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UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR

Tnia Dalila de Jesus Barcelos

COBRE :
V ITAL OU P REJUDICIAL PARA A S ADE H UMANA ?

DISSERTAO PARA A OBTENO DO GRAU DE MESTRE EM MEDICINA PELA UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR

ORIENTADOR: Professor Doutor Jos Lus Ribeiro Themudo Barata

Covilh, Junho de 2008

UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR


FACULDADE DE CINCIAS DA SADE

Tnia Dalila de Jesus Barcelos

COBRE :
V ITAL OU P REJUDICIAL PARA A S ADE H UMANA ?

Dissertao realizada sob orientao de Professor Doutor Jos Lus Ribeiro Themudo Barata1

Licenciado em Medicina pela Faculdade de Medicina em Lisboa, Especialista em Medicina Interna com Graduao em Consultor, Especialista em Medicina Desportiva pela Ordem dos Mdicos, Mestre em Medicina Desportiva pela Faculdade de Medicina de Lisboa, Doutorado em Medicina Interna pela Faculdade de Medicina de Lisboa, Professor da Faculdade de Medicina da Universidade da Beira Interior e de Fisiologia do Esforo do Departamento de Cincias do Desporto da UBI e Director do Servio de Nutrio e Actividade Fsica do Centro Hospitalar da Cova da Beira, e da Consulta de Obesidade e Controle do Peso do mesmo Centro Hospitalar.

O princpio da sabedoria desej-la [Ibn Gabirol]

Resumo

O cobre um oligoelemento essencial para muitas funes fisiolgicas. Existem mecanismos homeostticos que permitem que este actue como cofactor em processos enzimticos e que previnem a acumulao de cobre em nveis txicos. Esta dissertao tem como objectivo primordial compreender o papel biolgico do cobre na fisiologia humana. A importncia do cobre justificada pelo seu papel na transferncia de electres nas actividades enzimticas de oxidao-reduo, fisiologicamente importantes. Destaca-se o envolvimento do cobre na defesa contra o dano oxidativo e, ao mesmo tempo, a sua capacidade para formar radicais hidroxil, atravs da reaco de Fenton. Nesta dissertao procurou-se avaliar as necessidades nutricionais dirias de cobre, com exposio das DDRs recomendas, da

biodisponibilidade e do metabolismo do cobre. Incidiu-se sobre as consequncias da deficincia bem como do excesso de cobre. Foi tambm focada a existncia de erros genticos do metabolismo do cobre. Para tal, organizou-se uma reviso da literatura publicada sobre a temtica, utilizando a base de dados MEDLINE. A principal concluso que, apesar de ser necessria a reavaliao dos dados publicados e a realizao de novas investigaes, o cobre um elemento Vital para a Sade Humana.

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Palavras Chave

Cobre Bioqumica do cobre Papel biolgico do cobre Dose diria recomendada Metabolismo do cobre Cuproenzimas Doena de Wilson Doena de Menkes Deficincia de cobre Toxicidade do cobre Radicais livres

viii

Abstract

Copper is an essential trace element for many physiological functions. Homeostatic mechanisms exist to allow copper to act as a cofactor in enzymatic processes and to prevent the accumulation of copper in toxic levels. The primary objective of this thesis is understand the copper biological role in human physiology. Copper importance is justified by its role in the electrons transfer in the enzymatic oxidation-reduction activities, physiologically importants. It was here presented the copper involvement in defence against oxidative damage and at the same time, their ability to form hydroxyl radical by the Fenton reaction. In this dissertation it was evaluated the daily nutritional copper needs, with exposure of recommended DDRs, bioavailability and copper metabolism. It was focused the consequences of copper deficiency and copper excess, and the existence of genetic errors of copper metabolism. To this end, it was organized a review of published literature on this thematic, using the database MEDLINE. The main conclusion is that, although it is required a re-assessment of the published data and new researchs, copper is a Vital element to Human Health.

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Keywords

Copper Copper biochemistry Biological role of copper Recommended daily needs Copper metabolism Cuproenzymes Wilsons disease Menkes disease Copper deficiency Copper toxicity Free radicals

Agradecimentos

Pela primeira vez sentimo-nos desassossegados. As palavras ganham um novo sentido quando no se tornam previsveis; ganham nova vida quando propem olhares e despertam perplexidades, quando inquietam o pensamento. E tornam-se sempre insuficientes quando com elas queremos dizer o que nos vai para l da alma. Como agora.

Desejo expressar o meu agradecimento ao Professor Doutor Jos Lus Ribeiro Themudo Barata, responsvel como orientador, pelo esprito crtico e construtivo que me incutiu no decorrer deste trabalho, marcante na minha forma de encarar a investigao cientfica.

Aos meus pais, por incutirem o amor ao estudo e realizao profissional, entre outros valores que regem a minha vida, pelo apoio na superao dos diversos obstculos e por terem suportado os encargos dos meus estudos. Sei que a vs que devo o facto de ser aquilo que sou hoje. minha restante famlia, pela sua compreenso, carinho e pelos seus sbios conselhos.

Ao Srgio, pelo apoio incondicional e incentivo sempre demonstrado, pela companhia, pelo carinho e toda a confiana em mim depositada.

xi

ndice

CAPTULO 1. INTRODUO 1.1 Motivao e Enquadramento Terico 1.2 Metodologia 1.3 Organizao do texto 1.4 Notao

1 2 4 4 5

CAPTULO 2. CARACTERIZAO DO COBRE 2.1 Generalidades 2.2 Identificao do elemento 2.3 Propriedades fsicas e qumicas

6 7 7 9

CAPTULO 3. QUMICA FISIOLGICA 3.1 Resenha Histrica 3.2 Papel biolgico do cobre 3.3 Aspectos nutricionais, biodisponibilidade e recomendaes gerais 3.4 Metabolismo 3.4.1 Absoro 3.4.2 Transporte e Distribuio

10 11 13 19 23 23 26

"##

3.4.3 Excreo 3.5 Bases Moleculares da Homeostase do Cobre 3.5.1 Transferncia do cobre atravs das membranas celulares 3.5.2 Reduo do Cobre 3.5.3 ATPases transportadoras de cobre 3.5.4 Metalotionenas e Metalochaperones

28 29 30 32 33 34

CAPTULO 4. ERROS GENTICOS DO METABOLISMO DO COBRE 4.1 Introduo 4.2 Doena de Menkes 4.3 Doena de Wilson 4.4 Outros sndromes hereditrios relacionados com o cobre

37 38 39 41 44

CAPTULO 5. EFEITOS BIOLGICOS DA DEFICINCIA E DO EXCESSO DE COBRE 5.1 Deficincia 5.2 Toxicidade 5.2.1 Bases bioqumicas para a toxicidade do cobre 5.2.2 Toxicidade do cobre em humanos 5.2.3 Cobre como um pr-oxidante

46 47 54 54 56 58

CAPTULO 6. CONCLUSO 6.1 Principais Concluses 6.2 Linhas orientadoras de trabalhos futuros

60 61 62

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

64

"###

Lista de Tabelas e Figuras

Tabela 2.1 Estados oxidativos do cobre Tabela 2.2 Propriedades fsicas e qumicas do cobre e de alguns sais de cobre Tabela 3.1 - Enzimas cupro-dependentes Tabela 3.2 - Factores de transcrio gentica dependentes do cobre Tabela 3.3 - Concentrao de cobre nos alimentos Tabela 3.4 - Dose Diria Recomendada para o cobre (g/dia) Tabela 3.5 - Promoo e inibio da absoro intestinal de cobre Tabela 3.6 - Locais de armazenamento de cobre Tabela 3.7 - Concentrao de cobre nos fludos e tecidos corporais em adultos Tabela 4.1 - Doenas genticas associadas a alteraes do metabolismo do cobre Tabela 4.2 - Manifestaes clnicas da Doena de Wilson Tabela 5.1 - Valores sricos normais de cobre e ceruloplasmina

8 9 14 17 21 22 26 27 28 38 43 54

Figura 3.1 - Modelo da transcrio regulada pelo cobre Figura 3.2 - Elementos da homeostase do cobre e defeitos da DW e da DM Figura 3.3 - Modelo do metabolismo do cobre na clula heptica Figura 4.1 - Anis de Kayser-Fleischer

18 31 36 43

xiv

Abreviaturas e Acrnimos

aC Antes de Cristo ADN cido desoxirribonucleico BHE Barreira Hematoenceflica Ca Smbolo qumico do clcio CP Ceruloplasmina Cu Smbolo qumico do cobre DDR Dose diria recomendada DM Doena de Menkes DW Doena de Wilson K Smbolo qumico do potssio MT Metalotionena Na Smbolo qumico do sdio RL Radicais livres SOD1 Superxido Dismutase 1 WHO World Health Organization

xv

CAPTULO

1
Introduo

Captulo 1 Introduo

1.1 Motivao e Enquadramento Terico


A motivao que me impulsionou para esta temtica, est primordialmente relacionada com a convivncia e com o acompanhar da evoluo clnica de um familiar portador da Doena de Wilson (DW). Sendo o cobre o elemento implicado na progresso da mesma, tornou-se importante, para mim, aprofundar o conhecimento acerca deste mineral que, como outros oligoelementos, influi sobre vrios processos biolgicos. Naturalmente imps-se a questo: Ser o cobre vital ou prejudicial para a sade humana?, a qual acabou por ser o fundamento desta dissertao, constituindo a sua intitulao. Por outro lado, a fraca incidncia durante a minha formao acadmica neste tema, reforou a opo pelo mesmo. Desta forma, esta abordagem facilitar ainda a consolidao e aquisio de conhecimentos que certamente se revelaro importantes na minha vida futura enquanto profissional de sade. Em pleno sculo XXI, e apesar dos conhecimentos cientficos at agora adquiridos pelas vrias pesquisas experimentais e clnicas, em Portugal, deparamo-nos ainda com uma considervel lacuna em termos de informao sistematizada acerca da complexidade do papel do cobre na Sade Humana. Torna-se ento preponderante reunir e sintetizar os pontos de vista prevalecentes sobre a importncia e o impacto deste elemento na populao em geral. Assim, e tendo por base esta premissa, a presente tese tem por objectivo mostrar aspectos actuais, reforados pela literatura, no s sobre o papel biolgico mas tambm sobre aspectos deletrios do cobre na Sade Humana. Sendo o cobre o principal interesse cientfico desta dissertao, segue-se uma nota introdutria acerca deste elemento que se tem revelado essencial para o ser humano.

Captulo 1 Introduo

O cobre um elemento qumico que apresenta quatro estados de oxidao (Cu0, Cu+1, Cu+2 e Cu+3) predominando nos sistemas biolgicos como Cu+2. O io cuproso (Cu+1) instvel sendo facilmente oxidado a io cprico (Cu+2) [Linder et al., 1996]. As mudanas do estado de oxidao podem alterar os sistemas biolgicos, afectando diversas molculas atravs da oxidao (peroxidao de lpidos, dano do DNA por oxidao das bases nitrogenadas, por exemplo). Por outro lado, a transio entre estes diferentes estados de oxidao permite a participao deste elemento numa diversidade de actividades catalticas prprias da transferncia de electres [Uauy et al., 1998]. At 1928 sabia-se que o cobre era um constituinte da hemocianina pigmento responsvel pelo transporte de oxignio em invertebrados. Aps esta data, foi reconhecido como um elemento essencial para os vertebrados quando se demonstrou que a anemia em ratos alimentados somente base de leite podia ser corrigida pela adio de cinzas de origem animal e vegetal que continham sulfureto de cobre [Uauy et al., 1998]. Alm disso, hoje largamente conhecido que organismos to diferentes como as leveduras e os mamferos compartilham requisitos idnticos na regulao do metabolismo do cobre para garantir a correcta funo de vrias protenas. Recentemente, estudos bioqumicos e moleculares demonstraram que o cobre intervm em vrios processos homeostticos celulares agindo tanto como co-factor como componente alostrico de vrias cuproenzimas, conferindo-lhes uma estrutura apropriada para a aco cataltica. O cobre tal como outros ies, interfere tambm, na regulao da expresso gentica [Uauy et al. 1998; Caballero, 2005]. Sendo ento o cobre um micronutriente necessrio para a fisiologia humana e o terceiro oligoelemento mais comum do corpo humano, importa dissertar sobre os mecanismos envolvidos na bioqumica deste elemento. 3

Captulo 1 Introduo

1.2 Metodologia
Organizou-se uma reviso da literatura publicada sobre o estado da arte, utilizando-se a base de dados MEDLINE para a procura dos artigos. Foram pesquisados artigos utilizando as seguintes palavras-chave: copper, copper essenciality, copper diseases, copper metabolism, copper functions, copper excess e copper deficiency. Filtraram-se os documentos pelo idioma (ingls, espanhol e portugus) e pela sua data de colocao on-line (2000 at presente data). Aps leitura do abstract e, em alguns casos, aps leitura integral, foi possvel a seleco dos artigos mais relevantes para este trabalho e, por no ter informao suficiente acerca de determinados aspectos relevantes nesta area, procedeu-se ao alargamento do intervalo das datas para incluir os artigos disponveis desde 1998. Foram tambm utilizados artigos referenciados nos artigos primordialmente escolhidos, mesmo que publicados anteriormente s datas referidas. Foram includos trabalhos de reviso, estudos prospectivos, meta-anlises e ensaios clnicos. Por fim, procedeu-se pesquisa de alguns livros publicados na rea da Nutrio e da Bioqumica.

