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Avaliao do efeito antifngico do leo resina e do leo essencial de copaba (Copaifera multijuga Hayne)
DEUS, R.J.A.*; ALVES, C.N.; ARRUDA, M.S.P. Laboratrio de Qumica, Programa de Ps-graduao em Qumica, ICEN, Universidade Federal do Par, Avenida Augusto Correa, s/n - Guam, CEP: 66075-110, Belm-Brasil *dedeus@ufpa.br

RESUMO: leo de Copaifera multijuga Hayne, in natura e as fraes foram avaliados quanto s suas atividades fungitxicas, frente a cinco espcies de fungos filamentosos do gnero Aspergillus e trs espcies de leveduras do gnero Candida. Concentraes de leo resina e de leo essencial na faixa de 0,08 mg mL-1 a 1,6 mg mL-1 foram usadas para as anlises qualitativa e quantitativas. As amostras foram dispostas sobre discos de papel de 5 mm de dimetro e distribudos sobre o meio Saboraud em placas de Petri, inoculadas com esporos dos microrganismos e incubadas a 28C durante 10 dias. Utilizou-se uma soluo com 1,6 mg mL-1 de nitrato de miconazol como controle positivo. Os resultados qualitativos mostraram que o leo resina apresentou boa atividade, porm uma das fraes do leo essencial se mostrou altamente efetivo contra C. parapsilosis IOC - 2882, A.flavus IOC-3874 e A. tamarii IOC-187 com halos de inibio de 16,01,4 mm, 19,52,1 mm e 12,53,5 mm, respectivamente. J a avaliao quantitativa mostrou que 0,3 mg mL-1 do leo resina inibiu o crescimento de A. flavus e C. parapsilosis, enquanto que 0,08 mg mL-1 da frao do leo essencial atingiu esta mesma atividade. Palavra-chave: Copaifera multijuga, leo essencial, atividade antifngico, Aspergillus, Candida

ABTRACT: Evaluation of the antifungal effect of oleoresin and essential oil of copaiba (Copaifera multijuga Hayne). Copaifera multijuga Hayne oil in natura and its fractions were evaluated as to their fungitoxic activities against five filamentous fungus species belonging to the genus Aspergillus and three yeast species of the genus Candida. Oleoresin and essential oil concentrations ranging from 0.08 mg mL-1 to 1.6 mg mL-1 were used for qualitative and quantitative analyses. The samples were placed onto 5mm-diameter paper discs distributed on Sabourauds medium in Petri dishes inoculated with spores of the microorganisms and incubated at 28C for 10 days. A solution containing 1.6 mg mL-1 miconazole nitrate was used as positive control. Qualitative results showed that the oleoresin presented good activity, while a fraction of the essential oil was highly effective against Candida parapsilosis IOC-2882, Aspergillus flavus IOC-3874 and A tamarii IOC-187 with 16.01.4 mm, 19.52.1 mm and 12.53.5 mm inhibition halos, respectively. The quantitative evaluation showed that 0.3 mg mL-1 oleoresin inhibited the growth of Aspergillus flavus and Candida parapsilosis, while 0.08 mg mL-1 of the essential oil fraction reached this same activity. Key words: Copaifera multijuga, essential oil, antifungal activity, Aspergillus, Candida

INTRODUO Diversas doenas microbianas de origens bacteriana, viral ou fngica so relatadas na literatura. Em muitos casos, os responsveis pelas infeces adquirem resistncia ao medicamento administrado, e por este motivo grande nmero de antibiticos tem sido desenvolvido (Kubo et al., 1993; Koshi & Cherian, 1995). Paralelamente, a busca de antimicrobianos

de origem natural que apresentem atividade sobre grande espectro de microrganismo e que possam ser usados como alternativa aos antibiticos convencionais tem despertado o interesse da classe cientfica, sobretudo nas molculas de origem vegetal, j que as plantas possuem grande potencial em sintetizar substancias qumicas com estruturas diversificadas,

