SADE

TERAPIA GNICA

Mdico pela Universidade Federal de Minas Gerais; Doutor em Medicina pela Universidade de Hannover, Alemanha; Livre-Docente em Gentica pela Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto USP; Bolsista do Programa Jovem Pesquisador em Centro Emergente, da FAPESP; Diretor de Pesquisa & Desenvolvimento da Genon ltda. sudani@rgm.fmrp.usp.br

Sergio U. Dani

Vetores para terapia gnica

Fotos cedidas pelo autor

erapia gnica o tratamento A tecnologia bsica envolvida em qualfragmentos de DNA de vrus contendo o de doenas baseado na transquer aplicao da terapia gnica a transDNA a ser transferido; ou mesmo a partferncia de material gentiferncia gnica. Vrios mtodos atuais de cula viral formada por protenas virais co. Em sua forma mais simtransferncia gnica e suas vantagens e empacotando um DNA viral modificado ples, a terapia gnica consisdesvantagens esto listados nas Tabelas 1 de maneira a tornar o vetor menos txico, te na insero de genes funa 3. A maneira mais simples de transferir menos patognico ou no-patognico. cionais em clulas com genes defeituosos, genes para clulas e tecidos por meio da A palavra vetor, que deriva do Latim para substituir ou complementar esses inoculao de DNA puro, com tcnicas de vector (aquele que carrega, entrega) degenes causadores de doenas. A maioria microinjeo; eletroporao e o mtodo fine o agente que constitui ou contm os das tentativas clnicas de terapia gnica biobalstico. Mtodos mais elaborados e genes a serem transferidos e expressos em atualmente em curso so para o tratamento mais eficientes incluem a administrao de uma clula receptora. Os diversos tipos de de doenas adquiridas, como AIDS, neoDNA encapsulado (e.g., liposomos); ou vetores so utilizados com o objetivo de plasias malignas e doenas cardiovasculaatravs de vetores virais, que podem ser levar o DNA teraputico ao ncleo das res, mais do que para doenas hereditrias. Em alguns protoTabela 1 colos, a tecnologia da transferncia gnica vem sendo usada Mtodos Qumicos para Introduo de Genes em Clulas de Mamferos para alterar fenotipicamente uma clula de tal modo a torn-la Mtodo Vantagens Desvantagens antignica e assim desencadear uma resposta imunitria. De DNA-fosfato de clcio Morte celular durante S ex vivo; transfeco maneira anloga, um gen estrao procedimento mnima; baixa; baixo nvel de nho pode ser inserido em uma importante na produo de expresso do transgen; clula para servir como um vetores virais recombinantes; marcador genotpico ou fenotsimples e barato; expresso pico, que pode ser usado tanto pode ser transitria ou estvel; em protocolos de marcao gnica quanto na prpria terapia DNA-DEAE dextran Mais reprodutvel que o mtoS ex vivo; transfeco gnica. O panorama atual indica do anterior; baixa e transitria; s que a terapia gnica no se funciona em alguns limita s possibilidades de substipos celulares tituir ou corrigir genes defeituosos, ou eliminar seletivamente clulas marcadas. Um espectro teraputico muito mais amplo se apresenta medida em que novos sistemas so desenvolvidos para permitir a liberao de protenas teraputicas, tais como hormnios, citocinas, anticorpos, antgenos ou novas protenas recombinantes. A terapia gnica a esperana de tratamento para um grande nmero de doenas at hoje consideradas incurveis por mtodos convencionais, das hereditrias e degenerativas s diversas formas de cncer e doenas infecciosas.
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DNA-lpide (liposomos)

No se integram ao genoma hospedeiro; uso in vitro e in vivo; carregam grandes pedaos de DNA (to grandes como cromossomos inteiros); direcionveis; no-imunognicos; preparaes livres de contaminantes (cf. vetores virais); alto grau de pureza; padronizao Maior direcionamento No se integram no genoma; inseres maiores so possveis; melhor controle transcricional

