Carla Neves Toledo

Voltametria direta de mioglobina imobilizada em eletrodo de ouro modicado com polimetil metacrilato com bloco de poli-2-dimetilaminoetil metacrilato (PMMA-bloco-PDMAEMA)

Alfenas - MG 2012

Carla Neves Toledo

Voltametria direta de mioglobina imobilizada em eletrodo de ouro modicado com polimetil metacrilato com bloco de poli-2-dimetilaminoetil metacrilato (PMMA-bloco-PDMAEMA)

Orientador:

Jos e Maur cio Schneedorf Ferreira da Silva

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS

Alfenas - MG 2012

Disserta ca o de Mestrado sob o t tulo Voltametria direta de mioglobina imobilizada em eletrodo de ouro modicado com polimetil metacrilato com bloco de poli-2-dimetilaminoetil metacrilato (PMMA-bloco-PDMAEMA), defendida por Carla Neves Toledo e aprovada em 31/07/2012, em Alfens, Estado de Minas Gerais, pela Banca Examinadora constituida pelos seguintes doutores(as):

Prof. Dr. Jos e Maur cio Schneedorf Ferreira da Silva Universidade Federal de Alfenas

Prof. Dr.T ulio Matencio Universidade Federal de Minas Gerais

Prof. Dra. Ma sa Ribeiro P. Lima Brigag ao Universidade Federal de Alfenas

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Agradecimentos
Agrade co, Primeiramente a Deus, por ter me dado for ca; Ao meu orientador Dr. Jos e Maur cio Schneedorf Ferreira da Silva, pelo apoio, orienta ca o, pelo conhecimento que transmitiu, pelo exemplo que legou e incentivo durante a realiza c ao deste trabalho; ` UNIFAL-MG pela p A os-gradua ca o; Em especial a minha fam lia pelo est mulo e compreens ao nas horas de aus encia, em especial minhas lhas Thayn a e J ulia e meu esposo Douglas; Aos meus amigos da P os-Gradua c ao pela amizade; ` amigas especiais: Ariane, Bianca, Cl As audia e Ludimila por me mostrarem o verdadeiro valor da amizade; Aos funcion arios e professores do laborat orio de bioqu mica; Aos professores que contribu ram neste trabalho; E a todos aqueles n ao citados, mas que acreditaram, verdadeiramente, na minha capacidade e a `queles que contribu ram direta ou indiretamente para realiza c ao deste trabalho.

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Dedico a Deus, ao meu esposo, as minhas lhas, aos meus pais, irm aos, a ` minha madrinha e meus amigos pelo apoio na realiza c ao deste trabalho

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Lista de S mbolos
A- area do eletrodo (cm2 ) Ag/AgCl- Eletrodo de refer encia de prata/cloreto de prata H - varia ca o de entalpia G - varia ca o de energia livre de Gibbs Ep varia ca o do potencial de pico S- varia ca o de entropia Co- concentra ca o da esp ecie oxidada Cr- concentra ca o da esp ecie reduzida CV- Voltametria c clica Do - coeciente de difus ao (cm2 s1 ) E - potencial do eletrodo E0 - potencial padr ao da rea c ao Eeq - potencial de equil brio Ep- potencial de pico Fe (CN)6 ]4 /3 - K4 [ Fe (CN)6 ]/ K3 [ Fe (CN)6 ] F- constante de Faraday( 96487 Cmol1 ) GLU- Gluteralde do H2 O2 - per oxido de oxig enio Hb- hemoglobina i - corrente do eletrodo ia - corrente an odica ic - corrente cat odica i0 - densidade de corrente ip - corrente de pico K- constante de equil brio

Km- constante de Michaelis-Menten Ks- coeciente de heterogeneidade padr ao L-cys- ciste na Mb - mioglobina n - n umero de mols de el etrons transferidos na rea c ao Ox- forma oxidada PMMA-b-PDMAEMA- polimetil metacrilato com bloco de poli-2-dimetilaminoetil metacrilato PG- eletrodo de grate pirol tico pH- potencial hidrogeni onico pO2 -press ao parcial de oxig enio Pt- platina R - constante dos gases (4,18 J mol1 K1 ) Red- forma reduzida RAFT- t ecnica de polimeriza c ao (Transfer encia Revers vel de Cadeia por Adi c ao- Fragmenta c ao) SAMs - monocamadas auto-organizadas T - temperatura absoluta, em Kelvin v frequ encia - velocidade de varredura (em Vs1 ) V- volts VIS- regi ao espectral de comprimento de onda vis vel UV regi ao espectral de ultraviolotela - comprimento de onda - coeciente de eletro-transfer encia

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Lista de Figuras
1 Representa ca o da cadeia glob nica e o grupo heme da mioglobina. Fonte: (Protein Data Bank (Brookhaven National Laboratory; http://www.rcsb.org/pdb), sob o c odigo 1MBO. Acessado em: 17 dez. 2011). . . . . . . . . . . . . 2 Grupo prost etico heme, constitu do por um sistema protoporrina e um a tomo de ferro central [1]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Ciclovoltamogramas (a) de eletrodo de ouro em solu ca o de Mb e L-cys,(b) eletrodo de ouro em tamp ao fosfato pH 6,7, (c) eletrodo de ouro e L-cys em tamp ao fosfato pH 6,7 (d), eletrodo de ouro e L-cys em solu c ao de Mb. Taxa de varredura 100 mV.s1 [2]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 Ciclovoltamograma para sistema revers vel ([3], Fig. 9.3). . . . . . . . . Potencial da curva corrente para o sistema O+ne/R, assumindo que a transfer encia de el etrons comporta- se: Co = Cr, e = 0,5. As linhas pontilhadas mostram os componentes Ic e Ia [4]. . . . . . . . . . . . . . 6 Representa ca o esquem atica das principais t ecnicas de imobiliza ca o (adaptado da refer encia) [5]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Estrutura qu mica do PMMA-b-PDMAEMA sintetizado pela t ecnica de RAFT [6]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 9 Eletrodo de trabalho utilizado durante os experimentos. . . . . . . . . . C elula eletroqu mica utilizada nos experimentos. A c elula era composta de tr es eletrodos: contra eletrodo (o Pt), eletrodo de trabalho (Au a Au modicado) e de refer encia (Ag/AgCl). . . . . . . . . . . . . . . . . p. 35 p. 24 p. 33 p. 19 p. 11 p. 8 p. 10 p. 7 p. 6

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Representa c ao da c elula eletroqu mica acoplada ao banho ultratermost atico e ao sistema jaquetado, utilizada nos experimentos de varia ca o da temperatura de Mb imobilizada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 38

11

Voltamograma c clico do eletrodo de Au em 0,5 mol.L1 de H2 SO4 a 20mVs1 , 25 ciclos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 42

12

Voltamograma c clico de tamp ao fosfato e Mb/PMMA-b-PDMAEMA em eletrodo Au. Velocidade de varredura 100 mV.s1 . . . . . . . . . . . p. 45

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Voltamograma c clico de Mb/PMMA-b-PDMAEMA em tamp ao fosfato 0,1 mol1 pH 7,4 nas velocidades de varredura de 20; 40; 60; 80; 130; 160; 180; 200 mV.s1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 45

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Efeito da varia ca o do quadrado da taxa de velocidade de varredura na intensidade de corrente de pico de Mb/PMMA-b-PDMAEMA em tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 pH 7,4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 47

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Efeito da taxa de velocidade de varredura na corrente de pico de Mb/PMMAb-PDMAEMA em tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 pH 7,4. . . . . . . . . . . p. 47

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Representa c ao duplo-logaritmo de velocidade de varredura e corrente de pico, para a cin etica de transfer encia eletr onica em Mb-PMMA-bPDMAEMA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 48

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Depend encia do potencial de pico Ep com o logaritmo da taxa de velocidade de varredura ( ) de Mb 15 mol.L1 em tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 pH 7,4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 50

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Depend encia do potencial de pico com logaritmo da corrente de pico de Mb 15 mol.L1 em tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 pH 7,4. . . . . . . . . p. 51

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Efeito da varia ca o de pH no potencial formal padr ao encontrado para Mb/PMMA-b-PDMAEMA. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , eletr olito suporte de tamp ao fosfato de s odio 0,1 mol.L1 . . . . . . . . . . . . . . p. 52

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Resposta da varia c ao da concentra c ao de H2 O2 sobre o eletroo de Mb/PMMAb-PDMAEMA. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , eletr olito suporte de tamp ao fosfato s odio 0,1 mol.L1 , pH 7,4. . . . . . . . . . . . p. 53

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Representa c ao de Lineweaver-Burk da resposta da varia c ao de H2 O2 sobre o eletrodo de Mb/PMMA-b-PDMAEMA. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , eletr olito suporte de tamp ao fosfato s odio 0,1 mol.L1 , pH 7,4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 54

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Gr aco de E0 vs temperatura (K) para Mb/PMMA-b-PDMAEMA em ensaio termodin amico n ao-isot ermico. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , eletr olito suporte de tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 , pH 7,4. . . . p. 56

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Gr aco de Gibbs-Helmholtz (E0 /T vs 1/T (K)) para Mb/PMMA-bPDMAEMA/GLU em ensaio termodin amico n ao-isot ermico. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , eletr olito suporte de tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 , pH 7,4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 57

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Efeito do tempo de estocagem do biossensor M/PMMA-b-PDMAEMA sobre a corrente de pico an odica em tamp ao fosfato s odio 0,1 mol.L1 , pH 7,4. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , temperatura de ensaio de 25 0 C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 58

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Sum ario

Agradecimentos Lista de S mbolos Lista de Figuras Resumo Abstract 1 Introdu c ao 2 Referencial Te orico 2.1 2.2 Mioglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Voltametria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1 2.2.2 2.3 Voltametria de prote nas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Voltametria de prote nas imobilizadas na superf cie do eletrodo . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

p. ii p. iv p. vii p. xiv p. xvi p. 1 p. 4 p. 5 p. 8 p. 14 p. 16 p. 18 p. 19 p. 19 p. 19 p. 20 p. 20

T ecnicas de Imobiliza ca o de Prote nas 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4

Adsor c ao F sica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Filmes delgados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Microencapsulamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Liga c ao Covalente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.4

Copol meros sint eticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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2.4.1 2.4.2

Pol meros RAFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Copol mero PMMA-block-PDMAEMA . . . . . . . . . . . . . .

p. 21 p. 23 p. 26 p. 28 p. 29 p. 29 p. 30 p. 31 p. 31 p. 32 p. 32 p. 34 p. 34 p. 34 p. 35 p. 35 p. 36 p. 36 p. 36 p. 37 p. 37 p. 37

3 Justicativa 4 Objetivos 4.1 4.2 Principal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Espec cos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5 Metodologia 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 Reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Equipamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Calibra ca o do sistema potenciostato-galvanostato . . . . . . . . . . . . Cela Eletroqu mica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Limpeza dos eletrodos de trabalho . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Caracteriza c ao eletroqu mica da superf cie de eletrodo de Au . . . . . . Teste dos eletrodos com sonda de ferro/ferricianeto de pot assio . . . . . Preparo da solu c ao de mioglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Espectrofotometria de Mb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.10 Montagem do sistema de voltametria de mioglobina . . . . . . . . . . . 5.11 Imobiliza ca o da prote na na superf cie dos eletrodos . . . . . . . . . . . 5.12 Voltametria c clica de mioglobina imobilizada . . . . . . . . . . . . . . 5.13 Determina ca o dos par ametros cin eticos de transfer encia de carga . . .

5.14 Estudo de varia c ao de pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.15 Estudo da atividade catal tica de H2 O2 . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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5.16 Ensaio termodin amico de Mb imobilizada . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.17 Estudo da estabilidade e reprodutibilidade do biosensor . . . . . . . . . 5.18 An alise de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Resultados e Discuss ao 6.1 6.2 6.3 Determina c ao da pureza de Mb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pr e-tratamento de eletrodo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C alculo de concentra c ao de Mb eletroativa na superf cie do eletrodo de Mb-PMMA-b-PDMAEMA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 Efeito da velocidade de varredura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Determina c ao dos par ametros cin eticos de transfer encia de carga . . . . Efeito da varia ca o de pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

p. 38 p. 38 p. 39 p. 40 p. 41 p. 41

p. 42 p. 44 p. 48 p. 52 p. 53 p. 55 p. 57

Determina c ao da atividade eletrocatal tica de H2 O2 . . . . . . . . . . . Efeito da temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Determina c ao da Estabilidade do Biossensor . . . . . . . . . . . . . . .

6.10 Mecanismo proposto de forma ca o do biossensor de PMMA-b-PDMAEMA p. 58 7 Conclus oes Refer encias p. 60 p. 62

Ap endice A -- Manuscrito submetido ao peri odico The Open Journal of Electrochemistry - ISSN 1876-505X Ap endice B -- Imobilizacao covalente de Mb em sistema EDC/NHS p. 72 p. 73

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Resumo
A termodin amica de prote nas est a intimamente relacionada com mudan cas entre as diferentes formas de energia e tamb em com o estudo das transforma c oes de energia que acompanham fen omenos f sico-qu micos. As intera c oes entre o reagente e a superf cie eletr odica s ao importantes para a determina c ao da cin etica de transfer encia eletr onica. Neste trabalho, avaliou-se a modica c ao de um substrato de ouro com PMMAb-PDMAEMA e liga ca o com gluteralde do, seguido por imobiliza ca o de mioglobina de sangue equino como modelo de intera ca o. Nos experimentos eletroqu micos, a intera ca o foi obtida por gotejamento da prote na na superf cie do ouro, seguindo da adi c ao do copol mero e agente bifuncional GLU. Uma segunda etapa deste trabalho consistiu da an alise termodin amica do sinal voltam etrico de mioglobina imobilizada, por varredura t ermica em cela termoqu mica n ao- isot ermica. A intera c ao entre Mb/PMMA-b-PDMAEMA/GLU foi investigada por voltametria c clica, por meio da mensura ca o de par ametros, tais como: constante de estabilidade, cin etica de transfer encia de carga, determina ca o da atividade eletrocatal tica de H2 O2 , efeito da temperatura. O efeito do pH tamb em foi avaliado por voltametria, bem como a estabilidade e reprodutibilidade do biosensor. A voltametria c clica da intera ca o do complexo Mb/PMMA-b-PDMAEMA/GLU exibiu um processo de rea ca o quase-revers vel na superf cie do eletrodo de ouro modicado controlado por voltametria de camada delgada com potencial de oxida ca o e de redu ca o, com valores de 0,248 V e 0,034, respectivamente. O potencial padr ao (E0 ) foi de 0,180V. O coeciente de transfer encia de carga assumiu um valor de () de aproximadamente 0,400,01 . Os valores de KS obtidos sugerem que a cin etica e lenta, entretanto variou com a velocidade, refor cando a quase-reversibilidade da rea ca o. O efeito do pH revelou valores que conrmam que o processo de transfer encia eletr onica ocorreu na propor ca o de 2 el etrons para um pr oton. Complementarmente, houve varia ca o de KS com pH, refor cando a exist encia de pr otons H+ durante a eletro-transfer encia. A constante Michaelis-Menten (Km ) aparente calculada foi de 115M, representando uma alta atividade catal tica para o H2 O2 . A m edia da 11 11 concentra c ao da area de superf cie calculada foi de 9,8 x 10 1,13 x 10 mol/cm2 , n ao se observando varia c oes signicativas com o aumento da velocidade. Os valores encontrados de S0 e H0 foram respectivamente 351.3 0.0 J mol1 K1 e -76831.9 0.8KJ/mol. A m edia da a rea eletroativa obtida foi de obtidos foi 1.146 cm2 0.1371. Em suma, os resultados obtidos podem ser u teis para a compreens ao de prote nas imobilizadas,abrindo perspectivas para estudo mais aprofundado para determina ca o de par ametros eletrocin eticos sob varia c ao de temperatura. Palavra-chave: termodin amica; prote na; imobiliza ca o; pol mero; voltametria; mioglobina.

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Abstract
Myoglobin was immobilized in the reversible additionfragmentation chain transfer (RAFT) copolympoly(methyl methacrylate)-block-poly[(2-dimethylamino)ethyl methacrylate] PMMA-block-PDMAEMA polymer. Cyclic voltammograms gave direct and slow quasi-reversible heterogeneous electron transfer kinetics between Mb-PMMA-blockPDMAEMA modied electrode and the redox center of the protein. The values for heterogeneous electron transfer constant (ks ) and transfer coecient () were determined to be 0.0550.00 1 and 0.810.08, respectively. The pH dependence of the formal potential of Mb suggested that protonation accompanies a two electron transfer to Mb. The reduction potential determined as a function of temperature (20-55 C0 ) revealed a value of reacton center entropy of S0 of 351.3 0.0 Jmol1 K1 and enthalpy change of -76831.9 0.1 Jmol1 , suggesting solvent eects and charge ionization atmosphere involved in the reaction. The immobilized protein also exhibit an electrocatalytical response to reduction of hydrogen peroxide, with an apparent Km of 114.758.7 M. The overall results substantiates the design and use of RAFT polymers towards to the development of thirdgeneration biosensors. Keyword: thermodynamics, protein immobilization, voltammetry, myoglobin,copolymers.

