UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO INSTITUTO DE BIOCINCIAS CURSO DE MESTRADO EM ECOLOGIA E CONSERVAO DA BIODIVERSIDADE

DIVERSIDADE GENTICA DE POPULAES DE Moenkhausia oligolepis (CHARACIFORMES:CHARACIDAE) EM RIACHOS AFLUENTES DO RIO ARAGUAIA (BACIA ARAGUAIA-TOCANTINS)

TIAGO JOS DOMINGOS

CUIAB-MT 2011

ii UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO INSTITUTO DE BIOCINCIAS CURSO DE MESTRADO EM ECOLOGIA E CONSERVAO DA BIODIVERSIDADE

DIVERSIDADE GENTICA DE POPULAES DE Moenkhausia oligolepis (CHARACIFORMES: CHARACIDAE) EM RIACHOS AFLUENTES DO RIO ARAGUAIA (BACIA ARAGUAIA-TOCANTINS)

TIAGO JOS DOMINGOS Dissertao apresentada ao Curso de Ps-Graduao, do Instituto de Biocincias, para obteno do ttulo de Mestre em Ecologia e Conservao da Biodiversidade.

CUIAB MT

Dados Internacionais de Catalogao na Fonte

D671d Domingos, Tiago Jos. Diversidade gentica de populaes de Moenkhausia oligolepis (Characiforme: Characidae) em riachos afluentes do rio Araguaia (bacia Araguaia-Tocantins). / Tiago Jos Domingos, 2011. v, 41 f. color. ; 30 cm (incluem figuras e tabelas). Orientador: Paulo Cesar Venere Co-orientador: Issakar Lima Souza Dissertao (mestrado). Universidade Federal de Mato Grosso. Instituto de Biocincias. Programa de Ps-Graduao em Ecologia e Conservao da Biodiversidade, 2011. Bibliografia: f. 36-41 Catalogao: Maurcio Silva de Oliveira Bibliotecrio CRB/1 1860

iii

ORIENTADOR: PROF. DR. PAULO CESAR VENERE CO-ORIENTADOR: PROF.DR. ISSAKAR LIMA SOUZA

iv

v SUMRIO LISTA DE FIGURAS..........................................................................................................6 LISTA DE TABELAS..........................................................................................................7 RESUMO..............................................................................................................................8 ABSTRACT..........................................................................................................................9 1.INTRODUO...............................................................................................................10 1.1. Diversidade Gentica..............................................................................................10 1.2 Marcadores Moleculares..........................................................................................12 1.3 O gnero Moenkhausia e semelhanas morfolgicas entre espcies.......................14 2. OBJETIVOS...................................................................................................................16 2.1 Objetivos especficos...............................................................................................16 3. MATERIAIS E MTODOS..........................................................................................17 3.1 Anlises morfomtricas.........................................................................................18 3.2 Anlise de marcadores genticos...........................................................................19 3.2.1 Extrao de DNA.........................................................................................19 3.2.2 Confirmao da extrao e quantificao do DNA extrado........................21 3.2.3 Reaes PCR-ISSR......................................................................................21 3.2.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%...............................................21 3.3 Anlise da diversidade gentica com dados de ISSR.............................................22 3.3.1 Identidade gentica.......................................................................................23 3.3.2 Distncia gentica.........................................................................................23 3.3.3 Anlise de agrupamento pelo mtodo UPGMA...........................................24 3.3.4 Anlise de varincia molecular (AMOVA)..................................................24 3.3.5 Medidas da fragmentao populacional: estatstica f (FRANKHAM et al, 2008).................................................................................................................................... 25 4. RESULTADOS...............................................................................................................26 4.1 Anlises Morfomtricas..........................................................................................26 4.2 Anlise de marcadores genticos............................................................................28 5. DISCUSSO...................................................................................................................31 6. CONSIDERAES FINAIS........................................................................................35 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.........................................................................36

6 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Pontos de coleta de M. oligolepis: Crrego Taquaralzinho (tringulo cinza); Itapirapu-GO (crculo cinza); Pontal do Araguaia-MT (quadrado cinza). Ponto de coleta de M. forestii na RPPN Sesc Pantanal (crculo preto). Rio das Mortes apresentado em linha pontilhada, e Rio Araguaia apresentado em linha mais espessa..........................................17 Figura 2. Exemplar de Moenkhausia oligolepis coletado no crrego Taquaralzinho..........18 Figura 3. Esquema ilustrando as medidas tomadas nos indivduos analisados morfometricamente. CP- comprimento padro; DO- dimetro do olho; DPD distncia pr-dorsal; HCORPO altura do corpo; EI espao inter-orbital; APC altura do pednculo caudal; DORSAL base da nadadeira dorsal; PREA distncia pr-adiposa; POSA distncia ps-adiposa; ANAL base da nadadeira anal; CCAB comprimento da cabea; HCAB altura da cabea........................................................................................18 Figura 4. Variao morfolgica de 50 indivduos de acordo com a Anlise de Variveis Cannicas. Circulos vazios = M. oligolepis de Itapirapu -GO; Quadrados preenchidos = M. oligolepis de Pontal do Araguaia-Mt; Quadrados vazios = M. oligolepis de Taquaralzinho; Crculos preenchidos = M. forestii da RPPN SESC Pantanal.....................26 Figura 5. Gis de poliacrilamida com reaes de PCR-ISSR utilizando o primer M2. possvel observar a presena de uma banda exclusiva no-unnime na populao Taquaralzinho.......................................................................................................................28 Figura 6. Cladrograma representando a relao entre as populaes estudadas de M. oligolepis e M. forestii de acordo com a distncia gentica de Nei (1978) e o mtodo UPGMA................................................................................................................................29

7 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Contribuio de cada varivel morfolgica nos dois eixos gerados pela Anlise de Variveis Cannicas........................................................................................................27 Tabela 2. ndices de identidade gentica (acima direita) e distncia gentica (abaixo esquerda) entre as populaes estudadas..............................................................................29 Tabela 3. Resultados da Anlise de Varincia Molecular (AMOVA) com os dados de presena/ausncia de alelos resultantes da aplicao da tcnica de ISSR nas amostras de DNA das populaes estudadas, considerando-as como grupos separados a priore. A variao Entre grupos a variao dos hapltipos entre as populaes de M. oligolepis e a populao de M. forestii. A variao Entre populaes dentro dos grupos a variao que ocorre entre as populaes de M. oligolepis. A variao Dentro das populaes a variao dos hapltipos desconsiderando-se grupos, ou seja, a variao que ocorre considerando-se todas as populaes como um nico grupo...............................................30 Tabela 4: ndice Fst calculado entre cada populao, demonstrando nveis de isolamento gentico entre as populaes de M. oligolepis e M. forestii.................................................30

8 RESUMO Avaliaes da estrutura gentica populacional fornecem um retrato gentico das populaes, revelando nveis de endogamia, diversidade gentica e diferenciao entre os espcimes. Esses dados associados ao conhecimento de atributos como o tamanho efetivo da populao, o fluxo gnico e os sistemas de acasalamento so particularmente importantes no delineamento das aes de manejo a serem adotadas na conservao da diversidade biolgica. Entre as espcies que necessitam de manejo e so alvo das aes do homem, esto vrias de uso ornamental, como Moenkhausia oligolepis, cujas populaes, assim como as de outros peixes ornamentais, sofrem coletas oportunistas livremente por todo o pas. Para contribuir com a conservao da espcie e na resoluo de questes taxonmicas no gnero Moenkhausia, este trabalho objetivou realizar uma anlise morfomtrica comparativa entre indivduos de riachos que drenam para o Rio Araguaia e Rio das Mortes e, com base em marcadores moleculares obtidos pela tcnica de ISSR, desenvolver um estudo para avaliar a presena e variabilidade de caractersticas especficas em cada populao. Foram coletados 72 indivduos, com 52 pertencendo espcie M. oligolepis, coletados em afluentes dos rios Araguaia e Mortes e 20 da espcie Moenkhausia forestii da RPPN SESC Pantanal. Foram realizadas 12 medies do corpo de 50 indivduos utilizando-se de paqumetro digital com preciso de 0,01mm sendo 30 de M. oligolepis ( 9 do Crrego Taquaralzinho, 9 de Itapirapu-GO , 12 de Pontal do Araguaia-MT) e 20 indivduos de M. forestii da RPPN SESC Pantanal. O estudo com base em marcadores moleculares ISSR foi realizado com base em 5 primers diferentes [Primer M1 (GGACGGACGGACGGAC) ; Primer M2 (GGACGGACGGACA) ; Primer M3 (GGACGGACGGACT) ; Primer M4 (GGACGGACGGACC) e Primer M5 (AACCAACCAACCAACC)]. Com base nos dados obtidos foi elaborada uma matriz de diversidade gentica. Os dados morfomtricos foram analisados pela anlise de variveis cannicas, e os dados moleculares pela anlise de varincia molecular (AMOVA), distncia gentica e agrupamento UPGMA. Foram encontrados marcadores exclusivos para algumas populaes e o agrupamento dos indivduos de acordo com a forma, refletiu sua distribuio geogrfica. A diversidade gentica da espcie revelou resultados correlacionados variao morfolgica, suportando a idia de que indivduos de M. oligolepis presentes na bacia do rio Araguaia esto isolados reprodutivamente de indivduos da bacia do Rio das Mortes, assim como os indivduos de M. oligolepis da bacia Araguaia-Tocantins esto isolados de indivduos de M. forestii da bacia do rio Paraguai. Palavras-Chave: Gentica da Conservao , Araguaia-Tocantins , Peixes , Moenkhausia, ISSR.