Baixa eficincia de transfeco em relao aos sistemas virais; expresso transitria do transgen; leve toxicidade celular; podem ser inibidos por componentes sricos

DNA-protena DNA-lpide-protena HACs (cromossomos artificiais)

Em desenvolvimento

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clulas-alvo. Outra forma de transferncia da mensagem gentica envolve a entrega de RNA diretamente ao citoplasma das clulas, mas o RNA mais instvel que o DNA, o que limita a aplicao dessa modalidade de transferncia gnica. O uso de mitocndrias ou DNA mitocondrial (mtDNA) como vetores gnicos citoplasmticos tem aplicao potencial na reposio do mtDNA a clulas com deficincia no metabolismo energtico da fosforilao oxidativa causada por mutaes no mtDNA. Afora o ncleo, a mitocndria a nica organela que possui seu prprio DNA. Uma questo-chave da terapia gnica a escolha do vetor adequado a cada situao. Um vetor ideal seria aquele que pudesse acomodar um tamanho ilimitado de DNA inserido, fosse disponvel em uma forma concentrada, pudesse ser facilmente produzido, pudesse ser direcionado para tipos especficos de clulas, no permitisse replicao autnoma do DNA, pudesse garantir uma expresso gnica a longo prazo e fosse no-txico e noimunognico. Tal vetor ainda no existe e nenhum dos sistemas de entrega de DNA atualmente disponveis para transferncia gnica in vivo perfeito com respeito a qualquer um desses pontos. At a presente data, quatro sistemas de transferncia gnica (DNA plasmidial complexado, vetores retrovirais, vetores adenovirais e vetores baseados no virus adeno-associado) foram os mais usados em tentativas de terapia gnica em humanos, totalizando uma experincia clnica de cerca de trs mil pacientes em todo o mundo. DNA Plasmidial Complexado Um vetor plasmidial uma molcula de DNA circular purificada, construda por meio de tcnicas do DNA recombinante para conter, alm do gen teraputico de interesse, sequncias regulatrias tipo promotores e intensificadores, para facilitar e controlar a expresso do gen. Vetores de DNA plasmidial podem ser introduzidos nas clulas por uma variedade de mtodos. O mais bvio deles, conceitualmente, a injeo direta, que exige tcnicas sofisticadas para injeo em escala microscpica. Essa tcnica, entretanto, limitada pelo fato de que somente um nmero relativamente pequeno de clulas pode ser injetado em um determinado momento. Apesar das tentativas de automatizar as tcnicas de microinjeo, o pequeno nmero de clulas que podem ser injetadas por vez continua sendo uma grande limitao. Esse mtodo de transferncia gnica poder ter interesse e de utilidade clnica se um pequeno nmero de clulas purificadas da medula ssea forem injetadas e condies de cultivo celular forem encontradas para expandi-las substancialmente. Entretanto, ainda existir o problema da