Introdu c ao

A busca pelo uso de metodologias que permitam an alises simples, r apidas, de baixo custo e com a m nima sostica ca o de pr e-tratamentos, ainda e um grande desao e continua sendo o foco de in umeras pesquisas. Nesse sentido, a a rea de sensores qu micos est a em constante crescimento, uma vez que os sensores possuem grande sensibilidade e capacidade de monitora ca o, al em de aplica ca o em in umeros procedimentos espec cos que permitem o controle de processos bioqu micos [7]. Dentro desse contexto, as pesquisas atuais t em como foco principal minimizar os interferentes, tais como: a passiva c ao gradual da superf cie eletr odica, adsor c ao de produtos da rea c ao redox, que podem polimerizar e depositar sobre a superf cie do eletrodo. Assim, surgem os eletrodos quimicamente modicados, cuja fun ca o principal e a simplica c ao de procedimentos tradicionais, al em de minimizar os fatores acima [8]. Para o desenvolvimento de biosensores formados por prote nas e enzimas, existem v arios procedimentos utilizados no processo de imobiliza c ao amplamente empregados, como o uso de pol meros, matriz sol-gel, monocamadas autoorganizadas (SAMs), membranas lip dicas e nanomateriais [9]. A estabilidade de uma prote na depende exclusivamente do ambiente termodin amico em que se encontra, enquanto que sua termoestabilidade depende de intera c oes espec cas entre seus res duos de amino acidos e esses com o solvente, cando evidente quando os fatores de entalpia e entropia se alteram, incidindo diretamente sobre as propriedades funcionais do polipept dio. Com o intuito de reproduzir biosensores de natureza proteica, com robustez e conabilidade, e essencial a comunica ca o ecaz entre as biomol eculas e a superf cie eletr odica. Essa u ltima etapa fundamental no desenvolvimento desses dispositivos. S ao conhecidas in umeras t ecnicas para imobiliza c ao de prote nas, sendo as mais comuns a liga ca o covalente, a liga ca o covalente cruzada, a adsor c ao f sica, o encapsulamento, parte das quais com o uso de pol meros naturais ou sint eticos. Nesse sentido, a utiliza ca o de pol meros e de copol meros tem sido bastante utilizada, de modo que se torna peculiar a discuss ao acerca do processo de eletro-transfer encia envolvido [10]. Copol meros sintetizados pela t ecnica conhecida por RAFT (Transfer encia Revers vel de Cadeia por Adi c ao-Fragmenta c ao), podem ser de grande valia no sentido acima, dada a exibilidade ajust avel de suas propriedades f sico-qu micas nais no processo de s ntese, direcionando-as ` as especicidades de imobiliza ca o de determinada prote na (como rede de carga l quida, intera ca o com sol-

vente, potencial de oligomeriza ca o, entre outros). A m de testar a possibilidade de emprego de pol meros RAFT para a constru ca o de biosensores, foi utilizado neste trabalho o copol mero polimetil metacrilato com bloco de poli-2-dimetilaminoetil metacrilato (PMMA-bloco-PDMAEMA). O copol mero foi empregado em liga ca o cruzada com o reagente bifuncional gluteralde do, para a imobiliza ca o e estudo eletroanal tico de mioglobina equina como prote na modelo, e pela t ecnica de voltametria c clica.

Referencial Te orico

2.1

Mioglobina

A mioglobina e uma prote na monom erica de 153 res duos de amino acidos, e com a estrutura terci aria formada por 8 -h elices, classicadas alfabeticamente (Figura 1), formando a estrutura compacta caracter stica da prote na [11]. Em 1958, Max Perutz e John Kendrew determinaram a estrutura da mioglobina por cristalograa de raios X. O dobramento ocorre de tal forma que quase todos os grupos polares encontram-se na parte externa da prote na, em frente ao ambiente aquoso. A mioglobina apresenta uma estrutura dobrada extremamente compacta devido ` a cadeia polipept dica, e com dimens oes de aproximadamente 4,5 x 2,5 nm [12]. N ao existe espa co livre na mol ecula devido ` as fortes liga co es que formam a estrutura compacta. Aproximadamente, 80% de seus res duos s ao encontrados em conforma co es -h elice [12]. A posi ca o do grupo heme e espectroscopicamente identicada devido ` a densa localiza ca o do atomo de ferro. Al em disso, a estrutura da mioglobina conrma o particionamento de cadeias hidrof obicas e hidrof licas. No interior da prote na existe um grupo prost etico denominado por grupo heme, circundado quase que inteiramente por res duos n ao-polares [13]. Dessa forma, os grupos hidrof obicos situam-se no interior da prote na, com consequente efeito hidrof obico desempenhando um papel efetivo na manuten ca o da estabilidade nativa dessa prote na. A mioglobina se liga ao oxig enio no tecido muscular por meio de um a tomo de ferro (Fe
2+

) de seu grupo prost etico (heme). A intera ca o do heme com a mioglobina n ao permite

que a oxida c ao do ferro ocorra, liberando sua a ca o para o transporte de oxig enio. O grupo heme e constituido por um anel de porrina ligado com Fe2+ , sendo respons avel pelas propriedades de liga ca o de oxig enio da mioglobina. O grupo heme se liga de forma n ao-covalente ` a mioglobina. O anel de protoporrina possui quatro a tomos de nitrog enio, conforme apresentado a ` Figura 2. O a tomo de ferro pode formar duas liga co es adicionais, um de cada lado do plano heme. Esses s tios de liga c ao s ao chamados, respectivamente de penta e hexa-coordena c ao. Na mioglobina, o quinto s tio de coordena ca o e ocupado pelo anel imidaz olico de um res duo de histidina na prote na. Essa histidina e denominada de

histidina proximal.

Figura 1: Representa c ao da cadeia glob nica e o grupo heme da mioglobina. Fonte: (Protein Data Bank (Brookhaven National Laboratory; http://www.rcsb.org/pdb), sob o c odigo 1MBO. Acessado em: 17 dez. 2011).

A hexa-coordena ca o ca, portanto, livre para se combinar ao oxig enio [1]. Adicionalmente, a Mb pode estar combinada ao oxig enio livre, denominando-se por oximioglobina, ou na forma na qual o oxig enio molecular encontra-se ligado, chamada ent ao por deoximioglobina. Apesar do processo de liga c ao revers vel do oxig enio ocorrer diretamente ao a tomo de ferro do grupo heme, a liga c ao do oxig enio pela mioglobina n ao ocorre de maneira cooperativa, como no pigmento quatern ario da hemoglobina [1]. A mioglobina apresenta uma alta anidade pelo oxig enio observado pelas curvas de liga ca o ou pers que s ao registrados na fra ca o de satura c ao do oxig enio (expressa como press ao parcial de oxig enio (pO2 )). A curva de liga ca o da mioglobina com o oxig enio e hiperb olica e rapidamente atinge o n vel de satura ca o, em torno de 30 torr [14]. Embora a fun c ao siol ogica da Mb n ao seja a de uma transportadora de el etrons, ela sofre o processo de oxido-redu ca o no mecanismo respirat orio. Portanto, essa rea ca o de transfer encia de el etrons desempenha um papel essencial nos processos biol ogicos. Isso faz da Mb um modelo para o estudo da eletro-transfer encia de rea co es de prote nas contendo grupo heme, biosensoriamento e eletrocat alise [15]. De modo geral, a eletroqu mica de Mb tem sido elucidada usando-se eletrodos de merc urio gotejante, bem como eletrodos de pasta de carbono e eletrodos de ouro quimicamente modicados [16].

Figura 2: Grupo prost etico heme, constitu do por um sistema protoporrina e um atomo de ferro central [1].

Como modelo, a mioglobina e uma prote na bastante empregada em estudos de rea co es de eletro-transfer encia devido 1) ` a facilidade de obten ca o, 2) ao custo moderado, 3) ` a estrutura qu mica conhecida, 4) a ` massa molecular relativamente baixa (cerca de 17,8 KDa), 5) ` a relativa facilidade de transfer encia de carga, e 6) a in umeros trabalhos descritos na literatura [11]. A transfer encia eletr onica direta entre a superf cie do eletrodo e a prote na, evitando etapas intermedi arias, constitui um biosensor de terceira gera ca o [15]. S ao v arios os m etodos de modica ca o da superf cie eletr odica para promover uma imobiliza ca o adequada do material biol ogico garantindo-se assim, a funcionalidade do sensor, com um tempo de vida maior. Para permitir a r apida transfer encia de el etrons, as mol eculas da prote na devem formar monocamadas sobre o eletrodo [7]. HU e coloboradores [16], visando melhorar a transfer encia de el etrons de Mb, relataram o uso de mediadores e promotores quimicamente modicados na elabora c ao de eletrodos. Estudos de eletroqu mica de Mb usando surfactantes, tais como membranas lip dicas e lmes polim ericos, demonstraram que esses materias podem aumentar a taxa de transfer encia de el etrons entre a prote na e a superf cie do eletrodo [15]. Exemplicando, a Figura 3 apresenta um ciclovoltamograma de Mb tratado com L-cys utilizando eletrodo de ouro modicado em tamp ao fosfato 0,1M pH 6,7 [2]. Outros estudos relatam que Mb incorporada em lmes polim ericos adsorvidos a eletrodos de grate pirol tico apresentaram picos ciclovoltam etricos quase revers vel para o Fe Mb (III) / Fe (II), demonstrando que a transfer encia de el etrons entre Mb e eletrodos de PG foi facilitada na presen ca de lme [15].

Eletroqu mica direta de Mb imobilizada foi tamb em descrita utilizando-se eletrodo do carbono v treo modicado com poros de s lica [16]. Picos redox correspondentes a redu c ao de Fe (III) para Fe (II) de Mb foram tamb em observadas [16]. Peng e colaboradores [15] utilizaram eletrodo de pasta de carbono modicada com nanopart culas magn eticas para promover a adequada imobiliza c ao de Mb, constitu do um biosensor em plataforma de detec ca o. Os autores atribu ram essa r apida transfer encia eletr onica a `s propriedades das nanopart culas magn eticas.

Figura 3: Ciclovoltamogramas (a) de eletrodo de ouro em solu c ao de Mb e L-cys,(b) eletrodo de ouro em tamp ao fosfato pH 6,7, (c) eletrodo de ouro e L-cys em tamp ao fosfato pH 6,7 (d), eletrodo de ouro e L-cys em solu c ao de Mb. Taxa de varredura 100 mV.s1 [2].

conhecido que a eletro-transfer E encia direta de Mb baseia-se na rea ca o de um el etron acoplado a um pr oton [16]. A eletro-transfer encia pode ser facilitada, dependendo da biomol ecula, de qual procedimento utilizado e da maneira como a prote na e imobilizada [15].

2.2

Voltametria

A voltametria e uma t ecnica eletroanal tica que se baseia em fen omenos que ocorrem na interface entre a superf cie do eletrodo de trabalho e a camada na de solu ca o adjacente uma t a essa superf cie [17]. E ecnica classicada como din amica. Essa t ecnica compreende um grupo de m etodos eletroanal ticos em que a informa c ao sobre o analito e observada por meio de medidas de corrente em fun c ao do potencial aplicado [4]. Um exemplo de processo eletroqu mico que ocorre na interface eletrodo-solu c ao est a representado na equa ca o abaixo:

Ox + ne Red

(2.1)

onde Ox e a forma oxidada, Red e a forma reduzida e ne o n umero de el etrons envolvidos no processo de oxido-redu c ao. A magnitude da corrente obtida pela transfer encia de el etrons durante um processo de oxiredu c ao pode ser relacionada com a quantidade de analito presente na interface do eletrodo e, consequentemente, na cela eletroqu mica. Dentre as t ecnicas voltam etricas, podem-se destacar a voltametria de varredura linear, a voltametria por pulso diferencial, a voltametria de onda quadrada, a voltametria c clica, a voltametria de redissolu ca o e a voltametria adsortiva de redissolu ca o [18]. A voltametria e muito utilizada na qu mica inorg anica, na f sico-qu mica e na bioqu mica para estudos fundamentais de processos de redu ca o e oxida c ao, processos de adsor c ao em superf cies e mecanismos de transfer encias de el etrons em superf cies de eletrodos quimicamente modicados. As aplica c oes anal ticas nas a reas ambiental, industrial e m edica, entre outras, s ao tamb em variadas [17]. A voltametria c clica e provavelmente uma das t ecnicas eletroqu micas mais vers ateis para o estudo de esp ecies eletroativas em solu ca o ou imobilizadas sobre eletrodos, fornecendo informa co es tanto quantitativas quanto qualitativas sobre o sistema. Isso tem resultado num extensivo uso da voltametria c clica nos campos da eletroqu mica. O voltamograma resultante fornece informa ca o de uma determinada esp ecie como fun ca o da varredura de potencial aplicado ao sistema [19] (cap. 3). Operacionalmente, inicia-se a aplica ca o do potencial a um valor no qual nenhuma rea ca o de oxiredu ca o ocorra (Figura 4), com a

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varia c ao desse potencial at e a promo ca o de uma transfer encia de carga entre o analito e a superf cie do eletrodo, gerando um pico de corrente proporcional ` a concentra ca o deste composto; quando o potencial tiver atingido um valor no qual nenhuma rea ca o de redu ca o ou oxida ca o ocorra, o potencial e varrido no sentido inverso, at e o seu valor inicial. O tipo de voltamograma gerado depende do tipo de mecanismo redox que o composto em quest ao sofre no eletrodo, o que faz da voltametria c clica uma ferramenta valiosa para estudos mecan sticos [20].

Figura 4: Ciclovoltamograma para sistema revers vel ([3], Fig. 9.3).

Existem dois componentes principais que determinam as rea co es que ocorrem na superf cie de um eletrodo: a transfer encia difusional de massa do analito em solu ca o para a superf cie do eletrodo, e a transfer encia heterog enea de carga entre o analito e o eletrodo; normalmente, podem ocorrer, tamb em, rea co es qu micas acopladas a alguns desses processos. Essas rela c oes podem ser expressas pela equa ca o de Butler-Volmer abaixo [4]:

i = A i0 exp

(1 )nF nF exp RT (E Eeq ) RT (E Eeq )

(2.2)

Nesse formalismo essencial da eletroqu mica, i representa a corrente que perpassa o eletrodo de trabalho (A); i0 corrente de troca (A/m2 ); E potencial do eletrodo (V); Eeq o

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potencial de equil brio (V); A, a area de superf cie do eletrodo (cm2 ); T, a temperatura absoluta (K); n, n umero de el etrons envolvidos na rea ca o; F, a constante de Faraday; R, a constante universal dos gases, e , o coeciente de transfer encia de carga. O valor de , normalmente entre 0,3 e 0,7 ( otimo em 0,5 para processos puramente revers veis), e representativo da barreira de energia de ativa c ao para um processo de simples transfer encia de el etron [19] (cap. 3). A corrente depende tanto do potencial operacional como da concentra ca o da superf cie de cada forma redox (oxida c ao-redu c ao). A Figura 5 mostra o potencial da corrente dependendo de cada caso de Co (0, t) = Cr (0, t) e = 0,50. Grandes potenciais negativos aceleraram o movimento de carga no sentido cat odico e tamb em desaceleraram o movimento de carga no sentido oposto. Como resultado, o componente an odico da corrente torna-se insignicante e a corrente se funde com o componente l quido cat odico. A acelera c ao e a desacelera c ao da corrente an odica e cat odica n ao s ao necessariamente sim etricas (como mostrado na Figura 5) e divergem para valores de diferentes de 0,5. Da mesma forma, nenhuma contribui c ao da corrente cat odica e observada no potencial positivo [4].

Figura 5: Potencial da curva corrente para o sistema O+ne/R, assumindo que a transfer encia de el etrons comporta- se: Co = Cr, e = 0,5. As linhas pontilhadas mostram os componentes Ic e Ia [4].

Quando uma cela eletroqu mica est a em equl brio, ic iguala-se a ia , correspondendo a ` corrente de troca i0 . Quando niveladas pela a rea de superf cie eletr odica (A), as correntes

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tornam-se, respectivamente, densidade de corrente (j) e densidade de corrente de troca (j0 ). A densidade de corrente de troca pode ser obtida por lineariza ca o da fun ca o de Butler-Volmer acima, e fornece resultados importantes , como o coeciente de heterogeneidade padr ao (Ks), ou a resist encia de transfer encia de carga (Rct ) [19] (cap. 3). Para uma rea ca o revers vel, ou seja, para uma rea ca o que ocorre com velocidade suciente para estabelecer um equil brio na interface, a equa ca o de Butler-Volmer (equa ca o 2.2) se reduz a ` equa c ao de Nernst (equa c ao 2.3), pois como a cin etica da rea c ao de transfer encia de carga e r apida (Ks menor 101 cm.s1 , onde Ks e o coeciente cin etico de heterogeneidade padr ao), apenas a etapa de transfer encia de massa ser a relevante para o processo.

