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UNIVERSIDADE DE SO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos Departamento de Cincias Bsicas Bioqumica Fundamental-ZAB0361 Prof. Dr.

Marcelo de Cerqueira Csar Relatrio 1: Titulao de Aminocidos Fernanda Yamanaka Hayashi Pirassununga -SP Maio/2011

Sumrio 1. Introduo....................................................................... .............................. 2 2. Objetivos.................................................................... ................................... 5 3. Materiais e Mtodos............................................................ ...........................5 3.1 Materiais .................................................................. ............................. 5 3.2 Mtodos....................................................................... ......................... 6 4. Resultado e Discusso.......................................................... ....................... 7 5. Concluso ..................................................................... ............................. 10 6. Referncias Bibliogrficas ...................................................... ....................11

1. Introduo As protenas so as molculas mais abundantes e funcionalmente diversas nos sistemas biolgicos. Praticamente todos os processos vitais dependem desta classe de molculas. Apresentam uma incrvel diversidade de funes, embora todas compartilhem a caracterstica estrutural comum de serem polmeros lineares de aminocidos [1]. Na forma de protenas, os aminocidos desempenham uma variedade de funes estruturais, hormonais e catalticas, essenciais vida. Portanto, no surpresa que defeitos genticos no metabolismo dos aminocidos podem resultar em doenas graves [2]. As protenas so compostas de um ou mais polipeptdeos, que por sua vez so formados por aminocidos. Embora mais de 300 aminocidos diferentes tenham sido descritos na natureza, somente 20 so comumente encontrados como constituintes das protenas dos mamferos, so os a-aminocidos [1]. Eles possuem um grupo carboxila e um grupo amino ligados ao mesmo tomo de carbono. Diferem um dos outros nas suas cadeias laterais, ou grupos R, que variam em estrutura, tamanho e carga eltrica e que influenciam a solubilidade dos aminocidos em gua. So classificados em cinco grandes grupos baseados no grupamento R, so eles: grupo R alifticos, no-polares (exemplo: glicina); grupo R aromtico (exemplo: fenilalanina); grupo R nocarregados , polares (exemplo: asparagina); grupo R carregado positivamente (exemplo: lisina); grupo R carregado negativamente (exemplo: aspartato) [3]. Alm desses 20 aminocidos, h muitos outros menos comuns. Alguns so resduos modificados depois que a protena foi sintetizada; outros so aminocidos presentes em organismos vivos, mas no como constituintes de protenas [3]. Em humanos saudveis, uma vez que no podem ingeridos por meio da aminocidos de cadeia nove aminocidos so considerados essenciais, ser sintetizados endogenamente e, portanto, devem ser dieta. Dentre os aminocidos essenciais, se incluem os trs ramificada (ACR), ou seja, leucina, valina e isoleucina.

Esses aminocidos participam da regulao do balano protico corporal alm de serem fonte de nitrognio para a sntese de alanina e glutamina [4]. As espcies de aminocidos, a ordem em que eles so ligados e a sua relao espacial mtua determinam as estruturas tri-dimensionais, propriedades biolgicas das protenas simples e so importantes determinantes da estrutura e funo para as protenas complexas que contm, alm de aminocidos, o heme, carboidratos, lipdeos, cidos nuclicos, etc [2]. Quando protenas so aquecidas em um meio aquoso, cido ou bsico, as ligaes amida sofrem hidrlise liberando os aminocidos constituintes, cuja identificao implica no conhecimento de suas propriedades fsico-qumicas. importante relembrar que estas substncias so anfotricas, ou seja, podem agir como cido de Brnsted (doadoras de prtons) ou como base de Brnsted (aceptoras de prtons) -reaes 1 e 2 [5]. H3N+CH(R)COOH H3N+CH(R)COO-(Reao 1) I II H3N+CH(R)COO- H2NCH(R)COO-(Reao 2) II III A forma zwiterinica (II) produzida pela dissociao do prton em I (Reao 1) e essa forma pode tambm sofrer dissociao de um prton e gerar o nion III [5]. Cada reao inica definida por uma constante de ionizao, Ka e um pKa (-log Ka). Todos os grupos a-carboxlicos dos 20 aminocidos tm valores de pKa prximos, mas diferentes (pKa . 2 a 3), o mesmo se observa para os grupos .-amino (pKa . 9 a 10). O valor do pKa de um aminocido representa o pH no qual as duas formas inicas esto presentes em concentraes iguais. Alguns aminocidos apresentam grupos ionizveis na cadeia R lateral. Os grupos cidos ou bsicos extras, lgico, aumentam a complexidade das reaes cido-base