expresso transitria, pois a maioria das clulas injetadas com o vetor no ser capaz de manter a expresso por longo prazo. Isso exige outras melhorias na sequncia do vetor, de modo a aumentar, por exemplo, a eficincia de sua integrao. Aumento da eficincia de transfeco do DNA plasmidial purificado pode ser obtido com a formao de algum tipo de complexo: lipdico, protico, ou misto. Aps a aplicao desse complexo nas clulas em cultura ou in vivo, uma poro substancial das clulas endocita o DNA e capaz de transportar pelo menos parte dele para o ncleo, onde o DNA expresso transitoriamente por alguns dias (Figura 1). A no ser que o DNA plasmidial tenha a capacidade de integrao dirigida, apenas uma frao muito pequena (geralmente muito menos de 1 por cento) das clulas retm o DNA permanentemente, incorporando-o em seus cromossomos e continuam a expressar os genes introduzidos. Vetores Virais Vrus so vetores gnicos por excelncia e vm evoluindo h milhes de anos na natureza em associao com virtualmente todos os organismos, de bactrias at plantas e animais. Os sistemas biomoleculares especficos de transferncia, recombinao e expresso gnica adotados pelos virus constituem instrumentos poderosos para a construo de vetores mais eficientes e seguros, com indicaes precisas de uso. Bacterifagos, baculovirus, retrovirus, adenovirus e virus adeno-associados so exemplos de virus que foram modificados com sucesso pelas tcnicas do DNA recombinante e j possuem aplicaes na pesquisa, na agricultura e na medicina. Conceitualmente, no surpreendente que virus de animais estejam sendo usados como vetores para a transferncia de genes para clulas de mamferos. Conforme listado na Tabela 3, vrios virus vm sendo explorados desta maneira. Vetores Retrovirais Um retrovirus murino, o virus da leucemia murina de Moloney (MoMuLV), foi o primeiro sistema vetorial desenvolvido para aplicaes clnicas da terapia gnica. Os conceitos gerais da produo e uso desse tipo de vetor esto ilustrados na Figura 2: Por meio de tcnicas de DNA recombinante, os genes no genoma viral necessrios para a reproduo do MoMuLV, genes gag, pol e env, so removidos e substitudos por um gen de interesse. O que sobra do retrovirus so seus elementos regulatrios: as repeties terminais longas (LTR), que funcionam como sinais de integrao do provirus e promotores da transcrio e um sinal de empacotamento, para permitir que o RNA transcrito seja acomodado em uma partcula viral. Para a

produo dos vetores retrovirais contendo o gen de interesse, utilizada uma linhagem celular de empacotamento contendo os genes gag, pol e env incorporados ao genoma destas clulas. Os vetores so produzidos em altos ttulos nas clulas de empacotamento e a seguir purificados e injetados no paciente (terapia gnica in vivo) ou postos em contato com clulas colhidas do paciente e mantidas em codies de cultivo celular (terapia gnica ex vivo). Os vetores tm a habilidade de entrar nas clulas-alvo, transcrever seu RNA na forma de DNA (graas atividade da enzima transcritase reversa), e se integrar estavelmente em um cromosomo da clula como resultado da presena das sequncias regulatrias retrovirais remanescentes. Uma vez integrado, o gen inserido pode ser expresso para produzir a protena teraputica desejada. O vetor retroviral, desprovido dos genes para a replicao viral, no competente para a replicao (diz-se que o vetor defectivo), e por isso no capaz de produzir mais virus competentes dentro da clulaalvo. Portanto, o vetor age como um agente final de transferncia gnica, deixando uma cpia de sua sequncia no genoma da clula-alvo. Vetores Adenovirais Os adenovrus humanos so DNAvrus, no envelopados, com um genoma dupla-fita linear de, aproximadamente, 36 kb, encapsulado em um capsdeo icosadrico medindo 70-100 nm de dimetro. O capsdeo contm em seus vrtices espculas por onde se d a interao com receptores celulares. Na natureza, os adenovirus so capazes de infectar clulas do trato respiratrio e gastrointestinal, causando gripes, gastroenterites em crianas ou conjuntivites epidmicas. As glndulas adenides so um de seus alvos e de onde se originou o nome adenovrus. Infeces envolvendo o trato urinrio, vias hepticas e o sistema nervoso central podem ocorrer espordicamente. A maioria, seno a totalidade dos adultos j foi exposta ao adenovirus e j possui anticorpos anti-adenovirus. Ao contrrio dos retrovirus, os adenovirus se replicam independentemente da diviso da clula hospedeira, e seu cromosomo raramente se integra ao genoma da clula, permanecendo episomal na maioria das vezes. A integrao parece ocorrer somente na presena de altos nveis de infeco em clulas em diviso, mas esse evento no contribui significativamente para a utilidade destes virus como vetores. Os vetores adenovirais possuem um largo espectro de infectividade celular que inclui virtualmente todas as clulas psmitticas e mitticas (Figura 3), e tambm podem ser produzidos em elevados ttulos.
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Tabela 2 Mtodos Fsicos para Introduo de Genes em Clulas de Mamferos