1.3 Organizao do texto


O texto da tese est organizado em 6 captulos. O Captulo 2 destinado caracterizao e descrio qumica do cobre. No Captulo 3 discutido o papel fisiolgico do cobre, so apontados os aspectos fundamentais do metabolismo e da sua homeostase. No Captulo 4 feita uma reviso das doenas genticas associadas

Captulo 1 Introduo

deficincia Doena de Menkes (DM) e ao excesso de cobre Doena de Wilson. No Captulo 5 versa-se acerca do efeitos biolgicos da deficincia e do excesso de cobre, bem como sobre a sua contribuio para a formao de radicais livres. O Captulo 6 conclui a tese e apresenta algumas direces que se crem importantes para o desenvolvimento de trabalhos futuros.

1.4 Notao
As figuras e tabelas so identificadas com referncia ao captulo em que so apresentadas e so numeradas de forma sequencial no captulo respectivo. A identificao das referncias bibliogrficas representada entre parnteses rectos [].

CAPTULO

2
Caracterizao do Cobre

Captulo 2 Caracterizao do Cobre

2.1 Generalidades
O cobre aparece na Natureza, na sua forma metlica, em minrios e minerais, sendo um dos primeiros metais utilizados pelo Homem. Esta utilizao tem sido referenciada desde 5000 aC na regio do Egeu, onde o cobre serviu para a criao de objectos de arte valiosos. A palavra cobre tem origem do latim cuprum, derivada de Cyprum, nome latino da ilha do Chipre, considerada pas do cobre por excelncia, assim como Espanha. O cobre utilizado em sistemas internos, canalizaes e utenslios de cozinha, na produo de fios elctricos, em aplicaes de microelectrnica, na galvanoplastia e fotografia, como material de telhados e como catalisador na indstria qumica.

2.2 Identificao do elemento


O cobre um membro dos elementos de transio, sendo o primeiro do grupo IB da Tabela Peridica. Tem smbolo qumico Cu, nmero atmico 29 e peso anatmico de 63.546. Possui dois istopos estveis,
63

Cu e

65

Cu, com uma abundncia relativa de

69.2% e de 30.8%, respectivamente. Este elemento apresenta quatro estados de oxidao: Cu0, Cu+1, Cu+2 e Cu+3, de forma excepcional (Tabela 2.1). Nos sistemas biolgicos predomina como Cu+2. O io cuproso instvel sendo facilmente oxidado a io cprico [Linder et al., 1996]. Tm sido caracterizados istopos radioactivos, sendo os mais estveis o
67

Cu, o

64

Cu e o

61

Cu com uma vida mdia de 61.83, 12.7 e 3.333

horas, respectivamente. Os restantes, com massas atmicas entre 54.966 (55Cu) e 78.955 (79Cu), tm uma vida mdia inferior a 23.7 minutos, sendo que a maioria no alcana os 30 segundos.

Captulo 2 Caracterizao do Cobre

Tabela 2.1 Estados oxidativos do cobre Estado Oxidativo Cu Cu Cu


0 +

Cobre Cobre metlico Io cuproso Io cprico Io trivalente Cu

Consideraes Instvel em pH neutro, oxidado a Cu+2 pelo ar Estvel

Cu+2
+3

Frmula estrutural

O cobre encontrado numa grande variedade de sais minerais e de compostos orgnicos, podendo tambm ser encontrado na Natureza na sua forma metlica, como anteriormente referido. O metal possui uma cor castanho-avermelhada, malevel, um bom condutor trmico e um excelente condutor elctrico. A forma metlica estvel em ar seco e em baixas temperaturas, no entanto sofre uma reaco lenta na presena de ar hmido para produzir um hidroxicarbonato ou um hidrosulfato que forma uma pelcula de cor cinzento-esverdeado sobre a superfcie subjacente para proteco do metal. O cobre metlico moderadamente solvel em gua, sal e em solues ligeiramente cidas, podendo ser dissolvido em cido ntrico e cido sulfrico bem como em solues bsicas de hidrxido de amnio, carbonato de amnio e cianeto, na presena de oxignio [EHC 200, 1998]. A configurao electrnica da forma metlica (Cu0) 1s22s22p63s23p63d104p1. Os estados de oxidao mais comuns so o cuproso (Cu+1 3d10) e o cprico (Cu+2 3d9). A qumica do elemento, especialmente nos sistemas biolgicos, profundamente alterada pelo estado electrnico/de oxidao. A facilidade com que ocorre alterao do estado de oxidao fornece a este elemento propriedades redox que podem ser de natureza essencial ou deletria nos sistemas biolgicos.

Captulo 2 Caracterizao do Cobre

O estado de oxidao mais importante em ambientes aquosos o cprico. O io cprico liga-se, preferencialmente atravs do oxignio, a ligandos inorgnicos (H2O, OH-, CO3-2, SO4-2, etc.) e a ligandos orgnicos atravs de grupos fenlicos e carboxlicos. A forma trivalente de cobre encontrada apenas em alguns compostos e um forte agente oxidante.

2.3 Propriedades fsicas e qumicas


As propriedades fsicas e qumicas do cobre e alguns dos seus sais encontram-se sumarizadas na Tabela 2.2.

Tabela 2.2 Propriedades fsicas e qumicas do cobre e de alguns sais de cobre Cobre Frmula Molecular Massa molecular relativa Ponto de ebulio Ponto de fuso Solubilidade na gua
Adaptado de EHC 200, 1998

Cu 63.55 2567 1083,4 Insolvel

Sulfato de Cobre CuSO4 159.6 Decompe-se em CuO a 650C Decompe-se parcialmente a > 200C 143 g/L a 0C

xido cuproso Cu2O 141.3 1235 Praticamente Insolvel

Hidrxido de Cobre Cu(OH)2 97.56 Decompe-se a 140C Decompe-se 2.9 mg/L a 25C

Cloreto de Cobre CuCl2 134.45 Decompe-se a 993 C 620 706 g/L

CAPTULO

3
Qumica Fisiolgica

Captulo 3 Qumica Fisiolgica

3.1 Resenha Histrica


O cobre foi identificado em plantas e animais no sculo XIX e proclamado como catalisador biolgico no sculo XX. Ao longo dos anos foram surgindo novos conhecimentos acerca deste elemento, que ajudaram a estabelecer o seu importante papel nas funes fisiolgicas do ser humano. Estudos delineados para testar a necessidade de cobre, em animais de grande porte foram primordialmente incitados pela hemocianina, molcula que transporta oxignio nos invertebrados e que contm cobre [Pedroso e Lima, 2001]. No entanto, a potencial necessidade de cobre nos humanos no foi reconhecida at 1928, altura em Hart et al. documentaram que o cobre seria um elemento essencial para a formao de eritrcitos em ratos alimentados com uma dieta exclusivamente base de leite. A consequente anemia foi corrigida pela adio de cinzas de origem animal ou vegetal dieta, na qual o precipitado de sulfureto de hidrognio, que continha sulfureto de cobre, foi responsvel pela recuperao. Achados semelhantes em humanos estabeleceram a base para a essencialidade deste elemento [Pedrosa e Cozzolio, 1999]. Estudos realizados no sculo passado, nos anos 60 em crianas desnutridas do Peru e nos anos 70 no Chile, evidenciaram a recuperao dos doentes com anemia refractria ao tratamento com ferro, neutropenia e anomalias na medula ssea, aps suplementao da dieta com cobre [Uauy et al., 1998]. No conjunto, estes estudos estabeleceram que o cobre necessrio para o crescimento, mecanismos de defesa, mineralizao ssea, maturao de eritrcitos e leuccitos, transporte de ferro, metabolismo do colesterol, contractilidade do miocrdio, metabolismo da glicose e desenvolvimento cerebral [Linder et al., 1998].

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

Depois de reconhecida a particular importncia do cobre na sntese de hemoglobina em ratos, o metabolismo do cobre passou a ser objecto de discusso e alvo de profcua investigao. Foram realizados vrios estudos em cadveres humanos, entre 1930 e 1940 [Turnlund, 1998], no entanto, os resultados desta investigao nunca tero sido publicados at 1944 [Wintrobe et al., 1952], altura em que Cartwright e Wintrobe iniciaram uma investigao acerca do metabolismo do cobre num grupo de indivduos saudveis, composto por estudantes de medicina, mdicos, enfermeiros e tcnicos de laboratrio, com idades compreendidas entre os 17 e 45 anos. Estes autores estimaram a percentagem de cobre que seria absorvida perante uma dieta normal, a percentagem que seria excretada pelas diferentes vias de excreo e a quantidade de cobre presente nos diferentes rgo de acumulao de cobre [Mercer, 1998]. Foi descrito que o cobre seria um componente essencial da dieta para a manuteno da cor do plo em vrias espcies de animais. Keil e Nelson, em 1931, constataram que ratos pretos tornaram-se cinzentos quando alimentados com uma dieta pobre em cobre. As doenas genticas associadas a alteraes do metabolismo do cobre, nomeadamente a doena de Wilson e a doena de Menkes, so conhecidas pelo Homem vrios anos. A doena de Wilson conhecida desde 1883, quando Westphal a denominou de pseudoesclerose ao observar a presena de tremores e rigidez em dois pacientes. Strmpell, em 1898, evidenciou uma doena no fgado aquando da autpsia de dois pacientes portadores de tremores. Em 1912, Kinnier Wilson descreveu a forma clssica da doena, correlacionando a sintomatologia dos gnglios da base doena do fgado, denominando-a ento de degenerao lenticular progressiva. Hall, em 1921, descreveu a doena como degenerao hepatolenticular [Brito et al., 2005]. Em 1930 na 12

Captulo 3 Qumica Fisiolgica

Austrlia, cientistas veterinrios descreveram o papel importante do cobre no desenvolvimento neurolgico atravs da associao da deficincia de cobre com a doena desmielinizante em borregos com ataxia. Quarenta anos mais tarde, Danks identificou a doena de Menkes como um exemplo humano de desenvolvimento neurolgico anormal devido deficincia de cobre. Todos estes estudos contriburam, de alguma forma, para estabelecer o papel biolgico do cobre, compreender a cintica e o metabolismo e interpretar a reaco orgnica perante o dfice ou excesso de cobre, nos seres humanos.

3.2 Papel biolgico do cobre


O cobre foi reconhecido como um nutriente essencial para o Homem h cerca de 80 anos, quando, como j mencionado, Hart et al. documentaram que este seria um elemento essencial para a eritropoiese em ratos alimentados exclusivamente com leite. O rpido desenvolvimento no campo analtico e na biologia celular permitiram uma melhoria da compreenso do papel do cobre nas deficincias imunolgicas, no tecido conjuntivo e esqueleto, na eritropoiese, nos vasos sanguneos e no sistema nervoso. A necessidade biolgica de cobre deve-se h sua incorporao especfica num grande nmero de protenas estruturais e enzimticas [Linder e Hazegh-Azam, 1996]. O papel do cobre nas actividades enzimticas de oxidao/reduo consequncia da sua capacidade para funcionar como um intermedirio da transferncia de electres. Deste modo, o cobre est presente nas enzimas envolvidas na respirao celular, na defesa contra radicais livres, na funo de neurotransmisso, na sntese de tecido conjuntivo e no metabolismo celular do ferro [EHC 200, 1998]. Em algumas delas, o cobre 13

Captulo 3 Qumica Fisiolgica

necessrio como co-factor, como no caso da superxido dismutase 1 (SOD1), da citocromo-c oxidase, da ceruloplasmina e da tirosinase, tambm conhecida como monofenol monoxigenase (Tabela 3.1). Alm disso, a actividade oxidase da ceruloplasmina e da SOD1 requer especificamente a presena de cobre. Noutros casos, o cobre parece actuar como componente alostrico de algumas enzimas, conferindo-lhes uma estrutura apropriada para as suas actividades catalticas. O cobre no pode ser substitudo por outro elemento j que apenas este proporciona as propriedades redox necessrias nestas protenas.