E = E0 + (

2, 3RT C0 )log ( ) nF CR

(2.3)

A corrente do pico, nesse caso, e dada pela equa ca o de Randles-Sevcik abaixo [4]:

ip = (2, 69 105 )n3/2 ACD1/2 v 1/2

(2.4)

Onde n e o n umero de el etrons envolvidos no processo; A, e a a rea do eletrodo (cm2 ); D, e o coeciente de difus ao (cm2 s1 ); C, e a concentra ca o da esp ecie em solu c ao (mol.cm3 ); e , e a velocidade de varredura de potencial aplicado (V.s1 ). Portanto, nos processos limitados por difus ao, considera-se que a velocidade do processo de transfer encia de el etrons na superf cie est a em equil brio. Nesse caso, a corrente de pico (ip ) e proporcional a ` concentra c ao da esp ecie eletroativa, a ` raiz quadarda da velocidade de varredura, a `a rea do eletrodo, e ao coeciente de difus ao, conforme a equa ca o 2.4. Sistemas eletroqu micos podem comportar-se reversivelmente (RedOx) ou n ao (RedOx), o que incide diretamente no mecanismo de transfer encia de el etrons, bem como no formalismo empregado para a extra c ao de par ametros eletroanal ticos [3] (cap. 9). Existem v arios crit erios para diagnosticar se um sistema eletroqu mico comporta-se reversivelmente, dentre eles: 1) ip proporcional a ` raiz quadrada da velocidade de varredura;

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2) Ep independente da velocidade de varredura; 3) Ep de 28,5/n mV em 250 C; 4) Ep -Ep /2 de 56,5/n mV em 250 C, onde Ep /2 representa o potencial que confere metade da resposta m axima de corrente [21] (cap. 3). Em sistemas puramente irrevers veis, ou seja, aqueles em que a taxa de transfer encia de carga n ao e alta o suciente para manter o equil brio de reagentes e produtos pr oximos a ` superf cie do eletrodo segundo previsto pela rela ca o de Nernst (equa ca o 2.3, o equil brio de transfer encia de el etrons n ao ocorre. Dessa forma, a velocidade de transfer encia n ao mant em o equil brio das esp ecies eletroativas na superf cie do eletrodo. Com isso, a forma do voltamograma c clico e modicada, podendo ocorrer uma aus encia de pico na varredura reversa de potencial. Por em, essa caracter stica n ao signica que o sistema seja eletroquimicamente irrevers vel, pois uma rea ca o qu mica r apida acoplada ao processo de transfer encia eletr onica pode estar consumindo rapidamente a esp ecie formada na varredura direta. A corrente de pico cat odica do voltamograma para sistemas irrevers veis e dada por:

ip = 2, 99 105 (n)1/2 ACD1/2 v 1/2

(2.5)

Os principais crit erios eletroqu micos para detectar um sistema irrevers vel s ao: 1) aus encia de pico na varredura reversa de potencial; 2) ip proporcional a ` raiz quadrada da velocidade de varredura ( 1/2 ) e ao valor de ; 3) altera c ao em Ep de 30/n(mV) para varia c ao a cada d ecada em ; 4) Ep de 48/nF mV em 250 C [21] (cap. 4). Para um sistema quase-revers vel (com Ks entre 101 e 105 cm/s [19] (cap. 3)), a corrente e dada pela transfer encia de carga e transporte de massa. A forma do voltamo grama e uma fun ca o de Ks aD, onde a =nF /RT. Quando Ks aD aumenta, o processo se aproxima de um caso revers vel. Para pequenos valores de Ks (ou seja, v e r apido), o sistema exibe um comportamento irrevers vel. Em geral, o voltamograma de um sistema quase-revers vel e mais denido e exibe uma grande dist ancia entre os picos dos potenciais, se comparados com um sistema revers vel [4]. A Figura 4 representa a forma de aplica ca o do potencial na voltametria c clica, em que o potencial e varrido linearmente com o tempo no eletrodo de trabalho estacion ario,

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em uma solu ca o sem agita c ao, usando-se um potencial em forma de tri angulo. Durante a varredura do potencial, o potenciostato mede a corrente resultante versus o potencial aplicado. Por em, o potencial e aplicado na forma de escada, com degraus de potenciais pequenos (da ordem de 10 mV) e tempo de dura c ao pequena (50 ms), em que a corrente e lida apenas no nal desse intervalo. O objetivo dessa varia ca o e conseguir minimizar a contribui ca o da corrente capacitiva, que e a corrente necess aria para carregar a dupla camada el etrica existente na interface eletrodo-solu ca o, na corrente total. Como as etapas de potencial s ao pequenas, as equa co es para as respostas da voltametria c clica s ao consideradas como id enticas ` as provenientes da voltametria c clica de varredura linear [19] (cap. 3).

2.2.1

Voltametria de prote nas

A voltametria vem sendo utilizada como ferramenta de an alise para o estudo direto de prote nas desde 1950. No entanto, at e o nal da d ecada de 1980, esses estudos eram direcionados para a an alise qualitativa de metaloprote nas, ou seja, na caracteriza ca o da transfer encia de el etrons entre o centro redox (met alico) da prote na e o eletrodo [22]. Neste sentido m etodos voltam etricos v em sendo cada vez mais utilizados para estudar prote nas com centro redox ativo. Estudos pr evios utilizando m etodos voltam etricos tornaram-se primordiais na determina ca o de potenciais redox em s tios de prote nas. E sabido que, com eletrodos adequados, transportadores de el etrons, tais como citocromos, ferredoxinas e prote nas contendo cobre, ferro, e enxofre entre outros elementos, resultam em respostas eletroqu micas revers veis [23]. Investiga c oes da eletroqu mica de prote nas e de enzimas podem fornecer um bom modelo para estudos sobre a elucida c ao dos mecanismos de transfer encia de el etrons entre essas biomol eculas em sistemas biol ogicos. As realiza co es de transfer encia direta de el etrons entre os eletrodos e o centro redox de enzimas tamb em t em sido aplicadas a biosensores e biorreatores de enzima [24]. Grandes esfor cos t em sido feitos em eletroqu mica de prote na e m etodos con aveis est ao sendo desenvolvidos para aumentar a eletro-transfer encia entre os eletrodos e prote nas. Esses estudos tem resultado em uma melhor transfer encia eletr onica dos centros redox

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proteicos, por incorpora ca o a lmes modicados na superf cie do eletrodo, como monocamadas auto-organizadas (SAMs) de mol eculas, lmes de surfactante, lmes de lip dios, lmes de pol meros eletroativos, lmes de materiais sol-gel, entre outros [25]. Eletrodos enzim aticos combinam a especicidade de uma enzima a um sistema eletroqu mico poss e t em sido usados para a detec c ao de v arios analitos. E vel monitorar eletroquimicamente essas concentra co es, num intervalo devidamente pr e-estabelecido da enzima imobilizada na superf cie do eletrodo [26]. Na superf cie do eletrodo pr oxima a ` prote na ocorrem dois processos distintos. Inicialmente, o el etron tem que ser transferido da enzima para o substrato para formar o produto (transfer encia de el etrons), seguindo-se a redu c ao do produto sintetizado (transfer encia de el etrons eletroqu mica). Normalmente, a transfer encia eletroqu mica de el etrons eo passo limitante e desempenha um papel crucial na transfer encia cin etica de el etrons (processos irrevers veis ou quase-revers veis) [27]. A maioria das prote nas n ao exibe eletrotransfer encia direta na superf cie do eletrodo. Estudos de eletroqu mica direta de prote nas t em sido o foco de in umeros trabalhos, mas poucas delas s ao providas de eletroqu mica direta em condi c oes experimentais otimizads, mesmo com o r apido desenvolvimento da tecnologia na superf cie e com o conhecimento atual de eletrodos quimicamente modicados [23]. As prote nas apresentam um problema especico para a eletroqu mica uma vez que, devido a sua intera ca o com os tipos mais comuns de superf cies de eletrodos, n ao produzem respostas eletroqu micas signicativas [24]. Al em disso, o processo de eletro-transfer encia direta entre a superf cie do eletrodo e o centro redox de prote nas, sem modica c ao do sensor, e dicultada devido a v arios fatores, tais como: a desnatura ca o e adsor c ao de prote nas sobre eletrodos, as orienta c oes desfavor aveis no eletrodo, e passiva ca o gradual da superf cie eletr odica [27], centros redox met alicos (grupos prost eticos) imersos na estrututa polipept dica, portanto distantes da camada favor avel para transfer encia de carga a ` superf cie de eletrodos, e intera c oes com solvente e solu c ao eletr olito [3] (Cap. 17).

N ao obstante, s ao variados os trabalhos que utilizam eletrodos n ao modicados em voltametria direta de prote nas. Exemplicando, eletrodos de membrana de celulose, constru dos com membranas de di alise com variados limites de exclus ao e cargas, foram

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utilizados para investigar o comportamento eletroqu mico de diversas prote nas, como Hb, citocromos, e citocromo c [28]. Foram analisados diversos fatores, tais como o tratamento da membrana, efeito de carga, esp ecies positivas, for ca i onica, pH, efeito da espessura da camada. Esse estudo demonstrou que a eletroqu mica do citocromo c no eletrodo de membrana foi essencialmente regida por intera co es eletrost aticas favor aveis, e que outros fatores (especialmente adsor c ao e a presen ca de formas desnaturadas) n ao desempenharam um papel dominante. Um dos principais objetivos da modica ca o de eletrodos em voltametria direta de prote nas e melhorar a capacidade de reconhecimento e amplicar sinais de corrente, aumentando tamb em a seletividade do analito pelo efeito eletrocatal tico induzido pelo modicador [16]. Prote ns tais como mioglobina (Mb), hemoglobina (Hb) e peroxidase s ao as mais estudadas em voltametria direta. Qial (et al.) identicaram um signicativo aumento da transfer encia de el etrons entre as prote nas e eletrodos modicados, quando comparado a ` tranfer encia de carga de prote nas em solu c ao. Esses autores incorporaram duas heme prote nas (hemoglobina e mioglobina) em micelas de lecitina para formar lmes comp ositos em eletrodos de pasta de carbono, e conclu ram que esses lmes apresentam r apida transfer encia de el etrons [29].

2.2.2

Voltametria de prote nas imobilizadas na superf cie do eletrodo

A produ ca o de sensores eletroqu micos e uma das a reas de maior e mais r apido crescimento dentro da Qu mica, principalmente devido aos novos desaos impostos por amostras de interesse industrial, cl nica e ambiental, e que tem levado ` a crescente busca por sensores de melhores caracter sticas, tais como alta sensibilidade, seletividade e estabilidade [30]. A maior propor c ao de trabalhos reportados na literatura enfatiza a eletroqu mica direta de prote nas imobilizadas na superf cie de eletrodo e os mecanismos de transfer encia eletr onica. A realiza ca o de transfer encia direta de el etrons, evitando o uso de mediadores e promotores, tem sido aplicada aos biosensores de terceira gera ca o, tais como camadas auto-organizadas (SAMs). Nesse sentido, tem-se observada a forma ca o espont anea de uma camada polim erica auto-organizada em substrato a urico, resultando em uma

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estrutura ordenada e orientada [31]. A natureza da liga ca o tem sido correlacionada ` a quimiossor ca o na superf cie do ouro, por liga co es com car ater covalente, com consequente aumento da estabilidade das monocamadas formadas [31]. A aplica ca o de modica ca o eletr odica tem sido muito explorada, visto que monocamadas bem organizadas e compactas oferecem vantagens tais como seletividade, sensibilidade, curto tempo de resposta e potencial reduzido em aplica c oes eletrocatal ticas. A literatura t em demonstrado que a modica ca o da superf cie eletr odica pode afetar sensivelmente a velocidade de transfer encia eletr onica entre compostos eletroativos e o eletrodo [32]. A aplica ca o de SAMs em eletroqu mica tem sido muito explorada, visto que monocamadas bem organizadas e compactas oferecem vantagens tais como seletividade, sensibilidade, curto tempo de resposta e potencial reduzido em rea c oes eletrocatal ticas [32]. Nesse sentido, Sato et al. evidenciaram a resposta redox de Mb utilizando eletrodo de pasta de carbono modicado com oxido de poli-etileno (PEO) [33]. Imobiliza ca o de Mb e Hb utilizando pol mero hidrof lico foi utilizada por Forero et. al [34] no desenvolvimento de biosensores. Nesse estudo, foram utilizadas duas t ecnicas distintas de imobiliza c ao. A t ecnica de adsor c ao apresentou alta resposta de imobiliza c ao de Mb, e os autores atribu ram essa reposta a ` intera c ao com o pol mero de DMAEM-dimetiletil amino metacrilato. Xie et al. [35] investigaram a atividade eletroativa de Mb utilizando o copol mero o xido de polipropileno, com a forma c ao de um lme na superf cie do eletrodo. Com as t ecnicas de voltametria c clica e com microbalan ca de cristal de quartzo, os pesquisadores caracterizaram o biosensor, que exibiu exibiu picos revers veis e boa atividade catal tica [35]. O uso de promotores pode ser utilizado para aumentar a taxa de transfer encia de el etrons entre as prote nas e a superf cie de eletrodos. Assim, Zang et al. [27] investigaram a transfer encia direta de el etrons de catalase imobilizada em uma na pel cula de s lica de sol-gel na superf cie do eletrodo de ouro, e monitoramento na presen ca de L-ciste na. Os eletrodos modicados podem ser fabricados de forma f acil e simples em uma u nica etapa. Varma (et al.) realizaram um estudo da cin etica de catalase, com eletrodo de Pt modicado com celulose e PTFE (politetrauoretileno) utilizando a t ecnica de voltametria c clica (CV). Os autores concluiram que a eletro-transfer encia ocorreu de maneira satisfat oria, refor cando o conjunto de trabalhos que apresentam o uso de media-

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dores como de signicativa import ancia para viabilizar ou otimizar o desenvolvimento de diversos biosensores [26].

2.3

T ecnicas de Imobiliza c ao de Prote nas

At e a metade da d ecada de 70, grande parte dos eletrodos utilizados em voltametria consistiam de eletrodos convencionais como platina, merc urio, ouro e carbono, desprovidos de modica co es superciais [30]. As principais desvantagens encontradas envolviam fen omenos de adsor c ao do analito na superf cie do eletrodo, baixas velocidades de algumas rea co es eletroqu micas, e o alto custo desses materiais nobres para aplica ca o pr atica em larga escala. Vericou-se, posteriormente que essas desvantagens poderiam ser controladas, favorecendo assim o desenvolvimento de eletrodos quimicamente modicados para v arias aplica co es. O desenvolvimento de eletrodos quimicamente modicados (EM) tem sido de crescente interesse nas a reas de ci encias e tecnologia, com utiliza c ao em diversos campos, tais como: eletrocat alise, s ntese org anica, convers ao de energia solar, cin etica de transfer encia de el etrons, permea ca o de membranas e sensores qu micos [30]. Uma variedade de m etodos tem sido ent ao empregada na modica ca o de eletrodos, dentre as quais destacam-se 1) aplica ca o de lmes polim ericos na superf cie do eletrodo, alterando as propriedades de transporte, 2) utiliza ca o de materiais biol ogicos junto ` a superf cie do eletrodo, 3) mediadores que favore cam a transfer encia de el etrons ` a superf cie do eletrodo [36], entre outros. S ao diversas tamb em as varia co es experimentais para a aplica ca o de tais procedimentos. A principal vantagem dos lmes polim ericos, por exemplo, reside no fato de que os mesmos podem tamb em atuar como barreira para excluir interferentes, como Naon para a determina ca o mutuamente exclusiva de dopamina sem a interfer encia de a cido asc orbico [36]. Da mesma forma, h a uma variedade de m etodos para imobiliza ca o de prote nas em superf cie de eletrodos. Dentre os procedimentos mais comuns destacam-se 1) a adsor c ao f sica, 2) a liga ca o covalente (cross-linking ), e 3) a liga ca o covalente cruzada com matriz polim erica, e 3) o encapsulamento em matrizes, entre outros. A escolha do melhor m etodo depende de v arios fatores, como solubilidade, estabilidade, temperatura e aplicabilidade do produto [5]. A Figura 6 exemplica as principais t ecnicas de imobiliza ca o.

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Figura 6: Representa c ao esquem atica das principais t ecnicas de imobiliza c ao (adaptado da refer encia) [5].

2.3.1

Adsor c ao F sica

A adsor c ao f sica envolve a adsor ca o de mol eculas em suportes insol uveis que resulta em intera co es do tipo polar, i onica, Van der Waals, liga co es de hidrog enio ou hidrof obicas. A adsor ca o e um m etodo bastante simples, mas geralmente e pouco utilizada devido ao fato de proporcionar aparatos pouco sens veis. Pode tamb em envolver perda de material e tempo de vida muito curto do biosensor, pois a uni ao e considerada fraca [19] (cap. 3).

2.3.2

Filmes delgados

A imobiliza ca o de esp ecies moleculares sobre o sensor por t ecnicas citadas pode levar ao recobrimento de uma ou, no m aximo, poucas monocamadas (SAMs). Dessa forma o recobrimento com lmes polim ericos t em sido amplamente utilizado por permitir a imobiliza ca o de camadas da biomol ecula, resultando no aumento da resposta eletroqu mica. De acordo com a aplica ca o desejada, os pol meros inertes, quimicamente ativos e ou pol meros eletroativos podem ser utilizados [37].