Mtodo Microinjeo direta Vantagens Alta taxa de transfeco; evita a degradao citoplasmtica e lisossomal do material injetado; tcnica muito trabalhosa; requer clulas muito bem isoladas Alta taxa de transfeco Desvantagens S ex vivo; potencial para uso em terapia gnica da linhagem germinativa apresenta problemas tcnicos e ticos

Eletroporao

S ex vivo; muita morte celular torna o procedimento pouco eficiente Baixa porcentagem de fibras expressam o transgen aps a injeo; uso restrito a pele, timo e msculo estriado

Injeo de plasmdeo

Simplicidade; 2-19 kb podem ser facilmente transferidos para msculo; uso em vacinao gnica

Injeo balstica de DNA

Alta taxa de transfeco; Expresso transitria; entrega de doses precisas; leso celular considervel uso em vacinao gnica no centro da regio atingida pelo disparo
cado ento transfectado para as clulas empacotadoras onde ele empacotado na forma de partculas adenovirais defectivas. Os vetores adenovirais assim produzidos so isolados do meio de cultivo das clulas empacotadoras, e purificados por ultracentrifugao em gradiente de cloreto de csio, que tambm concentra o vetor em suspenses com elevada titulao (mais de 1013 UFP ml-1), ou por cromatografia. O virus purificado estvel em uma variedade de tampes aquosos e pode ser congelado por perodos prolongados sem perda de atividade. Uma estratgia alternativa de produo de vetores adenovirais consiste em preparar um plasmdeo no qual o gen de interesse flanqueado por seqncias de DNA adenovirais. Estas sequncias servem como regies controle e contm sinais de empacotamento e stios para a recombinao com DNA genmico adenoviral, que ser usado para reconstituir adenovirions defectivos dentro da clula empacotadora. A transfeco desse plasmdeo para clulas empacotadoras, juntamente com o DNA genmico de adenovirus com delees selecionadas (e.g., E1, E3) leva, por meio de recombinao homloga, formao de partculas adenovirais com o(s) transgen(es) substituindo as regies previamente deletadas. Portanto, tanto a clonagem direta, quanto a recombinao homloga podem ser usadas para produzir adenovirions defectivos. Com o desenvolvimento de novas linhagens de clulas de empacotamento contendo um nmero cada vez maior de genes adenovirais para a

A estrutura genmica dos adenovirus mais complexa que a dos retrovirus. O genoma adenoviral codifica aproximadamente 15 protenas. A expresso gnica viral ocorre de uma maneira ordenada e dirigida, em grande parte, pelos genes E1A e E1B, localizados na poro 5' do genoma adenoviral. Esses genes possuem funes de transativao para a transcrio de vrios genes virais e da clula hospedeira. Como estes genes da regio E1 esto envolvidos na replicao do adenovirus, sua remoo torna o virus incompetente para replicao ou defectivo. A remoo tambm cria espao para a insero de um gen de interesse teraputico. A regio E3, cujo produto est envolvido na habilidade do virus de escapar do sistema imunolgico do organismo hospedeiro, tambm pode ser substituda por um DNA exgeno. Para a produo de vetores adenovirais, necessrio utilizar, a exemplo do que ocorre com vetores retrovirais defectivos, uma linhagem de clulas empacotadoras contendo genes virais que transcomplementam o vetor defectivo a ser produzido. As etapas principais de produo e uso de um vetor adenoviral esto ilustradas na Figura 4. Uma das modalidades comea pela produo de um plasmdeo ou cosmdeo contendo o genoma do adenovirus com delees em algumas regies especiais, como a regio E1. A deleo de E1 torna o virus defectivo. O gen de interesse pode ser clonado nestas regies deletadas, e o plasmdeo ou cosmdeo pode ser multiplicado em uma cultura de bactria. O plasmdeo ou cosmdeo purifi30 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