9 ABSTRACT Assessments of population genetic structure provide populations genetic portraits, revealing endogamy levels, genetic diversity and differentiation among specimens. These data, associated to the knowledge of attributes as the effective population size, gene flow and mating systems, are particularly important on the design of handling actions to be adopted on the biological diversity conservation.Among species that need handling and are target of human actions, there are several of ornamental use, like Moenkhausia oligolepis, whose populations, just as other ornamental fishes, suffer from opportunistic activities all over the country. Contributing with this species conservation and to solve taxonomical questions on the Moenkhausia genus, this work had as objective, a comparative morphometrical analysis among individuals from Araguaia river tributaries and Mortes river tributaries, and, based on ISSR molecular markers, to develop a study for evaluate the presence and variability of population-specific characteristics. A total of 72 individuals were sampled, with 52 being M. oligolepis, from which 31 are from Corrego Taquaralzinho-MT, 9 from Itapirapu-GO and 12 from Pontal do Araguaia-MT; and 20 individuals of Moenkhausia forestii from RPPN SESC Pantanal. Using digital paquimeter, 12 body measures were taken from 50 individuals, being 30 of M. oligolepis and 20 of M. forestii. The ISSR-based study was performed through processes of DNA extraction and amplification using 5 primers (Primer M1 (GGACGGACGGACGGAC); Primer M2 (GGACGGACGGACA); Primer M3 (GGACGGACGGACT); Primer M4 (GGACGGACGGACC) e Primer M5 (AACCAACCAACCAACC)), where were detected presences and absences of bands (genes) for each individual, composing a genetic diversity matrix. The morphometrical data were analyzed through a Canonical Variables Analysis, and the molecular data were analyzed through Analysis of Molecular Variance (AMOVA), genetic distance and UPGMA clustering. Population-exclusive genes were found for some populations and the morphometrical cluster reflected the individuals geographical distribution. The genetic diversity of the species revealed results extremely related to morphological variation, supporting the idea that individuals from M. oligolepis of Araguaia river basin are reproductively isolated from individuals of Mortes river basin; as individuals of M. oligolepis of Araguaia-Tocantins river basin are isolated from M. forestii individuals of Paraguai river basin. Key-words: Conservation Genetics , Araguaia-Tocantins , Fishes , Moenkhausia, ISSR.

10 1. INTRODUO 1.1 Diversidade Gentica A diversidade biolgica do planeta est sendo rapidamente reduzida como conseqncia direta e indireta das atividades humanas. Embora no conhecido, um grande nmero de espcies j foi extinto, enquanto muitas outras tm tamanhos populacionais reduzidos que as colocam em risco, necessitando assim da interveno humana para assegurar sua sobrevivncia (FRANKHAM et al., 2008). Diante desse quadro, qualquer inteno de se proteger uma espcie s ter sucesso se for precedida de um bom conhecimento da mesma, j que aspectos da biologia das espcies so usados como fundamentos para aes de conservao. Portanto, importante que diferentes frentes de estudo sejam desencadeadas a fim de se buscar mecanismos que possam garantir, ou ao menos dar as condies mnimas para que qualquer interveno seja favorvel. Dentre os estudos atualmente desenvolvidos, destacam-se aqueles que se preocupam em avaliar a diversidade gentica como ferramenta de fundamental importncia para a proteo e manejo das populaes naturais. Essa diversidade se refere soma de todos os genes dos indivduos das espcies, englobando a variabilidade entre populaes de uma espcie e a variabilidade dentro de uma populao. A diversidade gentica facilita o estabelecimento da espcie em um novo hbitat e tambm a sua persistncia num contexto de mudana do ambiente (VILELA-MORALES & VALOIS, 2000; ARAUJO, 2007 ). A preservao da diversidade gentica garante um potencial evolutivo de longo prazo para a espcie. Formas raras de um gene ou combinaes destes podem no conferir qualquer vantagem imediata, mas podem vir a favorecer uma determinada espcie frente a novas condies ambientais no futuro. As pequenas populaes tendem a apresentar uma menor variabilidade gentica e, com o endocruzamento, so conduzidas a redues na fecundidade e viabilidade dos indivduos (ALLENDORF & LUIKART, 2007) . Considerando que os ambientes experimentados por uma espcie em locais distintos, dentro de sua rea de distribuio, diferem entre si, deve-se esperar que a existncia de variantes das espcies em diferentes locais seja favorecida por processos de seleo e adaptao (MILLS, 2004). A evoluo segue no sentido de favorecer a divergncia de caractersticas entre populaes; porm, isso s possvel se as foras seletivas que favorecem a divergncia

11 sejam suficientemente fortes para contrapor a miscigenao e a hibridizao de indivduos de locais diferentes e exista variao hereditria suficiente sobre a qual a seleo possa agir (FORD,1980). Duas populaes no divergiro completamente se seus membros migrarem continuamente entre elas, acasalando-se e misturando seus genes (TOWNSEND et al., 2006). A variao gentica, matria-prima na qual a seleo natural age, criada continuamente atravs da mutao e, ao mesmo tempo, erodida pela seleo e deriva gentica. Isso faz com que a habilidade de uma espcie em responder seleo natural seja dependente da presena de variaes herdveis, que aumentaro em nmero ao aumentarem as chances de sobrevivncia da espcie (MERRELL, 1981). Se a variao gentica estiver presente dentro de uma espcie, qualquer alterao nas presses seletivas devido a mudanas ambientais permitir que alguns indivduos possam sobreviver e se reproduzir (LOWE et al., 2004). Membros de uma espcie esto comumente distribudos sobre um grande espao geogrfico. Uma populao um grupo local pertencente a uma espcie, dentro do qual o cruzamento est atual ou potencialmente ocorrendo. O conjunto de informaes genticas carregados por todos os membros intercruzantes de uma populao denominado 'pool gentico'. Populaes so dinmicas; elas podem crescer e expandir ou diminuir e se contrair pelas mudanas nas taxas de nascimento ou morte, por migrao, ou por fuso com outras populaes. Isso tem importantes conseqncias e, ao longo do tempo, pode levar a mudanas na sua estrutura gentica (KLUG & CUMMINGS, 1997), ou seja, no seu pool gentico. Os indivduos de uma populao, normalmente, so geneticamente diferentes uns dos outros. Os vrios alelos de um gene podem afetar diferentemente o desenvolvimento e a fisiologia de um organismo individual. Embora as mutaes forneam o material bsico para a variao gentica, a habilidade de espcies que se reproduzem sexualmente e de reorganizar os alelos ao acaso, em diferentes combinaes, aumenta substancialmente seu potencial de variao gentica (PRIMACK, 2001). Avaliaes da estrutura gentica populacional fornecem um retrato gentico das populaes, revelando nveis de endogamia, diversidade gentica e diferenciao entre os espcimes. Esses dados, associados ao conhecimento de atributos como o tamanho efetivo da populao, o fluxo gnico e os sistemas de acasalamento so particularmente importantes no delineamento das aes de manejo a serem adotadas, como reproduo em cativeiro. Em longo prazo, as metas de conservao se preocupam em evitar a endogamia

12 nas populaes que no so normalmente endogmicas, permitindo a manuteno do maior potencial evolutivo possvel (RAMOS, 2007). 1.2 Marcadores Moleculares Nas ltimas dcadas, vrios marcadores moleculares tm sido utilizados em estudos de diversidade gentica e biologia da conservao (OBRIEN, 1994; AVISE, 1996), com o objetivo de definir prioridades no manejo de espcies ou populaes ameaadas (MORITZ, 1994), para desenvolver modelos demogrficos de populaes pequenas ou fragmentadas (LACY & LINDENMAYER, 1995), e para analisar o valor adaptativo de populaes naturais ou cativas (NUNNEY & CAMPBELL, 1993; LYNCH,1996). Os marcadores moleculares usam como base o DNA e acessam o genoma, evitando o efeito ambiental e, conseqentemente, erros de identificao (BORBA et al., 2005). Para Milach (1998), marcadores moleculares so caractersticas de DNA que diferenciam dois ou mais indivduos e so herdados geneticamente. definido como qualquer fentipo molecular oriundo de um gene expresso ou de um segmento especfico de DNA (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Entre os marcadores atualmente disponveis esto o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (WILLIAMS et al., 1990), VNTR (Variable Number of Tandem Repetitions) , SSR (Simple Sequence Repeat) e os ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) (GUPTA et al., 1994). O RAPD foi uma das primeiras tcnicas de obteno de marcadores moleculares de DNA amplamente estudada e que democratizou a utilizao desses marcadores em anlise gentica com interesses ecolgicos, por ser uma tcnica de resultados rpidos, barata em comparao com outros marcadores moleculares, pouco intensiva em mo de obra e baseada na PCR. Este marcador realiza a amplificao de segmentos de DNA genmico com o uso de cpias de um primer curto (10-11 bases), de seqncias nucleotdicas arbitrrias e que amplificam seqncias desconhecidas do DNA, portanto, no necessitando de conhecimento prvio do genoma do organismo a ser estudado. Em peixes, o RAPD tem sido eficaz em investigaes sistemticas de populaes naturais, incluindo espcies e sub-espcies (BARDAKCI & SKIBINSKI, 1994; ALMEIDA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; PRIOLI et al., 2002). Tambm chamado de minissatlite, o VNTR um marcador que detecta seqncias com nmero varivel de repeties em tandem. Estas seqncias tm segmentos centrais