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2.3.3

Microencapsulamento

Nesse m etodo, o biomaterial e connado entre membranas, cando a biomol ecula aprisionada dentro de uma matriz polim erica. Essa t ecnica e tamb em apropriada para processos que envolvam substratos e produtos de baixo peso molecular apresentando problemas para substratos e produtos de maiores pesos moleculares. Esse processo pode ser puramente f sico ou envolver liga c oes covalentes [16].

2.3.4

Liga c ao Covalente

A imobiliza ca o e realizada por meio de liga co es covalentes de grupos funcionais n ao reativos e de grupos funcionais reativos (hidroxila, amino, fen olico) ligados a ` superf cie do suporte. A desvantagem desse tipo de imobiliza c ao e que ela provoca estresse na prote na, podendo causar altera co es conformacionais, que resultam em perda de atividade catal tica. Complementarmente, essa t ecnica apresenta in umeras vantagens, como forte liga ca o entre a prote na e o suporte; aumento de estabilidade t ermica; menor susceptibilidade a problemas decorrentes de varia co es recorrentes de pH, solvente e temperatura [19] (cap. 3). Adicionalmente, podem ser utilizados reagentes bifuncionais como, por exemplo, gluteralde do, que reage com o grupo amino, formando liga c oes cruzadas o que permite a imobiliza ca o de biomol eculas na superf cie polim erica [5]. As liga c oes cruzadas de prote nas geralmente levam a ` forma c ao de lmes proteicos com propriedades de hidrogel. Quando liga c oes covalentes s ao incorporadas ao hidrogel, um lme compacto e est avel e formado. Para forma c ao do lme, carbodiimidas s ao geralmente utilizadas, onde se unem com aminas prim arias resultando na forma ca o de liga c oes imidas [36]. Portanto, essa imobiliza ca o consiste na forma ca o de liga co es qu micas cruzadas entre os grupos amino do suporte, e com os grupos amino das biomol eculas [7].

2.4

Copol meros sint eticos

Pol meros s ao materiais constitu dos a partir de unidades repetidas de mon omeros, originando um composto com alto peso molecular. Os pol meros podem ser obtidos de forma natural ou sint etica. Copol meros s ao pol meros constitu dos de diferentes unidades

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de repeti ca o, e s ao divididos em uma classes de acordo com a forma em que as diferentes unidades de repeti ca o s ao distribu das nas cadeias polim ericas [3] (cap. 17). Os pol meros oferecem grande potencial no desenvolvimento de materiais com propriedades importantes de seletividade e de sensibilidade. Pol meros s ao foco de intensa pesquisa, como pol meros condutores, com propriedades eletr onica e eletroqu mica est aveis [38]. Os pol meros condutores s ao bastante utilizados em rea co es que envolvem transporte de carga, no qual s tios do mon omero oxidado se difundem por interm edio do lme polim erico. Os lmes polim ericos bem aderidos podem ser formados na superf cie de eletrodos, como platina e ouro em experimentos eletroqu micos [38]. Entre os materiais polim ericos, destacam-se os copol meros em bloco que s ao pol meros formados pela presen ca de dois ou mais blocos em uma cadeia polim erica. Nesse caso, cada bloco e formado por uma sequ encia espec ca de repeti c ao de um ou mais tipos de mon omeros [39]. Existem in umeras t ecnicas desenvolvidas para a s ntese de copol meros em bloco por meio de mecanismos de crescimento de cadeias, e que podem ser realizados sem a ocorr encia de etapas indesejadas. Dentre as t ecnicas mais empregadas, podem-se destacar a Polimeriza c ao I onica, a Polimeriza c ao Radicalar Livre (Free Radical Polimerization, FRP) e a Polimeriza ca o Radicalar Controlada (Controlled Radical Polimerization, CRP). A s ntese por CRP pode ser realizada por meio de algumas variantes t ecnicas conhecidas como Transfer encia At omica Revers vel (ATRP), Polimeriza ca o Mediada por Nitr oxido (NMP) e Transfer encia Revers vel de Cadeia por Adi c ao-Fragmenta ca o (RAFT) [40].

2.4.1

Pol meros RAFT

A ci encia vem estudando mecanismos de produ ca o de novos materiais, pela demanda tecnol ogica exigida, como por exemplo, materiais nanotecnol ogicos de baixo custo, e com capacidade funcional e reprodut vel. Nesse contexto, os pol meros destacam-se como os mais promissores para aplica co es em areas que v ao desde a fabrica c ao de nanodispositivos at e os biomateriais [41]. Um m etodo bastante utilizado para a produ ca o de materiais polim ericos e a polimeriza ca o radicalar livre (FRP), considerada uma polimeriza ca o por condensa ca o. Ela se baseia na propriedade de subst ancias que apresentam insatura co es

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ativas para reagir em cadeia por via radicalar, formando os as estruturas polim ericas. Essa t ecnica e bastante eciente para a produ ca o de pol meros das mais diversas massas molares. Esse m etodo tamb em fornece uma alta polidispersidade, embora com limitada produ ca o dos copol meros. A FRP apresenta vantagens, entre suas vantagens, o baixo custo dos materiais utilizados e a facilidade da s ntese. A polidispersidade, considerada como a diferen ca entre as massas molares das cadeias polim ericas, resulta da velocidade com que as cadeias s ao formadas e terminadas (em poucos segundos), em compara c ao ao tempo total da polimeriza ca o, que e um processo lento [42]. Outra desvantagem desse m etodo consiste na diculdade em se produzir um copol mero com propriedades denidas. Visto que a rea ca o de polimeriza ca o ocorre com a presen ca de mais de um mon omero no meio de s ntese, torna-se necess ario determinar a concentra c ao e a reatividade do mon omero, para que seja poss vel conhecer a composi c ao do copol mero. Por interm edio da FRP n ao e poss vel forma ca o de copol meros em blocos, devido ao fato de que as cadeias terminadas n ao permitem a adi ca o de outras cadeias, n ao sendo vi avel a reinicializa ca o da s ntese por via radicalar [42]. Devido a `s peculiaridades dos materiais polim ericos, a capacidade de caracteriza c ao completa tem import ancia vital para as t ecnicas de s ntese de pol meros. Para a caracteriza c ao de pol meros e crucial a determina ca o de par ametros tais como: a massa molar m edia, o grau de ramica ca o, a proporcionalidade entre os mon omeros. Portanto, e necess ario determinar os par ametros estruturais dos produtos obtidos da s ntese, objetivando-se correlacionar tais par ametros com suas propriedades em n vel micro ou macrosc opico. A caracteriza ca o de um copol mero se faz por intermedio da determina c ao de seu grau de polimeriza ca o, que e proporcional a ` sua massa molar; em outras palavras, quanto maior a massa molar, maior e o n umero de mon omeros na cadeia do copol mero e, consequentemente, maior e a polimeriza c ao da cadeia [43]. A literatura tem abordado a necessidade de uni ao entre t ecnicas avan cadas de s ntese controlada de pol meros, t ecnicas de caracteriza ca o dos mesmos e estudo de agrega c ao em solventes seletivos. Assim, tem-se buscado agregar informa c oes a respeito do comportamento de um copol mero espec co em solu c ao. Essas informa c oes fornecem as bases para as rela co es que regem a depend encia das propriedades do copol mero com sua estrutura, possibilitando a previs ao das propriedades de um material polim erico, pela an alise da

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estrutura qu mica das cadeias dos copol meros que o formam e, portanto, contribuindo para o desenvolvimento da ci encia e tecnologia dos materiais [44]. A qu mica dos pol meros teve um salto com o in cio das t ecnicas de polimeriza ca o radicalar controlada (CRP), que busca suprir as falhas da FRP. Essas t ecnicas atuais s ao, via de regra, essenciais para a s ntese pol meros variados, pois permite controlar as rea co es de polimeriza ca o. Tendo em vista essa nova situa ca o, tornou-se crescente o estudo da s ntese de pol meros, visto a evolu ca o de t ecnicas Polimeriza ca o Radicalar Controlada (PRC) e o avan co de t ecnicas de caracteriza c ao, permitindo a obten ca o dos mais variados pol meros, para as mais diversas aplica co es, tais como: materiais m edico-hospitalares, dispositivos eletr onicos, dispositivos o pticos e aplica co es tecnol ogicas. A variante de PRC considerada mais ecaz e a RAFT (Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer ). A t ecnica RAFT baseia-se em uma rea c ao de polimeriza c ao radicalar na presen ca de agentes de transfer encia de cadeia, fazendo com que as cadeias polim ericas cres cam de forma controlada, de maneira similar ao que ocorre na polimeriza c ao por adi c ao [45]. Com o avan co dessas t ecnicas tornou-se poss vel sintetizar copol meros com diversas estruturas e com peso molecular desejado. Embora muito se conhe ca sobre as utilidades dos copol meros anf licos obtidos por RAFT, tais como estabiliza ca o de emuls oes, remo c ao de agentes oxidantes e/ou poluentes, e incorpora ca o de f armacos para sua libera ca o em tecidos alvos, pouco se conhece sobre o seu uso em t ecnicas eletroanal ticas [6]. Para a s ntese de copol meros, empregando-se a t ecnica de Polimeriza ca o Radicalar Controlada (CRP) utilizando RAFT, e necess ario o uso de agentes de transfer encia de cadeia (CTA), sendo o mais utilizado o ditiobenzoato de cumila (DTBC) [45]. Quando um dibloco AB de um copol lmero, ou tribloco ABA desse pol mero e dissolvido em solvente espec co, e atua como solvente apropriado para o bloco A e n ao apropriado para o B, as mol eculas do copol mero podem se juntar e formar micelas. Estudos de micela ca o de blocos de copol meros hidrof licos-hidrof obicos tem recebido destaque na literatura pois, devido a `s suas propriedades espec cas, podem ser aplicados no ambito tecnol ogico [40].

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2.4.2

Copol mero PMMA-block-PDMAEMA

PDMAEMA (poli-2-dimetilaminoetil metacrilato) e um pol mero funcional que apresenta carga positiva em pH baixo (Figura 7). Copol meros com blocos de PDMAEMA geralmente apresentam miscibilidade em meio aquoso em fun c ao do valor de sua temperatura cr tica inferior de solu ca o (LCST) [46]. A solubiliza ca o do copol mero em agua, regulada pela mudan ca na energia livre de Gibbs, pode ser ent ao comprometida acima dessa temperatura [46]. Rela co es capazes de prever o comportamento de pol meros com base em sua estrutura qu mica s ao necess arias para a s ntese de materiais com propriedades desejadas [6]. As propriedades f sico-qu micas dos sistemas baseados em pol meros do tipo PDMAEMA, com utiliza ca o resultante em sistemas coloidais especializados, est ao intimamente ligadas a ` estrutura qu mica dos materiais que os formam, ou seja, ` as propriedades qu micas, a `s intera co es entre as cadeias e a `s formas de agrega c ao em solu ca o dos pol meros [6]. Os copol meros PDMAEMA podem ser formados por blocos de diferentes polaridades, apresentando car ater anf lico, justicando-se o crescente interesse por seu estudo [39].

Figura 7: Estrutura qu mica do PMMA-b-PDMAEMA sintetizado pela t ecnica de RAFT [6].

Baines et al. investigaram a miceliza c ao de blocos de copol meros com car ater hidrof obico/hidrof lico utilizando poli-2-dimetiletil metracrilato (PDMAEMA) em maior propor ca o e car ater hidrof lico, e poli-metilmetacrilato (PMMA) em menor propor ca o e hidrof obico. Segundo os autores, esses copol meros em bloco tem capacidade de for-

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mar micelas. Esse estudo sugeriu a exist encia de intera co es repulsivas entre as cadeias hidrof licas cati onicas de PDMAEMA, e que desempenham papel fundamental na determina ca o do tipo da associa c ao existente. Os autores determinaram o efeito de carga por protona ca o do componente DMAEMA em HCl, e perceberam que quando PDMAEMA e completamente ionizado, se comporta como um polieletr olito cati onico. An alises de ultracentrifuga c ao mostraram que a presen ca de um sal (KCl) pode controlar a repuls ao de cargas, favorecendo a miceliza c ao [47]. Gohy et al. estudaram as intera co es existentes entre o pH da solu ca o e blocos do copol mero PMMA-b-PDMAEMA, levando-se em considera c ao a constante de dissocia ca o do pol mero, com valor de pKa de 6,6 para PDMAEMA. Esse valor e relativamente baixo para resultar em altera ca o conformacional da cadeia, com resultante estabiliza ca o do grupo amina por uma carbonila [40]. O homopol mero PDMAEMA tem um comportamento mais acido com o aumento do grau de protona c ao, devido ` as repuls oes de cargas positivas ao longo da cadeia. Existem dois processos respons aveis pela organiza ca o molecular do pol mero: a intera ca o eletrost atica e a intera c ao hidrof obica. Em pH acima ou abaixo do ponto isoel etrico, n ao h a efeito signicativo no tamanho dos agregados [40]. A capacidade do copol mero PMMA-b-PDMAEMA em formar micelas em solu ca o aquosa e em pH acima de 6,0 foi determinada por Lee et al.. Em meio a cido, os grupos amina da cadeia lateral est ao protonados, favorecendo o car ater hidrof lico do copol mero, permitindo que o pol mero se comporte como um polieletr olito. Por conseguinte, a adi ca o de base faz com que o bloco DEAEMA se torne hidrof obico. Acima do pH cr tico, o copol mero agrega formando micelas [42]. Entre as aplica c oes do pol mero PMMA-bPDMAEMA, destacam-se sua atividade antibacteriana, homeost atica e antitumoral, al em de aplica c oes potenciais em a reas do meio ambiente, drogas, sensores, tintas, membranas [48]. Entretanto, n ao foi encontrado aplica c ao de um pol mero RAFT tal como PMMA-bPDMAEM como substrato para a elabora c ao de biosensores, tal como o pretendido nesse trabalho.

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Justicativa

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Copol meros de s ntese radicalar controlada por RAFT constituem compostos de variada aplicabilidade tecnol ogica e industrial. Compostos dessa natureza tem chamado aten ca o recente devido ` a possibilidade de desenvolvimento de estruturas polim ericas com massa molecular, arquitetura e composi c ao previs veis a partir condi c oes experimentais ex veis. Essa variabilidade estutural e funcional ajust avel na s ntese de copol meros RAFT pode permitir sua aplica c ao in edita na elabora ca o de biosensores espec cos para mol eculas alvo de interesse biotecnol ogico. Nesse sentido, pretendeu-se nesse trabalho avaliar o potencial uso de um pol mero RAFT, o copol mero PMMA-bloco-PDMAEMA, para o estudo de voltametria direta de transfer encia de carga de mioglobina como prote na modelo, imobilizada em lme polim erico a ` superf cie de eletrodo de ouro.

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Objetivos

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4.1

Principal

Estudar a transfer encia de carga de mioglobina imobilizada em copol mero RAFT de PMMA-b-PDMAEMA por voltametria c clica.

4.2

Espec cos

1. Determinar a pureza da amostra de mioglobina por espectrofotometria; 2. Modicar a superf cie de eletrodo de ouro visando a ` imobiliza ca o de grupos funcionais de PMMA-b-PDMAEMA; 3. Imobilizar a Mb na superf cie do eletrodo de ouro modicada por PMMA-b-PDMAEMA (Mb/PMMA-b-PDMAEMA); 4. Realizar ensaios de voltametria c clica de Mb/PMMA-b-PDMAEMA; 5. Determinar par ametros cin eticos de transfer encia de carga de Mb/PMMA-b-PDMAEMA; 6. Estudar o comportamento do complexo Mb/PMMA-b-PDMAEMA em diferentes faixas de pH; 7. Avaliar a atividade catal tica de Mb/PMMA-b-PDMAEMA sobre H2 O2 ; 8. Determinar par ametros termodin amicos associados a ` transfer encia de carga de Mb/PMMAb-PDMAEMA; 9. Avaliar a estabilidade e reprodutilidade de Mb/PMMA-b-PDMAEMA.