Tabela 3.1 - Enzimas cupro-dependentes. Enzima Citocromo-c oxidase Superxido dismutase 1 Tirosinase Protena-lisina 6-oxidase Amino-oxidases Ceruloplasmina Dopamina-!-monooxigenase (ou hidroxilase) Peptidilglicina monooxigenase Respirao celular Defesa antioxidante Sntese de melanina, metabolismo de aminocidos Ligao cruzada do colagnio e elastina Desaminao das aminas primrias Transporte de cobre, oxidao Sntese de catecolaminas "-amidao de neuropptidos Funo

Adaptado de Uauy et al. (1998), Essentiality of copper in humans, Am J Clin Nutr, 67: 952S - 959S.

A citocromo-c oxidase uma protena complexa da membrana mitocondrial interna, a ltima da cadeia transportadora de electres, que catalisa a reduo do oxignio molecular em gua, um passo essencial da respirao celular. Neste processo, d-se a translocao de quatro protes que ajudam na formao de um potencial quimiosmtico que usado pela ATP sintetase para a formao de ATP. Nesta enzima, esto presentes 3 tomos de cobre: dois tomos na subunidade I, envolvidos na transferncia de electres do citocromo para o centro heme a3-CuB e um tomo na 14

Captulo 3 Qumica Fisiolgica

subunidade II, cuja funo consiste na reduo do dioxignio. A deficincia de cobre resulta numa reduo da actividade da citocromo-c oxidase e da capacidade respiratria das mitocndrias, particularmente no fgado, corao e crebro [Uauy et al., 1998]. A ceruloplasmina (CP) uma oxidase, produzida principalmente ou exclusivamente no fgado, que contm mais de 90% do cobre srico total encontrado nos vertebrados. A sua estrutura cristalide confirma a presena de seis ies de cobre fortemente ligados, trs dos quais formam o centro I, envolvido no processo de transferncia de electres. Os restantes trs consistem num centro trinuclear nico o qual corresponde ao local de activao do oxignio durante o ciclo cataltico da enzima. Esta enzima est envolvida nas reaces de fase aguda da inflamao e na remoo de radicais livres (RL), protegendo as clulas contra o dano celular oxidativo. O metabolismo do ferro e do cobre esto interligados pela actividade ferroxidase da ceruloplasmina. A ceruloplasmina oxida o Fe+2 (io ferroso), libertado pela ferritina intracelular, atravs de uma reduo ou chelao, para que possa ser ligado transferrina, que apenas se une ao Fe+3 (io frrico). Assim, a deficincia de

ceruloplasmina acompanhada pela acumulao de ferro no fgado [Harris e Gitlin, 1996]. O papel da SOD1 foi alvo de estudo intensivo. Esta enzima, abundante no fgado, rim e eritrcitos, catalisa a dismutao dos anies superxido (O2-) no citoplasma, os quais so sub-produtos da respirao celular. Durante a dismutao, o cobre do centro activo da SOD1 reduzido pelo substrato O2- dando origem a dois metabolitos: o oxignio molecular (O2) e o perxido de hidrognio (H2O2) e proporcionando uma defesa contra radicais livres de oxignio. Nesta reaco o cobre 15

Captulo 3 Qumica Fisiolgica

no pode ser substitudo por qualquer outro metal, porque apenas este confere actividade cataltica a esta enzima, como anteriormente referido. Isto fundamenta a funo antioxidante do cobre [Pedrosa e Cozzolino, 1999]. Mutaes genticas que modifiquem a SOD1 esto relacionadas a um aumento da apoptose das clulas neuronais. Estas mutaes esto associadas a 20-25% dos casos de Esclerose Lateral Amiotrfica. A tirosinase a enzima responsvel pela sntese de melanina, a qual confere proteco contra a exposio a raios ultra-violeta e responsvel pela colorao do cabelo, pele e olhos. Esta enzima composta por uma, duas ou quatro subunidades com um centro binuclear de cobre [Linder e Hazegh-Azam, 1996]. A dopamina-!-monooxigenase ou hidroxilase a enzima principal da produo de catecolaminas, envolvidas na transmisso neuronal no sistema nervoso central assim como na resposta ao stress mediada pelas glndulas supra-renais. Esta enzima possui dois tomos de cobre em cada uma das suas quatro subunidades. Assim, o cobre considerado um componente major para dos centros catalticos das diferentes enzimas redox, sendo a sua presena essencial para a funo fisiolgica normal, como a respirao celular, defesa contra radicais livres de oxignio, sntese de melanina, biossntese de tecido conjuntivo e metabolismo do ferro. Assim como outros metais, o cobre tem um papel importante na expresso gentica, pela activao ou represso da transcrio gentica. Estudos da transcrio em leveduras permitiram a identificao dos mecanismos de aco dos factores de transcrio regulados pelo cobre em eucariontes [EHC 200, 1998].

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

O papel do cobre na funo das protenas ligadas a este elemento foi demonstrado para Ace1, Mac1 e Amt1 (Tabela 3.2), que correspondem a um conjunto de protenas que actuam a nvel fisiolgico como factores de transcrio e possuem um domnio obrigatrio de cobre, necessrio para a ligao ao ADN. O mecanismo da regulao transcricional pelo Ace1 e Amt1 envolve a unio do factor de transcrio, induzida pelo cobre, a uma sequncia de activao especfica do promotor da

metalotionena (MT). Elementos que respondem a metais (Figura 3.1) foram encontrados em todos os promotores da metalotionena, caracterizados por uma srie de repeties dos pares de bases 13-15. Outra protena reguladora a Cup 9, identificada em leveduras. Esta protena pode actuar como um factor transcricional que regula a expresso dos genes envolvidos na distribuio intracelular de cobre [Uauy et al., 1998].

Tabela 3.2 - Factores de transcrio gentica dependentes do cobre. Factor de transcrio Mac1
1

Funo Armazenamento celular de cobre e tampo Catalase citoslica Redutase cobre/ferro da membrana Armazenamento celular de cobre e tampo Dismutao de superxido Armazenamento celular de cobre e tampo Dismutao de superxido Distribuio celular de cobre

MT CTT1 FRE1 Amt1


1

MTI, MTII! e MTII" SOD1 Ace1


1

MT SOD1 Cup9
1

Cobre como factor alostrico de factores de transcrio. O cobre absolutamente necessrio para a unio ao DNA. 2Gene alvo desconhecido. MT- metalotionena; SOD- superoxido dismutase. [Uauy et al. 1998]

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

Uma importante caracterstica dos factores de transcrio cupro-dependentes (Ace1, Amt1 e Mac1) a sua associao com outros genes relacionados com processos fisiolgicos. O promotor da SOD1 contm um stio nico de ligao para o Ace1 que regula a transcrio de MT e de SOD1 como resposta ao cobre. Alm disso, a Mac1 regula a transcrio de dois genes alvo: o FRE1 (codifica uma protena de membrana plasmtica associada reduo de Cu+2 e Fe+3) e o CTT1 (codifica a catalase citoslica). Estudos indicam que a ausncia de cobre produz efeitos dramticos em alguns processos celulares, como a proliferao, o crescimento e a actividade metablica. Alguns destes efeitos relacionam-se com disfunes dos factores de transcrio cuprodependentes, sugerindo, portanto, que o cobre tem um papel fundamental na fisiologia das clulas eucariotas.

Figura 3.1 - Modelo da transcrio regulada pelo cobre.

Os ies de cobre entram no ncleo celular e ligam-se s protenas reguladoras (Ace1, Mac1 e Amt1). Esta ligao activa-as para interagirem com a sequncia especfica dos elementos que respondem aos metais na 5 dos genes regulados por estes elementos.

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

Manifestamente so necessrios mais estudos sobre os mecanismos de transcrio regulada pelo cobre em mamferos incluindo o Homem, especialmente a nvel celular e molecular, relacionando os factores de transcrio cuprodependentes e os diferentes processos fisiolgicos celulares.

3.3 Aspectos nutricionais, biodisponibilidade e recomendaes gerais


O cobre um micronutriente encontrado em quantidades variveis na maioria dos alimentos assim como contaminante natural da gua. Desta forma, a incorporao corprea de cobre advm, maioritariamente, por via oral atravs da alimentao. As maiores concentraes de cobre esto presentes nos rgos dos animais (por exemplo, o fgado), marisco, frutos secos e cereais (Tabela 3.3). A concentrao de cobre nos alimentos varia de pas para pas, de acordo com o tipo de produto, condies de cultivo (solo, gua, uso de fertilizantes e fungicidas que contenham cobre), tipo de processamento e utilizao do produto, pH e uso de embalagens ou utenslios de cobre [Pedroso e Lima, 2001]. A ingesto mdia de cobre atravs da dieta varia , normalmente, entre 0.9 e 2.7 mg por dia. Esta variao reflecte os diferentes hbitos alimentares assim como os diferentes processamentos agrcolas em todo o mundo, como referido anteriormente. Em alguns casos o consumo de gua pode contribuir de forma adicional para a ingesto diria total de cobre, particularmente em habitaes mais antigas pela corroso das canalizaes [WHO, 2004]. 19

Captulo 3 Qumica Fisiolgica

Considerando que 10% do cobre total ingerido atribuvel ao consumo de gua, a WHO props uma guideline provisria da quantidade de cobre presente na gua de 2 mg/l, a qual considerada protectora contra os efeitos adversos do cobre, fornecendo uma margem de segurana adequada nas populaes com homeostase normal [Fitzgerald, 1998; WHO, 2004]. Este valor provisrio explicado da seguinte forma:

ID Ingesto diria de cobre tolervel; P Peso; % H2O Percentagem de cobre ingerido atribuvel ao consumo de gua; ID H2O Ingesto diria de gua; *Valor arredondado unidade.

Para o clculo do valor desta guideline, a WHO utilizou valores de 60 kg e 2 L para o peso corporal e para a ingesto diria de gua de um adulto, respectivamente. Foi tambm utilizada a percentagem de cobre ingerido atribuda ao consumo de gua. Na realidade, podem haver variaes considerveis em cada indivduo no entanto, os valores escolhidos para a obteno desta guideline so considerados suficientemente aceitveis para valores standard [Fitzgerald, 1998]. Uma ingesto diria tolervel definida como a quantidade de uma substncia presente nos alimentos ou na gua de consumo alimentar, expressa num peso corporal base, que pode ser ingerida diariamente, por um perodo indefinido e sem riscos apreciveis para a sade. Isto justifica o valor escolhido para a ingesto diria tolervel o qual foi proposto pelo princpio de que no suscitaria quaisquer problemas em termos de sade humana [Fitzgerald, 1998].

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Tabela 3.3 - Concentrao de cobre nos alimentos. Alimentos Leite Colostro Humano Humano Vaca Magro (em p) Fgado Bovino Cordeiro Rim de Bovino Bife Bovino Porco Cereais Milho Trigo Arroz Po de trigo Po de trigo integral Vegetais Batata Batata frita Batata-doce Cenoura Brcolos Ervilha Alface Tomate Couve Marisco/Peixe Atum Salmo Camaro Truta Solha Fruta Ma Banana Uva Pssego Anans Ameixa Laranja Gelado Chocolate Baunilha Morango Frutos Secos Passas Amendoim Amndoa Noz Cobre (mg/Kg) 0.57 (0.24 - 0.76) 0.2 - 0.76 0.1 - 0.88 0.7 157 56 2.1 - 4.3 0.1 - 1.8 0.1 - 9.1 0.6 - 16.6 3.3 - 36.0 0.6 - 3.1 2.9 3.4 0.48 - 16.0 2.2 - 3.6 0.15 0.37 - 0.62 0.68 - 0.87 1.9 - 2.4 0.1 - 2.9 0.1 - 3.4 0.1 - 1.7 0.1 - 1.2 0.5 - 0.8 2.0 - 2.9 0.1 - 3.3 0.1 - 2.5 0.1 - 2.3 0.74 - 1.5 1.1 - 1.4 0.86 - 0.96 3,7 - 5.0 0.8 - 0.9 0.7 - 3.0 0.3 - 3.4 0.1 - 0.9 0.1 - 1.4 2.7 - 4.1 2.7 - 9.6 9.7 - 13.6 2.0 - 13.9

Adaptado de Lnnerdal (1996), Bioavailability of copper, Am J Clin Nutr, 63: 821S - 829S.