13 de repetio com tamanhos variveis de 10-100 bases, e so detectadas com o uso de uma enzima de restrio que as corta a partir do genoma do organismo em estudo (FRANKHAM et al, 2008). Alguns marcadores analisam partes do genoma que so densamente povoadas por seqncias simples repetidas, as quais consistem em um a seis nucleotdeos repetidos em tandem, sendo denominadas Microsatlite, podendo ser SSR (Simple Sequence Repeats Seqncias simples repetidas), ou os marcadores ISSR (Inter-SSR). As seqncias de DNA que flanqueiam os microsatlites so geralmente conservadas entre os indivduos de uma mesma espcie, permitindo seleo de primers (pequenas sequncias de nucleotdeos utilizadas na replicao do DNA) especficos que amplificam, via PCR, fragmentos contendo o DNA repetitivo em todos os gentipos. Os produtos de amplificao so observados em gel de poliacrilamida ou em gel de agarose de alta resoluo (BORM & CAIXETA, 2006). O ISSR (ZIETKIEWICZ et al., 1994; REDDY et al., 2002) um mtodo baseado em microssatlite, que no necessita o conhecimento prvio do genoma. Enquanto os SSR so baseados na amplificao da regio repetida usando dois primers loco-especficos, em ISSR, um nico primer composto por uma seqncia do microssatlite usualmente de 16-25pb de comprimento utilizado para amplificar seqncias de diferentes tamanhos. Estes primers podem estar desancorados ou usualmente ancorados na extremidade 5 ou 3 por 1 a 4 bases degeneradas. Os alelos polimrficos ocorrem sempre que em um genoma esteja faltando a seqncia repetida ou tm uma deleo ou uma insero que modifica a distncia entre as repeties. Para os primers ancorados na posio 5, polimorfismos ocorrem tambm devido s diferenas no comprimento do microssatlite. As seqncias de repeties e de nucleotdeos ancorados so selecionadas aleatoriamente. Embora ISSR sejam marcadores dominantes, tm a vantagem de analisar loci mltiplos em uma nica reao (GOULO & OLIVEIRA, 2001) assim como marcadores RAPD, mas diferem destes na sua estrutura, pois enquanto marcadores RAPD so formados por seqncias de nucleotdeos completamente arbitrrias, os marcadores ISSR so formados por repeties de pares ou trios de nucleotdeos, permitindo-os atuar entre regies de microssatlite (LALHRUAITLUANGA & PRASAD, 2009). O desenvolvimento de marcadores moleculares e seu uso em pesquisas genticas acontecem continuamente. Alm das tcnicas citadas acima, existem vrias outras, incluindo as que analisam polimorfismos de tamanho em fragmentos de restrio (RFLP), polimorfismos de tamanho em fragmento amplificado (AFLP), polimorfismos de

14 conformao em fita simples (SSCP) e polimorfismo de um nico nucleotdeo (SNP) (FRANKHAM et al., 2008). 1.3 O gnero Moenkhausia e semelhanas morfolgicas entre espcies Devido dimenso territorial do Brasil e a distncia entre suas bacias hidrogrficas, estudos sobre peixes vm sendo realizados h vrios anos, na tentativa de melhorar a identificao das espcies e descobrir no apenas quais so as diferenas entre elas, mas tambm se estas surgiram devido ao distanciamento geogrfico das bacias ( FORESTI, 1989; CARVALHO, 2002; LUCINDA, 2007; OLIVEIRA et al., 2008). Uma definio acurada das espcies pode auxiliar no manejo de suas populaes, evitando tentativas frustradas de re-colonizao de reas e cruzamento entre indivduos de diferentes procedncias sem os devidos cuidados. Em peixes, muito comum a ocorrncia de animais que morfologicamente aparentam ser da mesma espcie, quando na verdade so grupos geneticamente independentes. Exemplos clssicos podem ser observados com a espcie Hoplias malabaricus (Erythrinidae). Vrios estudos com marcadores cromossmicos e moleculares demonstram que esse grupo de organismos, na verdade, representa um grande complexo de espcies morfologicamente indiferenciveis, porm, com particularidades cariotpicas e moleculares que definem vrias das populaes estudadas como unidades evolutivas geneticamente isoladas (BERTOLLO et al., 2000; VITORINO et al., 2011). Dentre alguns dos grupos de peixes neotropicais mais estudados geneticamente, esto os gneros Astyanax e Moenkhausia, que tambm so representativos comercialmente. No ano de 2007, por exemplo, mais de 13,5 toneladas dos dois gneros foram vendidas e contabilizadas na balana comercial externa do pas (IBAMA, 2008). O gnero Moenkhausia foi proposto por Eigenmann (1903) e definido como comparvel Tetragonopterus, mas com uma linha lateral ligeiramente curvada para baixo. Eigenmann (1917, cit. in BENINE et al., 2007) apresentou uma redefinio para Moenkhausia baseada na presena de duas linhas paralelas de dentes pr-maxilares, cinco ou mais dentes na linha interna de dentes pr-maxilares, uma linha lateral completa e lobos da nadadeira caudal escamados. Devido ausncia de uma anlise filogentica compreensiva, estas caractersticas descritas por Eigenmann permanecem como diagnstico para o gnero (BENINE et al., 2007). Atualmente, Moenkhausia

15 representado por 74 espcies vlidas, ocorrendo nas bacias fluviais da Amrica do Sul (LIMA et al., 2003; ESCHMEYER, 2010; MARINHO, 2010). Apesar de Moenkhausia no ser atualmente definido como um gnero monofiltico, um grupo de espcies compartilha um padro de cores muito similar, formado por bordas escuras nas escamas, uma mancha umeral alongada verticalmente, uma mancha escura no pednculo caudal precedida de uma rea mais clara e, freqentemente, olhos vermelhos escuros quando vivos. Este grupo consiste de M. oligolepis Gunther, M.sanctaefilomenae Steindachner, M. cotinho Eigenmann, e M. pyrophtalma Costa (BENINE et al., 2009) Assim como outras espcies do gnero, Moenkhausia oligolepis (Gunther,1864) considerada de uso ornamental e suas populaes naturais sofrem coletas oportunistas, livremente, por todos os locais onde pode ser encontrada. Deve-se considerar que o desconhecimento taxonmico faz com que vrias espcies sejam comercializadas como se pertencessem a uma mesma unidade taxonmica. Essas identificaes errneas, somadas s coletas indiscriminadas, representam uma grande ameaa ictiodiversidade da regio Neotropical, pois bastante provvel que espcies ainda no identificadas possam ser extintas localmente, mesmo antes de sua descrio taxonmica. Devido existncia da necessidade de se buscar mais informaes acerca da espcie para a resoluo de questes taxonmicas no gnero Moenkhausia (BENINE et al., 2009), e para auxiliar no estabelecimento de prioridades de conservao e na definio de valores de biodiversidade para esta e outras espcies em situao semelhante, este trabalho almeja identificar caractersticas genticas e morfolgicas de populaes citadas como pertencentes espcies Moenkhausia oligolepis, que permitam reconhecer possveis unidades geneticamente isoladas em alguns crregos que drenam para o Rio Araguaia e para o rio das Mortes (Bacia Araguaia-Tocantins), nos trechos em que esses ambientes se encontram isolados geograficamente pelos macios da Serra Azul (Parque Estadual da Serra Azul) e Serra do Taquaral na regio do municpio de Barra do Garas, MT. Para uma melhor comparao e avaliao da metodologia empregada, foram estudados tambm, representantes da espcie Moenkhausia forestii, da bacia do Alto Paraguai, descrita recentemente a partir do complexo M. oligolepis.

16 2. OBJETIVOS Realizar uma anlise morfomtrica comparativa entre indivduos coletados em quatro reas de amostragem selecionadas para o estudo e, com base em marcadores moleculares obtidos pela tcnica de ISSR, desenvolver um estudo nos lotes procedentes dos diferentes ambientes estudados, para avaliar a presena e variabilidade de caractersticas especficas em cada populao.

2.1 Objetivos especficos - Avaliar a variao morfolgica entre indivduos de M. oligolepis de trs populaes procedentes de afluentes dos rios Araguaia e Mortes e de uma populao de M. forestii coletada no em alfuente da regio do Alto rio Paraguai; - Detectar a presena de marcadores moleculares especficos para cada populao utilizando a tcnica de ISSR; - Quantificar a diversidade gentica intra e inter-populacional pela a Anlise de Varincia Molecular (AMOVA), e apresentar a relao entre as populaes pelas freqncias de alelos presentes/ausentes em cada indivduo, identificadas pela tcnica de ISSR, por uma anlise de agrupamento pareado no ponderado baseado na mdia aritmtica (UPGMA).

17 3. MATERIAIS E MTODOS Os indivduos foram coletados em quatro localidades distintas. Para M. oligolepis foram realizadas coletas em: Crrego Taquaralzinho (1540'42"S, 5217'52"W), afluente de terceira ordem do rio das Mortes; dois pequenos crregos que drenam para o rio Araguaia e Garas, em Itapirapu GO (1549'30"S, 5036'05"W) e Pontal do Araguaia MT (1554'38"S, 5215'41"W) respectivamente. Para M. forestii foi realizada uma coleta no rio Paraguai, na Reserva Particular Patrimnio Nacional Sesc Pantanal (1631'07"S, 5622'42"W) (Figura 1).

Figura 1: Pontos de coleta de M. oligolepis: Crrego Taquaralzinho (tringulo cinza); Itapirapu-GO (crculo cinza); Pontal do Araguaia-MT (quadrado cinza). Ponto de coleta de M. forestii na RPPN Sesc Pantanal (crculo preto). Rio das Mortes apresentado em linha pontilhada, e Rio Araguaia apresentado em linha mais espessa. Foram coletados 72 indivduos de Moekhausia (Figura 2), com 52 pertencendo espcie M. oligolepis, sendo 31 do Crrego Taquaralzinho, 9 de Itapirapu-GO , 12 de Pontal do Araguaia-MT e 20 indivduos de M. forestii da RPPN SESC Pantanal, com uso de rede de arrasto, peneiras, linhas e anzis. Todos os exemplares foram fixados em lcool 100% e levados aos laboratrios do Grupo de Estudos em Peixes do Mdio Araguaia (GEPEMA/UFMT), para retirada de tecido (msculos e/ou fgado) e depsito na coleo de Ictiologia do GEPEMA. Em seguida, foram realizadas as anlises morfomtricas e de marcadores genticos com base em ISSR.