Recebido para publicao em 20/10/2008 Aceito para publicao em 16/11/2010

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como sistema de defesa contra agentes patognicos (Rodrigues et al., 1997). Para serem efetivas como agentes antimicrobianos, as substncias precisam ser produzidas e acumuladas em concentraes suficientes nos rgos e stios intracelulares, e se so efetivas em tecidos vegetais podero ser efetivas em tecidos animais (Santos, 1998). Este assunto vem ao encontro da investigao sistemtica sobre os aspectos microbiolgicos, profilticos e teraputicos das infeces oportunistas (Rodrigues et al., 1997). Dentro deste assunto, ressaltam-se as infeces fngicas que correspondem at 10% do total de casos, com predomnio de microrganismo pertencente aos gneros Candida e Aspergillus (Koshi & Cherian, 1995; Mylonakis & Calderwood, 2001). O principal tratamento para a infeco fngica a antibioticoterapia endovenosa prolongada (Verghese et al., 1998; Menesalvas & Bouza, 1998). O tratamento especfico de doenas causadas por fungos prolongado em funo da dificuldade diagnstica mais do que s infeces causadas por bactrias; fato este que limita o arsenal antimicrobiano contra este tipo de patgeno. Deste modo, a busca de antimicrobianos de origem vegetal se apresenta com grande potencial em funo das clulas vegetais reagirem contra patgenos, alm de que possam ser mais eficientes no tratamento dessas infeces micticas e menos txicas aos pacientes (Recio et al., 1989; Farnsworth, 1996). Entre as diversas famlias de plantas estudadas, destaca-se a Leguminosae que est divida em trs subfamlias, Caesalpinoideae, Mimosoideae e Papilionoideae (ou Faboideae) (Judd et al.,1999). Nesta classificao, destaca-se o gnero Copaifera, pertencente subfamlia Caesalpinoideae (Andrade Junior et al., 2000; Veiga Junior & Pinto, 2002), gnero que apresenta 16 espcies ocorrentes no Brasil das quais apenas 4 ocorrem na regio Norte, onde o leo de copaba amplamente comercializado e utilizado na medicina popular (Cascon & Gilbert, 2000). O leo de copaba constitudo de dois grupos de substncias distintas, solveis entre si, sendo um constitudo de substncias volteis, correspondendo a cerca de 90% de massa do leo resina e outro grupo constitudo de substncias no volteis, resinosa de cor caramelo que comea a ser decomposta temperatura prxima de 300C, e que corresponde a 10% da massa total do leo resina (Veiga Junior, 1997). Neste trabalho, descrevem-se as avaliaes dos potenciais antifngicos do leo resina e do leo essencial de copaba, comparando-se os nveis de fungitoxidade dos leos naturais com o nitrato de miconazol, um fungicida comercial, frente a 5 espcies de fungos filamentos do gnero Aspergillus e 3 espcies de leveduras do gnero Candida.

MATERIAL E MTODO Coleta do leo resina de copaba O leo resina de copaba foi coletado no municpio de Santarm pertencente mesorregio do Baixo Amazonas e microrregio Santarm, situado latitude 022530"S, longitude 544250"W. A espcie foi identificada como Copaifera multijuga Hayne apresentando registro de exsicata de nmero INPA-82418 depositado no herbrio do Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia (INPA). Para obteno do leo, foi usado trado manual de 7/8 polegada de dimetro e 1,0 m de comprimento. A rvore foi perfurada altura de 60 a 70 cm do cho, at o centro do caule (20 a 50 cm de profundidade no tronco, conforme o dimetro da rvore), com pequeno declive para escoamento. Uma mangueira de 3/4 de polegada foi colocada bem ajustada no orifcio, e no outro extremo do tubo foi colocado frasco de vidro mbar de 1 L. Aps a colheita, o furo foi tampado com uma espcie de rolha de madeira ou com argila e a rvore foi preservada recebendo curativo. Este mtodo produz pouco leo, tem altos custos operacionais, mas preserva a rvore, para colheitas futuras e ecologicamente correto (Azevedo, 2004). Obteno das linhagens de fungos utilizados nos ensaios As cepas de microrganismos das espcies Aspergillus flavus (IOC-3974), Aspergillus niger (IOC200), Aspergillus tamarii (IOC-186), Aspergillus tamarii (IOC-187), Aspergillus terreus (IOC-217), Candida guilliermondii (IOC-2889), Candida tropicallis (IOC3610) e Candida parapsilosis (IOC-2882), empregadas neste trabalho foram obtidas do Laboratrio de Coleo de Fungos do Instituto Osvaldo Cruz (Fiocruz-RJ). Meio de cultura e cultivo dos microrganismos O meio de cultura utilizado para este experimento foi o ASD (gar Sabouraud-Dextrose). Em cada placa de Petri foram adicionados 20 mL de meio (Midley et al., 1998; Mendes-Giannini & Melhem, 2001; Minami, 2003). O mtodo de investigao de atividade fungitxico aplicado neste trabalho foi adaptado e segue um protocolo de execuo do descrito por Lima et al.(2006). Obteno do leo essencial 100 mL do leo resina de copaba foram submetidos destilao em balo de fundo redondo de 250 mL, no qual foram adaptados a coluna de destilao de 30 cm de comprimento por 2 cm de dimetro e condensador de 40 cm de comprimento com 1 cm de dimetro de serpentina no qual foi acoplada refrigerao com circulao de gua com vazo de 4 L por min a temperatura de 10C. O procedimento foi realizado durante 5 h, obtendo-se