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Metodologia

31

5.1

Reagentes

A mioglobina utilizada foi de sangue equino, marca Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), lote 04447006). Acetona (C3 H6 O), teve proced encia da empresa Merck Co. (99,00% de pureza) e gluteralde do, (C5 H8 O2 ), proced encia Sigma, 25,00% de pureza. PMMA-b-PDMAEMA foi cedido pelo Prof. Dr. F abio Herbst Florenzano, do Laborat orio de Bioqu mica da UNIFAL-MG, sem purica ca o posterior. A s ntese do pol mero PMMA-block-PDMAEMA foi realizada por Florenzano ,em que foram utilizados metacrilato (MMA) 99% adquirido da Sigma-Aldrich, DMMEMA 98% adquirido da SigmaAldrich e per oxido de benzo la (BPO) obtido da Vetec Brazil. Resumidamente, essa foi realizada por um bloco de PMMA, seguindo-se utiliza c ao de reagente BPO como iniciador. Os blocos de PMMA foram puricados por precipita ca o em metanol e secagem em v acuo. Esses blocos de PMMA foram posteriormente utilizados como agentes de transfer encia de cadeia de macro (macroCTAs) em uma copolimeriza ca o usando DMAEMA como mon omero e BPO como iniciador. Os copol meros resultantes foram puricados por precipita ca o em n-hexano. Os produtos foram conrmados por 1 H-RMN (Bruker INOVA DPX300 espectr ometro). Demais reagentes para elabora c ao de solu c ao eletr olito, solu ca o tamp ao, padr ao de calibra ca o do sistema potenciostato-galvanostato e espectrofot ometro, foram de grau anal tico. Foi utilizado como eletr olito suporte uma solu c ao tamp ao de fosfato de s odio 0,1 molL1 em pH 7,4, preparada por dissolu c ao dos sais na a gua e ajuste de pH. O sistema potenciostatogalvanostato foi calibrado com solu c ao de ferro/ferricianeto de pot assio 10 mmolL1 em 0,5 molL1 de KCl.

5.2

Equipamentos

Potenciostato/galvanostato PG-39MCSV, Omni Metra Instrumentos Cient cos Ltda

(Nova Friburgo, Rio de Janeiro);

Ultrasom Ultracleaner 1400 UNIQ modelo usc -1400;

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Miniagitador magn etico processado Quimis Q221M; Balan ca anal tica KERN 410; Espectrofot ometro Biochrom Libra S22; Banho ultratermost atico com circula ca o Quimis (modelo Q214-S); Term ometro digital Minipa MT600 com sa da RS232; pHmetro - Marte Brasil MB-10, s erie: 126431701.

5.3

Calibra c ao do sistema potenciostato-galvanostato

O sistema PG-39MCSV foi calibrado empregando-se o registro el etrico e qu mico do sinal de corrente obtido em ensaios distintos. Para o primeiro, foram conectadas as extremidades das garras RE1-WE e RE2-CE um resistor de 100 , seguindo-se a rampa linear de -0,1 a +0,1 V a 100 mV.s1 . Para a calibra c ao qu mica, foram empregados 5 ml de solu ca o de ferricianeto de pot assio 10 mM em KCl 0,5 M, seguindo-se a imers ao da superf cie de contato dos eletrodos de trabalho (pasta de carbono e carbono v treo), auxiliar (platina) e de refer encia (Ag/AgCl), pr oximos um do outro, e monitoramento do sinal eletroqu mico. Este foi obtido por voltametria c clica a 200 mV.s1 e faixa de -0,2 a +0,6 V. O sinal de reversibilidade caracter stico foi utilizado como crit erio para an alises param etricas dos eletrodos, como potencial de pico an odico e cat odico.

5.4

Cela Eletroqu mica

O eletrodo de trabalho foi elaborado em corpo v treo, e a superf cie utilizada consistiu de discos de Au (marca Sigma-Aldrich-265802, 99,9% de pureza) 2 mm de di ametro e 0,5 mm espessura. Tamb em foram utilizados discos de 5 mm de di ametro e 0,5 mm de espessura obtidos e confeccionados por ourives local, a partir de lingotes de ouro de 2 g (99 % pureza). Cada disco foi soldado com solda de prata a o de cobre de 2 mm de espessura e 10 cm de comprimento, conforme a Figura 8. Os ensaios, utilizando-se o eletrodo de trabalho, foram precedidos por otimiza ca o da aquisi ca o de sinal eletroqu mico por voltametria c clica, na solu c ao eletr olito de ferro/ferricianeto de pot assio, at e a obten ca o de um voltamograma est avel e revers vel com Ipa/Ipc pr oximo

33

Figura 8: Eletrodo de trabalho utilizado durante os experimentos.

a ` unidade. O eletrodo de refer encia de Ag/AgCl foi constru do em corpo v treo colocado sobre uma ponteira pl astica de 1 ml. Ao corpo, foi axado um o de prata (marca SigmaAldrich-267430, 99,99% de pureza) de 5 mm de di ametro, 5 cm de comprimento e 0,5 mm de espessura, utilizando-se resina Epoxi (Araldite ) polimerizada com 20 L de HF. O o de prata foi anodizado por cronoamperometria a um potencial de 0,5 V durante 300 s, em c elula eletrol tica contendo KCl 3 mol.L1 . A ponteira pl astica teve sua extremidade fundida em bico de g as com um o de platina de 0,5 de espessura por 1,0 cm de comprimento. Ap os preenchimento de 0,8 ml de KCl 3 mol.L1 , a ponteira foi rmemente ajustada ao corpo v treo contendo o segmento met alico. O eletrodo de refer encia foi testado frente a um eletrodo Ag/AgCl Metrohm Inc, pela determina ca o de potencial formal padr ao E0 de uma solu c ao de KCl a 3 mol.L1 contendo 10 mM de ferro/ferricianeto de pot assio (1:1). Os ensaios foram realizados por voltametria c clica, com varredura de potencial de -0,2 a 0,6 V, e taxa de varredura a 100 mV.s1 . O eletrodo auxiliar foi confeccionado em corpo v treo (segmento de pipeta com capacidade para 2 ml, e 8 cm de comprimento). No corpo, foi introduzido um o de platina de 1,0 cm de comprimento e 0,5 mm de espessura, soldado a um o de cobre de 2 mm de espessura e 10 cm de comprimento, essa extremidade para o contato el etrico ao potenciostato. O conjunto foi nalizado utilizando-se resina Epoxi (Araldite) polimerizada com 20 L de HF, para veda ca o, isolamento e imobiliza c ao dos segmentos met alicos.

34

5.5

Limpeza dos eletrodos de trabalho

Os eletrodos de Au confeccionados foram tratados com solu ca o piranha composta por H2 SO4 concentrado e H2 O2 a 30 % (3:1) por apenas 20 s, a m de se evitar a degrada c ao da resina formada, seguindo-se lavagem abundante em a gua destilada e tratamento mec anico com pasta de Al2 O3 . Feito isso, prosseguiu-se com ultrasonica ca o por 30 min em a gua MiliQ, lavagem com EtOH 95%, e secagem ao ar, seguido por uxo de N2 sobre a superf cie dos eletrodos de trabalho, por um m nimo de dois minutos. Imediatamente antes dos ensaios, os eletrodos eram tratados com o uxo do g as por 60 s. Quando n ao utilizados, os eletrodos de trabalho foram mantidos em solu ca o de H2 SO4 a 0,5 mol.L1 . A deara ca o das solu c oes tamponadas, contudo, n ao apresentou diferen ca de perl nem magnitude de corrente, em rela c ao ` as n ao tratadas, optando-se por evitar o uso de uxo de N2 nas solu co es proteicas, de modo a reduzir a desnatura ca o provocada pela agita ca o nas mesmas.

5.6

Caracteriza c ao eletroqu mica da superf cie de eletrodo de Au

Para aferir a resposta eletroqu mica da superf cie do eletrodo de trabalho, este foi imerso em 6 mL de solu ca o de H2 SO4 a 0,5 mol.L1 , seguindo-se voltametria c clica com varredura de potencial de +0,1 a +1,6 V, e velocidade de varredura a 20 mVs1 , durante 25 ciclos. O perl resultante foi comparado aos j a reportados [49]. A c elula eletroqu mica montada pode ser visualizada na Figura 9.

5.7

Teste dos eletrodos com sonda de ferro/ferricianeto de pot assio

Foi utilizada como sonda para aferir a corrente produzida sobre o eletrodo de Au, uma solu ca o de KCl a 3 mol.L1 contendo 10 mM de ferro/ferricianeto de pot assio (1:1). Os ensaios foram realizados por voltametria c clica, com varredura de potencial de -0,2 a + 0,6 V, e taxa de varredura a 100 mV.s1 . Usualmente, foi empregada uma amplica ca o de 5 mA e 500 uA para, respectivamente, eletrodo nu e eletrodo tratado.

35

Figura 9: C elula eletroqu mica utilizada nos experimentos. A c elula era composta de tr es eletrodos: contra eletrodo (o Pt), eletrodo de trabalho (Au a Au modicado) e de refer encia (Ag/AgCl).

5.8

Preparo da solu c ao de mioglobina

A solu ca o de mioglobina foi preparada em solu c ao tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 pH 7,4, na concentra ca o 15 mol.L1 por mL de tamp ao fosfato. Por apresentar baixa solubilidade em meio aquoso, as amostras de Mb eram deixadas em repouso por 15 min em temperatura ambiente at e a completa dissolu c ao. Optou-se pela n ao agita c ao, para que n ao houvesse poss vel desnatura c ao da prote na.

5.9

Espectrofotometria de Mb

Solu co es de Mb pipetadas em cubeta de quartzo (1mg/mL) foram monitoradas espectrofotometricamente a 200-450 nm a m de se obter informa co es a respeito do grau de pureza da prote na. Os dados foram analisados por m edias de absorb ancia obtida de uma solu ca o controle preparada ` a temperatura ambiente. Foi empregado o tamp ao fosfato como solu ca o de refer encia nos ensaios.

36

5.10

Montagem do sistema de voltametria de mioglobina

O sistema de voltametria foi composto por m odulo potenciostato-galvanostato conectado a um microcomputador para aquisi c ao, ltragem e an alise de dados. A congura ca o utilizada foi de tr es eletrodos (trabalho ouro, refer encia Ag/AgCl, e auxiliar o de Pt), imersos em tamp ao fosfato 0,1 molL1 pH 7,4. A voltametria c clica foi conduzida a uma taxa de 100 mV.s1 em potencial de -0,3 a +0,7 V.

5.11

Imobiliza c ao da prote na na superf cie dos eletrodos

O eletrodo de ouro, previamente limpo, era tratado com uxo de ar por 60 s. Em seguida, pipetava-se 30 l de solu ca o contendo Mb e copol mero PMMA-b-PDMAEMA (10 mg/L) simultaneamente, deixando-se secar ` a temperatura ambiente por aproximadamente 40 min. Posteriormente a ` secagem do eletrodo, foram pipetdos 30 L de solu ca o de gluteralde do (GLU 3%) sobre a superf cie do eletrodo modicado, deixando-se secar naturalmente. Finalmente, o eletrodo era abundantemente lavado EtOH 95% e agua destilada com aux lio de uma pisseta, no intuito de se desorver a Mb n ao complexada ao pol mero. Imediatamente ap os os ensaios eletroqu micos o eletrodo, era acondicionado em um b equer com solu ca o tamp ao fosfato para assegurar a ` integridade do complexo formado.

5.12

Voltametria c clica de mioglobina imobilizada

Os ensaios foram realizados com 6 mL de solu c ao eletr olito de 0,1 mol.L1 de tamp ao fosfato de s odio pH 7,4. Para tanto, a superf cie de cada eletrodo contendo a prote na supostamente imobilizada era lavada com a gua destilada, com posterior secagem ao ar e uxo de N2 por 60 s, e imers ao na c elula eletroqu mica contendo o tamp ao. Os ensaios foram conduzidos a uma varredura de potencial de -0,3 a +0,7 V, em velocidade de varredura de 100 mV.s1 , quando n ao especicada. Foi empregada uma janela de amplica c ao

37

de 500 A para a obten ca o dos dados.

5.13

Determina c ao dos par ametros cin eticos de transfer encia de carga

Os par ametros cin eticos de Mb/PMMA-b-PDMAEMA foram determinados com solu c oes de tamp ao fosfato de s odio 0,1 mol.L1 pH 7,4, variando-se a taxa de varredura em 20, 40, 60, 80, 100, 130, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, e 500 mV.s1 .

5.14

Estudo de varia c ao de pH

Esse estudo foi realizado preparando-se solu co es de tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 em valores de pH de 4,0; 4,5; 5,0 ; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; e 7,5, com aux lio de solu co es de NaOH e HCl a 0,1 mol.L1 . Os voltamogramas c clicos foram registrados a cada troca de tubos com taxa de varredura de 100 mV.s1 , e faixa de potencial -0,3 a 0,7 V, e varredura de 3 ciclos consecutivos por ensaio.

5.15

Estudo da atividade catal tica de H2O2

Para a determina c ao da atividade catal tica de H2 O2 , realizou-se o monitoramento da resposta voltam etrica ap os a adi ca o sequencial de 30 L de solu c ao de 0,165 molL
1

H2 O2 na solu c ao de eletr olito suporte. Para isso, foi preparada um s erie de tubos

contendo 5 ml solu ca o tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 , pH 7,4. Inicialmente, o voltamograma c clico era registrado entre a faixa potencial -0,3 a +0,7 V sem adi c ao de H2 O2 . Ao tubo subsequente, eram adicionados 30 L de H2 O2 . A adi ca o de per oxido de hidrog enio na s erie de tubos seguintes era ent ao realizada seguindo-se uma progress ao de 30 L por vez, e com corre c ao de volume.

38

5.16

Ensaio termodin amico de Mb imobilizada

Os ensaios foram realizados de acordo com a metodologia proposta [50, 51, 52] e foi conduzida forma n ao- isot ermica com o eletrodo de refer encia Ag/AgCl em contato com a solu c ao tamp ao apenas por meio de um o de Pt de 5 cm, preservando-se o corpo do eletrodo fora da solu ca o eletrol tica. Dessa forma, o eletrodo de refer encia era mantido em temperatura constante de 250 , monitorada por sensor Pt100 acoplado a term ometro digital Minipa. Os eletrodos auxiliar e o de trabalho, por sua vez, eram mantidos imersos em c elula eletroqu mica jaquetada conectada a banho ultratermost atico de circula ca o (vaz ao de 10 L/min) conforme a Figura 10, e com varia ca o termal at e 65 C0 . Todos os ensaios eram realizados ap os equil brio t ermico da c elula, conforme monitoramento do term ometro.

Figura 10: Representa c ao da c elula eletroqu mica acoplada ao banho ultratermost atico e ao sistema jaquetado, utilizada nos experimentos de varia c ao da temperatura de Mb imobilizada.

5.17

Estudo da estabilidade e reprodutibilidade do biosensor

Para a determina c ao do tempo de vida u til do biosensor de Mb/PMMA-b-PDMAEMA, realizou-se um monitoramento di ario da resposta do dispositivo, usando sempre um mesmo eletrodo de trabalho. Durante a avalia c ao da estabilidade do eletrodo, a estocagem foi realizada em temperatura ambiente, em solu c oes de tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 pH 7,4. Os testes de reprodutibilidade da medida, foram efetuados com eletrodos diferentes,

39

utilizando-se sempre o mesmo protocolo de imobiliza c ao.

5.18

An alise de dados

O planejamento experimental foi realizado por parcelas inteiramente casualizadas, a um m nimo de triplicatas para a obten ca o de referenciais estat sticos (m edia e desviopadr ao da m edia). Ajustes (linear e n ao linear) e modelos estat sticos (ANAVA, p<0.05)) foram empregados conforme a especicidade das an alises. Os dados resultantes foram avaliados utilizando-se o programa estat stico de dom nio p ublico R (CRAN, Comprehensive R Archive Network [53]), com pacotes espec cos para cada an alise. Os gr acos foram tamb em elaborados com aux lio desse.

40

Resultados e Discuss ao

41

6.1

Determina c ao da pureza de Mb

Amostras de mioglobina a 1 mg/mL em tamp ao fosfato foram aferidas quanto ao grau de pureza por espectrofotometria, por compara c ao ao coeciente de extin c ao molar reportado por Postnikova e colaboradores [54]. O valor do coeciente de extin ca o molar em A409 , regi ao pertencente ` a banda de Soret, foi de 142,6 x 103 M1 cm pureza da amostra de 90,29%.
1

, sendo a

6.2

Pr e-tratamento de eletrodo

A Figura 11 apresenta o ciclovoltamograma obtido a partir da metodologia de limpeza da superf cie do eletrodo de Au, pelo perl voltam etrico em 0,5 mol.L1 H2 SO4 . De acordo com trabalhos anteriores o perl voltam etrico apresenta nessas condi co es a forma c ao de o xido de ouro em um determinado intervalo de potencial. Com a invers ao de sentido da varredura, o o xido e reduzido com um potencial de pico de redu ca o em aproximadamente 1,0 V [49]. O pico de redu c ao ocorre devido ` a redu ca o do o xido de ouro, considerado um processo r apido em temperatura ambiente e em baixas velocidades de varredura [55]. A area eletroqu mica (Areal ), ou area eletroativa, eaa rea total da superf cie, incluindo cavidades, ondula c oes e defeitos em n vel at omico. Portanto a referida area fornece dados a respeito da quantidade de s tios dispon veis na superf cie do sensor [56]. A a rea eletroativa foi calculada pela integra c ao do pico de redu ca o do ciclovoltamograma do eletrodo de ouro, considerando o fator de rugosidade (fr ), de acordo com a equa c ao 6.1:

Areal =

qreal t

(6.1)

fr =

Ageom Areal

(6.2)

Onde a area geom etrica Ageom foi obtida de acordo com a carga de redu c ao te orica

42

Figura 11: Voltamograma c clico do eletrodo de Au em 0,5 mol.L1 de H2 SO4 a 20mVs1 , 25 ciclos.

t de 390 C necess aria para redu c ao da camada de oxido de ouro e qreal e carga medida experimentalmente. Por esse procedimento, a m edia de area eletroativa obtida foi de 1,146 0,137 cm2 . Considerando que a area geom etrica m edia dos eletrodos foi de 0,220 cm2 , o fator de rugosidade (fr ) calculado pela equa ca o 6.2 foi de 5,35, o que sugere uma grande ondula ca o supercial dos eletrodos de trabalho.