dos aminocidos, o que garante maior resoluo na anlise destes compostos em uma mistura [5]. Atravs da titulao dos aminocidos possvel determinar o efeito do pH sobre sua estrutura. Isso ocorre justamente devido aos processos de desprotonao dos grupos carboxila, amino e eventuais outros grupos presentes na cadeia lateral [6]. A titulao tambm til para determinar a reatividade das cadeias laterais dos aminocidos. O processo de titulao utilizado para determinar a concentrao de uma soluo amostra atravs de sua reao com outra soluo de concentrao conhecida (padro). A soluo padro, normalmente denominada titulante, colocada em uma bureta e as alquotas da soluo amostra so colocadas em frascos Erlenmeyer, juntamente com substncias indicadoras apropriadas para cada reao [7]. A Figura 1 mostra a curva de titulao da Histidina. No incio da curva observa-se que os grupos dos aminocidos carboxilo e amino esto completamente protonados. Com a titulao o grupo carboxlico vai liberar prtons. Durante essa liberao evidenciado um ponto onde a concentrao desse doador de prtons igual concentrao do on dipolar desse aminocido, ponto de inflexo, correspondente a pH igual ao pK (medidor da tendncia de ceder prtons) do grupo protonado que no est sendo titulado [8] . O ponto onde se observa o fim da liberao de prtons por parte do carboxilo o ponto isoeltrico, pI, esse ponto possui um pH caracterstico, onde se observa todo o aminocido como on dipolar, ou seja, a carga total igual a zero [8]. Com a continuao da titulao, o prton do grupo NH3+ ser liberado. Tambm se observa um ponto de inflexo nessa segunda parte da curva de titulao. O pI de um aminocido pode ser calculado pela seguinte equao: pI = (pKa1 + pKa2) 2 Para a maioria dos aminocidos, h apenas dois valores de pKa portanto essa equao facilmente utilizada para calcular o pI. Para os aminocidos

acdicos e bsicos, porm, devemos tirar a mdia dos valores corretos de pKa. O pKa1 para o grupo funcional que foi dissociado em seu ponto isoeltrico. Se houver dois grupos dissociados em um pH isoeltrico, o pKa1 o pKa mais alto dos dois. Portanto, o pKa2 para o grupo que no foi dissociado a pH isoeltrico. Se houver dois grupos no dissociados, aquele com menor pKa1 ser utilizado [3,9,10]. Figura 1: curva de titulao da Histidina. 2. Objetivos Identificao de dois aminocidos desconhecidos, atravs dos valores de pKas obtidos numa curva de titulao. 3. Materiais e Mtodos 3.1. Materiais . Bureta de 50 mL . Becker de 50 mL

. Erlenmeyer de 250 mL . Proveta de 25 mL . Soluo de Aminocido 0,1 M (A e B) . Soluo de NaOH 0,1 M . PHmetro e eletrodo 3.2. Mtodos Aminocido A: Com auxlio de uma proveta transferiu-se 25 mL da soluo de aminocido A 0,1 M para um Erlenmeyer A de 250 mL, anotou-se o valor de seu pH e a soluo foi reservada. Com um becker de 50 mL, preencheu-se uma bureta com a soluo-padro de NaOH, houve escoamento da mesma para retirada de eventuais bolhas e em seguida a bureta foi completada novamente. Iniciou-se a titulao do aminocido, agitando-se vagarosamente com basto de vidro e a cada 2 mL de base adicionada foi anotado o valor do pH, at atingir aproximadamente 12,48. Anotou-se tambm o volume gasto na bureta. Aminocido B: Com auxlio de uma proveta transferiu-se 25 mL da soluo de aminocido B 0,1 M para um Erlenmeyer de 250 mL, anotou-se o valor de seu pH e a soluo foi reservada. Com um becker de 50 mL, preencheu-se uma bureta com a soluo-padro de NaOH, houve escoamento da mesma para retirada de eventuais bolhas e em seguida a bureta foi completada novamente. Iniciou-se a titulao do aminocido, agitando-se vagarosamente com basto de vidro e a cada 2 mL de base adicionada foi anotado o valor do pH, at atingir aproximadamente 11,28. Anotou-se tambm o volume gasto na bureta.

4. Resultado e Discusso Aps titulao do aminocido A, foram obtidos 51 valores de pH com seus respectivos valores de volume gasto correspondente. A partir dos mesmos, foi possvel construir o grfico da Figura 2: 02468101214020406080100120pH Volume de NAOH 0,1 M Aminocido A Figura 2: Curva de titulao para o aminocido A. Onde os valores de p ,p , pI e p esto representados nessa ordem. O clculo:

= = 2,55

= = 8,55

pI= = 10,15

= = 11,75

(Highlight comment Gilmar 11/09/2013 15:13:32 blank) Aps a adio do NaOH, o primeiro pH medido foi 1,80, nesse ponto os grupos ionizveis estavam totalmente protonados, por isso, o baixo valor.