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

Recentemente, o Canad e os EUA estabeleceram as doses dirias recomendadas (DDRs) para as diferentes idades (Tabela 3.4), as quais correspondem s adoptadas pela WHO. Segundo a WHO, o limite inferior do intervalo aceitvel de ingesto de cobre de 12,5 g/kg/dia, considerando as necessidades dos indivduos adultos e as variaes na absoro, reteno e armazenamento. Para crianas este valor de 50 g/kg/dia. A IOM recomenda um limite mximo para a ingesto de cobre em adultos de 10 mg/dia a partir de alimentos e suplementos [WHO, 2004].

Tabela 3.4 - Dose Diria Recomendada para o cobre (g/dia). Idade Lactentes < 6 meses 6-12 meses Crianas 1-3 anos 4-8 anos 9-13 anos 14-18 anos Adultos > 19 anos Mulheres grvidas Mulheres que amamentam
Adaptado de IOM, 2001; WHO, 2004

DDR 200 220 340 440 700 890 900 1000 1300

Sumarizando, a ingesto de cobre em adultos, no geral, varia entre 1 e 3 mg/dia contudo, o uso de suplementos vitamnicos/minerais podem aumentar este valor at 2 mg/dia. A gua consumida contribui com cerca de 0,1-1 mg/dia na maioria das situaes. Assim, a ingesto diria pode variar entre 1 e 5 mg/dia [WHO, 2004].

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

3.4 Metabolismo
Como anteriormente referido, desde 1944 vrios aspectos do metabolismo do cobre, em seres humanos, tm sido estudados [Cartwright e Wintrobe, 1964]. Desde essa altura, surgiram novos conhecimentos que permitiram estabelecer os mecanismos fisiolgicos actualmente descritos. Assim, possvel discutir, por ordem sequencial, a absoro, o transporte, a distribuio e a excreo de cobre.

3.4.1 Absoro
Nos mamferos , o cobre absorvido no estmago (ao contrrio de outros metais) e no intestino delgado, no entanto parecem existir diferenas entre vrias espcies no que diz respeito ao local de absoro mxima. Em ratos, o cobre absorvido a partir do estmago e duodeno, enquanto que nos hamsters a absoro ocorre no leo e no jejuno. O local de absoro mxima desconhecido nos seres humanos, contudo presume-se que ocorra no estmago e no intestino delgado proximal devido ao rpido aparecimento de cobre no plasma aps a administrao oral de
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Cu. A

contribuio do estmago parece, no entanto, ter menor importncia devido digesto incompleta dos alimentos neste rgo [Schmann et al., 2002]. A absoro varia entre 15 e 97%, dependendo do contedo de cobre e da composio da dieta alimentar [Turnlund, 1998]. Estudos com istopos estveis indicam que, aquando de uma ingesto de cobre dentro dos valores recomendados, ocorre uma adaptao da absoro relativamente s necessidades corporais: elevadas quantidades de cobre so absorvidas perante uma

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

baixa ingesto e vice-versa [Caballero, 2005]. Em ingestes extremas a percentagem absorvida pode decair para 10% (se as ingestes forem 10 vezes superiores ingesto recomendada). Em 1989 Turnlund et al., utilizando istopos estveis (65Cu), demonstraram que indivduos adultos apresentavam uma absoro mdia de 56% com uma dieta pobre em cobre (0,78 mg/dia), de 36% quando o nvel de cobre ingerido era de 1,68 mg/dia e de 12% quando a dieta continha 7,53 mg/dia de cobre. Numa actualizao deste estudo, Turnlund (1998) calculou a reteno de cobre atravs da avaliao da sua excreo pelas fezes durante 12 dias aps a administrao oral ou intravenosa, em indivduos voluntrios. Os resultados indicaram que 67% do cobre era retido pelo organismo perante uma ingesto de 0,38 mg/dia. Se a dose diria de cobre aumentasse para 0,66 mg/dia a percentagem de absoro baixava para 54% e para 44% se a ingesto fosse de 2,49 mg/dia. A percentagem da absoro total antes da excreo biliar endgena foi de 77, 73 e 66%, respectivamente, para as 3 doses. Foi observada uma variao similar da absoro em lactentes alimentados com frmulas com diferentes contedos de cobre, sendo a fraco absorvida mais elevada do que o observado nos adultos para a mesma dose mg/kg. Existem factores fisiolgicos, dietticos e patolgicos capazes de modificar a absoro de cobre [Wapnir, 1998]. Uma produo adequada de cido clordrico facilita a digesto no estmago e a disponibilidade de cobre no intestino delgado. Contrariamente, um pH alcalino no intestino promove a formao de hidrxido de cobre e de sais de cobre com uma baixa constante de dissociao, reduzindo assim a quantidade de metal disponvel para a absoro. A absoro tambm influenciada pela competio de vrios ies, incluindo o zinco, o ferro, o molibdnio, o chumbo e o cdmio. O zinco e o cdmio parecem ser os 24

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inibidores mais potentes da absoro, possivelmente pela competio com o cobre para o transporte e/ou pelo aumento das concentraes intestinais de metalotionenas. Estas consistem num grupo de pequenas protenas que se ligam a metais pesados, actuando na desintoxicao e na captao destes elementos. Os polmeros de glicose aumentam o cotransporte de cobre e gua para as clulas intestinais, no entanto, a frutose e outros hidratos de carbono, as fibras vegetais, os fitatos e a diminuio de sdio no lmen intestinal inibem a absoro intestinal [Wapnir, 1998]. Grandes concentraes de aminocidos e pptidos podem ligar-se ao cobre e reduzir a sua absoro. Contudo, em concentraes moderadas estes ligandos podem reduzir a formao de hidrxido de cobre e aumentar a absoro deste elemento [Schmann et al., 2002]. cidos orgnicos como os citratos, lactatos e o glutamato aumentam a solubilidade e a absoro de cobre (Tabela 3.5). Estudos clnicos sugerem que doses elevadas de cido ascrbico em humanos podem afectar a absoro assim como os nveis sricos de cobre e de ceruloplasmina, no entanto, os resultados deste estudo no foram consistentes com outros estudos. Os primeiros estudos realizados em segmentos isolados do duodeno sugerem que os ies de cobre entram nas clulas da mucosa intestinal por difuso simples [Linder e Hazegh-Azam, 1996]. Contudo, trabalhos recentes permitiram a identificao de vrios transportadores de cobre que podem transferir o cobre atravs das membranas celulares. Foi identificado um transportador de metais divalentes, DMT1, o qual significativamente expresso no duodeno proximal e nos rins, no entanto, pode ser encontrado em todos os tecidos [Lee et al., 2002]. Tambm podem existir outros

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

transportadores intestinais de cobre. Foi sugerido que a absoro intestinal de cobre catalisada pela Ctr1, a qual foi identificada pela primeira vez em leveduras. Esta protena expressa em todos os tipos celulares, at agora investigados, incluindo os entercitos e catalisa o transporte de Cu+1 atravs da membrana celular.

Tabela 3.5 - Promoo e inibio da absoro intestinal de cobre. Promoo Digesto gstrica adequada Concentraes adequadas de aminocidos e pptidos (reduzem a formao de hidrxido cprico) cidos orgnicos (aumentam a solubilidade do cobre) Inibio Diminuio de sdio e glicose no lmen intestinal pH alcalino no lmen intestinal Fitatos (pouco impacto) Elevadas concentraes de aminocidos e pptidos (aumento da ligao ao cobre no lmen) Ies divalentes (zinco e ferro)

A absoro de cobre controlada por processos homeostticos complexos (ver adiante). No entanto, a idade parece diminuir a sua eficincia originando um aumento das concentraes plasmticas de cobre na velhice [Wapnir, 1998].

3.4.2 Transporte e Distribuio


O cobre libertado a partir das clulas intestinais atravs de um transporte activo estabelecido por ATPases do tipo P, move-se atravs dos capilares da serosa para a circulao portal onde se liga, maioritariamente, albumina e transcuprina. Uma pequena quantidade do metal pode ligar-se a pptidos e a aminocidos, especialmente

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histidina [WHO, 2004]. A maior parte deste cobre chega rapidamente aos hepatcitos e uma pequena parte entra nos rins [Linder e Hazegh Azam, 1996 ; WHO , 2004], tornando o fgado o maior rgo distribuidor de cobre. Apenas quando a ceruloplasmina sintetizada e secretada no plasma se inicia uma incorporao aprecivel de cobre noutros tecidos. Assim, esta protena no participa no transporte de cobre do intestino para o fgado. Isto sugere a existncia de duas fases de distribuio aps a entrada do cobre na circulao sangunea, envolvendo o transporte de cobre pela transcuprina e a albumina para o fgado, incorporao do metal na ceruloplasmina durante a sua sntese e distribuio para outros tecidos atravs desta mesma protena [Linder e HazeghAzam, 1996]. O cobre ento armazenado em vrios rgos, sendo o fgado o nico capaz de o mobilizar em caso de balano negativo (Tabela 3.6). Na gravidez, o feto est dependente do cobre da circulao materna. Este acumula cerca de 50 g/kg de cobre por dia, principalmente na ltima metade da gravidez. Mais de metade do cobre armazenado no fgado, sobretudo na forma de metalotionena, sendo o crebro o segundo local de armazenamento para o feto. No fim da gestao este ter armazenado cerca de 15 mg de cobre, dos quais 9 mg se encontram no fgado. Depois do nascimento a concentrao de cobre no fgado decai, atingindo os nveis do adulto aos 6 meses de idade [EHC 200, 1998].

Tabela 3.6 - Locais de armazenamento de cobre. rgo Fgado Msculo esqueltico Crebro Tecido conjuntivo Sangue Rim Cobre armazenado (%) 20 40 20 8 8 8

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3.4.3 Excreo
Actualmente, os mecanismos pelos quais o cobre expulso do organismo no esto totalmente compreendidos. No entanto, evidente que do total absorvido e apesar da perda diria de cobre, apenas uma nfima parte entra na urina, e que a maior via excretria deste metal parece ser a blis (80%). A reduzida excreo de cobre pela urina (cerca de 30-60 g/dia) vai de encontro evidncia j existente de que h pouco ou nenhum cobre livre no plasma sanguneo e sugere que qualquer complexo de baixo peso molecular que pode ser filtrado a nvel renal reabsorvido [Linder e Hazegh-Azam, 1996]. As clulas epiteliais descamativas no parecem contribuir de forma significativa para a excreo de cobre. Apesar da elevada concentrao deste elemento no cabelo e unhas, as perdas dirias associadas no so importantes. A blis claramente o fludo corporal com maior concentrao de cobre, contribuindo com uma secreo diria de 2,5 mg de Cu no tubo digestivo (Tabela 3.7), o qual no reabsorvido.

Tabela 3.7 - Concentrao de cobre nos fludos e tecidos corporais em adultos. Fludo ou tecido Saliva Suco gstrico Blis Suco pancretico Urina Lquido cefaloraquidiano Linfa Sangue Plasma Rim Fgado Crebro Corao Msculo Esqueltico Cabelo/Unhas
Resumo da literatura de Linder e Hazegh-Azam, 1996.

Concentrao de cobre (g/g) 0,22 0,39 4,0 0,3-0,9 0,02-0,05 5 1,2 1,1 1,05 12 6,2 5,2 4,8 0,9 20/8-20

Excreo diria (g) 330-450 1000 2500 400-1300 30-75 -

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

Indivduos com DW apresentam uma incapacidade para secretar cobre na blis. Consequentemente manifestam excesso de cobre, especialmente no fgado. Assim, a excreo de cobre pela blis extremamente importante para o controle dos nveis hepticos de cobre [Turnlund, 1998].

3.5 Bases Moleculares da Homeostase do Cobre


O transporte e o metabolismo celular do cobre tm sido objecto de investigao activa. Sistemas modelo, incluindo seres procariontes e eucariontes unicelulares, forneceram dados importantes para a compreenso dos mecanismos moleculares envolvidos na homeostase do cobre em mamferos, incluindo seres humanos. A manuteno de uma homeostase adequada envolve uma coordenao entre a absoro, distribuio, armazenamento e excreo de cobre. A doena de Menkes e a doena de Wilson, decorrentes de erros genticos do metabolismo do cobre, permitiram uma melhor compreenso da absoro e excreo de cobre nas clulas eucariticas. Estudos realizados em organismos procariontes permitiram avaliar os mecanismos moleculares pelos quais o cobre transportado e conduziram identificao e compreenso dos homlogos funcionais em clulas eucariticas. Em termos gerais, o transporte de cobre a nvel celular envolve a passagem de cobre extracelular atravs da membrana celular por bombas especializadas. O cobre intracelular encaminhado para enzimas e organelos por protenas especializadas chamadas metalochaperones. Por fim, existem mecanismos especficos para libertar o cobre a partir das clulas. Os detalhes de como todas estas etapas so efectuadas

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

continuam incertos. A Figura 3.2 mostra os elementos chave da circulao de cobre em humanos, na medida em que se encontram actualmente compreendidos.