18

Figura 2: Exemplar de Moenkhausia oligolepis coletado no crrego Taquaralzinho. 3.1. Anlises morfomtricas Foram realizadas 12 medies do corpo de 50 indivduos utilizando-se de paqumetro digital com preciso de 0,01mm (Figura 3) sendo 30 de M. oligolepis ( 9 do Crrego Taquaralzinho, 9 de Itapirapu-GO , 12 de Pontal do Araguaia-MT) indivduos de M. forestii da RPPN SESC Pantanal. e 20

Figura 3: Esquema ilustrando as medidas tomadas nos indivduos analisados morfometricamente. CP- comprimento padro; DO- dimetro do olho; DPD distncia pr-dorsal; HCORPO altura do corpo; EI espao inter-orbital; APC altura do pednculo caudal; DORSAL base da nadadeira dorsal; PREA distncia pr-adiposa; POSA distncia ps-adiposa; ANAL base da nadadeira anal; CCAB comprimento da cabea; HCAB altura da cabea.

19 As medidas de todos os indivduos compuseram uma matriz numrica, que foi utilizada em uma Anlise de Variveis Cannicas pelo programa PAST. A anlise de variveis cannicas uma tcnica da estatstica multivariada que permite a reduo da dimensionalidade de dados. semelhante a componentes principais e correlaes cannicas. Essa tcnica especialmente empregada em anlises discriminantes realizadas a partir de amostras com observaes repetidas. A anlise tambm pode ser utilizada para representar vrias populaes em um subespao de menor dimenso. A anlise procura, com base em um grande nmero de caractersticas originais correlacionadas, obter combinaes lineares dessas caractersticas denominadas variveis cannicas de tal forma que a correlao entre essas variveis seja nula (KHATTREE & NAIK, 2000)

3.2 Anlise de marcadores genticos Para a aplicao da tcnica de ISSR para encontrar marcadores genticos populacionais e avaliar a variao de alelos entre indivduos e populaes, inicialmente realizada a extrao de DNA a partir dos tecidos dos indivduos.

3.2.1 Extrao de DNA O processo para extrao de DNA a partir de tecido muscular, seguiu basicamente o protocolo de Sambrook et al. (1989). Os procedimentos seguintes foram realizados para cada indivduo: a. Colocou-se um pedao de tecido do animal (equivalente a um gro de arroz), em um tubo de 1,5mL mais 500L de TE (Soluo tampo para hidratao do tecido e retirada do lcool utilizado para conservao), e manteve-se durante 30 minutos 4C. b. Em seguida, com o auxlio de gral e pistilo, o tecido foi triturado com nitrognio lquido, e transformado em p. Ainda no gral, foi adicionado 500L de soluo de digesto (NaCl 400mM, EDTA 100mM pH 8,0 e SDS 0,1%). Esse conjunto foi ento transferido para um tubo de 1,5mL e mantido em banho-maria a 65C por 1h30min at o desaparecimento dos pequenos pedaos de tecido que ainda permaneciam.

20 c. Aps este perodo, adicionou-se 10L de proteinase K e o conjunto foi ento mantido em banho-maria a 37C. Esse banho foi interrompido assim que a soluo se tornou homognea. Em seguida, foram acrescentados 10L de RNase no tubo que foi novamente incubado por 30 minutos 37C. d. Aps a protelise (etapa anterior), foi acrescentado 500L de Fenol saturado em tris-HCl. O tubo foi homogeneizado at que ficasse em uma s fase, e centrifugado por 5 minutos. A adio de Fenol faz com que a soluo fique em duas fases; uma fase aquosa, superior, onde permanece o DNA e outras molculas menores, e uma fase fenlica, densa e inferior, onde permanece o fenol e molculas pesadas e lisadas. A fase aquosa foi ento transferida para um tubo limpo. e. Nesse segundo tubo foram acrescentados 250L de Fenol Saturado em Tris-HCl e 250L de Clorofrmio : lcool Isoamlico(48:2). Novamente o tubo foi homogeneizado e centrifugado nas mesmas condies, e a fase aquosa transferida para um novo tubo limpo. f. Nesse terceiro tubo, foi acrescentado 500L de Clorofrmio:lcool Isoamlico (48:2), que foi homogeneizado e centrifugado nas mesmas condies, e a fase aquosa transferida para um novo tubo limpo. g. Nesse quarto tubo, foram adicionados 50L de Acetato de Sdio 3M, seguido de 1mL de Etanol 100% gelado. Nesse momento o DNA pde ser visto ao se inverter o tubo algumas vezes. O tubo foi estocado a -70C por 1 hora ou por toda a noite a 20C. h. Aps o perodo de estocagem, o tubo foi centrifugado a 12.000rpm por 15 minutos. O Etanol 100% foi descartado e substitudo por Etanol 70% gelado. O tubo foi centrifugado nas mesmas condies, por 5 minutos. Em seguida, descartou-se o sobrenadante e o tubo foi deixado para secar o DNA em uma estufa a 37C por 6 horas. Aps a secagem, o DNA foi ressuspendido em 50L H2O MiliQ.

21 3.2.2 Confirmao da extrao e quantificao do DNA extrado Para confirmar a extrao de DNA, as amostras foram submetidas eletroforese em gel de agarose 1%, corado com corante fluorescente (brometo de etidio) para verificar a integridade das amostras. As amostras correram no gel por aproximadamente 1 hora e 30 minutos, as bandas foram visualizadas com auxilio de 2UV Transilluminator com comprimento de onda de 302nm, e fotografadas no fotodocumentador Bio-Imaging Systems. Para quantificar o DNA extrado foi utilizado o Biophotometer Plus e cubetas UVette R da Eppendorf. O DNA foi diluido com H2O miliQ concentrao de 70 nanogramas por microlitro, para aumentar a eficincia da tcnica de ISSR sobre as amostras.

3.2.3 Reaes PCR-ISSR Todas as reaes de ISSR , nas duas etapas, seguiram o seguinte padro: cada reao foi constituda de 16,88 L H20 MiliQ, 2,5 L de Tampo de PCR 10X; 2 L de dNTP, 1 L de primer, 1,5 L de MgCl2, 1 L de DNA genmico e 0,12 L taq DNA polimerase (InvitrogenTM), para um volume total de 25L . Para controle negativo, foram utilizados tubos contendo todos os componentes exceto DNA para monitorar a reao e revelar eventuais contaminaes. Os primers utilizados foram os seguintes: Primer M1 (GGACGGACGGACGGAC); (GGACGGACGGACT); Primer M4 M2 (GGACGGACGGACA); e Primer Primer M3 M5 Primer (GGACGGACGGACC)

(AACCAACCAACCAACC). A programao do termociclador para as reaes consistiu em quatro repeties da srie seguinte: 45 segundos a 94C, 1 minuto a 51C e 1 minuto a 72C; e vinte e nove repeties da srie : 45 segundos a 94C , 1 minuto a 48C e 1 minuto a 72C.

3.2.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% Aps as reaes para visualizao das bandas referentes aos ISSR, as amostras foram submetidas eletroforese em gel de poliacrilamida. O gel foi constitudo de 13,34mL de poliacrilamida (acrilamida e bisacrilamida), 2mL de TBE 20X, 288 L de

22 persulfato de amnia, 24,35mL de gua destilada e 21,88 L de TEMED, respeitando-se essa ordem para preparao, uma vez que o TEMED, na presena de persulfato de amnia, catalisa o processo de polimerizao. Em seguida, rapidamente o gel foi injetado entre as placas da cuba contendo o pente e os espaadores. Depois de injetado o gel, foi aguardado 1 hora para que ocorresse a sua completa polimerizao. Em seguida, foi retirado o pente do gel e inseridas as placas com o gel na cuba vertical contendo TBE 1X. Em cada slot formado pelo pente, foram aplicados 6L do produto de PCR-ISSR com 3L de soluo tampo de corrida. Em cada gel foram colocadas 26 amostras. Para revelar as bandas resultantes da eletroforese vertical, o gel foi retirado das placas de vidro e corado com nitrato de prata. O processo de colorao realizado atravs da passagem do gel atravs de trs solues. Inicialmente, o gel colocado durante 20 minutos na soluo de fixao, que consiste de 300mL de gua destilada, 1,5mL de cido actico e 30mL de etanol. Em seguida, o gel permanece por 25 minutos na soluo de colorao, composta por 300mL de gua destilada e 0,51g de nitrato de prata 0,17%. Entre a segunda e terceira soluo, o gel permanece 3 minutos em 300mL de gua destilada. A ultima soluo aplicada durante 10 minutos, para revelao, sendo composta por 300mL de gua destilada, 30mL de NaOH 30% e 810L de formol. Aps o processo de colorao, os gis foram fotodocumentados.

3.3 Anlise da diversidade gentica com dados de ISSR Para os clculos de diversidade gentica das populaes, e ndices de distncia gentica, cada banda presente nos gis de poliacrilamida foi considerada um alelo independente, assim podendo estar presente ou ausente em cada indivduo. Bandas com o mesmo peso molecular, porm geradas com o uso de primers diferentes, foram consideradas independentes, pois a seqncia de nucleotdeos de cada primer nica. Assim, uma matriz de presena (1) e ausncia (0) de bandas nos gis foi gerada e utilizada para o clculo dos ndices a seguir. A partir desta matriz foram calculados ndices de identidade gentica, distncia gentica, variao inter e intra-populacional atravs de uma AMOVA, e a estatstica F, para avaliar o nvel de endogamia entre as sub-populaes.