transcomplementao, j possvel produzir vetores adenovirais contendo um nmero cada vez menor de sequncias adenovirais e um nmero cada vez maior de sequncias exgenas. Um vetor adenoviral all deleted foi produzido recentemente. Esse vetor possua 28 kb de DNA exgeno (gen da distrofina) e apenas 8 kb de sequncias adenovirais. Vetores Adeno-Associados Algumas caractersticas desfavorveis dos vetores adenovirais e retrovirais revistas na Tabela 3 incluem a incapacidade de integrao do DNA dos vetores adenovirais ao genoma da clula hospedeira, ocasionando uma expresso instvel e a integrao aleatria do DNA dos vetores retrovirais ao genoma hospedeiro, podendo acarretar mutagnese insercional ativadora de proto-oncogenes celulares humanos ou inativao de genes supressores de tumor. Alm disso, esses vetores podem provocar resposta imunolgica dos tipos humoral e celular e podem ser patognicos. Vetores alternativamente indicados para contornar esses problemas so baseados no virus adeno-associado (AAV, adenoassociated virus), um pequeno vrus de DNA, no envelopado, no patognico, pertencente famlia Parvoviridae. O AAV possui uma nica molcula de DNA fita simples de 4681 bases, com repeties terminais invertidas (ITRs, inverted terminal repeats). Os ITRs so sequncias palindrmicas de 145 pares de bases envolvidas na regulao do ciclo celular do AAV, dispostas nas pores terminais 5' e 3' do genoma viral, que servem como origem e iniciadores para a replicao do DNA. Flanqueadas pelas ITRs, duas amplas molduras abertas de leitura codificam uma protena regulatria e outra estrutural denominadas rep e cap, respectivamente. A regio de leitura situada na poro 5' (gen rep) codifica quatro protenas no-estruturais envolvidas com a replicao genmica. A poro 3' contm o gen cap, que codifica trs protenas estruturais para a formao do capsdeo viral. O AAV considerado um dependovirus porque somente capaz de se replicar em uma clula na presena de um virus auxiliar (adenovirus ou virus da herpes), que lhe fornea, em transcomplementao, os fatores auxiliares essenciais para sua replicao. Na ausncia do vrus auxiliar, o genoma do AAV integra-se, preferencialmente, em um stio especfico (AAVS1) no brao curto do cromossomo 19, entre q13.3 e qter, utilizando para isso os ITRs, com alta freqncia e estabilidade, para estabelecer uma infeco latente tanto em clulas mitticas quanto em clulas ps-mitticas. Recentemente, formas episomais do vrus tambm foram identifica-

