDICADOR PRINCPIO - O meio de Tioglicolato d suporte para o crescimento de vrios microrganismos. O potencial de oxidao e reduo baixo do meio neutraliza efeitos antibacterianos das espcies preservadas com mercrio. - A resazurina e o azul de metileno so indicadores da posio de oxidao de aerbios e a dextrose includa na frmula para os microrganismos que tem crescimento vigoroso na presena do carboidrato.

UTILIDADE - Usado para o cultivo de microrganismos aerbios, microaerfilos e anaerbios. - Usado para controle de esterilidade bacteriana de diversos materiais. INTERPRETAO - Cor original: amarelo claro. - Presena de crescimento: turvao do meio. - Ausncia de crescimento: meio permanece inalterado. - Crescimento de microrganismos anaerbios: crescimento na profundidade do meio. - Crescimento de microrganismos aerbios: crescimento na superfcie do meio. RECOMENDAES - No usar o meio quando estiver com cor rosa ou esverdeado na superfcie, pois indica a presena de oxignio no meio. - Recomenda-se o uso do meio recm-preparado, porm, se no houver a presena de oxignio, pode-se usar um perodo maior. - No usar meios que estejam turvos. - No utilizar o meio quando o indicador atingir a metade do volume do meio.

CALDO TIOGLICOLATO SEM INDICADOR PRINCPIO - As substncias redutoras tioglicolato, cistena e sulfito de sdio produzem uma anaerobiose suficiente para microrganismos anaerbios exigentes. UTILIDADE - Usado para o cultivo de microrganismos anaerbios. INTERPRETAO - Cor original: amarelo claro. - Presena de crescimento: turvao do meio. - Ausncia de crescimento: meio permanece inalterado. RECOMENDAES - No usar meios que estejam turvos. - Se necessrio, incubar um perodo superior 48 horas.

GAR MAC CONKEY PRINCPIO - O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos. - A concentrao de sais de bile relativamente baixa em comparao com outros meios, por isso no to seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o gar SS. UTILIDADE - Isolar bacilos Gram negativos (enterobactrias e no fermentadores) e verificar a fermentao ou no da lactose.

INTERPRETAO - Cor original do meio: rosa avermelhado. - Crescimento de bacilos Gram negativos. - Colnias cor de rosa: fermentadoras de lactose. - Colnias incolores: no fermentadoras de lactose. - No h crescimento de cocos Gram positivos.

GAR SANGUE PRINCPIO - O meio de gar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita, oferece timas condies de crescimento a maioria dos microrganismos. As conservaes dos eritrcitos ntegros favorecem a formao de halos de hemlise ntidos, teis para a diferenciao de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. UTILIDADE - Usado para o isolamento de microrganismos no fastidiosos. - Verificao de hemlise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. - Usado na prova de satelitismo (para identificao presuntiva de Haemophilus spp.). INTERPRETAO - Cor original do meio: vermelho. - Beta hemlise: presena de halo transparente ao redor das colnias semeadas (lise total dos eritrcitos). - Alfa hemlise: presena de halo esverdeado ao redor das colnias semeadas (lise parcial dos eritrcitos). - Gama hemlise (sem hemlise): ausncia de halo ao redor das colnias (eritrcitos permanecem ntegros). RECOMENDAES - No usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com cor muito escura, dificultando o estudo de hemlise; - No usar sangue humano, pois alguns microrganismos no apresentam hemlise; - No adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemcias rompem-se, dificultando o estude de hemlise; Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma ser abundante, sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de trabalhar com cepas misturadas. GAR CLED CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT PRINCPIO - Usado para isolamento e quantificao de microrganismos presentes em amostras urina. A deficincia de eletrlitos inibe o vu de cepas de Proteus. UTILIDADE - Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras.