3.5.1 Transferncia do cobre atravs das membranas celulares


Em mamferos, o cobre da dieta absorvido atravs da membrana apical das clulas da mucosa intestinal, que revestem as vilosidades intestinais. Desde h muito tempo que se pensa que este transporte realizado atravs de difuso passiva, no entanto, foram identificadas vrias protenas que podem estar implicadas neste processo. O cobre, no intestino, absorvido pelo transportador de metais divalentes 1 (DMT1). Este transportador, expresso na Xenopus laevis, catalisa o transporte de uma variedade de metais, incluindo o magnsio, o ferro, o cobalto, o nquel e o cobre. O papel do DMT1 na absoro de cobre sustentado pela observao de que o tratamento de clulas com um oligoncletido alterado neste transportador resultou na reduo de 48% da absoro de cobre [Arredondo et al., 2003]. No entanto, a afinidade da DMT1 para o cobre baixa e a sua principal funo consiste na absoro de ferro. Dados recentes sugerem a existncia de uma ATPase na membrana de alta afinidade para a absoro de cobre, contudo ainda no foi identificada a nvel molecular. Uma protena transportadora de alta afinidade para o cobre, CTR1, foi identificada, contudo no est claro o seu papel na membrana da mucosa. Claramente, a questo de como o cobre absorvido pelas clulas intestinais requer mais investigao.

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

Figura 3.2 - Elementos chave da homeostase do cobre e defeitos da DW e da DM.

O cobre da dieta no intestino absorvido pelas clulas intestinais atravs da DMT1 e por um sistema ainda no identificado. As Metalotionenas (MT) podem suportar o excesso de cobre nestas ou noutras clulas. As ATPases de Menkes (M ATPase) exportam o cobre das clulas intestinais para a circulao. No sangue o cobre pode formar complexos com molculas pequenas como a histidina e ligar-se a protenas como a albumina e a transcuprina. O cobre passa para o fgado, provavelmente pelo envolvimento da CTR1. No hepatcito, o cobre transportado para a regiao trans do aparelho de Golgi pela ATPase de Wilson (W ATPase) para ser incorporado na ceruloplasmina (CP). Esta secretada na circulao. O excesso de cobre excretado para a blis pelos hepatcitos. Este processo tambm requer a actividade da ATPase de Wilson. O transporte de cobre atravs da barreira hemato-enflica (BHE) parece ser catalisada por uma ATPase de Menkes que expressa nas clulas endoteliais cerebrovasculares. Na Doena de Menkes (DM) as ATPases de Menkes no so funcionais, levando a uma acumulao de cobre no intestino e, concomitantemente, uma deficincia na maioria dos tecidos. O cobre administrado a nvel sistmico no pode ser transportado at ao crebro. Na Doena de Wilson, o defeito da ATPase de Wilson resulta na acumulao de cobre nos hepatcitos.

Investigaes realizadas em leveduras, nomeadamente na Saccharomyces cerevisiae, demonstraram que a CTR1 transporta Cu+1 atravs da membrana plasmtica. O seu homlogo no ser humano, hCTR1, foi identificado. Este expresso em todos os rgos e tecidos examinados, com o fgado, o corao, e o pncreas a exibir os nveis mais elevados, o crebro e o msculos os mais baixos e o intestinos os nveis intermdios. Este transportador parece ser o principal sistema de captao de cobre de todas as clulas [Lee at al., 2002]. Uma segunda protena tambm transportadora de cobre (hCTR2) tambm foi identificada, no entanto a sua funo continua pouco esclaracida. A CTR1 no parece necessitar de ATP para o transporte de cobre, no

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

entanto, o mecanismo para a absoro de cobre permanece incompreendido [Lee et al., 2002]. Achados recentes, sugerem que a incorporao de cobre mediada pela hCTR1 regulada por um mecanismo ps-translacional que estimula a endocitose de cobre e a degradao do transportador. Ratos heterozigticos para o CTR1 apresentam defeitos na acumulao de cobre e uma reduo da actividade da citocromo-c oxidase e ratos com CTR1 totalmente deficiente apresentam deficincia profundas do crescimento e desenvolvimento, pelo que morrem in tero a meio da gestao [Lee et al., 2001]. Isto demonstra um papel crucial para a aquisio de cobre atravs do transportador CTR1 para as clulas dos mamferos e para o desenvolvimento embrionrio.

3.5.2 Reduo do Cobre


O substrato para a CTR1 e outros transportadores de cobre o io cuproso. A maioria do cobre extracelular e do cobre presente no tubo digestivo est sob a forma de io cprico, o que exige a presena de uma redutase para converter o Cu+1 em Cu+2. Esta actividade foi descrita nas clulas hepticas de ratos, contudo a protena no foi identificada. Um gene que aparece para codificar uma ferroxidase foi recentemente clonado a partir de um rato. O gene codifica uma citocromo b a nvel do duodeno, Dcytb, que tem uma sequncia 45-50% semelhante famlia da citocromo b561 das redutases de membrana. Foi demonstrado que esta protena exibe uma actividade redutase no ferro e no cobre estimulada pelo ascorbato e pode assim estar envolvida na reduo e na absoro de cobre [Knpfel e Solioz, 2002].

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

A reduo do cobre extracelular foi amplamente caracterizada nas leveduras. Foi demonstrado que a absoro de cobre na levedura facilitada pelas redutases da membrana plasmtica Fre1p e Fre2p, no entanto vrios genes podem desempenhar um papel na reduo e na absoro de ferro e cobre. Estas redutases so induzidas pelos quelantes de cobre, sugerindo um papel directo na reduo do cobre para a absoro. Embora seja claro que a reduo do cobre desempenha um papel importante na captao e distribuio, o processo e as funes enzimticas associadas continuam desconhecidas nos humanos. Continua a ser necessria investigao nesta rea para compreender a homeostase do cobre, incluindo estudos da absoro intestinal e da disponibilidade deste elemento.

3.5.3 ATPases transportadoras de cobre


Duas enzimas chave responsveis pela translocao de cobre atravs das membranas das clulas eucariticas parecem estar envolvidas com as ATPases cpricas das bactrias. Em humanos, estas so designadas de ATPase de Menkes (ou ATP7A) e ATPase de Wilson (ou ATP7B) com base nas doenas associadas. A principal diferena entre estas duas enzimas distribuio a nvel tecidual. As ATPases so protenas transmembranares. As Cu-ATPases pertencem classe das ATPases do tipo P as quais incluem Na-K ATPases , Ca ATPases e enzimas relacionadas. A funo das ATPases consiste na translocao de cobre atravs das membranas celulares. A ATPase de Menkes consiste numa ATPase de membrana associada ao cobre que encontrada na maior parte dos tipos celulares, excepto no fgado, tem grande

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

expresso nas clulas intestinais epiteliais e parece ser essencial para o transporte de cobre atravs da membrana celular basolateral para a circulao portal e consequente entrada no fgado. Dados clnicos demonstram uma acumulao de cobre nas clulas da mucosa intestinal em indivduos com DM, o que evidencia o importante papel desta ATPase no transporte basolateral de cobre. A caracterizao molecular da DW permitiu a identificao da ATPase de Wilson, a qual apresenta uma sequncia 65% semelhante da ATPases de Menkes e est presente maioritariamente nas clulas hepticas. responsvel pela

disponibilizao de cobre para as cuproenzimas e pela sua excreo biliar. Na DW, um defeito no gene que codifica esta protena interfere nas suas funes resultando numa excreo deficiente, numa acumulao heptica de cobre e, se no tratada, numa toxicose severa. De forma similar ATPase de Menkes, a ATPase de Wilson est dependente do cobre: na presena de baixas concentraes de cobre, a ATPase est localizada na zona trans do aparelho de Golgi no fgado e no crebro, desempenhando um papel de transportador de cobre para o compartimento secretor para a incorporao na ceruloplasmina e outras cuproenzimas. Quando as concentraes de cobre so elevadas, a ATPase move-se do local trans para uma vescula citoplasmtica a qual no bem caracterizada, no entanto parece estar associada com o transporte de cobre para a membrana canalicular biliar para ser excretado (Figura 3.3).

3.5.4 Metalotionenas e Metalochaperones


A acumulao de cobre no citoplasma representa um risco para dano oxidativo.

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

Para minimizar esta possibilidade existem dois sistemas protectores que podem participar na desintoxicao. Um destes sistemas parece basear-se numa via de sequestrao no especfica na qual a glutationa rapidamente se liga ao Cu+1 e o entrega s metalotionenas ou a outras protenas ligadas ao cobre. As metalotionenas so polipptidos ricos em cistena que contm dois clusters polinucleares onde se ligam ies metlicos, incluindo o Cu+1. Perante concentraes intracelulares elevadas de Cu, as metalotionenas sequestram o metal do citoplasma e, se excessivo, transportam-o para os lisossomas. A expresso destes polipptidos reforada em resposta elevao dos nveis de ies metlicos. No entanto, parece que funcionam como um local de armazenamento transitrio de cobre e outros ies metlicos, quando presentes em excesso. As Metalochaperones so protenas citoplasmticas que ligam ies metlicos em complexos instveis. Estas permitem a troca de cobre quando se conjugam com uma protena alvo. Assim, as funo destas protenas consiste na colocao de cobre em locais intracelulares precisos e em compartimentos especficos. Foram identificadas pelo menos sete chaperones em eucariticos: A Atox1 interage directamente com as ATPases de Wilson/Menkes para cederlhes cobre, no entanto no esto esclarecidos os mecanismos intermedirios. A COX17, demonstrada em leveduras, responsvel pela entrega de cobre nas mitocndrias para incorporao do metal na citocromo-c oxidase. A COX17 liga-se a trs ies Cu+1, est presente no citoplasma e no espao intermembranar da mitocndria e pode servir como um transportador bidireccional de cobre.

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Captulo 3 Qumica Fisiolgica

As Sco1p e Sco2p das leveduras parecem participar na entrega do cobre da COX17 para a citocromo-c oxidase.

A COX11 codifica uma protena da membrana mitocondrial interna. De acordo com estudos realizados em leveduras, a COX11 uma enzima heme A biossinttica que necessria para a formao dos centros de cobre e magnsio da citicromo-c oxidase.

A CCS disponibiliza cobre no citoplasma para ser incorporado na SDO1. No entanto, os mecanismos de transporte de cobre pela CCS e a sua transferncia a superxido dismutase permanecem desconhecidos.

A NML45 (nuclear Menkes-like protein) pode transportar cobre para o interior do ncleo das clulas humanas, no entanto no est bem caracterizada.

Figura 3.3 - Modelo do metabolismo do cobre na clula heptica.

O cobre plasmtico (ligado a protenas) entra na clula heptica atravs dos transportadores CTR1 ou DMT1. Uma vez no citoplasma, e dependendo das necessidades da clula o cobre pode ser armazenado na metalotionena (MT) ou distribudo pelos chaperones (HAH1, CCS, Cox17) at aos organelos ou enzimas. A ATPase de Wilson, localizada na membrana do aparelho de Golgi permite que este seja enviado para os lisossomas para a sua posterior libertao no plasma ou eliminao pela blis.

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CAPTULO

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Erros Genticos do Metabolismo do Cobre

Captulo 4 Erros Genticos do Metabolismo do Cobre

4.1 Introduo
Muito do nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares pelos quais a homeostase do cobre alcanada, deve-se tanto a estudos em sistemas modelo como a duas doenas do metabolismo do cobre: a Doena de Menkes e a Doena de Wilson (Tabela 4.1). A DM manifesta-se como uma aparente deficincia de cobre enquanto que a DW se manifesta como uma toxicose por excesso de cobre [Linder e HazeghAzam, 1996; Roberts e Schilsky, 2003]. Estas duas doenas to diferentes devem-se a alteraes similares das bombas de cobre, as Cu-ATPases de Menkes e de Wilson. As ATPases de Menkes so expressas em tecidos como a pele, os rins, a placenta, o crebro, o tubo digestivo e o sistema vascular, enquanto que as ATPases de Wilson so expressas principalmente no fgado, mas tambm nas glndulas mamrias e, eventualmente, em outros tecidos especializados [Linder e Hazegh-Azam, 1996; WHO, 2004] .