das e a integrao em stios no especficos foi documentada, porm Vetores Vantagens Desvantagens no h, at o momento, nenhuma relao destas formas com oncogneRetrovirais Alta taxa de transduo; Imunognico; requer clulas se insercional. O provrus latente pode amplo espectro de hospedeiro em diviso; risco de mutagnese ser recuperado e replicado atravs de (somente clulas em diviso); insercional; risco de reverso para o uma superinfeco com o vrus auxisistema muito bem estudado tipo selvagem; inativao pelo liar. e conhecido; integrao no complemento; baixos ttulos; O vrus adeno-associado tem desgenoma hospedeiro; protenas baixa taxa de entegra in vivo pertado grande interesse como um do vetor no expressas no vetor potencial para transferncia de hospedeiro genes em tentativas de terapia gnica humana. Entre as suas propriedades Amplo espectro de hospedeiro Imunognico; reverso para o tipo mais favorveis esto: (I) nenhuma Adenovirais (clulas mitticas e no selvagem; perodo curto de expresso relao com doenas humanas; (II) mitticas); altos ttulos; gnica em clulas em diviso (depurapoder de infeco de uma ampla alta eficincia de transduo; o do epissomo); vazamento de gama de linhagens celulares derivagenoma viral epissomal; protenas virais das de diferentes tecidos; (III) a sua virus selvagem causa doena habilidade de integrar dentro do geleve; no envelopado noma hospedeiro e estabelecer uma infeco latente. Este tipo de integraAmplo espectro de hospedeiro; Limite ao empacotamento de DNA; o pode ocorrer em clulas que no Adenonenhuma doena humana integrao no sempre stio-dirigida; estejam em processo de diviso, em- associados associada; infecta clulas imunognico (?) bora acontea com uma freqncia em diviso ou paradas; intemenor que em clulas em diviso. grao dirigida preferencial Soma-se a estas caractersticas favorveis o tipo de integrao proporcioAmplo espectro; altos ttulos; Imunognico nado pelo AAV. A capacidade de Hbridos transduo com AAV recombinante Adenovirus-AAV alta eficincia de transduo; integrao dirigida (rAAV) tem sido demonstrada em uma ampla variedade de tipos celulares, incluindo as diferenciadas, o que Herpes simples Epissomal; pode induzir infecImunognico; virus diferentes tm sugere um grande potencial desse o latente por toda a vida (esseletividade diferente; EBV oncogsistema de vetor para transferncia pecialmente no CNS); nico; ativao de virus latente; baixa gnica in vivo para rgos como msacomoda insertos grandes; eficincia de transduo; expresso culo, fgado, sistema nervoso central produo de altos ttulos transitria nos vetores atuais; sistema e pulmo. em desenvolvimento Vetores rAAV so derivados de plasmdeos que carregam os ITRs HIV Infectam e transduzem clulas Sistema pouco conhecido; flanqueando o gen exgeno de intemitticas e ps-mitticas, por eficincia baixa in vivo resse. Esses vetores podem ser empalongo prazo cotados dentro do capsdeo do AAV pela co-transfeco em clulas infec- Vaccinia Potencial para desenvolvimento Uso limitado aos individuos no tadas com (I) adenovrus, e (II) um de uma grande variedade de previamente vacinados; uso no indisegundo plasmdeo de empacotamenvacinas gnicas cado em imunossuprimidos to contendo os genes rep e cap (Figura 5). O rAAV recuperado em clulas lisadas e o vrus auxiliar removido. plasmdeos contendo sequncias de ITR e mencionada anteriormente, e consiste na Desta forma, quatro elementos so requesua multiplicao em linhagens recombiconstruo de plasmdeos com sequncias ridos para o empacotamento do vetor nantes de Escherichia coli. A restrio ao de ITR delimitando genes de interesse para AAV: (I) clulas eucariticas em cultura, tamanho do genoma viral tambm foi promover a transformao gnica em clu(II) as protenas responsveis pela replicaminimizada, visto que esses plasmdeos las eucariticas e conferir maior persistno do genoma viral e sntese do capsdeo, no precisam ser encapsulados em um cia do DNA transfectado, se comparada (III) o DNA do vetor e (IV) o vrus auxiliar. capsdeo viral, podendo ser introduzidos quela obtida com plasmdeos convencioAs desvantagens de utilizar partculas em clulas eucariticas utilizando a tcninais sem os ITRs. Os vrus AAV podem ser rAAV como vetores de transferncia gnica de transfeco com lipossomos, sem substitudos por esse tipo de construo ca esto no tamanho do seu genoma prejuzo do amplo espectro de infectividacomplexada em liposomos, pois os nveis (acima de 5 kb ocorre interferncia no de celular caracterstico do AAV. de expresso gnica e reteno do transencapsulamento viral), o que limita a cloCombinaes de gen nas clulas transfectadas por esses nagem de determinados genes, e a dificulElementos Virais e No-Virais complexos so semelhantes aos nveis dade de produzir o vetor viral em grandes A combinao de elementos virais e obtidos com partculas virais encapsulaquantidades. Entretanto, vrios melhorano-virais tem sido usada para aumentar a das. mentos tm sido obtidos na produo e eficincia da transferncia gnica para cMitocndrias e DNA Mitocondrial uso de vetores baseados em AAV. A difilulas em cultura. Um exemplo de combinaA mitocndria a nica organela que culdade de produzir estes vetores em larga o de elementos virais e no virais uma possui seu prprio DNA (mtDNA). Em escala foi minimizada pela utilizao de alternativa ao uso de partculas de rAAV princpio, as mitocndrias se assemelham
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Tabela 3 Mtodos Biolgicos para Introduo de Genes em Clulas de Mamferos