23 3.3.1. Identidade gentica A freqncia de alelos presentes/ausentes, e a quantidade total de alelos diferentes em cada populao, so utilizadas para calcular a proporo de genes comuns entre duas populaes, ou seja, a identidade gentica (NEI,1972). Este um ndice gerado apenas para comparaes entre duas populaes, mas que pode ser utilizado para gerar uma matriz de similaridade gentica. Seu clculo se d por meio da frmula onde Jx , Jy e Jxy so as mdias aritmticas de jx , jy e jxy , que por sua vez so as probabilidades de um mesmo alelo se repetir em dois indivduos de uma populao X , em dois indivduos de uma populao Y, e em dois indivduos sendo um de cada populao, respectivamente. Estas probabilidades nada mais so do que o somatrio das freqncias quadradas de cada alelo em cada populao. Os valores resultantes deste ndice sempre ficaro entre 0 (zero), quando no houver alelos compartilhados por indivduos de populaes diferentes, e 1 (um), quando todos os alelos esto presentes nas duas populaes e com a mesma freqncia. A importncia deste ndice se d, principalmente, porque a partir desses valores que possvel se calcular a distncia gentica entre as populaes.

3.3.2. Distncia gentica Interpretada como o nmero acumulado de substituies de genes (alelos) por locus, ou, a diferena acumulada de alelos por locus entre as populaes, esta uma medida de dissimilaridade gentica entre duas populaes, dada por 1972). Assim como o ndice anterior, a distncia gentica de Nei pode ser calculada para qualquer grupo de indivduos e/ou populaes, independente de espcie, ploidia ou modo de reproduo. Outro benefcio deste ndice, que a distncia gentica apresenta relao linear com a distncia geogrfica em alguns modelos de migrao como o modelo de ilhas e o stepping-stone. No entanto, h ressalvas quanto ao uso destes ndices para populaes com poucos indivduos, sendo recomendado, caso o nmero de indivduos analisados seja menor que 10 (dez) por populao, devem ser analisados pelo menos 50 loci diferentes para se obter resultados confiveis, e as frmulas a serem utilizadas devem ser as propostas por Nei em seu artigo de correo (NEI,1978). Caso no seja possvel analisar tantos loci (NEI,

24 diferentes, a alternativa utilizar um nmero total de mais de 50 indivduos na pesquisa, onde as diferenas entre as frmulas originais e as propostas para correo, se tornam mnimas. Os clculos de identidade e distncia gentica foram realizados com o uso do software PopGene (YEH & BOYLE, 1997). 3.3.3. Anlise de agrupamento pelo mtodo UPGMA O mtodo UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean), um dos mtodos de agrupamento mais utilizados em anlises de diversidade quando se trabalha com populaes silvestres. Tem vantagem sobre os demais mtodos por considerar mdias aritmticas das medidas de dissimilaridade, o que evita caracterizar a dissimilaridade por valores extremos entre os indivduos considerados (CRUZ & CARNEIRO, 2003). empregado na representao das distncias em estudos multivariados por pesquisadores de diferentes reas de atuao (BERTAN et al., 2006). Uma matriz triangular de distncia gentica foi gerada e utilizada para a criao de um cladograma pelo mtodo UPGMA, atravs do programa PopGene (YEH & BOYLE, 1997). 3.3.4. Anlise de varincia molecular (AMOVA) A AMOVA surgiu como um sistema para o estudo da variao molecular dentro de uma nica espcie, onde a informao de diferenas no DNA so incorporadas em um formato de anlise de varincia, derivado de uma matriz de distncias quadradas entre todos os pares de hapltipos. Esta anlise produz estimativas anlogas de componentes de varincia e da estatstica F, da ANOVA, chamados de estatstica (phi). A significncia dos componentes de varincia e da estatstica so testados usando permutaes, eliminando a necessidade de normalidade que convencional ANOVA (EXCOFFIER et al., 1992). A anlise permite o clculo da variao em diferentes grupos hierrquicos, sendo neste trabalho utilizados apenas dois nveis, intra e inter-populacional, sem demais grupos. Assim, foi possvel comparar em qual componente a diversidade gentica maior, dentro das populaes, ou entre as mesmas.

25 Os clculos da AMOVA foram realizados com o software Arlequin, verso 3.5.1.2 (EXCOFFIER & LISCHER, 2010). A anlise foi realizada considerando-se a priore a populao de M. forestii como um grupo diferente das populaes de M. oligolepis.

3.3.5. Medidas da fragmentao populacional: estatstica f (FRANKHAM et al.,2008) A endogamia resultante da fragmentao populacional pode ser usada para medir o grau de diferenciao que ocorreu entre os fragmentos. A diferenciao entre os fragmentos ou sub-populaes est diretamente relacionada com os coeficientes de endogamia dentro e entre populaes. A endogamia na populao total (Fit) composta por: Endogamia dos indivduos em relao s suas sub-populaes ou fragmentos (Fis); e Endogamia devido diferenciao entre sub-populaes, em relao populao total (Fst). Referimos a estes ndices de endogamia como estatstica F. O Fst o efeito da subdiviso populacional sobre a endogamia. Com altas taxas de fluxo gnico entre os fragmentos, o valor de Fst baixo, e com baixas taxas de fluxo gnico entre fragmentos, as populaes divergem e tornam-se endogmicas, e o valor Fst alto. Sua variao entre 0 e 1.

26 4. RESULTADOS 4.1 Anlises morfomtricas Dos 50 indivduos medidos, 30 eram M. oligolepis pertencendo 9 Itapirapu, 12 a Pontal do Araguaia, 9 ao Crrego Taquaralzinho; e 20 eram M. forestii da RPPN Sesc Pantanal. A anlise de variveis cannicas demonstrou que os indivduos se encaixaram em quatro grupos definidos, de acordo com seus locais de origem. As populaes de Itapirapu (crculos vazios) e Pontal do Araguaia (quadrados preenchidos) mostraram ter uma morfologia bem parecida, quase se sobrepondo totalmente, enquanto que as populaes de Taquaralzinho (quadrados vazios) e de M. forestii (crculos preenchidos) mostraram ter morfologias totalmente discrepantes das outras duas, e delas mesmas (Figura 4).

3.2 2.4 1.6 0.8 Eixo 2 0

-0.8 -1.6 -2.4 -3.2 -4 -6.4 -4.8 -3.2 -1.6 Eixo 1 0 1.6 3.2 4.8

Figura 4: Variao morfolgica de 50 indivduos de acordo com a Anlise de Variveis Cannicas. Circulos vazios = M. oligolepis de Itapirapu -GO; Quadrados preenchidos = M. oligolepis de Pontal do Araguaia-Mt; Quadrados vazios = M. oligolepis de Taquaralzinho; Crculos preenchidos = M. forestii da RPPN SESC Pantanal.

27 A variao morfolgica est apresentada em 89,5% pelo primeiro eixo da anlise (Eixo 1), enquanto que o segundo eixo apresenta 8,4% da variao. A varivel que mais contribuiu na formao do padro de distribuio dos pontos ao longo do Eixo 1 foi comprimento padro e para o Eixo 2 foi a altura do corpo (Tabela 1). Tabela 1: Contribuio de cada varivel morfolgica nos dois eixos gerados pela Anlise de Variveis Cannicas. Eixo 1 Eixo 2 Comprimento Padro 2,5305 -0,39729 Altura do Corpo 1,1209 -0,64015 Distncia Pr-Dorsal 1,9337 -0,20362 Comprimento da Cabea 0,50551 -0,51645 Base da Nadadeira Anal 0,73061 -0,10224 Base da Nadadeira Dorsal 0,44168 -0,10278 Altura da Cabea 0,67865 -0,35792 Distncia Pr-Adiposa 0,56138 0,046687 Distncia Ps-Adiposa 0,15153 -0,069931 Altura do Pednculo Caudal 0,33808 -0,082288 Espao Inter-orbital 0,23161 -0,078726 Dimetro do Olho 0,18751 -0,15015

28 4.2 Anlise de marcadores genticos No total, foram detectados 86 loci de ligao (86 bandas diferenciveis nos gis). Foram encontrados alelos exclusivos de algumas populaes (marcadores populacionais)

Figura 5: Gis de poliacrilamida com reaes de PCR-ISSR PCR ISSR utilizando o primer M2. possvel svel observar a presena de uma banda exclusiva no-unnime no unnime na populao Taquaralzinho. As maiores distncias genticas ocorreram entre a populao de M. forestii e as outras populaes, sendo que a maior distncia gentica encontrada foi entre as populaes de Itapirapu e da RPPN SESC Pantanal (Tabela 2). A distncia entre a populao de Taquaralzinho e de Pontal do Araguaia, presentes em lados opostos da Serra do Taquaral e pertencentes a bacias diferentes, foi relevante, sendo quase metade da maior distncia gentica encontrada entre as populaes de espcies diferentes (M. forestii e M. oligolepis), e quase o dobro da distncia entre as populaes da bacia do rio Araguaia.

29 Tabela 2: ndices de identidade gentica (acima direita) e distncia gentica (abaixo esquerda) entre as populaes estudadas. estudadas Populao Itapirapu Pontal do Taquaral M.forestii / RPPN Araguaia SESC Pantanal Itapirapu 0,9230 0,9094 0,7481 Pontal do Araguaia Taquaralzinho M.forestii / RPPN Sesc Pantanal 0,0801 0,0949 0,2902 0,1549 0,2713 0,8565 0,2772 0,7624 0,7579 -

O cladograma formado pela anlise de agrupamento UPGMA apresentou as populaes de M. oligolepis de Itapirapu e Pontal do Araguaia mais prximas,ambas pertencentes bacia do rio Araguaia, com a populao de Taquaralzinho, da bacia do rio das Mortes, mais isolada, refletindo a pequena variao gentica entre as duas primeiras populaes (8% de diferena ena de acordo com a distncia gentica de Nei). A populao de M. forestii se apresentou mais distante das demais (Figura 6).