Tabela 4.1 - Doenas genticas associadas a alteraes do metabolismo do cobre. Doena de Wilson Gentica Autossmico recessivo Cromossoma 13 1 em cada 30 000 Incio na adolescncia Sintomas dos gnglios basais Doena heptica Anis de Kayser-Fleischer Distrbios psiquitricos Diminuio do Cu srico Diminuio da ceruloplasmina srica Aumento de Cu no fgado Excreo biliar de Cu Quelantes so bastante eficazes Doena de Menkes Recessivo Ligado ao cromossoma X 1 em cada 200 000 Incio depois do nascimento Degenerao da massa cinzenta Alteraes do cabelo Hipotermia, Hipopigmentao Morte precoce (< 3 anos) Diminuio do Cu srico Diminuio da ceruloplasmina srica Diminuio de Cu no fgado Transporte Gastrointestinal de Cu Sem tratamento efectivo

Clnica

Laboratrio

Defeito Tratamento

Resumo de Harris e Gitlin (1996) e de Kaller (1998).

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4.2 Doena de Menkes


Background A DM, descrita pela primeira vez em 1962 pelo mdico John Menkes, resulta de um defeito recessivo ligado ao cromossoma X, originando uma deficincia sistmica profunda de cobre que fatal na primeira infncia, acompanhada por anormalidades neurolgicas severas, aparentemente devido ao grande dfice de enzimas cuprodependentes necessrias para o desenvolvimento cerebral [Kaler, 1998; Guitet et al., 1999]. Segundo Julian Mercer, a frequncia deste distrbio de 1 a cada 200.000 nascimentos vivos. Tipicamente ocorre ocorre em rapazes [Kaller, 1998]. Os indivduos afectados apresentam hipopigmentao do cabelo devido deficincia de tirosinase, resultando na ausncia de sntese de melanina. O cabelo fica com um aspecto em palha de ao, frgil e estranho devido deficincia de uma cuproenzima desconhecida mas necessria para a ligao da queratina. Este achado levou designao alternativa de Doena do cabelo estranho [Kaler, 1994, Mercer, 1998]. A reduo da actividade da lisina oxidase resulta numa polimerizao defeituosa do colagnio e da elastina com anormalidades do tecido conjuntivo, incluindo aneurismas da aorta, descamao da pele e fragilidade ssea. Pensa-se que os defeitos neurolgicos severos se devam reduo da actividade da citocromo-c oxidase [Kaler,1998]. Com o diagnstico precoce e o tratamento, que consiste em injeces dirias de cobre e histidina a nvel

intraperitoneal e intratectal para o sistema nervoso central, alguns dos problemas neurolgicos podem ser evitados e a sobrevida pode ser prolongada. Contudo, os doentes com DM mantm anormalidades sseas, distrbios do tecido conjuntivo e apresentam atraso mental ligeiro a grave [Kaler, 1996]. Mesmo com um diagnstico precoce e com tratamento, a DM , normalmente, fatal. Embora alguns indivduos

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afectados tenham sobrevivido at adolescncia e at ao incio dos seus 20 anos, a maioria morre antes dos 10 anos de idade [Kaler, 1998]. Os indivduos com esta doena absorvem cobre a partir do intestino delgado, no entanto, este elemento no pode ser bombeado das clulas intestinais para a corrente sangunea para ser transportado at ao fgado e consequentemente at ao resto do corpo [Kaler, 1996, 1998]. Assim, a doena assemelha-se a uma deficincia nutricional severa de cobre. Tambm existem variantes clnicas menos severas da DM, das quais a melhor descrita o muito raro (cerca de 100 casos notificados) occipital horn syndrome.

Caracterizao Molecular Estudos genticos realizados em indivduos afectados e em animais demonstraram que cerca de 20% das mutaes responsveis pela DM correspondem a deleces no gene da ATPase de Menkes. Alteraes simples dos pares de bases, mutaes sem sentido (nonsense), mutaes com perda de sentido e duplicaes tambm foram identificadas. A doena severa resulta da ausncia ou de nveis muito baixos da actividade das ATPases. Os fentipos clnicos associados a mutaes reflectem, deste modo, o grau de diminuio da funo das protenas, reduzindo assim o transporte e a distribuio de cobre. No entanto, mantm-se difcil associar determinadas mutaes com formas severas ou moderadas da doena (Moller et al., 2000).

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4.3 Doena de Wilson


Background A DW, tambm chamada de degenerao hepatocelular, trata-se de um defeito gentico autossmico recessivo (cromossoma 13) do transporte de cobre, que envolve uma pobre incorporao de cobre na ceruloplasmina e um defeito na excreo biliar de cobre so induzidos por mutaes que prejudicam a funo das ATPases cupricas da DW. Estas mutaes produzem toxicidade devido ao excesso da acumulao de cobre predominantemente no fgado, no crebro, com menos extenso nos rins olhos e outros rgos. A incidncia da DW foi estimada a cerca de 1:30000, resultando numa

frequncia heterozigtica estimada de 1:90 na populao em geral. A idade de incio da doena varia entre os 3 e os 50 anos de idade e as manifestaes clnicas variam muito. A apresentao inicial dos doentes com DW envolve manifestaes hepticas, neurolgicas ou psiquitricas e raramente

sintomatologia renal, esqueltica ou endcrina. Os sintomas hepticos podem ser agudos e auto-limitados, mimetizando hepatite aguda, ou podem progredir rapidamente, sugerindo hepatite fulminante, com hepatite inicial severa, frequentemente complicada por anemia hemoltica com Coombs-negativo. As enzimas hepticas standard so marcadores de diagnstico de DW pouco fiveis. Os nveis da actividade da aminotransferase no esto marcadamente elevados e os valores sricos da fosfatase alcalina so quase sempre baixos, apesar de insuficincia heptica grave. A doena progride com ictercia e desenvolvimento de encefalopatia, anomalias severas da coagulao, por vezes associada a coagulao intravascular e insuficincia renal terminal. Na maioria das vezes a morte ocorre se a doena no for tratada.

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O cobre acumula-se nos hepatcitos, ocorrendo lise quando a sua capacidade excedida. O metal libertado, difunde-se para o sangue e acumulado nos tecidos extrahepticos. As leses neurolgicas ocorrem primariamente no putamen e globus pallidus, conjuntamente conhecidos como ncleo lenticular (da a nomenclatura da degenerao hepatolenticular). Os sintomas da doena incluem um tipo de tremor peculiar nas extremidades superiores, lentido de movimentos e mudanas do temperamento (Tabela 4.2). Os indivduos podem tornar-se excepcionalmente argumentativos,

extremamente emotivas ou apresentar uma diminuio das capacidades mentais. Os anis de Kayser-Fleischer, so alteraes pigmentadas localizadas da membrana de Descemet na regio perilmbica na crnea, de cor castanho-dourada, amarelo-dourada ou bronze devido deposio de cobre (Figura 4.1), que se tornam evidentes no incio da acumulao de cobre na crnea e aquando da afectao do sistema nervoso [Moreira et al., 2001; Mak et al., 2006; Kaplan, 2007]. Estes anis so observados em 90% dos doentes com DW e, ocasionalmente, em doentes com colestase prolongada e cirrose criptognica, sendo geralmente bilaterais [Moreira et al., 2001]. O tratamento da DW inclui terapia quelante com agentes como a D-penicilamina ou terapia com zinco, sulfato de zinco ou acetato de zinco. A teraputica com zinco , actualmente, o tratamento escolha. Este mineral produz um bloqueio na mucosa, por induo da metalotionena, que liga o cobre s clulas da mucosa at este ser soltado e eliminado pelas fezes. Mais recentemente, tratamentos experimentais com

tetratiomolibdato, mostraram resultados promissores. Este frmaco parece ser uma excelente forma de tratamento inicial em doentes que apresentam sintomas neurolgicos. Contrariamente penicilamina, o tratamento inicial com tetratiomolibdato raramente leva a uma deteriorao neurolgica acrescida [Brewer, 2000]. As restries

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dietticas desta doena implicam a eliminao de alimentos ricos em cobre, referidos no captulo 2 deste trabalho (Tabela 3.3).

Figura 4.1 - Anis de Kayser-Fleischer.

Fonte (1imagem da direita; 2imagem da esquerda): 1 Moreira et al. (2001), Anis de Kayser-Fleischer, Arq Brs Oftalmol, 64: 589-93; 2 Kaplan (2007), Diagnosis of Wilsons disease, UpToDate, www.uptodate.com.

Tabela 4.2 - Manifestaes clnicas da Doena de Wilson. Alteraes Hepticas Neurolgicas Psiquitricas Oftalmolgicas Hematolgicas Renais Cardiovasculares Msculo-esquelticas Gastrointestinais Endcrinas Dermatolgicas
Adaptado de Pedroso e Lima, 2001.

Sintomas Cirrose, hepatite crnica, disfuno heptica fulminante. Rigidez, tremor, ataxia, discinsia, disartria, convulses. Distrbios comportamentais, disfuno cognitiva, alteraes afectivas, psicose. Anis de Kayser-Fleisher, cataratas. Hemlise, coagulopatia. Alteraes tubulares renais, diminuio da filtrao glomerular, litase renal. Cardiomiopatia, arritmia, alteraes da conduo. Osteomalcia, osteoporose. Litase biliar, pancreatite, peritonite bacteriana espontnea. Amenorreia, aborto espontneo, puberdade tardia e ginecomastia. Hiperpigmentao.

Se a DW for diagnosticada e tratada atempadamente, os doentes podem viver normalmente. 43

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Caracterizao Molecular Na maioria dos casos, tcnicas biolgicas moleculares permitem a identificao de mutaes no gene da ATPase que produz a DW. A variabilidade fenotpica das manifestaes da DW so devidas, provavelmente, natureza das mutaes, contudo, no aparente uma correlao entre a mutao e severidade da doena. Mais de 100 defeitos genticos causadores da DW tm sido descritos. Algumas mutaes tm um foco geogrfico, 38% das mutaes da DW na Amrica do Norte so uma mutao histidina-1069 para glutamina, enquanto que outras populaes tm mutaes comuns diferentes. Dado que vrios doentes com DW possuem diferentes mutaes no cromossoma 13 (isto , so heterozigticos), difcil correlacionar o fentipo com o gentipo. Mesmo nos indivduos homozigticos para uma mutao, o incio e a severidade da doena podem variar. Indivduos homozigticos para mutaes severas tm um incio precoce da doena. A severidade da doena pode estar associada a factores ambientais, incluindo o contedo de cobre da dieta ou a variaes de protenas que influenciam a homeostase do cobre.

4.4 Outros sndromes hereditrios relacionados com o cobre


Outras doenas que parecem estar envolvidas com a alterao do metabolismo de cobre incluem a Cirrose Infantil Indiana e a toxicose idioptica por cobre. Estes sndromes da infncia so semelhantes entre si no que respeita etiologia e

apresentao. Ambos parecem possuir um componente gentico associado a uma ingesto elevada de cobre. Nos casos de Cirrose Infantil Indiana a elevada ingesto de cobre deve-se ao aquecimento e/ou armazenamento do leite em recipientes de cobre.

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Por outro lado, na toxicose idioptica devida s elevadas concentraes de cobre nas guas de abastecimento [Mller et al., 1998]. Embora a exposio a elevadas concentraes sejam comummente encontradas em ambas as doenas, crianas alimentadas exclusivamente com leite materno ou com uma baixa ingesto de gua com elevado teor de cobre tambm podem desenvolver as respectivas doenas. A hiptese que actualmente prevalece em relao toxicose idioptica que esta se deve a uma leso gentica que resulta numa alterao do metabolismo do cobre combinada com uma elevada ingesto de cobre. Esta possibilidade foi apoiada pela frequncia de ocorrncia de consanguinidade entre os casais, na maioria dos casos, facto que est ausente em zonas com teor elevado de cobre na gua potvel onde estes sndromes no so documentados [Mller et al., 1998].

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CAPTULO

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Efeitos Biolgicos da Deficincia e do Excesso de Cobre

Captulo 5 Efeitos Biolgicos da Deficincia e do Excesso de Cobre

O cobre um elemento essencial [EHC 200, 1998]. A maioria dos tecidos possui quantidades mensurveis de cobre que lhe esto associadas e, geralmente, as clulas e os tecidos possuem mecanismos mantm a disponibilidade e limitam a toxicidade do cobre (homeostase). Contudo, podem surgir manifestaes clnicas que decorrem das alteraes fisiolgicas em resposta alta ou baixa ingesto de cobre e que no esto relacionadas com alteraes genticas do metabolismo do cobre, referidas no captulo anterior.