INTERPRETAO - Cor original do meio: azul claro. - Colnias lactose positiva: cor amarela. - Colnias lactose negativa: cor azul. Caractersticas de crescimento: - Escherichia coli: colnias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de dimetro, as no fermentadoras de lactose colnias azuis - Espcies de Klebsiella: colnias muito mucosas, cor varivel de amarelo a branco azulado - Espcies de Proteus: colnias azul translcidas, geralmente menor que E.coli - Espcies de Salmonella: colnias planas, cor azul - Enterococcus faecalis: colnias amarelas, com cerca de 0,5 mm de dimetro - Staphylococcus aureus: colnias amarelas, com cerca de 0,75 mm de dimetro - Staphylococcus coagulase negativa: colnias amarelo palha e brancas - Corynebacterium: colnias pequenas e cinza - Lactobacilos: colnias pequenas e com superfcie rugosa - Pseudomonas aeruginosa: colnias verdes, com superfcie prateada e periferia rugosa RECOMENDAES - Organismos que fermentam lactose baixam o pH e mudam a cor do meio de verde para amarelo, podendo assim verificar se o microrganismo lactose negativa ou positiva; - Espcies de Shigella no crescem em meios deficientes em eletrlitos. CALDO BHI BRAIN HEART INFUSION PRINCPIO - um meio derivado de nutrientes de crebro e corao, peptona e dextrose. - A peptona e a infuso so fontes de nitrognio, carbono, enxofre e vitaminas. A dextose um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentao. UTILIDADE - Meio para cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactrias, no fermentadores, leveduras e fungos. - Pode ser utilizado na preparao do inculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, para realizao de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44C e para teste de motilidade em lmina. INTERPRETAO - Cor original do meio: amarelo claro, lmpido. - Positivo: presena de turvao = crescimento bacteriano. - Negativo: ausncia de turvao. RECOMENDAES - Para cultivo de anaerbios, acrescentar 0,1% de gar. - Para crescimento de Haemophilus e outros fastidiosos necessrio adio de suplementos a base de L-cistena, NAD (fator V) e hemina (fator X).

MEIOS COMERCIAIS PARA PROVAS DE IDENTIFICAO GAR CITRATO SIMMONS PRINCPIO - Verifica a capacidade da bactria de utilizar o citrato de sdio como nica fonte de carbono, juntamente com sais de amnia, alcalinizando o meio. UTILIDADE - Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores. INTERPRETAO - Cor original do meio: verde - Positivo: cor azul ou crescimento no local do inculo. - Negativo: no h crescimento e a cor permanece inalterada. - Se houver crescimento visual na rea do inculo sem mudana de cor, o teste pode ser considerado positivo, reincubar por 24 at 72 horas, a incubao poder mudar a cor do meio para alcalino (azul). Leitura inicial com 24 horas: - Se resultado positivo: encerrar o teste. - Se resultado negativo ou houver dvida: reincubar por mais 24/48 horas. Leitura com 48 horas: - Se houver crescimento visvel na rea do inculo sem mudana de cor, o teste pode ser considerado positivo, (encerrar o teste). - Se resultado negativo ou houver dvida, reincubar por 24 at 72 horas, a incubao poder mudar a cor do meio para alcalino(azul). RECOMENDAES - Manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxignio. - No se devem transportar colnias de meios que contenham glicose ou outros nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato, podendo dar um resultado falso positivo. - Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em temperatura ambiente (22 a 25C) por at 7 dias. - No usar repiques de caldo. - Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactria. - Para fazer o inculo flambar o fio bacteriolgico. - No fazer inculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo).

GAR BLIS-ESCULINA PRINCPIO - A prova de Bile-Esculina baseada na capacidade de algumas bactrias hidrolisarem esculina em presena de blis. A esculina um derivado glicosdico da cumarina. As duas molculas do composto (glicose e 7-hidroxicumarina) esto unidas por uma ligao ster atravs do oxignio. A esculina incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares. - As bactrias Bile-Esculina POSITIVAS, so capazes de crescer em presena de sais biliares. A hidrlise da esculina no meio resulta na formao de glicose e