6.3

C alculo de concentra c ao de Mb eletroativa na superf cie do eletrodo de Mb-PMMA-b-PDMAEMA

A concentra c ao de Mb na superf cie do eletrodo modicado foi obtida utilizando a equa ca o 6.3 abaixo, conforme relatado por Zheng e colaboradores [57]:

ip =

n2 F 2 A 4RT

(6.3)

A m edia da superf cie de concentra c ao foi de 9,81011 1,131011 mol/cm2 , utilizando valores abaixo da satura ca o de Mb. Esse resultado est a pr oximo do valor de 7.4 x 1011 reportado anteriormente [15], e maior do que o valor te orico previsto de 1.58 x 1011 para

43

uma monocamada de mioglobina [58]. Por outro lado, dada a extens ao plaus vel de cobertura do dibloco de PDMAEMA na superf cie do eletrodo (PMMA-b-PDMAEMA possui uma massa molecular estimada entre 30 a 100 kgmol1 [59, 60], e raio hidrodin amico de 2,2 nm [47]), frente ` a cobertura de Mb (Mb, uma massa molecular de 17.500 kgmol1 [61], e raio hidrodin amico de 0.21 nm [62]), pode-se sugerir que a monocamada de Mb esteja, na verdade, embebida na matriz polim erica de PMMA-b-PDMAEMA. Para tanto, buscou-se avaliar a espessura da camada de PMMA-b-PDMAEMA presente ` a superf cie eletr odica, conforme a rela ca o 6.4 que segue [63]:

Cdl =

0 d

(6.4)

Onde Cdl representa a capacit ancia da dupla camada el etrica, 0 a constante de permissividade el etrica no v acuo, 8,85 x 1012 Fm1 , e a constante de permissividade el etrica do pol mero (PMMA, 1.08 [64]). O valor de Cdl , por sua vez, foi determinado segundo a Eq. 6.5 abaixo [65]:

ia ic = Cdl 2

(6.5)

Onde ia e ic representam, respectivamente, a corrente an odica e cat odica ao centro do ciclovoltamograma de tamp ao somente (Figura 12), descontada a linha de base. Com base nesse formalismo, foi encontrado um valor de Cdl de 5,3 x 107 Fcm2 . Pela Eq. 6.4, o valor da espessura polim erica de cobertura do eletrodo foi de 180,3 nm. Considerando o raio hidrodin amico de PMMA-b-PDMAEMA acima, pode-se concluir que uma plaus vel monocamada de Mb encontra-se a ` superf cie do eletrodo imersa numa matriz polim erica possuindo v arias camadas de PMMA-b-PDMAEMA. Dessa forma, o copol mero PMMA-b-PDMAEM pode ter aumentado a densidade funcional de grupos eletroativos a ` superf cie do eletrodo. A integra c ao dos picos resultou em pouca varia c ao da supercie eletroativa do complexo em fun ca o da velocidade de varredura (1,51011 a 3,51011 ), o que est a de acordo com um comportamento de eletrotransfer encia connada ` a supercie, ou a um comportamento eletroqu mico em camada delgada [66, 21].

44

6.4

Efeito da velocidade de varredura

A Figura 12 apresenta os ciclovoltamogramas de tamp ao e mioglobina imobilizada. Pelo perl ciclovoltam etrico, pode-se observar que o sinal amperom etrico resultou em picos signicativos, tanto an odico como cat odico, apenas quando foi adicionada Mb. Ensaios de adsor c ao de Mb sobre a superf cie do eletrodo n ao resultaram em potenciais de pico detect aveis. A Figura 13 apresenta o voltamograma c clico de Mb/PMMA-bloco-PDMAEMA em diversos valores de taxa de varredura. Os ciclovoltamogramas resultantes evidenciam um deslocamento observado no potencial de pico cat odico para valores mais negativos com o aumento da velocidade de varredura, o mesmo ocorrendo no processo inverso. Como explicitado no cap tulo de referencial te orico deste trabalho, processos eletrocatal ticos podem ser classicados como revers veis, irrevers veis e quase-revers veis [19] (cap. 3). Esse diagn ostico e essencial para a eletroan alise de mecanismos de transfer encia de carga em estudos de voltametria, e precede a determina ca o de par ametros eletrocin eticos, base da elucida ca o mecan stica interfacial. O grau de reversibilidade de um sistema eletroqu mico, melhor denido termodinamicamente, leva em conta as taxas de transfer encia de carga em que o processo redox ocorre em ambas as dire co es (an odico e cat odico). Nesse caso, uma rea ca o revers vel segue a equa c ao de Nernst ( comportamento nernstiniano, equa ca o 2.3), em que as transfer encias de carga ` a superf cie do eletrodo s ao sucientemente r apidas, mantendo as taxas das esp ecies redox a valores fornecidos por essa rela ca o. A Figura 13 parece n ao apresentar um comportamento puramente revers vel, posto que os potenciais de pico parecem depender da velocidade de varredura [3] (cap. 9). Al em disso, o valor da raz ao entre as correntes de pico, ipa /ipc , foi de 0,840,08, n ao condizente com o valor unit ario previsto para sistemas revers veis puros [3] (cap. 9). Em eletroan alise diversas rela co es entre grandezas s ao utilizadas para a extra ca o de par ametros eletroanal ticos por meio de equa co es de reta ou lineariza co es [19] (cap. 3). As vantagens em se trabalhar com a estrat egia acima resume-se: 1) na converg encia de apenas dois par ametros de estimativas (inclina ca o ou coeciente angular, e intercepto), 2) na facilidade de ajustes lineares por m etodos correntes, como quadrados m nimos, 3)

45

Figura 12: Voltamograma c clico de tamp ao fosfato e Mb/PMMA-b-PDMAEMA em eletrodo Au. Velocidade de varredura 100 mV.s1 .

Figura 13: Voltamograma c clico de Mb/PMMA-b-PDMAEMA em tamp ao fosfato 0,1 mol1 pH 7,4 nas 1 velocidades de varredura de 20; 40; 60; 80; 130; 160; 180; 200 mV.s .

46

na necessidade de poucas medidas experimentais para estabelecer a rela ca o linear, 4) na robustez do tratamento estat stico do modelo linear, 5) no alto grau de conabilidade na interpola ca o de dados, 6) no reduzido n umero de premissas que satisfazem o m etodo (igualdade de vari ancias, normalidade de dados obtidos independentemente) [67]. Na investiga ca o de estudos voltam etricos avalia-se a rela c ao linear entre grandezas puras ou transformadas, tais como a corrente, o potencial de pico, ou a velocidade de varredura, na busca de modelos mecan sticos do processo de transfer encia de carga, o grau de reversibilidade do sistema, bem como de par ametros termodin amicos e eletrocatal ticos [3] (cap. 9). Dessa forma, a equa ca o de Randles-Sevcic ( 2.4) exemplica o formalismo que relaciona a corrente de pico com o quadrado da velocidade de varredura. O resultado apresentado a ` Figura 14 mostra que as correntes de pico de oxida ca o e redu ca o aumentaram linearmente com a raiz quadrada da velocidade de varredura no intervalo de 20 a 200 mV.s1 . Acima dessa taxa de varredura, contudo, o gr aco parece apresentar um desvio da linearidade, marcadamente no processo de oxida c ao. Por esse raz ao, o ajuste de quadrados m nimos para os picos de oxida c ao foi conduzido excluindo-se os dois u ltimos pontos, em todas as velocidades. Ainda assim, os coecientes de determina ca o, que espelham a propor c ao de vari ancia na ordenada explicada pela vari ancia na abscissa, segundo o modelo linear aplicado [68], resultaram em um valor inferior para o processo de oxida ca o no eletrodo. Em s ntese, esses dados sugerem que o processo aproxima-se de uma transfer encia de carga difusional [4], embora tenha havido desvios do modelo em taxas maiores de velocidade de varredura. A fuga a ` linearidade do modelo difusional de Randles-Sevcic pode ter sido originada frente a um comportamento de transfer encia de carga connada a ` superf cie [69, 21, 19] ou a ` estrutura de uma camada delgada formada pelo pol mero junto ao eletrodo [70, 21, 19]. Assim, os dados de taxa de varredura contrastados pelos valores de corrente de pico, apresentados ` a Figura 15 apresentaram tamb em um perl linear. Esse resultado refor ca que a cin etica de transfer encia eletr onica seja dirigida mais pela teoria de voltametria de camada delgada (ou lme no) [70, 21, 19], do que controlada por difus ao simples. Em outro tratamento empregando-se os mesmos dados, o gr aco de duplo logaritmo de velocidade de varredura por corrente de pico tamb em resultou em uma linha reta para

47

Figura 14: Efeito da varia c ao do quadrado da taxa de velocidade de varredura na intensidade de corrente de pico de Mb/PMMA-b-PDMAEMA em tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 pH 7,4.

Figura 15: Efeito da taxa de velocidade de varredura na corrente de pico de Mb/PMMA-b-PDMAEMA em tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 pH 7,4.

48

ambos os processos an odico e cat odico, e com valores de inclina ca o signicativamente iguais, de 0,72. Esse valor encontra-se em uma faixa intermedi aria reportada na literatura entre um processo puramente difusional (valor de 0,5) e 1,0 para processo puramente adsortivo [71]. Dessa forma tem-se que processo sugerido para a transfer encia de carga a ` superf cie do eletrodo modicado com o lme polim erico de Mb-PMMA-b-PDMAEMA possa ter sido decorrente de uma camada delgada ou lme no [21] (Cap. 10) como suporte eletr onico a ` essa transfer encia dos grupos redox proteicos [70].

Figura 16: Representa c ao duplo-logaritmo de velocidade de varredura e corrente de pico, para a cin etica de transfer encia eletr onica em Mb-PMMA-b-PDMAEMA

6.5

Determina c ao dos par ametros cin eticos de transfer encia de carga

Tendo em vista um mecanismo de quase-reversibilidade para a transfer encia de carga no sistema Mb/PMMA-b-PDMAEMA, procurou-se estabelecer os par ametros eletrocatal ticos de transfer encia de carga () e de coeciente de heterogeneidade padr ao (KS ), a m de auxiliar na elucida ca o do mecanismo reacional a ` superf cie do eletrodo. Esses par ametros eletrocatal ticos foram obtidos a partir do tratamento de Laviron, considerando valores Ep maiores que 200 mV, como segue [72]:

49

Epc = E 0

RT log nF

(6.6)

Epa = E 0 +

RT log (1 )nF

(6.7)

Dessa forma, a partir de uma representa ca o linear de log versus Ep, pode-se determinar E0 por extrapola ca o innita ao eixo da ordenada, e a partir da inclina ca o. O valor do coeciente de heterogeneidade padr ao pode ent ao ser obtido por [69]:

log (Ks ) = log (1 ) + (1 + ) log log

Ep RT (1 )nF F 2.3RT

(6.8)

A Figura 17 apresenta os resultados do tratamento de Laviron para modelos de transfer encia de carga connados a ` superf cie, conforme as equa co es acima. Por esse tratamento, foram encontrados valores de n de 0.810.08 e Ks de 0.0550.00 s1 . O baixo valor para o coeciente Ks refor ca a natureza quase-revers vel do processo eletrocatal tico. A pequena varia ca o de Ks com a velocidade de varredura tamb em refor ca um quadro adsortivo para a transfer encia de carga [19, 21]. O valor elevado para n sugere a exist encia de dois el etrons envolvidos na transfer encia de carga ` a superf cie do eletrodo modicado. A m de validar esse resultado, buscou-se uma determina ca o alternativa para o valor do coeciente de transfer encia de carga por extrapola ca o linear de Tafel a ` equa c ao de Buttler-Volmer, conforme segue [19] (cap. 3)):

2.3RT 2.3RT logi0 logi nF nF

(6.9)

Onde representa a sobretens ao (potencial aplicado acima do potencial de equil brio), e i0 a corrente de troca, conforme mencionado anteriormente (2.2), e representada pela faixa de corrente gerada quando o potencial aplicado iguala-se ao potencial de equil brio da rea c ao ( 0). Dessa forma, uma representa ca o linear de ln ip versus E pode fornecer

o valor de b da inclina ca o de Tafel, como segue [73]:

50

Figura 17: Depend encia do potencial de pico Ep com o logaritmo da taxa de velocidade de varredura ( ) de Mb 15 mol.L1 em tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 pH 7,4.

Ep =

b log ( ) + constante 2

(6.10)

A Figura 18 apresenta os resultados do tratamento. A partir desse, o valor n foi de 0,77, condizente com o esperado acima para a transfer encia de dois el etrons durante um processo quase-revers vel (0,3 < n< 0,7) [3] (cap. 9). A Tabela 1 evidencia um sum ario dos resultados obtidos da eletroan alise. O potencial de oxida ca o formal (E0 ) para Mb indica valores obtidos com reprodutibilidade, por em difere dos valores da literatura. Isto pode ser devido ` a intera c ao entre a prote na e o pol mero, como relatado em [15, 66]. O valor n reete a quase-reversibilidade da rea ca o [4].

O coeciente de transfer encia de carga, que mede o potencial da interface eletrodosolu ca o, assumiu um valor m edio aproximado para de 0,40 em um processo quaserevers vel, com o n umero de el etrons envolvidos na rea ca o sendo igual a dois. O coeciente de heterogeneidade padr ao, Ks, que sinaliza a facilidade cin etica da rea c ao, sugere que

51

Figura 18: Depend encia do potencial de pico com logaritmo da corrente de pico de Mb 15 mol.L1 em tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 pH 7,4.

Par ametros E0 (V) n KS (s1 )

m ediasd 0,180,03 0,80 0.27 0,060,03

Tabela 1: Par ametros eletroanal ticos encontrados para a resposta ciclovoltam etrica de Mb/PMMA-bPDMAEMA (n=3.).

a cin etica foi de natureza lenta. Essa taxa reduzida de transfer encia pode ter sido devida ` a complexidade das mol eculas submetidas a ` transfer encia de el etrons, e ao rearranjo molecular que pode suceder essa transfer encia [57]. Resultados aproximados tamb em foram reportados ([11, 57]). Complementarmente, o par ametro Ks, tal como determinado pelo modelo proposto por Laviron, utilizando-se Ep maior que 200 mV/s [69], sofreu varia c ao signicativa com a velocidade (0,03-0,10 s1 ), o que tamb em refor ca a quasereversibilidade da rea ca o [19] (cap. 3).

52

6.6

Efeito da varia c ao de pH

A eletrotransfer encia de Mb tamb em foi analisada pela varia c ao de pH, no intuito de se obter informa co es mecan sticas sobre o processo de transfer encia do complexo Mbpol mero. Os experimentos foram conduzidos na faixa de pH 4,0-7,5 em tamp ao fosfato por voltametria c clica com taxa de varredura de 100 mV.s1 . Os resultados apresentados a ` Figura 19 mostram um comportamento linear, com inclina c ao de -0,0250,001 para Mb/PMMA-b-PDMAEMA. Esse valor aproxima-se do valor te orico -0,029 V/pH, sugerido para rea c oes de transfer encia de carga acopladas a um processo qu mico envolvendo um pr oton H+ e dois el etrons [19] (cap. 3).

Figura 19: Efeito da varia c ao de pH no potencial formal padr ao encontrado para Mb/PMMA-bPDMAEMA. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , eletr olito suporte de tamp ao fosfato de s odio 0,1 mol.L1 .

Houve tamb em uma varia ca o no valor do coeciente de heterogeneidade padr ao Ks com pH, refor cando tamb em a exist encia de pr otons H+ durante a eletrotransfer encia, sendo encontrado um valor de 0,33 s1 /pH para a inclina ca o linear de Ks com pH.

53

6.7

Determina c ao da atividade eletrocatal tica de H2O2

Com o objetivo de explorar a atividade catal tica de Mb imobilizada no eletrodo, foram conduzidos ensaios para vericar uma plaus vel atividade pseudoperoxidase para o composto Mb-pol mero. Neste trabalho, o aumento do pico da corrente de redu ca o, caracter stico da atividade catal tica, ocorreu com o aumento da concentra ca o de H2 O2 em uma s erie crescente de concentra co es de 0,03 mol L1 a 0,4 mol L1 (Figura 20). Por essa Figura pode-se observar que a concentra ca o de H2 O2 atingiu valores pr oximos 0,27 mmol L1 , apresentando um plat o observado na resposta catal tica, devido a ` satura ca o na atividade pseudoperoxidase de Mb, demonstrando um mecanismo cin etico t pico de Michaelis-Menten, conforme j a reportado [72].