5.1 Deficincia
Crianas com achados caractersticos da deficincia em cobre (anemia refractaria ao tratamento com ferro e baixas concentraes plasmticas de cobre) foram reportadas pela primeira vez no Reino Unido em 1956. A deficincia em cobre mais frequente em recm-nascidos pr-termo, especialmente nos de muito baixo peso nascena, devido s baixas reservas de cobre, quer por possurem um fgado relativamente pequeno, quer pelas grandes necessidades de cobre requeridas para a sua grande taxa de crescimento, comparativamente aos recm-nascidos de termo. Alm disso, as crianas prematuras, alm de possurem uma menor capacidade digestiva tm uma absoro intestinal de cobre pouco desenvolvida. Os recm-nascidos com 36 ou mais semanas de gestao armazenaram

aproximadamente 15 a 17 mg de cobre durante a gravidez, encontrando-se no fgado cerca de 2,5 a 9 mg do total armazenado. Estas reservas previnem a deficincia de cobre durante os primeiros 47 meses aps o nascimento de bebs de termo [Schmann et al., 2002].

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Crianas alimentadas exclusivamente base de leite de vaca esto mais propensas a desenvolver deficincia de cobre que as crianas alimentadas com leite materno pelo pobre contedo de cobre no leito de vaca e devido absoro limitada deste mineral neste tipo de leite (apenas 15% do cobre absorvido). Contrariamente, as crianas amamentadas pela me absorvem mais cobre, o que pode ser devido ao pobre contedo em casena ou a factores associados ao leite humano que melhoram a absoro de cobre (a absoro de 60%). Nos pases em desenvolvimento, onde a alimentao das crianas baseada em leite da vaca enriquecido com uma grande quantidade de hidratos de carbono refinados, a deficincia de cobre pode ser mais prevalente dado a frutose e outros aucares diminuem a sua absoro. A deficincia de cobre tem sido observada em indivduos com sndromes de mabsoro como acontece na doena celaca, no espru tropical e no tropical, fibrose cstica e sndrome do intestino pequeno resultado de uma recesso intestinal. O aumento das perdas gastrointestinais normalmente explicam a ocorrncia de deficincia de cobre nestes sndromes. A deficincia de cobre deve ser suspeitada em crianas com diarreia prolongada ou recorrente, perdas anormais de blis, recesses intestinais ou perda de contedo intestinal atravs de fistulas. A elevada ingesto de zinco e ferro diminui a absoro de cobre e pode predispr sua deficincia. Este fenmeno usado na estratgia teraputica da Doena de Wilson, onde uma ingesto elevada de zinco demonstrou baixar a absoro de cobre. A deficincia de cobre tambm foi

documentada em indivduos que recebem penicilamina ou outros agentes quelantes de caties, os quais aumentam as perdas de cobre. No sndrome nefrtico e nas grandes queimaduras podem ocorrer perdas excessivas de cobre que devem ser repostas [Schmann et al., 2002]. 48

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Durante a nutrio parental ocorre um aporte insuficiente de cobre a no ser que haja suplementao com minerais como o cobre. De acordo com a American Medical Association, recomendada a administrao de 0,5 a 1,5 mg de cobre por dia durante a nutrio parentrica total. Em indivduos com colestase ou alteraes da secreo biliar, a administrao parental de cobre deve ser menor para compensar a limitao das perdas. Indivduos com alteraes da funo heptica no devem receber suplementao a no ser que seja documentada deficincia de cobre. A alimentao entrica deve conter uma quantidade de cobre adequada s necessidades de cada indivduo. A causa mais comum de deficincia de cobre consiste num aporte insuficiente de cobre durante a recuperao nutricional de crianas desnutridas. Vrios factores esto associados s maiores necessidades destas crianas, como o baixo peso nascena, um curto perodo de amamentao, o consumo de leite de vaca, o consumo de dietas base de hidratos de carbono refinados, o aumento das perdas de nutrientes como resultado de uma doena diarreica e infeces frequentes. Durante a recuperao nutricional, estas crianas crescem 5 a 10 vezes mais que as crianas normais da mesma idade, aumentando assim as necessidades impostas pelo crescimento. Este ainda outro factor de risco que contribui para 30-40% da prevalncia da deficincia de cobre nestas crianas. Num estudo comparativo, Castillo-Durn et al. avaliaram a magnitude das perdas de cobre em 14 crianas durante um episdio agudo de diarreia com necessidade de internamento hospitalar. As perdas fecais foram duas vezes maiores, quando comparadas com as das crianas do grupo controle. Estas perdas esto directamente relacionadas com o peso fecal. Outro estudo comparou um grupo de crianas com diarreia crnica (19 crianas) com dois grupos controle (19 crianas saudveis e 11 crianas desnutridas ). As concentraes plasmticas foram 30 % mais baixas e o

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contedo de cobre diminuiu trs a quatro vezes no grupo com diarreia, comparativamente aos grupos controle. A ingesto de cobre atravs da dieta essencial para o Homem e, geralmente, excede as necessidades mnimas deste oligoelemento. A deficincia de cobre clinicamente evidente relativamente rara em humanos adultos [Uauy et al., 1998]. Em animais pode causar doenas cardacas e vasculares, que podem, em parte, ser explicadas pela reduo da actividade das enzimas cupro-dependentes, dfices neurolgicos, tromboses, diminuio da motilidade dos espermatozides e alteraes na fertilidade [Schmann et al., 2002]. As manifestaes clnicas mais frequentes da deficincia de cobre so a anemia, a neutropenia e anormalidades sseas, incluindo fracturas. As alteraes hematolgicas so caracterizadas pela existncia de uma anemia hipocrmica, acompanhada pela reduo do ferro srico, diminuio da contagem de reticulcitos, neutropenia e trombocitopenia. [Cordano, 1998]. A neutropenia a manifestao mais comum e mais precoce da deficincia de cobre. Esta pode ser consequncia da diminuio de neutrfilos maduros na medula ssea ou o resultado da reduo da sobrevida das clulas polimorfonucleares. Estudos revelaram que a deficincia de cobre pode provocar dano celular quer na medula ssea, quer na circulao sangunea. Alm disso, podem existir alteraes na proliferao ou diferenciao das stem cells ou uma rpida destruio e uma rpida clearence celulares. A observao de uma quantidade normal de clulas precursoras e um baixo nmero de clulas maturadas na medula ssea, sugere que existe um atraso no processo de diferenciao celular como resultado da deficincia de cobre. No entanto, existem tambm evidncias de que o aumento da clearence de neutrfilos consequncia da reduo da sua semi-vida e da presena de anti-corpos contra estas 50

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clulas. No entanto, ainda so necessrios mais estudos acerca do mecanismo pelo qual a deficincia de cobre origina neutropenia, focando o processo celular de diferenciao assim como a viabilidade dos neutrfilos quer na circulao sangunea quer na medula ssea. Quando os nveis de cobre e os neutrfilos totais foram analisados simultaneamente em estudos realizados no Peru, encontrou-se uma correlao positiva significativa entre eles [Cordano, 1998]. Na deficincia de cobre, a neutropenia tem sido relacionada com o aumento da frequncia de infeces respiratrias, j que tambm ocorrem alteraes da capacidade fagoctica dos neutrfilos [Schmann et al., 2002]. A semi-vida dos eritrcitos tambm est diminuda na deficincia de cobre devido a alteraes da fluidez e ao aumento da sensibilidade da membrana peroxidao lipdica. Estudos citolgicos revelaram alteraes magaloblsticas e vacuolizao tanto dos precursores eritrides como dos mielides [Uauy et al., 1998]. A deficincia de cobre est associada com a imunidade nos seres humanos. Em 1985, Heresi et al. seguiram 19 crianas com hipocuprmia antes e aps de 1 ms de suplementao com cobre. Concluram que a actividade fagoctica dos leuccitos polimorfonucleares aumentou, no entanto, as imunoglobinas mantiveram-se inalteradas. Em 1995, Kelley et al., descreveram uma diminuio da proliferao das clulas sanguneas mononucleares perifricas, em 11 indivduos que receberam uma dieta pobre em cobre. Estudos recentes revelaram que, na deficincia de cobre, h uma diminuio efectiva de interleucina 2, o que determina uma reduo da proliferao de clulas T. Na deficincia de cobre, comum ocorrerem anomalias sseas, principalmente em crianas. O esqueleto tem tendncia a tornar-se osteoportico o que leva a um

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aumento do risco de fracturas dos ossos longos e das costelas. Alm disso, possvel encontrar eroso e formao de espores nas metfises, separao das epfises e formaes sseas subperiosteais [Uauy et al., 1998 e Schmann et al., 2002]. Manifestaes menos frequentes da deficincia de cobre so a hipopigmentao do cabelo, a hipotonia, o atraso do crescimento e as alteraes do metabolismo do colesterol e da glicose. A prevalncia de doenas cardiovasculares esteve associada ao excesso de zinco e ao dfice de cobre na dieta, no entanto esta hiptese ainda no foi validada. Foi observado um aumento da concentrao do colesterol total e do colesterol LDL e uma reduo do colesterol HDL, em indivduos submetidos a uma dieta experimental pobre em cobre. Uma fraca ingesto de cobre tambm mostrou uma diminuio da tolerncia glicose, alteraes do ritmo cardaco e do

electrocardiograma. No entanto, as alteraes do metabolismo do colesterol e da glicose no esto fortemente validadas. A importncia do cobre para o desenvolvimento fetal foi inicialmente sugerida em animais com sintomas de deficincia deste elemento. Uma paralisia espstica das pernas dos cordeiros est associada hipomielinizao do crebro na deficincia severa. Este achado deve-se deficincia da citocromo-c oxidase. Enquanto que uma incorporao deficiente de elastina no tecido pulmonar e uma matriz de colagnio deficiente parece ser consequncia de uma diminuio da actividade da lisina-oxidase, ambas dependentes do cobre [Schmann et al., 2002]. O papel da hipocuprmia na alterao do desenvolvimento neurolgico no Homem foi postulado tendo por base as elevadas concentraes de cobre no crebro, especialmente nos gnglios basais. A deficincia de cobre uma causa improvvel de

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efeitos teratognicos, no entanto, esteve associada a defeitos do tubo neural e ao aumento do risco de anencefalia, j que foi sugerida a existncia de uma fase critica prnatal para o desenvolvimento do sistema nervoso. Isto pode explicar a deficincia mental severa encontrada na Doena de Menkes, ao contrrio do que acontece na deficincia de cobre adquirida depois do nascimento que no acompanhada por alteraes neurolgicas marcadas [Uauy et al.,1998]. A deficincia de cobre, normalmente, associda hipoceruloplasminmia, no entanto, a diminuio da concentrao de ceruloplasmina maior do que seria de prever a partir dos valores da concentrao do cobre srico. Depois da suplementao de cobre em indivduos com hipocuprmia, as concentraes de ceruloplasmina podem aumentar dentro de 24 a 48 horas. Normalmente, as concentraes de cobre retornam aos valores normais antes das concentraes de ceruloplasmina. Por isso, possvel que a repleo de ceruloplasmina no seja de primordial importncia na correco da deficincia de cobre. Uma concentrao plasmtica de cobre inferior a 0,90 mg/L d um forte apoio ao diagnstico de deficincia de cobre (particularmente se for inferior a 0,45 mg/L), assim como concentraes baixas ou ausentes de ceruloplasmina [Cordano, 1998]. Na maioria dos doentes, quando o cobre inferior a 0,45 mg/L, a concentrao de ceruloplasmina inferior a 20 mg/L. Uma cuprmia entre os valores 0,45 e 0,90 mg/L est associada a concentraes de ceruloplasmina entre 20 e 200 mg/L. Em doentes com um processo de deficincia em cobre em desenvolvimento, as concentraes de ceruloplasmina decaem para valores abaixo de 200 mg/L antes do cobre plasmtico atingir valores abaixo de 0,90 mg/L. A Tabela 5.1 sumariza os valores sricos normais de cobre e ceruloplasmina. 53

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Tabela 5.1 - Valores sricos normais de cobre e ceruloplasmina Cobre Ceruloplasmina 100 10 g/dl 20-40 mg/dl

Adaptado de Brewer (2007), Iron and copper toxicity in diseases of aging, particularly atherosclerosis and Alzheimers disease, Experimental Biology and Medicine, Vol. 232, pp.323-335.