esculetina. A esculetina reage com ons frricos (fornecidos pelo composto inorgnico do meio - o citrato frrico), formando um complexo negro. UTILIDADE - Separao dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa. - Identificao dos Enterococcus spp., que so Bile-Esculina positiva. - Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores e enterobactrias, usar o meio sem blis (vide prova de esculina). INTERPRETAO Cor original do meio: acinzentado - Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio. - Negativo: Ausncia de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio aps 72 horas de incubao. RECOMENDAES - Provas negativas com 24 horas de incubao, recomenda-se perodo de incubao maior (48 horas). - Alguns Streptococcus do grupo viridans (cerca de 3%) podem hidrolizar a esculina em presena de blis se incubados em atmosfera de CO2. GAR SANGUE - CAMP PRINCPIO - Consiste na interao da beta hemlise secretada pelo Staphylococcus aureus com o microrganismo em estudo, que secreta uma protena, denominada "fator CAMP", produzindo aumento de hemlise no local da inoculao. UTILIDADE - Separao do Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e da Listeria monocytogenes (CAMP positivos) dos demais Streptococcus beta hemolticos e espcies de Listeri INOCULAO - Com auxlio do fio bacteriolgico, semear na superfcie de meio gar Sangue a cepa de Staphylococcus aureus com uma nica linha reta; - Novamente com o fio bacteriolgico (flambado), tocar nas colnias em estudo; - Semear uma nica linha reta na superfcie do meio gar Sangue, perpendicularmente linha de semeadura do S. aureus, sem tocar no inculo do S. aureus; - Logo em seguida, sem flambar o fio, picar o meio gar Sangue duas vezes, uma de cada lado da semeadura da cepa em estudo, sem tocar nas duas linhas de inculo j feitos (a do S. aureus e da cepa em estudo); - Incubar 35C 24 horas. (a) Inculo do S. aureus (b) Inculo da cepa em estudo INTERPRETAO

- Positivo: Aumento da rea de hemlise em forma de flecha no local onde esto mais prximas as duas estrias de crescimento. - Negativo: Ausncia de aumento da hemlise. Observa-se nitidamente a hemlise do S. aureus e da cepa em estudo, inalteradas. RECOMENDAO - No utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem no produzir beta hemolisina. - No tocar as estrias da semeadura das cepas, para no dar um resultado falso negativo. - No utilizar placas de gar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova, j que baseada na hemlise das cepas.

CALDO BASE DE MOELLER PRINCPIO - As descarboxilases so um grupo de enzimas com substrato especfico, capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminocidos para formarem aminas alcalinas. Essa reao, conhecida como descarboxilao, origina dixido de carbono como produto secundrio. - Emprega-se normalmente trs aminocidos para identificao dos microrganismos: lisina, ornitina e arginina. A base de Moeller a mais utilizada. Os produtos aminados especficos, so: - Lisina: Cadaverina; - Ornitina: Putrescina; - Arginina: Citrulina. A converso da arginina em citrulina uma atividade de diidrolase, e no descarboxilase, na qual o grupo NH2 retirado da arginina como primeira etapa. Em seguida, a citrulina convertida em ornitina, que sofre descarboxilao para formar putrescina. - A incubao deve ser em anaerobiose e para isso, adicionado 1 ml de leo mineral estril aps a inoculao. No incio da incubao, a glicose contida no meio fermentada e ocorre viragem de cor prpura para o amarelo. Quando o aminocido descarboxilado, as aminas alcalinas formadas revertem a cor do meio para prpura original. UTILIDADE - Verificar a capacidade de microrganismos usarem enzimas, auxiliando na identificao. - Utilizado principalmente para identificaes de enterobactrias, bacilos Gram negativos no fermentadores, estafilococos INOCULAO - A partir de crescimento recente, inocular a colnia em estudo no tubo contendo o aminocido e no tubo controle; - Colocar aproximadamente 1 ml de leo mineral estril em cada tubo; - Incubar 35 +/- 1C em aerobiose. INTERPRETAO - Cor original do meio: prpura