Figura 6: Cladrograma representando a relao entre as populaes estudadas de M. oligolepis e M. forestii de acordo com a distncia stncia gentica de Nei (1978) e o mtodo UPGMA. A anlise de varincia molecular (AMOVA) revelou que a maior parte da variao gentica se deu dentro das populaes (53,29%), sendo que entre as populaes a variao

30 foi razovel (20,57%), prxima variao entre os grupos, que foi de 26,14% (Tabela 3). A significncia da anlise foi realizada atravs de 1023 permutaes, que testaram os valores dos componentes de varincia. A AMOVA apresentou o ndice de endogamia devido diferenciao entre sub-populaes (Fst = 0,467) relativamente alto , indicando a existncia de baixo fluxo gnico entre as sub-populaes, como um todo. O ndice Fst tambm foi calculado entre cada populao, e reafirmou a posio de M. forestii como mais distante, assim como nveis significativos de baixo fluxo gnico entre as populaes de M. oligolepis (Tabela 4). Tabela 3: Resultados da Anlise de Varincia Molecular (AMOVA) com os dados de presena/ausncia de alelos resultantes da aplicao da tcnica de ISSR nas amostras de DNA dos indivduos de M. oligolepis e M. forestii das quatro populaes estudadas, considerando-as como grupos separados a priore. A variao Entre grupos a variao dos hapltipos entre as populaes de M. oligolepis e a populao de M. forestii. A variao Entre populaes dentro dos grupos a variao que ocorre entre as populaes de M. oligolepis. A variao Dentro das populaes a variao dos hapltipos desconsiderando-se grupos, ou seja, a variao que ocorre considerando-se todas as populaes como um nico grupo. Fonte de variao Porcentagem da variao Entre grupos 26,14 Entre populaes dentro dos grupos 20,57 Dentro das populaes 53,29 Efeito da subdiviso populacional (Fst) 0,467 Testes de significncia: 1023 permutaes p < 0,0001 Tabela 4: ndice Fst calculado entre cada populao, demonstrando nveis de isolamento gentico entre as populaes de M. oligolepis e M. forestii. M. oligolepis de M. oligolepis M. oligolepis M. forestii da Itapirapo-Go de Pontal do de RPPN Sesc Araguaia Taquaralzinho Pantanal M. oligolepis de 0,223 0 Pontal do Araguaia M. oligolepis de 0,204 0,309 0 Taquaralzinho M. forestii da RPPN 0,519 0,507 0,451 0 Sesc Pantanal

31 5. DISCUSSO A extenso das linhagens dentro do complexo M. oligolepis, assim como o prprio gnero Moenkhausia, ainda bem desconhecida; no entanto, diversas espcies no gnero vm sendo descritas desde a ltima dcada, utilizando-se, principalmente, de caractersticas morfolgicas em sua descrio. Benine et al (2007) utilizaram padres de colorao do corpo, presena de escamas e nmero de raios para descrever Moenkhausia diamantina, encontrada em um tributrio do rio Paraguau-BA, nordeste do Brasil. Marinho & Langeani (2010) utilizaram presenas de mculas em determinados pontos do corpo na descrio de Moenkhausia mikai das bacias do rio Amazonas e do rio Orinoco. Sousa et al. (2010) descrevem as novas espcies Moenkhausia chlorophtalma e Moenkhausia plumbea das bacias dos rios Tapajs e Xing, respectivamente, utilizando-se da presena de manchas e colorao dos olhos como caracteres importantes. Nesse mesmo contexto, Bertaco et al. (2011), descrevem Moenkhausia dasalmas, da bacia do rio Tocantins, utilizando-se novamente da presena de manchas escuras no corpo. Neste trabalho, a diversidade gentica das populaes revelou resultados correlacionados variao morfolgica, suportando a idia de que indivduos de M. oligolepis presentes na bacia do rio Araguaia esto isolados reprodutivamente de indivduos da bacia do Rio das Mortes, tanto quanto os indivduos de M. oligolepis da bacia Araguaia-Tocantins esto isolados de indivduos de M. forestii da bacia do rio Paraguai. Morfologicamente, a populao de M. oligolepis de Taquaralzinho est isolada das outras, quase tanto quanto M. forestii est de M. oligolepis, sendo que tal relao se repete quando se observam os resultados das anlises moleculares por ISSR. Estes resultados indicam que assim como M. forestii uma vez pertenceu ao complexo M. oligolepis como uma populao da bacia do rio Paraguai (BENINE et al.,2009), o mesmo pode ser vlido para a populao de M. oligolepis do Taquaralzinho. A presena de vrios alelos exclusivos entre as quatro populaes estudadas refora a idia de isolamento reprodutivo, j que tais alelos surgiram e se fixaram nas populaes. A anlise sobre as freqncias de alelos no-exclusivos entre as populaes e o agrupamento UPGMA tambm mostraram que os ndices de distncia gentica so suficientes para separar os indivduos em grupos definidos. Assim como a AMOVA mostrou que, apesar das populaes possurem alta diversidade gentica quando consideradas como um todo, o nvel de endogamia entre elas alto. Isso revelado pelos

32 significativos valores de Fst entre cada populao que sugerem isolamento reprodutivo entre elas. A eficincia dos marcadores ISSR neste trabalho se deu de maneira bem satisfatria, assim como em outros trabalhos de avaliao da diversidade gentica de peixes como Cichla (ALMEIDA-FERREIRA et al., 2011), Astyanax fasciatus (PAZZA et al., 2007), Paralichtys olivaceus (LIU et al.,2006), Valencia hispanica, Valencia letourneuxi e Aphanius fasciatus (MALTAGLIATI et al., 2006). Diferenciao morfolgica associada diferenciao gentica entre populaes de uma mesma espcie relatada como um passo intermedirio no processo de especiao por Taylor et al. (2006), em um estudo com marcadores microsatlites associado a estudos morfolgicos do Esgana-gata (Gasterosteus aculeatus), um peixe da Colmbia Britnica que possui formas bnticas e limnticas que vivem em simpatria Almeira-Ferreira et al. (2011), tambm relataram diferenciao gentica ao analisarem duas espcies de Cichla introduzidas na bacia do Rio Paran, inclusive com a descoberta de hbridos interespecficos, com base em marcadores moleculares SPAR. A associao de anlises discriminantes das caractersticas morfolgicas e de variao nas freqncias allicas com marcadores microsatlites foi utilizada por Dynes et al. (1999) como argumento para diferenciar duas formas de Salvelinus fontinalis (uma bntica e uma planctvora) na Austrlia. Os autores sugerem que o isolamento reprodutivo existe e as variaes morfolgicas esto associadas a variaes ambientais. Estudos sobre diferenciao gentica com uso de marcadores moleculares em espcies de tamanho semelhante M. oligolepis demonstraram a sensibilidade das populaes de peixes de pequeno porte. Leuzzi et al (2004) realizaram um estudo com populaes de Astyanax altiparanae que foram isoladas devido instalao de barragens no rio Paranapanema, e apresentaram altos nveis de diferenciao gentica jusante da Barragem da Capivara. Prioli et al (2002), tambm estudando Astyanax altiparanae encontraram alta diversidade genticas nas populaes, combinada com baixos nveis de isolamento e alto fluxo gnico, no rio Iguau, em pontos no isolados por barreiras geogrficas como barragens. Pazza et al (2007) analisaram populaes de Astyanax fasciatus, com os marcadores RAPD e ISSR, e tambm pelas tcnicas citogenticas, e encontraram resultados interessantes, pois o marcador ISSR revelou pequena estruturao entre as populaes, apesar de terem sido detectados dois cariomorfos distintos (2n=46 e 2n=48). Diferenas citogenticas podem passar despercebidas em estudos com marcadores moleculares, da mesma maneira que diferenas moleculares podem continuar

33 desconhecidas em estudos citogenticos, como neste trabalho de Pazza et al (2007) e outros. Este um fato de ocorrncia comum em estudos com complexos de espcies, como em Hoplias malabaricus, que apresenta sete cariomorfos j descritos, com base em diferenas no nmero diplide e na morfologia cromossmica e na presena ou no de sistemas de cromossomos sexuais (BERTOLLO et al, 2000). Em um trabalho bastante recente, Vitorino et al. (2011), descrevem um novo cariomorfo para esse mesmo grupo que, ainda que possua o mesmo nmero cromossmico que alguns dos cariomorfos descritos para a espcie, pode ser diferenciado por diferentes tipos de bandeamentos cromossmicos.. Em um estudo com Astyanax scabripinnis, Moreira-Filho & Bertollo (1991) analisaram sete populaes distribudas em diferentes bacias hidrogrficas e, pela combinao de tcnicas de citogentica e anlise de variveis cannicas, puderam caracterizar a espcie como um complexo com cinco unidades cariotpica e/ou morfologicamente distintas, restritas s cabeceiras das bacias hidrogrficas. As espcies do gnero Moenkhausia apresentam nmeros cromossmicos entre 2n=48 e 2n=50 (FORESTI et al, 1989), e M. sanctaefilomenae, uma das espcies de morfologia bem semelhante M. oligolepis, compartilha mesmo nmero cromossmico que M. oligolepis (2n=50), mas com a adio de cromossomos B ao seu caritipo (PORTELA-CASTRO et al, 2000; SCUDELER, 2010). Entretanto, os estudos citogenticos no tem sido suficientes para se detectar diferenas entre populaes que, aparentemente, sugerem algum tipo de isolamento, como o caso do grupo em estudo no presente trabalho.Assim, apesar dos estudos atuais no complexo M. oligolepis, existe mais a ser explorado, como este trabalho demonstrou com base em anlises moleculares e morfolgicas, ao detectar no Crrego Taquaralzinho (Bacia Mortes-Araguaia), um grupo de indivduos bem distinto dos outros, e que pode estar isolado e at mesmo ser restrito a esta microbacia. Carvalho (1993) enfatiza que pools genticos adaptados localmente so frgeis, e a conservao de recursos genticos deve incluir no apenas prticas que maximizem os nveis de diversidade gentica, mas tambm, medidas para preservar a variao genotpica associada a traos ecolgicos significantes. De maneira geral, pode-se afirmar, com base nos dados ora apresentados que o complexo M. oligolepis aparenta ser formado por populaes de restrita distribuio, que formam um contnuo de acordo com as nascentes e riachos, at os rios de maior porte. O isolamento geogrfico das nascentes e riachos de pequeno porte, assim como a variao