Figura 1. Os complexos formados entre lpides ou fosfolpides e DNA constituem liposomos. Liposomos catinicos so geralmente preparados a partir de fosfolpides bipolares e consistem de um ncleo hidroflico, delimitado por uma camada lipdica externa. Os lpides catinicos formam interaes eletrostticas com a molcula fortemente aninica do DNA de maneira espontnea, promovendo o encapsulamento do cido nucleico. Os liposomos assim produzidos possuem um amplo espectro de infectividade celular

Figura 2. Produo e uso de retrovirus

aos lipossomos utilizados em transferncia gnica, constitudos de membranas lipdicas envolvendo molculas de DNA. Uma vez que mitocndrias podem ser purificadas por ultracentrifugao de homogenados celulares, elas poderiam ser utilizadas como vetores de transferncia gnica. Mitocndrias isoladas do sangue de doadores podem ser fundidas a clulas receptoras, gerando hbridos de citoplasma (cbridos) viveis. O uso de mitocndrias ou do DNA mitocondrial (mtDNA) como vetores gnicos tem aplicao potencial na reposio do mtDNA a clulas com deficincias no metabolismo energtico da fosforilao oxidativa causadas por mutaes. Mutaes no mtDNA esto ligadas a um grande nmero de sndromes degenerativas neuromusculares com padro de herana materna. Alm disso, mutaes no mtDNA ocorrem em clulas da linhagem somtica e se acumulam durante o envelhecimento e em condies de stress oxidativo, e podem explicar boa parte dos fentipos caractersticos da idade avanada, como fraqueza muscular, doena de Alzheimer e doena de Parkinson. Concluso e Perspectivas Vrias doenas incurveis pelos mtodos teraputicos convencionais representam perspectivas futuras para a aplicao da terapia gnica. Contudo, ainda existem limitaes com relao eficincia e direcionamento dos vetores de transferncia gnica da gerao atual. Os vetores virais recombinantes so os veculos mais potentes para a transferncia gnica, mas a resposta imunolgica do hospedeiro e as dificuldades de produo em larga escala e padronizao ainda so grandes barreiras para seu uso clnico. A entrega de DNA via lipossomos ou via direcionamento a receptores celulares oferece alternativas elegantes para a transferncia mediada por virus, mas os nveis de expresso gnica obtidos com esses mtodos precisam ser melhorados significativamente antes que eles possam ser utilizados para o tratamento de doenas humanas. Alm disso, nosso conhecimento do controle transcricional incompleto. Estes campos esto sob intensa investigao; os mtodos de transferncia gnica ex vivo e in vivo esto em franco desenvolvimento e esperam-se avanos considerveis na prxima dcada. O desenvolvimento de sistemas altamente eficientes de empacotamento viral e o refinamento dos processos de purifica-