medida que o NaOH foi sendo adicionado, o pH foi aumentando at o momento em que o grupo COOH perdeu seu prton. O pKa do grupo carboxila menor que o do grupo amino, por isso ele desprotonado primeiro. Na metade dessa etapa, as concentraes das espcies doadoras e receptoras de prtons foram aproximadamente iguais, isso indica um dos pontos mdios da titulao, onde o pH igual ao pKa . Para o aminocido A o valor de foi de aproximadamente 2,55. Quando o pH estava em 3,30 foram adicionados 2 mL de NaOH e o pH aumentou para 7,2. Nessa regio existe um ponto de inflexo, no qual a remoo do primeiro prton foi completada e a remoo do segundo comeou. A partir dele, ocorreu a remoo do prton do grupo amino (NH3+). Na metade desse estgio, o pH possui valor igual ao do p , que no caso foi de aproximadamente 11,75. A titulao foi completada em pH de cerca de 12. O pH no ponto onde a carga lquida igual a zero chamado de pH isoeltrico ou ponto isoeltrico (pI). O ponto isoeltrico a mdia aritmtica dos valores de pKa e que neste caso foi de 10,15. Ao serem comparados com os valores de Tabela 1, no se encontraram valores idnticos, mas no geral nota-se maior semelhana com o aminocido histidina. No caso do aminocido B, anotou-se 36 valores de pH e de seus volumes gastos e foi possvel construir o grfico da figura 3:

0246810121401020304050607080pH Volume (mL) de NaOH 0,1M Aminocido B 0246810121401020304050607080pH Volume (mL) de NaOH 0,1M Aminocido B Figura 3: Curva de titulao para o aminocido B. Encontrando-se os seguintes valores para o p e p :

pI= = 6,2 p = = 2,75

p = = 9,65

Representados nessa mesma ordem no grfico. Assim como no aminocido A, no incio da titulao todos os grupos estavam totalmente protonados. medida que o NaOH foi sendo adicionado, o pH foi aumentando at o momento em que o grupo COOH perdeu seu prton e, posteriormente, o grupo amino tambm. Nas metades dessas etapas, as concentraes das espcies doadoras e receptoras de prtons foram aproximadamente iguais, ou seja, pontos titulao, onde o pH igual ao pKa . Com o aminocido B o valor de de aproximadamente 2,75 e 9,65, respectivamente. Notou-se a remoo primeiro prton e o incio do segundo, quando aps ser adicionado o um salto no pH de 3,7 para 7,4. mdios da e p foi do NaOH houve

A titulao do aminocido B tambm foi completada em pH por volta de 12. E seu ponto isoeltrico teve valor de 6,2. Ao serem comparados com os valores de Tabela 1, nota-se maior semelhana com o aminocido glicina. Tabela 1-Propriedades e convenes associadas com os aminocidos primrios Fonte: [3]. 5. Concluso Com base nas curvas de titulao e, consequentemente, pelos valores de p , p , pI e p encontrados, pode-se dizer que o aminocido A histidina e o aminocido B glicina. Porm, por ter sido um experimento qualitativo realizado por alunos, no se pode afirmar com toda certeza que estes so de fato os aminocidos certos, pois a falta de experincia pode levar a erros. 10

6. Referncias Bibliogrficas [1] ANDRADE, J.M.S. Cdigo Gentico e Sntese Protica. Universidade Federal de Cincias da Sade de Porto Alegre (UFCSPA). Disponvel em:<http://genetica.ufcspa.edu.br/seminarios%20monitores/cod%20gen%20e%20 sint%20prot.pdf>. Acesso: 09/05/2011. [2] MURRAY, R. K. et al. Harper: Bioqumica. So Paulo: Atheneu, 1998. [3] LEHNINGER, A.L. et al. Princpios de bioqumica. 4 ed. So Paulo: SARVIER, 2006. [4] ROGERO, M. M.; TIRAPEGUI J. Aspectos atuais sobre aminocidos de cadeia ramificada e exerccio fsico. So Paulo, dez. 2008. Disponvel em:< http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S15169332200800040000>. Acesso: 09/05/2011. [5] GUEDES, L. S. Manual de Aulas Prticas. Universidade Federal de Pernambuco (UFPE). Recife, 2007. Disponvel em:<www.ufpe.br/dbioq/portalbq04/arquivos/apostila%202007.doc>. Acesso: 09/05/2011. [6] MELO, I. S. B. D. et al. Titulao de Aminocidos. Universidade Federal da Paraba (UFPB). Disponvel em:<http://www.prac.ufpb.br/anais/IXEnex/iniciacao/documentos/catalogoresumo/ 6.SAUDE/6CCENDBMMT04.pdf>. Acesso: 09/05/2011. [7] HARRIS, D. C. Anlise Qumica Quantitativa. 6 ed. Rio de Janeiro: LTC, 2005. 876 p.

[8] VENDRUSCOLO, F. Produo de Pigmento Vermelho a partir de Pigmento Laranja produzido por Monascus ruber CCT 3802. Universidade Federal de Santa Catarina Centro (UFSC). Santa Catarina, 2009. Disponvel em:<http://pgeal.paginas.ufsc.br/files/2010/09/Tese-Francielo-Vendruscolo2009. pdf>. Acesso: 09/05/2011. [9] RODRIGUES, T. C. Titulao Potenciomtrica de Grupos Amino em Aminocidos e de Resduos de Lisina em Protenas. Campinas, 1993. Disponvel em:<http://biq.iqm.unicamp.br/arquivos/teses/vtls000062591.pdf>. Acesso: 09/05/2011. [10] MARZZOCO, A.; TORRES B. B. Bioqumica Bsica. 3 Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.