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75 mL de destilado, os quais foram transferidos para frasco de vidro de cor mbar, hermeticamente fechado e armazenado em temperatura de 5C para uso posterior (Veiga Junior & Pinto, 2002). Preparo do inculo O inoculo dos diferentes microrganismos descritos foram preparados atravs do cultivo em tubos de ensaio de 15 cm x 1,5 cm com tampa, contendo 5 mL de meio de cultura na posio inclinada e incubados a 28C, durante 7 dias. Aps este perodo, adicionou-se 3 mL de gua estril com subsequente agitao em Vortex (QUIMIS-220A) durante 1 min. As suspenses de esporos (na faixa de 106 a 108 esporos mm-1) foram transferidas para frascos com tampas e mantidas sob refrigerao a temperatura de 10C para uso posterior como inculo (Naghetini, 2006). Anlise do leo de copaba via CG/EM CG/EM: o leo resina e o essencial foram analisados por Cromatografia de Gs (Focus GC) acoplado a um Espectrometro de Massas em sistema Thermo DSQII, com coluna capilar de slica OV-5 (30 m x 0,25 mm; 0,25 m de espessura do filme). A programao de temperatura foi de 60C-240C (3C min-1); He foi utilizado como gs de arraste a uma velocidade linear de 32 cm s-1, medidas a 100C. A injeo foi do tipo splitless; com volume de 0,1 L de uma soluo de 2 L do leo em 1000 L de hexano (Luz et al., 1981; Santos et al., 1998; Adams, 2001). Os espectros de massas foram obtidos por impacto eletrnico a 70 eV com temperatura da fonte de ons a 200C. A identificao foi realizada por comparao de cromatograma, ndice de reteno ou ndice de Kovatz com dados da literatura (Luz et al., 1981; Santos et al., 1998; Adams, 2001). Determinao qualitativa da atividade antifngica do leo resina e do leo essencial de copaba. Aplicando a tcnica de Atividade Sobre Camada Microbiana (ASCM) adaptado da tcnica de difuso em Agar, onde um swab foi embebido na suspenso de esporos efetuando-se o espalhamento do microrganismo sobre a superfcie do meio slido, de modo a se obter um tapete fngico (Apisariyakul et al.,1995; Rios et al., 1998; Brando, 2004). Logo aps a inoculao foram dispostos, sobre o meio de cultura, 6 discos de papel de filtro whatman no 1 com dimetro de 5 mm. Os discos 1, 2 e 3 continham 2 L de leo resina, cada. Os discos 4 e 5 continham 2 L de solues comercial de miconazol nas concentraes de 1,6 mg mL-1. O disco 6 continha apenas gua destilada. Procedimento idntico foi realizado para cada microrganismo e repetido para o

leo essencial. As placas foram incubadas a 28C durante 10 dias e observadas a cada 24 horas (Lima et al., 2006). Determinao quantitativa da atividade antimicrobiana do leo resina e do leo essencial de copaba Em tubos de ensaio estreis de 12 cm x 1,5 cm foram adicionados 500 L de Tween-80 e 5 mL de gua desionizada, efetuando-se a homogeneizao da mistura por agitao manual. A seguir, foram transferidas quantidades programadas de leo resina ou leo essencial de copaba a fim de se obter suspenses nas concentraes de: 1,6 mg mL-1, 1,4 mg mL-1, 1,3 mg mL-1, 1,1 mg mL-1, 0,9 mg mL-1, 0,8 mg mL-1, 0,6 mg mL-1, 0,5 mg mL-1, 0,3 mg mL-1, 0,1 mg mL-1 e 0,08 mg mL-1. A partir destas suspenses foram retiradas alquotas de 2 L e inoculadas de acordo com o procedimento anterior. As placas foram incubadas durante 10 dias a 28C e observada a formao dos halos a cada 24 h. Os ensaios foram realizados em triplicata (Lima et al., 2006).