Figura 3. Amplo espectro de infectividade celular de um vetor adenoviral carregando o gen LacZ de E. coli, que codifica a enzima beta-galactosidase. A expresso do gen denotada pela cor azul do substrato X-gal, metabolizado pela enzima nas clulas infectadas pelo vetor. No sentido horrio, comeando pelo canto superior direito: (I) crtex renal de coelho, aps infuso intracarotdea do vetor; (II) fibras de msculo estriado esqueltico de rato, aps injeo intramuscular do vetor; (III) clulas endoteliais em capilar de crebro de rato, aps infuso intracarotdea do vetor; (IV) fibroblastos na pia mater de rato, aps injeo intraparenquimal do vetor; (V) astrcitos no crtex cerebral de rato, aps injeo estereotxica do vetor; (VI) neurnio piramidal do crtex do giro do cngulo, aps injeo estereotxica do vetor no hipocampo de rato
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tes para as diferentes aplicaes clnicas. Isso certamente ampliar as oportunidades para o uso da transferncia gnica no contexto clnico. A terapia gnica promete ser uma rea frtil de pesquisa cientfica e clnica por muitos anos, e no h dvida que se tornar uma prtica clnica importante neste novo sculo. A terapia gnica poder representar uma mudana de paradigma da medicina, com importantes repercusses para a sociedade. Leituras recomendadas Balagu C, Kalla M, Zhang W-W. 1997. Adeno-associated virus rep78 protein and terminal repeats enhance integration of DNA sequences into the cellular genome. J. Virology 71:3299-3306. Dani, S.U. 1998. Terapia Gnica. Captulo 90, in Dani, R. Gastroenterologia Essencial. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan. Dani SU. 1999. Terapia Gnica: O Objetivo Final. Cap. 14 in Rossi, BM, Pinho, M. Gentica e Biologia Molecular para o Cirurgio. So Paulo, Editora Lemar, pp. 261289. Dani SU. 1999. The challenge of vector development in gene therapy. Braz. J. Med. Biol. Res. 32:133-145. Dani SU, Uetsuki T, Nishimura I, Saito I, Yoshikawa K. 1998. Improved adenovirusmediated gene transfer to neurons in the brain: Effect of intraparenchymal injection of hypertonic mannitol and concentration of the vector particles in the infusate. Virus Reviews and Research 3(1-2):41-49. Darquet A-M, et al. 1997. A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle. Gene Therapy 4:13411349. Hartikka, J., et al. 1996. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum Gene Ther 7:1205-1217 Lebkowski JS, et al. 1988. Adeno-associated virus: a vector system for efficient introduction and integration of DNA into a variety of mammalian cell types. Mol Cell Biol 8(10):3988-96 Lebkowski JS, Okarma TB, Philip R. 1996. The challenges of recombinant adeno-associated virus manufacturing: alternative use of adeno-associated virus plasmid/ liposome complexes for gene therapy applications. Curr Top Microbiol Immunol 218:51-9 Philip, R., et al. 1994. Efficient and sustained gene expression in primary T lymphocytes and primary and cultured tumor cells mediated by adeno-associated virus plasmids DNA complexed to cationic liposomes. Mol. Cell. Biol. 14, 2411-2418. Zhu, N., Liggitt, D., Liu, Y., Debs, R. 1993. Systemic gene expression after intravenous DNA delivery into adult mice. Science 261, 209-211.
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Figura 4. Etapas da produo e uso de vetores adenovirais

Figura 5. Etapas da produo e uso de partculas de vetores adeno-associados recombinantes (rAAV) o e concentrao podero melhorar os ttulos dos vetores virais para valores que podero permitir a transferncia gnica pela administrao sistmica. O direcionamento da entrega poder ser possvel pela incorporao de anticorpos de cadeia nica contra antgenos de superfcie ou ligantes para receptores transmembrnicos incorporados ao envelope de retrovrus ou protenas penton de adenovrus, e h sinais encorajadores de que essa estratgia possa alcanar sucesso. A mdio prazo, espera-se a chegada de vetores de desenho incorporando os elementos mais teis dos sistemas virais e sintticos disponveis atualmente, com variaes dependendo da aplicao. Por exemplo, as repeties terminais invertidas (ITR) dos virus adeno-associados, que promovem integrao cromossomal estvel, podem ser combinadas com seqncias de outros vetores com maior capacidade de acomodao de insertos. A integrao pode ser aumentada atravs do empacotamento de uma enzima recombinase funcional com a construo de expresso gnica em complexos lipossomais direcionados a uma clula especfica com anticorpos ou protenas ligantes de receptores. A longo prazo, novos mtodos de entrega podero ser desenvolvidos para a transferncia intranuclear de cromossomos artificiais humanos (HACs) carregando grupos inteiros de genes com seus elementos naturais de controle. No futuro, a pesquisa bsica dever tentar definir os elementos genmicos que tornam possvel o controle temporal e espacial da expresso gnica durante a vida de um indivduo. Avanos nessas reas iro requerer desenvolvimentos paralelos no desenho de vetores, antes que os conhecimentos possam ser utilizados na prtica clnica. Da grande quantidade e criatividade dos sistemas de vetores e mtodos de transfeco gnica que esto sendo desenvolvidos, parece claro que, no futuro, haver uma grande escolha de mtodos diferen-