34 ambiental entre estes e a adaptabilidade dos indivduos, representam a matria prima necessria para o surgimento de novas espcies e suas variantes, como aconteceu com M. forestii na bacia do rio Paraguai e deve ocorrer com M. oligolepis na bacia do rio das Mortes. Este trabalho refora a idia de necessidade de conservao de habitats como estes, onde este complexo e vrias outras espcies aquticas ocorrem, para que esta biodiversidade ainda oculta no seja perdida. Moenkhausia oligolepis, como vrias outras espcies de peixes, formam complexos de espcies que precisam ser reconhecidas e descritas, s assim se poder ter um quadro real da ictiodiversidade sul-americana.

35 6. CONSIDERAES FINAIS

1. A tcnica de ISSR se revelou promissora e, se bem utilizada, pode fornecer dados fundamentais para o estabelecimento de limites populacionais, que so necessrios para a definio de reas de proteo para muitas espcies de importncia comercial que so, insistentemente, superexploradas. 2. Os lotes de exemplares utlizados no presente trabalho confirmam o isolamento geogrfico e, consequentemente reprodutivo, em condio naturais, de exemplares que habitam as cabeceiras da vertente norte dos exemplares que habitam as cabeceiras da vertente sul da Serra do Taquaral. 3. As anlises morfolgicas podem indicar caminhos importantes a serem trilhados para a deteco de isolados populacionais e, quando associadas anlises com base em marcadores de DNA, tornam-se ferramentas importantes para a caracterizao da biodiversidade de uma determinada rea de distribuio de algumas espcies, notadamente peixes de pequeno porte como o caso de Moenkhausia oligolepis. 4. Os lotes de Moenkhausia oligolepis representam unidades evolutivas independentes que necessitam de uma reviso taxonmica detalhada que permita a descrio das mesmas como espcies distintas.

36 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ALLENDORF, F. W. & LUIKART, G. Conservation and the genetics of populations. Blackwell Publishing, 2007. p. 10-11. ALMEIDA, F.S.; PELEGRINELLI, M.H.; SODR, L.M.K. RAPD and isoenzyme analysis of genetic variability in three allied species of catfish (Siluriformes: Pimelodidae) from the Tibagi River, Brazil. Journal of Zoology, v. 253, p. 113-120, 2001. ALMEIDA-FERREIRA, G.; OLIVEIRA, A.; PRIOLI, A.; PRIOLI, S. Spar genetic analysis of two invasive species of Cichla (Tucunar) (Perciformes: Cichlidae) in the Paran river basin. Acta Scientiarum, v.33, p.79-85, 2011. ARAUJO, M. A. R. Unidades de conservao no Brasil: da Repblica gesto de classe mundial. 1 Ed., SEGRAC , 2007. 272p. AVISE, J. C. Introduction: the scope of conservation genetics. In: AVISE, J. C. & J. L. HAMRICK (Eds), Conservation genetics: case histories from nature. 1 Ed., Chapman & Hall, 1996. p.1-9. BARDAKCI, F.; SKIBINSKI, D. O. F. Application of the RAPD technique in tilapia fish: species and subspecies identification. Heredity, v. 73, p. 117-123, 1994. BENINE, R. C.; CASTRO, R. M. C.; SANTOS, A. C. A. A new Moenkhausia Eigenmann, 1903 (Ostariophysi : Characidae) from Chapada Diamantina, Rio Paraguau basin, Bahia, northeastern Brazil. Neotropical Ichthyology, v.5, p.259-262, 2007. BENINE, R. C.; MARIGUELA, T.C.; OLIVEIRA, C. New species of Moenkhausia Eigenmann, 1903 (Characiformes : Characidae) with comments on the Moenkhausia oligolepis species complex. Neotropical Ichthyology, v.7, p.161-168, 2009. BERTACO, V. A.; JEREP, F. C.; CARVALHO, F. R. New species of Moenkhausia Eigenmann (Ostariophysi: Characidae) from the upper Rio Tocantins basin in central Brazil. Neotropical Ichthyology, v.9, p.57-63, 2011. BERTAN, I.; CARVALHO, F. I. F.; OLIVEIRA, A. C.; VIEIRA, E. A.; HARTWIG, I.; SILVA, J. A. G.; SHIMIDT, D. A. M.; VALERIO, I. P.; BUSATO, C. C.; RIBEIRO, G. Comparao de mtodos de agrupamento na representao da distncia morfolgica entre gentipos de trigo. Revista Brasileira de Agrocincia, v.12, p.279-286, 2006. BERTOLLO, L. A. C.; BORN G. G.; DERGAM J. A.; FENOCCHIO A. S.; MOREIRAFILHO O. A biodiversity approach in the neotropical Erythrinidae fish, Hoplias malabaricus. Karyotypic survey, geographic distribution of cytotypes and cytotaxonomic considerations. Chromosome Research, v. 8, p.603-613, 2000. BORBA, R. S.; GARCIA, M. S.; KOVALLESKI, A.; OLIVEIRA, A. C.; ZIMMER, P. D.; BRANCO, J. S. C.; MALONE, G. Dissimilaridade gentica de linhagens de Trichogramma Westwood (Hymenoptera : Trichogrammatidae) atravs de marcadores moleculares ISSR. Neotropical Entomology, v.34, p.565-569, 2005.

37

BORM, A.; CAIXETA, E. T., (Eds). Marcadores moleculares. 1 Ed., Editora Independente, 2006. 374p. CALLEJAS C. & OCHANDO M. D. Molecular identification (RAPD) of the eight species of the genus Barbus (Cyprinidae) in the iberian peninsula. Journal of Fish Biology, v.59, p.1589-1599, 2001. CARVALHO, G. R. Evolutionary aspects of fish distribution: genetic variability and adaptation. Journal of Fish Biology, v.43, p.5373, 1993. CARVALHO, M. L.; OLIVEIRA, C.; NAVARRETE, M. C.; FROEHLICH, O.; FORESTI, F. Nuclear DNA content determination in Characiformes fish (Teleostei, Ostariophysi) from the neotropical region. Genetics and Molecular Biology, v.25, p.4955, 2002. CRUZ, C. D.; CARNEIRO, P. C. S. Modelos biomtricos aplicados ao melhoramento gentico volume 2. 2 Ed., Editora UFV, 2003. 585p. DYNES, J..;MAGNAN, P.; BERNATCHEZ, L.; RODRGUEZ, M. A. Genetic and morphological variation between two forms of lacustrine Brook Charr. Journal of Fish Biology, v.54, p.955972, 1999. EIGENMANN, C. H. New genera of South America fresh-water fishes, and new names for some old genera. Smithsonian Miscellaneous Collection, v.45, p.144-148, 1903. EIGENMANN, C. H. The American Characidae. Part I. Memoirs Of The Museum of Comparative Zoology, v.43, p.1-102, 1917. ESCHMEYER, W. N. (Ed.). Catalog Of Fishes. Electronic Version- 12 July 2010. California Academy Of Sciences, 2010. Disponvel em: http://research.calacademy.org/ichthyology/catalog/fishcatmain.asp.. Acesso em: 16-112010. EXCOFFIER, L.; SMOUSE, P. E.; QUATTRO, J. M. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics, v.131, p.479-491, 1992. EXCOFFIER L. & LISCHER H. E. L. Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources, v.10, p.564-567, 2010. FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introduo Ao Uso De Marcadores Moleculares Em Anlise Gentica. 3 Ed, EMBRAPA-CENARGEM, 1998. 220p. FOO C. L.; DINESH, K. R.; LIM, T. M.; CHAN, W. K.; PHANG, V. P. E. Inheritance of RAPD markers in the guppy fish, Poecilia reticulata. Zoological Science, v.12, p.535-541, 1995. FORESTI F.; ALMEIDA-TOLEDO, L. F.; TOLEDO-FILHO S. A. Supernumerary chromosome system, C-banding pattern characterization and multiple nucleolus organizer