RESULTADO E DISCUSSO Avaliao do efeito fungitxico Quanto aos efeitos fungitxicos do leo resina e do leo essencial de Copafera multijuga Hayne, sobre a germinao de esporos das cepas de A. flavus, A. niger, A. tamarii, A. tamarii, A. terreus, e nas divises das clulas de C. guilliermondii, C. tropicallis e C. parapsilosis, observou-se a formao de tapete fngico contnuo sobre todas as placas sendo visualizada a formao de halos em torno dos discos de papel contendo, tanto o leo essencial quanto o leo resina. Os resultados foram comparados com o nitrato de miconazol nas mesmas condies que as amostras, com concentrao mnima de 1,6 mg mL-1, o que corresponde a 32 g de leo essencial por disco de papel. Neste estudo, observou-se que o mtodo comumente utilizado para avaliar a ao de leos e extratos vegetais o de difuso em disco. Porm, esse mtodo padronizado pela NCCL (National Committee for Clinical Laboratory Standards) e desenvolvido para analisar agentes antimicrobianos (Nascimento et al., 2007). O halo formado ao redor da amostra contendo o leo resina se formou com um dimetro mnimo de 7 mm, ou seja 30% menor que o halo formado com a amostra contendo miconazol. Este resultado ressalta a presena da atividade em 8 dias para as Candida, porm a partir deste perodo a atividade declinou havendo o avano microbiano sobre a zona inibida. Por este motivo, e com base nas observaes, o leo resina desta espcie apresentou apenas atividade fungisttica para as leveduras. J para nos fungos filamentosos, os

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halos de inibio foram maiores demonstrado que estes microrganismos so menos tolerantes ao leo resina do que as leveduras (Tabela 1). O leo essencial apresentou halo de inibio com dimetro de 19,5 mm, maior 25% do que o halo de inibio produzido pelo nitrato de miconazol (controle positivo). Neste contexto, observou-se que a formao do halo se manteve apenas por 8 dias para todas as linhagens, permitindo afirmar que o leo essencial apresenta atividade fungisttica, porm o leo essencial apresentou atividade superior ao leo resina, principalmente frente A. flavus e C. parapsilosis, possivelmente, causada pelo aumento nas concentraes de -copaeno (Tabela 2) (Koshi & Cherian, 1995; Mylonakis & Calderwood, 2001). O leo resina de copaba apresentou densidade de 0,8466 mg mL-1, propriedade que foi usada para a converso de volume em massa. O valor da densidade encontrado est dentro da faixa descrita na literatura para leo resina (Shanley et al., 1998). As composies qumicas volteis do leo resina e do leo essencial foram analisadas por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM), nas quais se observou as presenas de 23 constituintes no leo resina e 7

constituintes no leo essencial, ressaltando-se variaes modestas nas concentraes de poucos constituintes, e variaes mais significativas para copaeno, xido-de-cariofileno e -cariofileno (Tabela 2). Desta forma, se sups que as substancias qumicas: -copaeno, -cariofileno, Trans- bergamoteno, -humuleno, -muuroleno e bisaboleno, fossem responsveis pela inibio microbiana no leo resina (Craveiro et al., 1981; Wang, 2000; Souza et al., 2005). Nestas condies, a inibio do crescimento microbiano foi mais efetiva com leo essencial do que com o leo resina. Em relao ao do Nitrato de Miconazol, avaliado nas mesmas condies experimentais dos leos, verificou-se que o leo resina ou o leo essencial de copaba no apresentaram diferenas significativas de atividade para os microrganismos A. niger (IOC- 200) e A. tamarii (IOC-186), o que mostra efetividade das amostras contra os microrganismos avaliados. Resultados mais significativos foram obtidos com as cepas de Aspergillus flavus (IOC3974), Aspergillus tamarii (IOC-187) e Candida parapsilosis (IOC-2882) que apresentaram halos de inibio maiores do que a do miconazol, o que sugeriu caracterizar o leo essencial da espcie de Copaifera

TABELA 1. Resultados dos halos de inibio do crescimento de fungos frente ao efeito antifngico do leo resina e do leo essencial de copaba.

leo resina Microrganismos Halo de inibio (mm) Aspergillus flavus (IOC-3974) Aspergillus nger (IOC- 200) Aspergillus tamarii (IOC-186) Aspergillus tamarii (IOC-187) Aspergillus terreus (IOC-217) Candida guilliermondii (IOC-2889) Candida tropicallis (IOC-3610) Candida parapsilosis (IOC-2882) 10,0 1,1 10,0 2,1 7,0 1,0 8,0 0,0 9,0 2,2 9,0 1,0 9,0 0,0 11,0 1,1

leo essencial Halo de inibio (mm) 19,5 2,1 9,5 0,7 9,0 0,0 12,5 3,5 11,5 2,1 9,5 1,1 10,0 0,0 16,0 1,4

Nitrato de Miconazol Controle negativo Halo de inibio (mm) 15,0 1,1 10,0 1,4 9,5 1,0 10,0 1,1 13,0 0,0 10,0 0,0 11,0 1,0 15,0 0,0 Halo de inibio (mm) 0 0 0 0 0 0 0 0

Concentrao de leo resina 1,6 mg mL-1 (32 g de leo por disco) Concentrao de leo essencial 1,6 mg mL-1 Concentrao de nitrato de miconazol 1,6 mg mL-1 Controle negativo: soluo de gua + tween-80

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TABELA 2. Composies qumicas do leo resina e leo essencial de Copaifera multijuga Hayne.