- Positivo: Tubo controle (sem aminocido): amarelo e turvo - indica que o microrganismo vivel e o pH do meio abaixou o suficiente para ativar as enzimas descarboxilase. Tubo com aminocido: prpura e turvo- indica a formao de aminas a partir da reao de descarboxilao. -Negativo: Tubos controle e com aminocido: prpura. RECOMENDAES - Verificar se o inculo foi satisfatrio para o crescimento, pois a cor original do meio - prpura, sem apresentar turvao no significa positividade e sim, ausncia de crescimento bacteriano. - Como a reao ocorre em anaerobiose, imprescindvel a adio de leo mineral. - Pode-se autoclavar o meio j com o leo mineral ou adicionar aps a inoculao do microrganismo. - Para alguns microrganismos, como bacilos Gram negativos no fermentadores, necessrio um perodo de incubao prolongado (24 a 72 horas). GAR DNASE PRINCPIO - Cepas de alguns microrganismos produzem DNase e endonuclease termoestvel. Estas enzimas hidrolisam cido desoxirribonuclico (DNA) contido no meio de cultura aps um perodo de incubao. Posteriormente este meio acidificado com HCl 1N para a revelao da prova. UTILIDADE Prova de identificao que separa os principais microrganismos de importncia clnica, entre eles: - DNase positivos: Staphylococcus aureus , Serratia spp. e Proteus spp., Stenotrophomonas maltophilia, Cryseobacterium meningosepticum, Moraxella catarrhalis. - DNase negativos: Staphylococcus coagulase negativa, demais enterobactrias, demais bacilos Gram negativos no fermentadores. INTERPRETAO Revelao com HCl 1 N: - Cor original do meio: amarelo claro - Colocar sobre o crescimento bacteriano HCl 1 N at banhar totalmente a superfcie do meio; - Aguardar aproximadamente 3 minutos ou at que o meio fique opaco. - Positivo: Presena ntida de halo claro na parte inferior e em volta da colnia. - Negativo: Ausncia de halo claro em volta da colnia. Revelao com azul de toluidina o: - Cor original do meio: azul claro - Positivo: Presena de colorao rosa na parte inferior e em volta da colnia. - Negativo: Ausncia de cor rosa. O meio permanece com a cor original, azul. RECOMENDAES

- Usar sempre uma cepa controle positivo para facilitar a leitura da prova; - Em uma mesma placa, pode-se fazer at 4 testes (placas de 50 mm de dimetro); armazenamento incorreto e uso com validade vencida do HCl 1 N pode dar leituras falso negativas; - Para a deteco da atividade de DNase no necessrio que haja crescimento, por isso que a semeadura deve ser de forma circular densa e no de estria; - Para o meio preparado com Azul de Toluidina O, algumas cepas requerem um perodo maior de incubao (at 48 horas) para produzirem DNase; - Usar cultura jovem (at 24 horas) GAR ESCULINA PRINCPIO - Verifica se a bactria capaz de hidrolisar a esculina. - A esculetina exige sais de ferro formando precipitado marrom escuro ou preto. UTILIDADE - Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores; - Para identificao de Streptococcus e Enterococcus, usar o meio com blis, vide prova de Bile-Esculina. INTERPRETAO Adicionar diretamente o cloreto frrico no tubo inoculado, antes da interpretao do resultado e distribuir o reagente sobre a superfcie do meio. - Cor original do meio: amarelo palha. - Positivo: formao de uma colorao esverdeada na superfcie do meio aps a adio do cloreto frrico. - Negativo: o meio permanece inalterado. RECOMENDAES - Um resultado positivo deve ser interpretado imediatamente aps a adio do reagente, pois a cor verde desbota rapidamente. A interpretao deve ser feita em at 5 minutos. CALDO TRIPTONA E SIM PRINCPIO - Determinam a habilidade do microrganismo de metabolizar o triptofano em indol. Triptofano um aminocido que pode ser oxidado por certas bactrias resultando na produo de indol, aps a adio de reagentes de Erlich ou Kovacs. UTILIDADE - Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias, no fermentadores, Haemophilus e anaerbios. INOCULAO Meio Caldo Triptona - Fazer um inculo leve com colnia pura de cultura de 18-24 horas (para enterobactrias, bacilos Gram negativos no fermentadores ou anaerbios); - Fazer um inculo denso com colnia pura de cultura de 18-24 horas (para Haemophilus);