38 regions in Moenkhausia sanctaefilomenae (Pisces, Characidae). Genetica, v.79, p.107114, 1989. FORD, E. B. Gentica e adaptao. 1 Ed., EPU : Ed. Da Universidade De So Paulo, 1980. 69p. FRANKHAM, R.; BALLOU, J. D.; BRISCOE, D. A. Fundamentos de gentica da conservao. 1 Ed., Editora SBG , 2008. 280p. GOULO, L.; OLIVEIRA, C. M. Molecular characterization of cultivars of apple (malus X domestica Borkh.) using microsatellite (SSR and ISSR) markers. Euphytica v.122, p.81-89, 2001. GUPTA, M.; CHYI, Y. S; ROMERO-SEVERSON, J.; OWEN, J. L. Amplification of DNA markers from evolutionary diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics, v.89, p. 998-1006, 1994. KHATTREE, R. & NAIK, D. N. Multivariate data reduction and discrimination with Sas software. Sas Institute Inc., 2000. 558p. KLUG, W.; CUNNINGS, M. R. Concepts of genetics. 5 Ed., Editora Prentice Hall, 214p. LACY, R. C. & LINDENMAYER D. B. A simulation study of the impacts of population subdivision on the mountain brushtail possum Trichosurus caninus Ogilby (Phalangeridae: Marsupialia), in south-eastern Australia. ii. Loss of genetic variation within and between subpopulations. Biological Conservation, v.73, p.131142, 1995. LALHRUAITLUANGA, H. & PRASAD, M. N. V. Comparative results of RAPD and ISSR markers for genetic diversity assessment in Melocanna baccifera Roxb. growing in Mizoram state of India. African Journal of Biotechnology, v.8, p.6053-6062, 2009. LEUZZI, M. S. P.; ALMEIDA, F. S.; ORSI, M. L.; SODRE, L. M. K. Analysis by RAPD of the genetic structure of Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes) in reservoirs on the Paranapanema River, Brazil. Genetics and Molecular Biology, v.27, p.355-362, 2004. LIMA, F. C. T.; MALABARBA, L. R.; BUCKUP, P. A.; SILVA, J. F. P.; VARI, R. P.; HAROLD, A.; BENINE, R. C.; OYAKAWA, O.; PAVANELLI, C. S.; MENEZES, N. A.; LUCENA, C. A. S.; MALABARBA, M. C. S. L.; LUCENA, Z. M. S.; REIS, R. E.; LANGEANI, F.; CASATTI, L.; BERTACO, V. A.; MOREIRA, C.; LUCINDA, P. H. F. Genera incertae sedis in Characidae. In: REIS, R. E., KULLANDER, S. O.; FERRARIS JR, C. J. (Eds.). Check List Of Freshwater Fishes Of South And Central America. Primeira edio , Editora Edipucrs, 2003, p.106-169. LIU, Y. ; CHEN, S.; LI, J.; LI, B. Genetic Diversity in three japanese flounder (Paralichthys olivaceus) populations revealed by ISSR markers. Aquaculture, v.255, p.565-572, 2006. LOWE, A.; HARRIS, S.; ASHTON, P. Ecological genetics: Design, analysis and application. 1 Ed., Blackwell Publishing, 2004. 344p.

39 LUCINDA, P. H. F; MALABARBA, L. R.; BENINE, R. C. On a new species of the genus Moenkhausia Eigenmann (Ostariophysi: Characidae). Zootaxa, v.1525, p.6168, 2007. LYNCH, M. A quantitative-genetic perspective on conservation issues. In: AVISE, J. C. & J. L. HAMRICK (Eds), Conservation genetics: case histories from nature. 1 Ed., Chapman & Hall, 1996. p.471501. MALTAGLIATI, F.; LAI, T.; CASU, M.; VALDESALICI, S.; CASTELLI, A. Identification of endangered mediterranean cyprinodontiform fish by means of DNA intersimple sequence repeats (ISSRs). Biochemical Systematics and Ecology, v.34, p.626634, 2006. MARINHO, M. M. F. & LANGEANI, F. A new species of Moenkhausia from the Rio Amazonas and Rio Orinoco basins (Characiformes: Characidae). Zootaxa, v.2577, p.57 68, 2010. MARINHO, M. M. F. A new species of Moenkhausia Eigenmann (Characiformes: Characidae) from the Rio Xingu basin, Brazil. Neotropical Ichthyology, v.8, p.655-659, 2010. MASSAGO, H.; RIBEIRO, R. P.; BARRERO, N. M. L.; POVH, J. A.; CASTAGNOLLI, N.; GOMES, P. C. Diversidade gentica de quatro linhagens de Oreochromis niloticus utilizando o marcador RAPD. Bioscience Journal, v.25, n.4, p.150-159, 2009. MILACH, S. C. K. (Ed). Marcadores moleculares em plantas. 1 Ed., Editora UFRGS, 1998. 141p. MILLS, C. The theory of evolution: what it is, where it came from and why it works. 1 Ed., Editora John Wiley and Sons, 2004. 218p. MOREIRA-FILHO, O. & BERTOLLO, L. A. C. Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): A species complex. Brazilian Journal of Genetics, v.14, p.331-357, 1991. MORITZ, C. Defining evolutionary significant units for conservation. Trends in Ecology & Evolution, v.9, p.373375, 1994. NUNNEY, L. & CAMPBELL K. A. Assessing minimum viable population size: demography meets population genetics. Trends in Ecology & Evolution, v.8, p.234239, 1993. OBRIEN, S. J. A role for molecular genetics in biological conservation. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.91, p.57485755, 1994. OLIVEIRA, A. V.; PRIOLI, A. J.; PRIOLI, S. M. A. P.; PAVANELLI, C. S.; JLIO JR, H. F.; PANARARI, R. S. Diversity and genetic distance in populations of Steindachnerina in the upper Paran river floodplain of Brazil. Genetica, v.115, p.259-267, 2002. OLIVEIRA, C. ; FORESTI, F. ; HILSDORF, A. W. S. Genetics of neotropical fish: from chromosomes to populations. Fish Physiology and Biochemistry, v.35, p.81-100, 2008.

40 PAZZA, R.; KAVALCO, K. F.; PRIOLI, S. M. A. P.; PRIOLI, A. J.; BERTOLLO, L. A. C. Chromosome polymorphism in Astyanax fasciatus (Teleostei, Characidae), part 3: analysis of the RAPD and ISSR molecular markers. Biochemical Systematics and Ecology, v.35, p.843-851, 2007. PORTELA-CASTRO, A. L. B.; JNIOR, H. F. J.; NISHIYAMA, P. B. New ocurrence of microchromosomes B in Moenkhausia sanctaefilomeane (Pisces, Characidae) from the Paran River of Brazil: analysis of the synaptonemal complex. Genetica, v.110, p.277283, 2000. PRIMACK, R. B.; RODRIGUES, E. Biologia Da Conservao. 1 Ed., Editora Planta, 2001. 328p. PRIOLI, S. M. A. P.; PRIOLI, A. J.; JLIO JR., H. F.; PAVANELLI, C. S.; OLIVEIRA, A. V.; CARRER, H.; CARRARO, D. M.; PRIOLI, L. M. Identification of Astyanax altiparanae (Teleostei, Characidae) in the Iguau River, Brazil, based on mitochondrial DNA and RAPD markers. Genetics and Molecular Biology, v. 25, p.421-430, 2002. RAMOS, J. V. B. Estudo da estrutura gentica de Leporinus elongatus (Pisces, Characiformes) no Complexo Canosas: rio Paranapanema. 2007. Dissertao (Mestrado em Gentica E Biologia Molecular). Universidade Estadual De Londrina. REDDY, M. P.; SARLA, N.; SIDDIQ, E. A. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica, v.128, p.9-17, 2002. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F. AND MANIATIS, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Segunda edio, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1659p. SCUDELER, P. E. S.. Estudo da estrutura molecular dos cromossomos supranumerrios em Moenkhausia sanctaefilomenae (Teleostei, Characiformes, Characidae). 2010. Tese (Doutorado em Cincias Biolgicas (Zoologia)). Instituto de Biocincias de Botucatu, Universidade Estadual Paulista UNESP, Botucatu. SOUSA, L. M.; NETTO-FERREIRA, A. L.; BIRINDELLI, J. L. O. Two new species of Moenkhausia Eigenmann (Characiformes: Characidae) from Serra Do Cachimbo, Par, northern Brazil. Neotropical Ichthyology, v.8, p.255-264, 2010. TAYLOR, E. B.; BOUGHMAN, J. W.; GROENENBOOM, M.; SNIATYNSKI, M.; SCHLUTER, D.; GOW, J. L. Speciation in reverse: morphological and genetic evidence of the collapse of a three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus) species pair. Molecular Ecology, v.15, p.343355, 2006. TOWNSEND, C. R.; BEGON, M.; HARPER, J. L. Fundamentos Em Ecologia. 2 Edio, Editora Artmed, 2006. 592p. VILELA-MORALES, E. A. & VALOIS, A. C. C. Recursos genticos vegetais autctones e seus usos no desenvolvimento sustentvel. Cadernos De Cincia & Tecnologia, v.17, p.11-42, 2000. Suplemento. VITORINO, C. A.; SOUZA, I. L.; ROSA, J.N.; VALENTE, G . T .; MARTINS, C.; P. C . VENERE. Molecular cytogenetics and i ts contribution to the understanding of the

41 chromosomal diversication in Hoplias malabaricus (Characiformes). Journal of Fish Biology, v.78, p1239-1248, 2011. WASKO, A. P. & GALLETI JR, P. M. RAPD Analysis in the neotropical fish Brycon lundii: genetic diversity and its implications for the conservation of the species. Hydrobiologia, v.474, p.131-137, 2002. WELSH, J. & MCCLELLAND, M. Fingerprinting genomes using pcr with arbitrary primers. Nucleic Acids Research, v.18, p.72137218, 1990. WILLIAMS, J. G. K.; KUBELIK, A. R.; LIVAK, K. J.; RAFALSKI, J. A.; TINGEY, S. V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, v.18, p.65316535, 1990. YEH, F. C. & BOYLE, T. J. B. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits. Belgian Journal of Botany, v.129, p.157, 1997. ZIETKIEWICZ, E.; RAFALKI, A.; LABUDA, D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, v.20, p.176-183, 1994.

(Referncias bibliogrficas de acordo com as Normas para elaborao de dissertao de Mestrado do curso de Mestrado em Ecologia e Conservao da Biodiversidade , UFMT, 2009, que corresponde ao Guia para elaborao de referncias bibliogrficas ABNT NBR-6023 ago/2000)