IR- ndice de reteno. (-) concentraes abaixo do limite de deteco instrumental de 0,08%. (NI) no identificado IK- ndice Kovatz multijuga Hayne como agente potencial de atividade fungitxica contra estes microrganismos (Koshi & Cherian, 1995; Mylonakis & Calderwood, 2001). Avaliao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM) do leo resina e do leo essencial de copaba A Concentrao Inibitria Mnima (CIM) necessria para inibir o crescimento de A. flavus foi de 0,08 mg de leo essencial por L de soluo, o que corresponde a 0,16 g de leo, j que as densidades tanto do leo resina quanto do leo essencial no apresentaram grandes diferenas. Nestas condies se confirmou que a cepa de Aspergillus flavus foi mais suscetvel a inibio do que as demais cepas analisadas, j que no existe consenso acerca do nvel aceitvel (Oliveira et al., 2006) . A diferena de inibio entre o leo resina e a frao obtida (Tabela 3), indica a importncia da destilao fracionada para atividade antimicrobiana, de acordo com o procedimento executado. Esta ao promoveu minimizao de interferncia de outras substncias qumicas presentes no leo resina de copaba, alm de reduzir o nmero de variveis para se identificao as substncias responsveis pela atividade avaliada (Craveiro et al., 1981; Wang, 2000; Souza et al., 2005). Por outro lado, a tcnica de Atividade Sobre Camada Microbiana mostrou-se eficiente para substncias solveis em gua possibilitando difuso destas atravs do meio de cultura e consequentemente, resultados satisfatrios.

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TABELA 3. Resultado da avaliao da concentrao inibitria mnima (CIM) para o leo resina e para a frao do leo essencial de Copaifera multijuga Hayne sobre a germinao de esporos dos microrganismos.

Microrganismos (Fiocruz-RJ) Aspergillus flavus (IOC-3974) Aspergillus nger (IOC- 200) Aspergillus tamarii (IOC-186) Aspergillus tamarii (IOC-187) Aspergillus terreus (IOC-217) Candida guilliermondii (IOC-2889) Candida tropicallis (IOC-3610) Candida parapsilosis (IOC-2882)

leo resina (mg mL -1 ) 0,3 0,6 0,6 0,6 0,5 0,6 0,6 0,3

leo essencial (mg mL -1 ) 0,08* 0,1 0,5** 0,3 0,3 0,1 0,5** 0,1

Nitrato de Miconazol (controle positivo) ( mg mL-1 ) 0,1* 0,3 0,3 0,3 0,1 0,3 0,5** 0,1

Controle negativo -

(-) sem interferncia na germinao dos esporos. *halo com 2mm, **halo com 3mm 16 g por disco CONCLUSO Quanto atividade antimicrobiana observada para o leo resina e leo essencial de Copaifera multijuga Hayne durante os oito dias se supe que ou os microrganismos esto degradando as substncias inibitrias, o que pouco provvel, ou as mesmas esto se difundindo no ar por volatilizao, fenmeno que permitiu a minimizao do efeito txico no meio de cultura, fazendo com que os microrganismos pudessem se desenvolver aps o perodo de 8 dias. Esta proposio se baseia no fato de que o perodo foi o mesmo, tanto para as leveduras quanto para os fungos filamentosos. De um modo mais especfico, a inibio dos microrganismos do gnero Aspergillus e Candida extremamente promissora, em virtude dos valores de inibio terem atingido ndices acima de 90%, indicando que a frao F 10 apresenta potencial de uso como agente fungisttico no perodo de 8 dias, nas condies supradescritas. A relevncia dos resultados devida aos valores de halo de inibio encontrados para a frao F10 serem superiores ao Nitrato de Miconazol, que foi utilizado como controle positivo. Concluso, ndices iguais ou maiores do que 85% apresentam bom potencial de ao antimicrobiana para usos prticos, razo pela qual nos permite afirmar que o leo essencial de Copaifera multijuga Hayne poder ser um bom indicativo para estudos mais especficos nos combates aspergilose ou candidiase. REFERNCIA
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