- Incubar a 35C por 24 horas (enterobactrias) ou at 48 horas (bacilos Gram negativos no fermentadores ou anaerbios) em aerobiose ou anaerobiose, respectivamente. Meio SIM - Com o auxlio da agulha, inocular uma colnia no meio na posio vertical, lentamente at a base; - Afastar a agulha seguindo a linha inicial do inculo; - Incubar a 35C por 18-24 horas. INTERPRETAO - Cor original do meio: - Aps incubao, revelar com reagente de Ehrlich ou Kovacs. - A escolha entre os reagentes de Ehrlich ou Kovacs depende da preferncia dos Gram negativos no fermentadores ou anaerbios, que podem produzir mnima quantidade de indol. Revelao com reativo de Ehrlich ou Kovacs no meio de Caldo Triptona - Colocar 1mL de xilol no tubo com crescimento bacteriano, homogeneizar vigorosamente e aguardar 1 minuto; - Adicionar pela parede do tubo 0,5 ml do reativo de Erlich e realizar a leitura. Indol positivo: aparecer um anel vermelho logo abaixo da camada de xilol. Indol negativo: permanecer um anel amarelo logo abaixo da camada de xilol. Revelao com reativo de Kovacs no meio SIM - Realizar a leitura da motilidade e do HS. Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o crescimento bacteriano. - Agitar o tubo suavemente e proceder a leitura do indol. Motilidade positiva: microrganismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio causando turbidez. Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inculo, em volta continua lmpido. HS positivo: ao longo da linha de inoculao aparecer a cor negra. HS negativo: linha ao longo da inoculao inalterada. Indol positivo aparecer um anel vermelho. Indol for negativo aparecer um anel amarelo. RECOMENDAES - Um timo pH para triptofanase levemente alcalino (pH 7,4-7,8), um pH cido pode baixar a produo do indol indicando um resultado falso negativo ou positivo fraco. - Cultura para ser testada produo de indol deve ser incubada em aerobiose, a baixa tenso de oxignio baixa a produo de indol. - Indol positivo se perde aps 96 horas de incubao.

- Alguns microrganismos formam indol, mas se quebram ou baixam rapidamente a produo, podendo ocorrer um resultado falso negativo. Ocorre principalmente entre algumas espcies de Clostridium spp. - Pequenas modificaes podem ser necessrias para testar a produo de indol em no fermentadores (fracos produtores de indol), como a utilizao de um meio enriquecido, como o meio BHI enriquecido com 2% de soro de coelho ou isovitalex, extrao com xilol e revelao com reagente de Ehrlich. - Na extrao de indol com o reagente xilol, colocar pequena quantidade de xilol para evitar a diluio do indol tornando-o fraco positivo ou negativo. - Algumas cepas de Cardiobacterium hominis, Kingella spp., Sutonella indologenes, Eikenella corrodens, necessitam de inculo denso no caldo de triptona, incubao de 48 horas, extrao com xilol e revelao com reagente de Ehrlich. CALDO MALONATO PRINCPIO - Determina a habilidade do microrganismo de utilizar malonato de sdio como nica fonte de carbono, resultando em alcalinizao do meio. UTILIDADE - Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores. INTERPRETAO - Cor original do meio: verde. - Positivo: azul. - Negativo: inalterado (verde). CONSERVAO E VALIDADE - Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas. - Aps este perodo realizar controle positivo e negativo semanalmente. RECOMENDAES - Alguns resultados negativos produzem cor amarela, isso porque a fermentao da glicose aumenta a acidez. - Alguns microrganismos malonato positivo produzem uma fraca alcalinizao, dificultando a interpretao. Se o resultado for duvidoso incubar um tubo sem inculo para comparao, junto com o teste em questo, se no aparecer nenhum trao azul, incubar por mais 24 horas, liberando o resultado negativo aps incubao de 48 horas. - Cuidado ao interpretar resultados aps incubao prolongada. Cor azul fraco (azul esverdeado) pode parecer uma reao fraca positivo podendo ser ignorado.

CALDO NITRATO PRINCPIO - Determina a habilidade do microrganismo de reduzir o nitrato (NO) a nitrito (NO) ou gs nitrognio (N) (denitrificao). UTILIDADE - Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias, no fermentadores, anaerbios, Haemophilus, Neisseria e Mycobacterium.

INTERPRETAO - Cor original do meio: incolor a palha. - Verificar se h bolhas de gs dentro do tubo de Durhan, se houver significa que a bactria reduziu nitrato a gs = denitrificao. - Adicionar 5 gotas dos reagentes A e B no meio, sem homogeneizar. Se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactria reduziu nitrato a nitrito. - Se aps a adio dos reagentes A e B o tubo continuar incolor, adicionar uma pitada de p de zinco no tubo, se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactria no reduziu nitrato a nitrito e o nitrato ainda permanece no meio. IMPORTANTE: algumas bactrias no conseguem reduzir nitrato a nitrito e s conseguem reduzir nitrito, como por exemplo alcaligenes faecalis e oligella uretralis, havendo a necessidade de utilizar o caldo nitrito para este fim.