Figura 20: Resposta da varia c ao da concentra c ao de H2 O2 sobre o eletroo de Mb/PMMA-b-PDMAEMA. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , eletr olito suporte de tamp ao fosfato s odio 0,1 mol.L1 , pH 7,4.

Tem sido relatado na literatura que, com a adi ca o de H2 O2 , o pico de redu ca o de ferroprote nas tende a aumentar e o de oxida ca o desaparece por completo, o que demonstra um t pico processo eletrocatal tico de redu ca o de H2 O2 . Dessa forma, a constante catal tica (Km) pode ser expressa por uma adapta ca o da equa c ao de cin etica enzim atica de Lineweaver-Burk como segue [74]:

54

1 1 (Km ) = + Iss Imax Imax

(6.11)

Onde Iss e a corrente medida ap os a adi c ao de H2 O2 ; C e a concentra ca o de H2 O2 e Imax e o valor m aximo de corrente medida abaixo das condi c oes de satura c ao de H2 O2 , e Km e a constante aparente de Michaellis-Mentem para a eletrocat alise. O resultado apresentado a ` Figura 21 apresentou fuga a ` linearidade prevista pela equa c ao acima. Esse comportamento curvilinear de Lineweaver-Burk sugere que apenas em altas concentra c oes do substrato o modelo foi controlado por cat alise simples; em baixas concentra co es, contudo, a resposta parece ter sido decorrente de um modelo controlado por transporte de massa [74], com desvios poss veis pelo connamento de Mb na estrutura polim erica. Esse desvios poderiam tamb em ter decorrido do pr oprio copol mero, reduzindo a difusibilidade do substrato at e a Mb imobilizada, e congurando um processo limitado por difus ao.

Figura 21: Representa c ao de Lineweaver-Burk da resposta da varia c ao de H2 O2 sobre o eletrodo de Mb/PMMA-b-PDMAEMA. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , eletr olito suporte de tamp ao fosfato s odio 0,1 mol.L1 , pH 7,4.

Com o desvio da linearidade na representa ca o de Lineweaver-Burk, procedeu-se um ajuste n ao linear da equa ca o de Michaelis-Mentem aos dados por algoritmo de GaussNewton [68], conforme a seguinte rela ca o:

55

Iss =

Imax [H2 O2 ] (Km ) + [H2 O2 ]

(6.12)

O resultado est a apresentado a ` Figura 20. De acordo com este m etodo, o valor de Vm aparente calculado foi de 207,538,2 mol.L1 , e Km aparente de 114.758.7 M. Esse u ltimo, que representa o equil brio de forma ca o do complexo Mb-H2 O2 , foi similar ao reportado na literatura (137 M [15], 140 A [75], 88 A [72]). Esses resultados indicam que o complexo Mb/PMMA-b-PDMAEMA formado forneceu um ambiente favor avel para imobiliza ca o de Mb, e preservou a atividade catal tica de Mb para H2 O2 .

6.8

Efeito da temperatura

A m de se obter informa co es acerca do equil brio termodin amico do complexo, foram realizados ensaios n ao-isot ermicos com varia c ao de temperatura da c elula eletroqu mica, contudo sem altera ca o t ermica do eletrodo de refer encia, que permaneceu em contato com a solu ca o por ponte el etrica de Pt [76, 52, 50]. Os ensaios termodin amicos foram conduzidos com o complexo Mb/PMMA-b-PDMAEMA com o aumento progressivo de temperatura (20 a 55 0 C), em tamp ao fosfato 0,1 mol L1 , pH 7,4. Os par ametros termodin amicos do processo redox da mioglobina foram calculados seguindo o procedimento proposto por Tanigushi e colaboradores [77], pelas rela co es que seguem [52]:

S 0 = nF (

dE 0 ) dT

(6.13)

H 0 = nF

dE 0 /T ) 1 d( T )

(6.14)

Dessa forma, a inclina ca o de um gr aco de T por E0 pode fornecer a varia ca o de entropia da transfer encia de carga (S0 ), ao passo que 1/T por 1/E0 , a varia ca o de entalpia envolvida na transi ca o de trocas de carga (H0 ) [78]. A varia c ao de energia livre do processo, composta por contribui co es ent alpicas e entr opicas, pode ent ao ser obtida por diferen ca, seguindo a equa ca o de Gibbs-Helmholtz [3] (cap. 9), ou por:

56

G0 = nF E 0

(6.15)

Figura 22: Gr aco de E0 vs temperatura (K) para Mb/PMMA-b-PDMAEMA em ensaio termodin amico n ao-isot ermico. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , eletr olito suporte de tamp ao fosfato 0,1 mol.L1 , pH 7,4.

Assim, os valores de S0 , H0 , e G0 podem ser extra dos, respectivamente, das Figuras 22 e 23. Os valores encontrados para S0 (6.13) e H0 (6.14) foram respectivamente, 351.3 0.0 e -76831.9 0.1. Esses valores indicam uma varia ca o de entropia baixa, por em positiva, em contraposi ca o a uma grande varia c ao negativa de entalpia. A varia c ao positiva de entropia e creditada na literatura a processos de reorganiza c ao de solvente, em particular pr oxima ao grupo prost etico met alico de Mb [76], expondo esses s tios ao ` aquele. Por outro lado, o alto valor negativo para H0 pode ter sido devido a ` hidrofobicidade do grupo heme de Mb, juntamente com uma estabiliza ca o de intera c oes eletrost aticas em torno desse [50]. Essa u ltima hip otese fundamenta-se parcialmente no efeito eletrost atico da atmosfera i onica negativa em torno do grupo met alico, dado o valor do ponto isoel ettrico (pI) para Mb em torno de 7,0 [12]. Um perl similar aos resultados apresentados foi obtido com Mb em lme de didodecildimetilam onio [79].

57

Figura 23: Gr aco de Gibbs-Helmholtz (E0 /T vs 1/T (K)) para Mb/PMMA-b-PDMAEMA/GLU em ensaio termodin amico n ao-isot ermico. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , eletr olito suporte de 1 tamp ao fosfato 0,1 mol.L , pH 7,4.

6.9

Determina c ao da Estabilidade do Biossensor

Para vericar a precis ao, a reprodutibilidade, e o tempo de vida do bissensor Mb/PMMAb-PDMAEMA, foram realizadas medidas di arias utilizando sempre o mesmo eletrodo de trabalho. O biossensor foi estocado em temperatura ambiente por 4 semanas, em solu ca o tamp ao fosfato de s odio 0,1 mol.1 , pH 7,4. Os resultados est ao apresentados ` a Figura 24. Apesar da redu c ao nos valores de corrente de pico an odica, o eletrodo pareceu responder satisfatoriamente at e o 30 dia, a partir do qual passou a apresentar signicativa redu ca o no sinal amperom etrico. Mesmo com essa diminui ca o na resposta, o biosensor ainda apresentou sensibilidade suciente para ser utilizado em an alises rotineiras, dada a perda aproximada de 50% do sinal amperom etrico somente a partir da 3a. semana de estocagem.

58

Figura 24: Efeito do tempo de estocagem do biossensor M/PMMA-b-PDMAEMA sobre a corrente de pico an odica em tamp ao fosfato s odio 0,1 mol.L1 , pH 7,4. Velocidade de varredura de 100 mV.s1 , 0 temperatura de ensaio de 25 C.

6.10

Mecanismo proposto de forma c ao do biossensor de PMMA-b-PDMAEMA

Como reportado por Gohy et al. [40], copol meros neutros de PDMAEMA podem sofrer associa ca o livre ou mesmo agrega ca o em meio aquoso, devido ao efeito hidrof obico de seus blocos neutros. Esse dado e corroborado pelo aumento da solubilidade aquosa de PMMA-b-PDMAEMA, devido a ` presen ca de uma amina terci aria em suas unidades monom ericas. Apesar de PDMAEMA ser considerado um pol mero cati onico devido a ` presen ca dessas ( Figura 7), o valor de seu pKa situa-se entre 6,5 [40] e 8,0 [80]. Apenas em pH abaixo de 4,5 o bloco de PDMAEMA torna-se quase completamente carregado em solu c ao aquosa [80]. Assim, e poss vel sugerir um estado parcial neutro ou levemente protonado para os copol meros dibloco no pH 7,4 dos ensaios de imobiliza ca o utilizados nesta monograa. Dessa forma, os copol meros de PMMA-b-PDMAEMA poderiam cumprir um papel duplo. Por um lado, a estrutura hidrof obica de PMMA-b-PDMAEMA (Figura 7) poderia interagir com a superf cie met alica de ouro dos eletrodos, refor cado pelo efeito hidrof obico com o solvente aquoso e, simultaneamente a ` intera c ao com grupos

59

carregados positivamente na prote na, tais como res duos de histidina (His), lisina (Lys), e arginina (Arg) de Mb. A intera ca o com esses res duos poderia ocorrer devido a ` rede de grupamentos eter eletronegativos da estrutura do copol mero, refor cando uma intera c ao ion-dipolo entre Mb e estrutura nal de PMMA-b-PDMAEMA. Resultado semelhante foi encontrado por Qiao et al. na produ c ao de um biosensor modicado com polietilenoglicol depositado em camadas junto a ` Mb [81]. Essa intera ca o ion-dipolo e corroborada pela pr opria agrega c ao de um copol mero dibloco semelhante a PMMA-b-PDMAEMA, metacrilato de poli-(2-(diamino)) etila em bloco com a cido polimetacr lico (PDMAEMAb-PMAA), em fun c ao do aumento nos valores de pH em meio aquoso [40]. Em pH abaixo do ponto isoel etrico (entre 6 e 9, dependendo da natureza e tamanho dos blocos), PDMAEMA forma micelas decorrentes da intera ca o de seus blocos hidrof obicos. Com aumento do pH, parte dos blocos torna-se ionizado, surgindo intera c oes eletrost aticas entre a estrutura ani onica de PMAA e os blocos cati onicos de PDMAEMA, originando copol meros dibloco anf licos. De fato, a estrutura de Mb comporta 19 res duos de Lys e 2 de Arg, com valores de pK em torno de 1012 and 1213, respectivamente, conferindo ` a Mb uma rede de carga positiva supercial para intera ca o com PMMA-b-PDMAEMA no tamp ao [82], a ` despeito da proximidade de seu ponto isoel etrico (7,0; [61]). Os res duos de His, em n umero de 6, encontram-se no cerne hidrof obico da prote na [82], e s ao considerados menos acess veis a ` intera c ao. A presen ca de aminas prim arias na estrutura proteica, principalmente de res duos de Lys, poderia refor car a intera c ao do complexo, face a liga ca o covalente (crosslinking ) promovida por gluteralde do. Complementarmente, a intera ca o de Mb com PMMA-b-PDMAEMA poderia tamb em ser favorecida pelo efeito ou intera ca o hidrof obica pertinente a ambas as estruturas, dada a extens ao de cobertura de Mb/PMMAb-PDMAEMA a ` superf cie do eletrodo, como mencionado anteriormente. Dessa forma, os vetores da intera ca o Mb-Mb, Mb-pol mero e ouro-pol mero, em conjunto, poderiam resultar numa maior estabilidade do lme polim erico de Mb/PMMA-b-PDMAEM cataliticamente ativo e aderido ao sensor.

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Conclus oes

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1. A voltametria c clica da intera c ao Mb/PMMA-b-PDMAEMA exibiu um processo de rea ca o quase-revers vel na superf cie do eletrodo de ouro modicado, tal como evidenciado por voltametria c clica, e distinto do eletrodo n ao modicado de Au, ou tratado apenas com o copol mero; 2. A m edia da a rea eletroativa obtida foi de 1.1460.137 cm2 ; 3. O retorno a ` integridade eletroqu mica do sinal do eletrodo de Au foi obtido por extra ca o do copol mero ligado por imers ao em acetona por 10 s; 4. Melhores resultados da imobiliza ca o da prote na na superf cie a urica foram obtidos com gluteralde do a 3% e copol mero a 10 mg mL1 em acetona, e Mb a 15 mg mL1 , em tamp ao fosfato de s odio 0,1 mol.L1 , pH 7,4; 5. O potencial padr ao (E0 ) de Mb/PMMA-b-PDMAEMA foi de cerca de 180 mV (100 mVs1 ), dependendo da velocidade de varredura; 6. A transfer encia de carga ` a superf cie do eletrodo modicado sugeriu um processo controlado por adsor ca o ou por camada na; 7. O valor do coeciente de transfer encia de carga () foi de 0,40; 8. Os valores de Ks obtidos sugerem que a cin etica de transfer encia foi lenta; 9. Houve varia c ao de Ks com pH, refor cando a exist encia de pr otons H+ durante a eletrotransfer encia; 9. O processo de transfer encia eletr onica ocorreu na propor ca o de 2 el etrons para um pr oton; 10. O eletrodo modicado exibiu atividade catal tica sobre H2 O2 , e com constante aparente de Michaelis-Menten (Km ) de 115M; 11. A an alise termodin amica por ensaio n ao-isot ermico revelou valores de S0 e H0 de, respectivamente, 351.34 0.00 J mol1 K1 e -76831.90 0.78 J mol1 . 12. A intera ca o de PMMA-b-PDMAEMA com Mb permitiu a forma ca o de um biosensor est avel com eletrodo de ouro, com prov aveis intera co es eletrost aticas entre res duos expostos da prote na e grupos

62

Refer encias
[1] STRYER, L. Bioqu mica. [S.l.]: New York, 1995. cap.3, p.85122. p. [2] ZHANG, bin at a H. M.; LI, N. Q. The direct electrochemistry electrode. of myoglo-

dl-homocysteine n. 1,

self-assembled

gold

Bioelectroche-

mistry,

v. 53,

p. 97101,

2001. ISSN 1567-5394. Dispon vel em:

<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0302459800001276>. [3] BRETT, C. M. A.; BRETT, A. M. O. ELECTROCHEMISTRY Principles, Methods, and Applications. Oxford University Press Oxford, 1993. 978984 p. Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TWB-48H360D-

D6/2/8103c4c3175f9d97d8b36b87bbf8a559>. [4] WANG, J. Analytical Electrochemistry. Wiley-VCH, 2006. 250 p. Dispon vel em: <http://doi.wiley.com/10.1002/0471790303.fmatter>. [5] SASSOLAS, L. J. B. B. D. L.-B. A. Immobilization strategies to develop enzymatic biosensors. 30 (2012) 489511, v. 30, p. 489511, 2012. [6] FLORENZANO, F. H. Cmc of pmma-block-pdmaema measured by npn uorescence. Polym. Bull., v. 67, p. 875884, 2011. [7] GALLI, A. Desenvolvimento e caracteriza c ao de um Biossensor Bienzim atico Imobilizado sobre monocamadas auto organizadas para determina c ao de a cu cares em alimentos. Tese (Doutorado) Universidade de S ao Paulo, 2007. [8] FREIRE, R.; PESSOA, C.; KUBOTA, T. Emprego de monocamadas auto-organizadas no desenvolvimento de sensores eletroqu micos. Qu mica Nova, v. 26, p. 381 389, 2003.

63

[9] AKRAM, M.; STUART, M.; WONG, D. Direct application strategy to immobilize a thioctic acid self-assembled monolayer on a gold electrode. Analytica Chemistry Acta, v. 504, p. 243251, 2004. [10] GERARD, M.; CHAUBEY, A.; MALHOTRA, B. Applicationofconductingpolymerstobiosensors. BiosensorsandBioelectronics, v. 17, p. 345359, 2002. [11] BILLAH, M. M. et al. Directed immobilization of reduced antibody fragments onto a novel sam on gold for myoglobin impedance immunosensing. Bioelectrochemistry, v. 80, n. 1, p. 4954, 2010. ISSN 1567-5394. A Selec-

tion of Papers presented at the 4th International Workshop on Surface Modication for Chemical and Biochemical Sensing (SMCBS 2009). Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567539410001258>. [12] TAKANO, T. Structure of myoglobin rened at 2a-0 a resolution: Ii.

structure of deoxymyoglobin from sperm whale. Journal of Molecular Biology, v. 110, n. 3, p. 569584, 1977. ISSN 0022-2836. Dispon vel em:

<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283677801125>. [13] JOHNSON, K. A.; OLSON, J. S.; JR, G. N. P. Structure of myoglobinethyl isocyanide histidine as a swinging door for ligand entry. Journal of Molecular Biology, v. 207, n. 2, p. 459463, 1989. ISSN 0022-2836. Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022283689902696>. [14] WHITFORD, D. Proteins Structure and Function. [S.l.]: England, 2005. [15] PENG, fe 2o 4 H.-P. et al. Sonochemical and their for synthesis application of to magnetic the core shell

zro 2

nanoparticles of

highly

eective

immobilization Acta, v. 56,

myoglobin

direct

electrochemistry.

Electrochimica

n. 11,

p. 42314236,

2011. ISSN 0013-4686. Dispon vel em:

<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468611001514>. [16] HU, S. e. a. Biosensors based on direct electron transfer of protein. [S.l.]: New York, 2008. cap. 17, p. 531581. p.