O estudo da deficincia em cobre em seres humanos realizado por Graham e Cordano, confirma a existncia de duas alteraes do metabolismo do ferro, perante esta condio. A primeira ocorre precocemente e consiste numa modificao da absoro ou distribuio do ferro. Uma deficincia em ferro no tratada, que precede ou se desenvolve simultaneamente com a deficincia de cobre, caracterizada por uma hipocromia que persiste apesar do tratamento exclusivamente com cobre. A segunda alterao tardia e est relacionada com uma eritropoiese inadequada, mesmo na presena de reservas abundantes de ferro. Verificou-se que quando as reservas de ferro mantinham-se inalteradas a anemia respondia suplementao isolada de cobre.

5.2 Toxicidade
5.2.1 Bases bioqumicas para a toxicidade do cobre
A necessidade de cobre em vrios rgos ou sistemas do organismo efectivamente regulada por mecanismos homeostticos. A toxicidade provavelmente ocorre quando este controle homeosttico est sobrecarregado e/ou os mecanismos de defesa ou de reparao esto comprometidos. A necessidade e a potencial toxicidade do cobre nos sistemas biolgicos assenta basicamente na configurao especfica do io, particularmente na camada electrnica

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externa. Assim, o io cuproso altamente polarizvel e liga-se a principalmente a componentes que contm nitrognio e enxofre pela partilha das suas orbitas electrnicas. O io cprico, por outro lado, capaz de formar complexos com ligandos que contm oxignio e de se ligar parcialmente a centros que contenham nitrognio e enxofre de forma covalente. Consequentemente, o cobre torna-se muito reactivo e capaz de se ligar fortemente a vrias estruturas ricas em electres. A afinidade do cobre para com um ligando particular tambm influenciada pela polarizao do prprio ligando. O cobre em excesso promove as seguintes reaces adversas: Deslocao do metal dos seus locais de ligao resultando, por exemplo, em alteraes da membrana como a despolarizao e dano dos receptores ou de molculas transportadoras. Dano funcional pela ligao de cobre a locais cruciais em macromolculas, como o DNA ou enzimas. Isto ir conduzir a dano proteico directo, ou a alteraes oxidativas do DNA originando vrias alteraes funcionais, devido ao grande nmero de enzimas dependentes de cobre e possvel leitura incorrecta dos cdigos genticos. Dano celular devido produo de radicais pela reaco de Fenton: Cu+ + H2O2 ! Cu+2 + OH- + OH A produo excessiva destes radicais iro iniciar uma cascata de reaces de oxidao-reduo levando a uma perda da integridade celular. Este dano celular deve-se ao aumento dos nveis de clcio no citoplasma, depleco de ATP, oxidao de tiol, peroxidao lipdica, dano do DNA e danos nos organelos vitais como as mitocndrias e os lisossomas. 55

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5.2.2 Toxicidade do cobre em humanos


A toxicidade associada ao excesso de cobre foi recentemente considerada um problema de sade pblica j que at a esta altura no existiam casos relatados em seres humanos. Contudo, a incidncia na populao em geral marcadamente baixa [Bremner, 1998]. A identificao de doenas genticas do metabolismo do cobre que originam toxicidade severa (Doena de Wilson) ou deficincia de cobre (Doena de Menkes) no s incitou a investigao no domnio da gentica molecular e da biologia da homeostase do cobre mas tambm a focalizao das consequncias potenciais da toxicidade do cobre quer nos indivduos normais quer nos mais susceptveis. Os ltimos incluem pacientes hemodialisados (quando as solues dialisadas so contaminadas com excesso de cobre), indivduos com doena renal crnica e os doentes com obstruo biliar [Bremner, 1998]. O cobre em excesso tambm induz toxicidade indirectamente pela interaco com outros nutrientes, por exemplo, o excesso de Cu produz anemia pela interferncia com o transporte e/ou metabolismo do ferro. Em casos de ingesto intencional ou acidental de elevadas concentraes de sais de cobre (as doses no so totalmente conhecidas, no entanto pensa-se que estejam entre 20-70 g de cobre) foi observada uma progresso de sintomas que incluam dor abdominal, cefaleias, nuseas, vmitos, tonturas, diarreia, taquicardia, dificuldade respiratria, anemia hemoltica, hematria, hemorragia digestiva macia, insuficincia heptica e renal e morte. O facto desta toxicose poder progredir para morte se no for reconhecida atempadamente explica o facto de, em tempos, o cobre ter sido utilizado como mtodo suicida atravs de uma dose cerca de 1 000 vezes superior da ingesto

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diria normal [Bremner, 1998].

Toxicose Aguda Episdios agudos de alteraes gastrointestinais precedidos de uma ingesto nica ou repetida de gua com elevados nveis de cobre (geralmente cerca 3-6 mg/L) so caracterizados por nuseas, vmitos e epigastralgias, os quais resolvem quando a fonte de gua mudada. A maioria dos casos relatados no fornecem boas estimativas dos nveis de cobre que induzem estes efeitos. Trs estudos experimentais realizados por Araya et al. (2001) e Pizarro et al. (1999), demonstraram um limiar para as alteraes gastrointestinais de aproximadamente 4-5 mg/L em adultos saudveis, embora no seja claro se estes sintomas se devem aos efeitos irritantes agudos do cobre e/ou ao sabor metlico, amargo e salgado.

Toxicose crnica As exposies de longa durao ao cobre no tm sido bem estudas nos seres humanos, contudo rara em populaes normais que no tm nenhum defeito hereditrio na homeostase do cobre. Uma intoxicao crnica que originou insuficincia heptica foi documentada num indivduo adulto do sexo masculino sem susceptibilidade gentica conhecida que consumiu 30-60 mg/dia de cobre em suplemento mineral durante 3 anos. Contudo, existem indcios de que os seres humanos so capazes de se adaptar a elevadas concentraes de cobre. Indivduos expostos a concentraes superiores a 3 mg/L, nos EUA, no exibiram efeitos adversos.

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A susceptibilidade para desenvolver toxicose induzida pelo cobre depende de vrios factores, incluindo a espcie, a gentica, a idade e a dieta. Isto parece reflectir no apenas variaes na eficincia da absoro e excreo de cobre mas tambm diferenas na ingesto de outros factores protectores ou hepatotxicos, na distribuio celular e na expresso de protenas especficas de transporte e armazenamento de cobre. O tratamento corrente da maioria das doenas associadas inclui dieta pobre em cobre, dieta com elevado zinco e uso de quelantes como a penicilamina e a trientina. Os indivduos afectados devem ter a gua de consumo analisada para o contedo de cobre e beber agua desmineralizada se este for superior a 100 g/L. Sendo o fgado o maior rgo de armazenamento de cobre e o mais afectado, deve ser evitada qualquer actividade que afecte o metabolismo celular heptico. O consumo de lcool fortemente desaconselhado.

5.2.3 Cobre como um pr-oxidante


certo que muitos dos efeitos txicos do cobre, como o aumento da peroxidao lipdica das membranas celulares e dano do ADN, esto relacionadas com o seu papel na gerao de radicais livres [Bremner,1998]. Um RL definido como qualquer tomo, molcula ou fragmento de molcula que contm um ou mais electres desemparelhados nas suas camadas de valncia. Existem vrios radicais livres, sendo OH- e o O2- os que tm maior importncia biolgica j que so formados durante o processo de reduo de O2 no interior das mitocndrias, durante a metabolizao de bases purnicas ou devido reduo do

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perxido de hidrognio pelo anio O2- catalisada por redutores como o Cu+, pela reaco de Fenton. Se o O2 parcialmente reduzido pela recepo de dois electres, o produto final o perxido de hidrognio (H2O2), contudo se receber apenas um electro o produto ser o radical superxido (O2-). O H2O2 no considerado um verdadeiro RL, porm por ser uma substncia altamente hidrossolvel e penetrar facilmente nas clulas, age como um precursor da formao de outros RLs. O H2O2 e o O2- so extremamente txicos porque atacam os cidos gordos das membranas celulares, causando leso celular. Esta toxicidade deve-se em grande parte, converso no radical hidroxil (OH-). Este radical altamente lesivo e causa quebra e modificaes na bases de DNA levando a alteraes na expresso gentica, mutaes e apoptose celular, alteraes das cadeias proteicas e peroxidao lipdica com consequente detrimento do transporte intercelular [Leite e Sarni, 2003]. O cobre tambm participa na defesa anti-oxidante por intermdio da SOD1. Contudo, esta defesa e outras defesas no conferem proteco completa contra os RLs produzidos pelo organismo. Assim, o cobre, implicado na peroxidao lipdica produzida nas paredes do endotlio vascular, contribui para a aterosclerose, risco de AVC e enfarte do miocrdio [Leite e Sarni, 2003]. Alm disso, existem evidncias de que outros processos do envelhecimento bem como doenas (Doena Alzheimer, por exemplo) so causados, pelo menos em parte, pela contribuio do Cu para o dano oxidativo [Brewer, 2007].

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CAPTULO

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Concluso

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6.1 Principais Concluses


O cobre um oligoelemento essencial para todos os organismos biolgicos, desde bactrias at seres humanos. A sua importncia biolgica, funcional e estrutural est relacionada com as funes metablicas de enzimas cuprodependentes, as quais catalisam reaces fisiolgicas importantes. Assim, a maioria das manifestaes da deficincia de cobre so consequncia de alteraes funcionais nessas mesmas enzimas. A dose diria recomendada deste mineral varivel, dependendo da faixa etria em que se encontram os indivduos. Foi estabelecido um intervalo com os valores mnimos e mximos aceitveis para a ingesto diria de cobre em adultos, que variam entre 0,8 mg/dia (aproximadamente) e 10 mg/dia, respectivamente. A partir dos dados obtidos para o Homem, possvel afirmar que o risco para a sade decorrente da deficincia de cobre superior ao resultante da exposio excessiva, em particular nas crianas, j que os valores mdios de ingesto diria de cobre, na populao em geral que variam entre 1 e 3 mg/dia (sem suplementao) esto prximos do limite inferior admissvel. Por forma a aumentar o nvel de proteco da sade pblica, recomenda-se: Estabelecer guidelines nutricionais a nvel nacional e internacional para que seja evitada a deficincia de cobre, com particular ateno para a suplementao mineral de alimentos processados e interaces nutricionais; Monitorizar as concentraes de cobre na gua potvel e nos alimentos.

Existem estudos que promovem a suplementao mineral com cobre em indivduos sujeitos a alimentao parental e em crianas fortemente susceptveis deficincia de cobre. Perante a suplementao oral importante ter em conta os possveis modificadores da absoro intestinal de cobre.

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Est documentada a existncia de mecanismos homeostticos reguladores das necessidades de cobre que, apesar de no se encontrarem completamente compreendidos no Homem, o protegem contra a toxicidade e, por outro lado, permitem uma adaptao corporal s necessidades de cobre. Existem distrbios genticos que alteram a homeostase do cobre que, apesar de no serem o alvo principal desta dissertao, no podem deixar de ser referenciados Doena de Wilson e Doena de Menkes. de salientar o papel do cobre no dano oxidativo, actuando tanto na proteco contra a produo de radicais livres por intermdio da SOD1, como na produo dos mesmos, atravs da reaco de Fenton, contribuindo desta forma para as doenas relacionadas com o envelhecimento. Apesar de evidente a predominncia de estudos em animais e da fraca abordagem cientfica nos ltimos 10 anos no que concerne aos processos homeostticos envolvidos no metabolismo do cobre, claro que este um elemento vital para a sade humana. Contudo, quer o excesso quer a deficincia de cobre, se no tratados, podem levar morte. Perante esta dualidade, Vital vs Prejudicial , torna-se pertinente abordar e dar continuidade a este tema.

6.2 Linhas orientadoras de trabalhos futuros


possvel estabelecer um conjunto de direces de investigao/reviso, quer no mbito desta dissertao, uma vez que a mesma no esgota os assuntos nela

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abordados, quer no que concerne a novas perspectivas, que a prpria tese deixa antever, para futura investigao. Assim, salientam-se as seguintes linhas orientadoras: Determinao da biodisponibilidade de cobre nas dietas, particularmente nas dietas vegetarianas; Caracterizao dos mecanismos que influenciam a homeostase do cobre, incluindo a transferncia de cobre na barreiras sanguneas (placentar e enceflica) e a regulao das Cu-ATPases; Desenvolvimento de metodologias, em seres humanos, para a identificao dos efeitos adversos do cobre perante a ingesto diria de determinadas doses e relao com os nveis recomendados.

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