RECOMENDAES - Utilizar o tubo de nitrato sem inocular como controle negativo, para evitar resultado falso positivo, devido alta sensibilidade do teste. - Quando for adicionado o p de zinco, no colocar em excesso, pode resultar em falso negativo (incolor).

MEIO BASE PARA OXIDAO E FERMENTAO - OF PRINCPIO - Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa. UTILIDADE - Diferenciar bacilos Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo empregado em utilizar carboidratos. INTERPRETAO - Cor original do meio: verde - Oxidador: tubo aberto - desenvolvimento de cor amarela tubo fechado - inalterado (verde) - Fermentador: tubo aberto e fechado - desenvolvimento de cor amarela - Assacaroltico: tubo aberto e fechado - inalterado (verde)

RECOMENDAES - Sempre antes de interpretar a reao verificar se h crescimento nos tubos, porque algumas bactrias no crescem no meio OF, sendo necessrio enriquecimento do meio, acrescentando 2 % de soro de coelho ou cavalo. - Importante deixar tampa frouxa no tubo aberto. FRMULAS E PRODUTOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAO PARA PROVA DE CATALASE PRINCPIO A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em gua e oxignio. UTILIDADE Para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus, Bacillus, Moraxella catarrhalis. INOCULAO Colocar uma gota de perxido de hidrognio (gua oxigenada) 3% sobre uma lmina; Com auxlio de fio bacteriolgico, agregar a colnia em estudo na gota de perxido de hidrognio. INTERPRETAO Positivo: Presena imediata de bolhas - a produo de efervescncia indica a converso do H2O2 em gua e oxignio gasoso. Negativo: Ausncia de bolhas ou efervescncia. RECOMENDAES Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrcitos podem produzir reao fraca de catalase. Para uso de outra cepa de Staphylococcus para o controle positivo, no usar cepas de Staphylococcus saccharolyticus e Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, pois so catalase negativos. PARA PROVA DE COAGULASE PRINCPIO Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um cogulo, uma vez que a coagulase uma protena com atividade similar protombrina, capaz de converter o fibrinognio em fibrina, que resulta na formao de um cogulo visvel. Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada e coagulase livre. A coagulase conjugada (prova em lmina), tambm conhecida como fator de aglutinao, encontra-se unida parede celular bacteriana e no est presente em filtrados de cultivos.

Quando as clulas bacterianas so suspensas em plasma (fibrinognio), formam-se cordes de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visveis. A coagulase livre (prova em tubo), uma substncia similar trombina e est presente em filtrados de cultivos. secretada extracelularmente e reage com uma substncia presente no plasma denominado Fator de Reao com a Coagulase CRF, para formar um complexo que, por sua vez, reage com fibrinognio, formando fibrina (cogulos). Quando uma suspenso em plasma do microrganismo produtor de coagulase preparada em tubo de ensaio, forma-se um cogulo visvel aps o perodo de incubao. UTILIDADE Separar as espcies de Staphylococcus de importncia clnica, S. aureus coagulase positiva, das demais espcies coagulase negativa. INOCULAO Coagulase conjugada: Traar dois crculos com lpis de cera em uma lmina de vidro; Colocar duas gotas de gua destilada ou soluo fisiolgica estreis dentro de cada crculo; Com auxlio de um fio bacteriolgico agregar a colnia em estudo, homogeneizando delicadamente em cada crculo; Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos crculos; No outro crculo, adicionar outra gota de gua destilada ou soluo fisiolgica estreis, como controle; Homogeneizar com palito de madeira; Inclinar a lmina delicadamente, para frente e para trs; Observar presena de aglutinao. Coagulase livre: Com auxlio do fio bacteriolgico, suspender colnias em estudo em caldo BHI e colocar em estufa 37C at que turve; Se necessrio, acertar a turbidez at 0,5 da escala de MacFarland; Em um tubo de ensaio estril, colocar 0,5 ml de plasma reconstitudo e 0,5 ml do caldo BHI com crescimento bacteriano recm turvado; Incubar em estufa 35C 4 horas; Verificar se h presena de cogulo; Se no houver presena de cogulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir as leituras com 18 e 24 horas de incubao. INTERPRETAO Coagulase conjugada:

 Positiva: formao de precipitado branco e aglutinao dos microrganismos da suspenso, aps 15 segundos, no crculo que contm o plasma. Negativa: ausncia de aglutinao no crculo que contm o plasma. Controle sem plasma: dever ser leitoso e uniforme, sem presena de precipitado ou aglutinao. A presena de precipitado ou aglutinao, torna a prova inespecfica, devendo ser repetida a prova em tubo. Coagulase livre: Positiva: presena de qualquer grau de cogulo. Negativa: ausncia de cogulo. RECOMENDAES Para a coagulase em tubo, as provas negativas aps 4 horas a 37C, os tubos devem ser mantidos em temperatura ambiente, pois a incubao prolongada a 37C podem produzir fibronolisinas, o que causa dissoluo do cogulo durante a incubao. Durante a leitura inclinar o tubo delicadamente e no agitar, pois a agitao pode desmanchar os cogulos parcialmente formados. Recomenda-se o uso de plasma de coelho com EDTA. No utilizar plasma citratado, pois os microrganismos capazes de metabolizar o citrato (como os Enterococcus), daro resultados positivos se, forem confundidos com estafilococos. Plasma humano no recomendado, pois contm quantidades variadas de Fator de Reao com a Coagulase e de anticorpos antiestafilococos, podendo dar uma prova falso/ negativa. PARA PROVA DE OXIDASE PRINCPIO O teste de oxidase baseado na produo intracelular da enzima oxidase pela bactria. UTILIDADE Ajuda caracterizar espcies de Neisseria, distingui no fermentadores (oxidase positiva) de enterobactrias (oxidase negativa). Diferencia algumas bactrias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp. FRMULA / PRODUTO Reativo para teste de oxidade preparado no laboratrio: N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato 1g gua destilada 100 ml Tiras impregnadas com o reativo (comercial pronto para uso). Reativo de oxidase em ampolas (comercial pronto para uso), para ser revelado em papel de filtro. PROCEDIMENTOS Reativo para teste de oxidase: Pesar 1g. de N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato em um Becker e

adicionar 100 ml gua destilada, vagarosamente para no oxidar a soluo; Colocar o papel de filtro cortado em tiras dentro do Becker com o reativo; Deixar o papel de filtro absorver o reativo. Desprezar o reativo que sobrou; Colocar o papel na estufa a 35 1C para secar. Deixar o papel pendurado sobre um Becker para juntar o excesso de reativo; Cortar a fita em tamanhos menores e guardar em frasco escuro. Obs: No utilizar luvas para fazer o procedimento de preparo e corte das fitas. Mod IV - 48 INOCULAO Com auxlio de um palito de madeira ou plstico, espalhar a colnia a ser testada sobre a fita de oxidase. Observar se h formao de cor roxa de imediato. INTERPRETAO Cor original: branca ou levemente azulada Oxidase positiva: produo de cor roxa imediatamente no local da inoculao da bactria. Oxidase negativa: no h mudana da cor do papel no local da inoculao da bactria. No considerar alterao de cor tardia. INOCULAO Com auxlio de um palito de madeira ou plstico, espalhar a colnia a ser testada sobre a fita de oxidase. Observar se h formao de cor roxa de imediato. INTERPRETAO Cor original: branca ou levemente azulada Oxidase positiva: produo de cor roxa imediatamente no local da inoculao da bactria. Oxidase negativa: no h mudana da cor do papel no local da inoculao da bactria. No considerar alterao de cor tardia. CONSERVAO E VALIDADE Fitas: 3 meses, quando conservadas em frasco escuro de 4 a 8C. Reativo: deve ser preparado no momento de impregnar as fitas. RECOMENDAES No fazer o teste de colnias de crescimento de meios que contenham glicose, a fermentao inibe a atividade da oxidase, podendo resultar em falso negativo. No fazer teste de oxidase de colnias de crescimento de meios seletivos (Mac Conkey, XLD, EMB). No usar ala ou agulha porque pode conter traos de ferro, podendo oxidar a fita e resultar em falso positivo. Utilizar colnias de meios no seletivos tais como: gar sangue e gar chocolate.