64

[17] SKOOG, D. A. H. F. J. N. T. A. Princ pios de an alise instrumental. [S.l.]: Porto Alegre, 2002. cap.14, p.300316. p. [18] ZOSKI, C. G. Handbook of electrochemistry. [S.l.]: Amsterdam, 2007. 935p. p. [19] BARD, A. J.; FAULKNER, L. R. Book. Electrochemical methods : fundamentals and applications. Wiley, New York :, 1980. xviii, 718 p. : p. ISBN 0471055425. Dispon vel em: <http://www.loc.gov/catdir/toc/onix02/79024712.html>. [20] BASTOS, M. Contribui c ao ao estudo eletroanal tico das bases de Schi SALEN e piridoxal-5-fosfato e alguns de seus complexos com Cu2+, Co+2, Ni2+ e UO2+2. Tese (Doutorado) Puc-Rio, Rio de Janeiro, 1997. [21] NOEL, M.; VASU, K. Cyclic Voltammetry and the frontiers of Electrochemistry. [S.l.]: Oxford & IBH Publishing Co., 1990. [22] SILVA, J. Estudo Voltam etrico da intera c ao dos ons Zn2+, Cu2+, Cd2+, Pb2+ com a Enzima Catalase. Tese (Doutorado) Universidade de Bras lia., 2007. [23] ZANG, W.; LI, G. Third generation biosensors based on the direct electron transfer of proteins. Analytical Sciences, v. 20, 2004. [24] ARMSTRONG, F. A. Recent developments in faradaic bioelectrochemistry. Electrochimica Acta, v. 45, p. 26232645, 2000. [25] MORRIN, A. Characterisation of horseradish peroxidase immobilization on an electrochemical biosensor by colorimetric and amperometric techniques. Biosensors Bioelectronics, v. 18, p. 715720, 2003. [26] VARMA, S.; MATTIASSON, B. Amperometric biosensor for the detection of hydrogen peroxide using catalase modied electrodes in polyacrylamide. Journal of Biotechnology, v. 119, p. 172180, 2005. [27] ZANG, M. e. a. Direct voltammetry of catalase immobilized on silica solgel and cysteine modied gold electrode and its application. .Biosensors and Bioelectronics, v. 22, p. 247252, 2006.

65

[28] LOJOU, E.; BIANCO, P. Application of the electrochemical concepts and techniques to amperometric biosensor devices. Journal of Electroceramics, v. 1, p. 7991, 2006. [29] QIAL, Y. Composite lms of lecithin and heme proteins with electrochemical and electrocatalytic activities. Journal of Colloid and Interface Science, v. 315, p. 537543, 2007. [30] EL-MAALI, N. Voltammetric analysis of drugs. Bioelectrochemistry, v. 64, p. 99 107, 2004. [31] ARAKAWA, T. Eect of the state of gold substrates on the surface composition of two-component alkanethiol self-assembled monolayres. Electrochemistry Communications, v. 7, p. 848852, 2005. [32] CHAKI, N. Self- assembled monolayers as a tunableplataform for biosensorapplications. Biosensors e Bioeletronics, v. 17, p. 112, 2002. [33] SATO, A. et al. Thermal stability and electron transfer reaction of modied myoglobin immobilized on a carbon electrode in poly(ethylene oxide) oligomers. Electrochimica Acta, v. 46, n. 1011, p. 17291735, 2001. ISSN 0013-4686. Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468600007787>. [34] FORERO, C.; ANGELINES, A. M. Immobilization of myoglobin from horse skeletal muscle (Mb) and hemoglobin I (HbI) from Lucina pectinata in hydrophilic polymer networks for H2S biosensor application. Tese (Doutorado) UNIVERSITY OF PUERTO RICO, 2006. [35] XIE, Y.; HU, N.; LIU, H. Bioelectrocatalytic reactivity of myoglobin in layerby-layer lms assembled with triblock copolymer pluronic f127. Journal of Electroanalytical Chemistry, v. 630, n. 12, p. 6368, 2009. ISSN 1572-6657. Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022072809000734>. [36] PEREIRA, C. a. Tend encias em modica c ao de eletrodos amperom etricos para aplica co es eletroanal ticas. Quim.Nova, v. 25, p. 101221, 2002. [37] AHUJAA, I. A. M. D. K. R. T. Biomolecular immobilization on conducting polymers for biosensing applications. Biomaterials, v. 28, p. 791805, 2007.

66

[38] BROWN, R. A. Comprehensive Polymer Science. [S.l.]: Polymer Properties, 1989. [39] LEE, A. S. et al. Characterizing the structure of ph dependent polyelectrolyte block copolymer micelles. Macromolecules, v. 32, n. 13, p. 43024310, 1999. Dispon vel em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma981865o>. [40] GOHY, J.-F. et al. Aggregates formed by amphoteric diblock copolymers in water. Macromolecules, v. 33, n. 17, p. 63786387, 2000. Dispon vel em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma992016j>. [41] MCKEE, M. G. et al. Solution rheological behavior and electrospinning of cationic polyelectrolytes. Macromolecules, v. 39, n. 2, p. 575583, 2006. Dispon vel em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma051786u>. [42] LEE, S. B.; RUSSELL, A. J.; MATYJASZEWSKI, K. Atrp synthesis of amphiphilic random, gradient, and block copolymers of 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate and n-butyl methacrylate in aqueous media. Biomacromolecules, v. 4, n. 5, p. 13861393, 2003. Dispon vel em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bm034126a>. [43] CHATTERJEE, U.; JEWRAJKA, S. K.; MANDAL, B. M. The amphiphilic block copolymers of 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate and methyl methacrylate: Synthesis by atom transfer radical polymerization and solution properties. Polymer, v. 46, n. 24, p. 10699 10708, 2005. ISSN 0032-3861. Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032386105013789>. [44] SORDI, T. de et al. Controlled radical polymerization of 2,3-epithiopropyl methacrylate. lag, v. 28, Macromolecular n. 1, p. Rapid Communications, ISSN WILEY-VCH Dispon vel Verem:

6371,

2007.

1521-3927.

<http://dx.doi.org/10.1002/marc.200600641>. [45] SAHNOUN, M. et al. Synthetic and characterization aspects of dimethylaminoethyl methacrylate reversible addition fragmentation chain transfer (raft) polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, Wiley Subscription Services, Inc., A Wiley Company, v. 43, n. 16, p. 35513565, 2005. ISSN 1099-0518. Dispon vel em: <http://dx.doi.org/10.1002/pola.20813>.

67

[46] SOUZA, J. de; NAVES, A.; FLORENZANO, F. Specic thermoresponsiveness of pmma-&lt;i&gt;block&lt;/i&gt;-pdmaema to selected ions and other factors in aqueous solution. Colloid & Polymer Science, Springer Berlin / Heidelberg, p. 17. ISSN 0303402X. 10.1007/s00396-012-2651-9. Dispon vel em: <http://dx.doi.org/10.1007/s00396012-2651-9>. [47] BAINES, F. L. et al. Micellization of poly(2-(dimethylamino)ethyl in aqueous solu-

methacrylate-block-methyl tion. Macromolecules,

methacrylate) n. 25,

copolymers p. 81518159,

v. 29,

1996. Dispon vel em:

<http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma960740l>. [48] NASSAR, A.-E. F.; WILLIS, W. S.; RUSLING, J. F. Electron Transfer from Electrodes to Myoglobin: Facilitated in Surfactant Films and Blocked by Adsorbed Biomacromolecules. Analytical Chemistry, v. 67, n. 14, p. 23862392, 1995. Dispon vel em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00110a010>. [49] HOOGVLIET, J. C. et al. Electrochemical pretreatment of polycrystalline gold electrodes to produce a reproducible surface roughness for self-assembly: A study in phosphate buer ph 7.4. Analytical Chemistry, v. 72, n. 9, p. 20162021, 2000. PMID: 10815959. Dispon vel em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac991215y>. [50] BORSARI, M. Redox thermodynamics of cytochrome c in mixed water organic solvent solutions. Inorganica Chimica Acta, v. 349, p. 182188, 2003. [51] BATTISTUZZI, G. e. a. Redox thermodynamics, acid-base equilibria and saltinduced eects for the cucumber basic protein. general implications for blue-copper proteins. Journal of Biological Inorganic Chemistry, v. 2, p. 350359, 1997. [52] SMITH, E. A variable-temperature direct electrochemical study of metalloproteins from hyperthermophilic microorganisms involved in hydrogen production from pyruvate. Biochemistry, v. 34, p. 71617169, 1995. [53] R Development Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria, 2012. ISBN 3-900051-07-0. Dispon vel em: <http://www.rproject.org>.

68

[54] POSTNIKOVA, G. B.; KOMAROV, Y. E.; YUMAKOVA, E. M. Fluorescence study of the conformational properties of myoglobin structure. European Journal of Biochemistry, Blackwell Publishing Ltd, v. 198, n. 1, p. 223232, 1991. ISSN 1432-1033. Dispon vel em: <http://dx.doi.org/10.1111/j.1432-1033.1991.tb16005.x>. [55] COELHO, D. Caracteriza c ao eletroqu mica de uma monocamada auto-organizada mista composta por acido 3- mercaptopropi onico e acido 11-mercaptoundecan oico. Tese (Doutorado) Universidade de S ao Paulo, 2007. [56] RESSINE, A. et al. Bioelectrochemical studies of azurin and laccase conned in threedimensional chips based on gold-modied nano-/microstructured silicon. Biosensors and Bioelectronics, v. 25, n. 5, p. 10011007, 2010. ISSN 0956-5663. Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566309005016>. [57] ZHEN, Z. Immobilization of myoglobin on nio nanoparticles matrix for preparation of novel biosensor. Bioelectrochemistry, v. 38, p. 15331537, 2010. [58] LIU, H. et al. Direct electrochemistry and electrocatalysis of heme-proteins entrapped in agarose hydrogel lms. Biosensors and Bioelectronics, Elsevier, v. 20, n. 2, p. 294 304, 2004. [59] SOUZA, V. de et al. Cmc of pmma-block-pdmaema measured by npn uorescence. Polymer bulletin, Springer, p. 110, 2011. [60] GUO, S. et al. Amphiphilic and biodegradable methoxy polyethylene glycol-block(polycaprolactone-graft-poly (2-(dimethylamino) ethyl methacrylate)) as an eective gene carrier. Biomaterials, Elsevier, v. 32, n. 3, p. 879889, 2011. [61] NAKAO, S. et al. Separation of proteins by charged ultraltration membranes. Desalination, v. 70, n. 13, p. 191 205, 1988. ISSN 0011-9164. ce:titleInternational Membrane Technology Conference 88/ce:title. Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0011916488850549>. [62] WILKINS, D. K. et al. Hydrodynamic radii of native and denatured proteins measured by pulse eld gradient nmr techniques. Biochemistry, v. 38, n. 50, p. 1642416431, 1999. Dispon vel em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi991765q>.

69

[63] DU, L. et al. A study on the interaction between ibuprofen and bilayer lipid membrane. Electrochimica acta, Elsevier, v. 51, n. 26, p. 57545760, 2006. [64] MADANI, M.; ALY, S.; EL-SAYED, S. Dielectric relaxation of new aniline methyl methacrylate copolymer synthesized by gamma irradiation initiated polymerization. High Performance Polymers, SAGE Publications, v. 22, n. 5, p. 515533, 2010. [65] ASAKA, K.; OTTOVA, A.; TIEN, H. Mediated electron transfer across supported bilayer lipid membrane (s-blm). Thin Solid Films, Elsevier, v. 354, n. 1, p. 201207, 1999. [66] LIU, Y. et al. Direct electrochemistry of horseradish peroxidase immobilized on gold colloid/cysteine/naon-modied platinum disk electrode. Sensors and Actuators B: Chemical, v. 115, n. 1, p. 109115, 2006. Dispon vel em: <http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0925400505007744>. [67] MEIER, mistry. J. P. C.; ZUND, & sons, R. E. Statistical ISBN methods in analytical Dispon vel cheem:

Wiley

2000.

9780471293637.

<http://www.worldcat.org/isbn/9780471293637>. [68] CRAWLEY, M. J. The R Book. 1st. ed. [S.l.]: Wiley Publishing, 2007. ISBN 0470510242, 9780470510247. [69] LAVIRON, E. General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diusionless electrochemical systems. Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry, v. 101, n. 1, p. 1928, 1979. ISSN 0022-0728. Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022072879800753>. [70] SANTOS, M. C. dos et al. Electrochemical studies on small electron transfer proteins using membrane electrodes. Journal of Electroanalytical Chemistry, v. 541, n. 0, p. 153162, 2003. ISSN 1572-6657. Dispon vel em:

<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022072802014274>. [71] GOSSER, D. K. J. Cyclic voltammetry: simulation and analysis of reation machanisms. [S.l.]: New York, 1993.

70

[72] HUANG, J.; ZHENG, J.; SHENG, Q. Direct electrochemistry of myoglobin based on electrodeposition of pd nanoparticles with carbon ionic liquid electrode as basic electrode. Microchimica Acta, Springer Wien, v. 173, p. 157163, 2011. ISSN 00263672. 10.1007/s00604-010-0529-4. Dispon vel em: <http://dx.doi.org/10.1007/s00604010-0529-4>. [73] KAMYABI, M. et al. Electrocatalytic oxidation of ascorbic acid and simultaneous determination of ascorbic acid and dopamine at a bis(4-(4-pyridyl)-2,2:6,2terpyridine)iron(ii) thiocyanate carbon past modied electrode. Journal of Electroanalytical Chemistry, v. 632, n. 12, p. 170176, 2009. ISSN 1572-6657. Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022072809001417>. [74] KAMIN, R. A.; WILSON, G. S. Rotating ring-disk enzyme electrode for

biocatalysis kinetic studies and characterization of the immobilized enzyme layer. Analytical Chemistry, v. 52, n. 8, p. 11981205, 1980. Dispon vel em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac50058a010>. [75] LIU, A. Direct electrochemistry of myoglobin in titanate nanotubes lm. Anal. Chem, v. 77, p. 80688074, 2005. [76] BATTISTUZZI, tein try, G. et from p. al. Redox spinach. 97100, properties Journal ISSN of of the basic blue pro-

(plantacyanin) v. 69, n. 12,

Inorganic

Biochemisem:

1998.

0162-0134.

Dispon vel

<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0162013497100265>. [77] TANIGUCHI, V. T. et al. Thermodynamics of metalloprotein electron transfer reactions. Pure and Applied Chemistry, v. 52, p. 22752281, 1980. [78] WILLIT, J. L.; BOWDEN, E. F. Adsorption and redox thermodynamics of strongly adsorbed cytochrome c on tin oxide electrodes. Journal of Physical Chemistry, ACS Publications, v. 94, n. 21, p. 82418246, 1990. Dispon vel em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/j100384a048>.

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[79] IVANOVA, V. M. E. Direct electron transfer of haemoglobin and myoglobin in methanol and ethanol at didodecyldimethylammonium bromide modied pyrolytic graphite electrodes. Electrochemistry Communications, v. 7, p. 323327, 2005. OME, [80] GOHY, J.; ANTOUN, S.; JER R. ph-dependent micellization of poly (2vinylpyridine)-b lock-poly ((dimethylamino) ethyl methacrylate) diblock copolymers. Macromolecules, ACS Publications, v. 34, n. 21, p. 74357440, 2001. [81] QIAO, K.; LIU, H.; HU, N. Layer-by-layer assembly of myoglobin and nonionic poly(ethylene glycol) through iondipole interaction: An electrochemical study. Electrochimica Acta, v. 53, n. 14, p. 4654 4662, 2008. ISSN 0013-4686. Dispon vel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468608001576>. [82] STIGTER D., A. D. D. K. Protein stability: Electrostatics and compact denatured states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 88, n. 10, p. 41764180, 1991. Cited By (since 1996) 72. Dispon vel em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2>.

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APENDICE A -- Manuscrito submetido ao peri odico The Open Journal of Electrochemistry - ISSN 1876-505X

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APENDICE B -- Imobilizacao covalente de Mb em sistema EDC/NHS

Os resultados a seguir constituem um exerto parcial de atividades conduzidas no Lab. de Bioqu mica da UNIFAL-MG, e constantes do Exame de Qualica c ao referente a este projeto de pesquisa. Resumidamente, foram conduzidas tentativas de imobilizacao covalente de Mb para posterior estudo de altera co es de transfer encia de carga combinadas a plaus veis mudan cas conformacionais na estrutura de mioglobina, monitoradas por uma t ecnica sugerido com ineditismo, voltametria diferencial de explora ca o t ermica, ` despeito do sucesso parcial na obten juntamente com t ecnicas espectrosc opicas. A c ao do biosensor ligado a ` superf cie de eletrodo de ouro pela rea ca o conjunta de acido mercaptoundecaenoico com 1-etil-3-3-dimetilaminopropilcarbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinamida (NHS), preferiu-se n ao utilizar o biosensor para os estudos termodin amicos pretendidos, uma vez que n ao foi poss vel comprovar a natureza covalente da liga c ao de Mb a ` superf cie do eletrodo, condi c ao prim aria para os ensaios termodin amicos em temperatura elevada.