 Os reagentes para oxidase, se auto oxidam rapidamente com o ar, perdendo a sensibilidade. No cortar o papel de filtro com tesoura, pois podem conter traos de ferro. PARA FERMENTAO DE CARBOIDRATOS PRINCPIO A fermentao de carboidratos amplamente utilizada para a diferenciao de gneros e identificao de espcies bacterianas. A prova consiste em verificar a capacidade do microrganismo fermentar ou no um determinado carboidrato, permitindo assim verificar as suas caractersticas que auxiliaram na identificao. UTILIDADE Identificar e separar espcies de Enterococcus spp., Streptococcus spp. e Staphylococcus coagulase negativa.

INOCULAO Dissolver as colnias no caldo; Incubar 35C 24 horas. INTERPRETAO Cor original do meio: prpura Positivo: Crescimento bacteriano (turvao do meio) com viragem do indicador para amarelo; Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, prpura e sem turvao. RECOMENDAES Para provas negativas, incubar um perodo maior (48 horas); No autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato. PARA A PROVA DE HIDRLISE PRINCPIO A prova de hidrlise PYR um teste enzimtico que consiste na hidrlise do substrato Lpyrrolidonylalfa-naftylamide por uma enzima bacteriana, a L-pyroglutamyl-aminopeptidase. A hidrlise do substrato libera -naphtylamide, que detectada com a adio do reagente, o N,Ndimetilaminocinamaldedo, que forma uma base de Schiff, de colorao vermelha. UTILIDADE Teste presuntivo para identificar Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) e Enterococcus spp. Identificao de algumas espcies Staphylococcus coagulase negativa. Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores. INOCULAO

 Dissolver as colnias no caldo OU; No caso de usar kits comerciais, com auxlio de uma pina flambada, colocar um disco impregnado com o substrato de PYR sobre as colnias em estudo recm isoladas; Incubar 37C por 4 horas; Adicionar 1 gota do reagente PYR (se caldo) OU; Retirar o disco e colocar sobre uma lmina e adicionar 1 gota do reagente PYR. INTERPRETAO Positivo: Desenvolvimento de cor vermelho cereja em 1 minuto (aps adicionar o reagente de PYR). Negativo: Sem alterao de cor (permanece amarela ou alaranjada). RECOMENDAES Para identificaes presuntivas do Streptococcus pyogenes ou de Enterococcus spp., confirmar se realmente so cocos Gram positivos/ catalase negativos, pois algumas cepas de Staphylococcus spp., Aerococos e Arcanobacterium haemolyticum, podem ser PYR positivos Raras cepas de Enterococcus spp. podem ser catalase positiva, confirmar com outras provas (como blis esculina) tratar de enterococo ou no; No utilizar colnias com crescimento superior a 24 horas, culturas velhas podem dar resultado falso - negativo; No exceder o tempo de leitura.

DISCOS PARA IDENTIFICAO BACITRACINA PRINCPIO Streptococcus beta hemoltico do grupo A so sensveis a concentraes baixas de bacitracina. UTILIDADE Identificao presuntiva de Streptococcus beta hemoltico do grupo A (S. pyogenes). PRODUTO Discos de bacitracina de 0,04 unidades/ disco. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo (Sensvel): Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Negativo (Resistente): Streptococcus agalactiae ATCC 13813 INOCULAO partir de caldo BHI ou TSB recm turvado, semear na superfcie do meio Mueller hinton sangue, com auxlio do "swab"; Colocar um disco de bacitracina e pressionar levemente; Incubar 35C 18 a 24 horas.

INTERPRETAO Positivo (Sensvel): Presena de qualquer halo ao redor do disco. Negativo (Resistente): ausncia de halo ao redor do disco. RECOMENDAES Streptococcus alfa hemolticos so sensveis a baixas concentraes de bacitracina. No existem dados disponveis que indiquem a necessidade de medir os halos de inibio. O inculo bacteriano deve ser confluente, inculo muito diludo pode permitir que os Streptococcus no pertencentes ao grupo A paream sensveis bacitracina. NOVOBIOCINA PRINCPIO Separa espcies de Staphylococcus coagulase negativa que podem ser sensveis ou no a Novobiocina. UTILIDADE Separa cepas de Staphylococcus saprophyticcus (Novobiocina resistente) das demais cepas de Staphylococcus coagulase negativa de importncia clnica; Staphylococcus saprophyticcus a nica espcie isolada em humanos como causadora de infeces urinrias. Cont pg 59