Relatrio

Separao dos componentes de uma mistura por filtrao em gel

Grupo VI Gonalo Palma (43038); Margarida Brotas (43040); Pedro Patrcio (43155).

Docente: Manuel Piedade.

ndice
Resumo.......................................................................................................................................... 2 Parte experimental........................................................................................................................ 2 Materiais ................................................................................................................................... 2 Reagentes .................................................................................................................................. 3 Procedimento ............................................................................................................................ 3 Discusso dos resultados .............................................................................................................. 4

Resumo

As biomolculas so purificadas utilizando tcnicas cromatogrficas que as segregam consoante as diferenas nas suas propriedades especficas. Existem quatro tipos de tcnicas de cromatografia: partio, absoro, filtrao em gel e troca inica. No caso desta experincia laboratorial, recorreu-se filtrao em gel numa coluna (GF Gel Filtration), que separa as biomolculas de diferentes dimenses pelas suas massas moleculares relativas. Pretendeu-se isolar as molculas de hemoglobina, cromato de potssio e azul de dextrano a partir de uma mistura. O conceito de cromatografia exige sempre a passagem de uma fase mvel por uma fase estacionria. Como tal, nesta experincia, a fase estacionria o gel e a fase mvel a soluo de NaCl a 0,9% e a mistura a separar, sendo que o NaCl vai permitir a eluio de molculas com determinado tamanho e funo. Conforme se vai movimentando a fase mvel, esta vai causar uma migrao diferencial das molculas, que iro ser separadas ao longo da fase estacionria. A ordem de eluio ser por ordem decrescente da massa molecular das protenas.

Parte experimental

Materiais

Espectrofotmetro da marca Spectronic Instruments, modelo Spectronic 20 Genesis; Coluna cromatogrfica.

Reagentes

Soluo de NaCl a 0,9% (w/v) previamente preparada; Sephadex G-100 (12 g em 210 mL de soluo de NaCl a 0,9%); Amostra (previamente preparada em 2 mL de soluo de NaCl alcalinizada com hidrxido de sdio): o o o 4 mg de azul de dextrano 2000; 4 mg de cromato de potssio; 30 mg de hemoglobina.

Procedimento
Foram numerados e marcados 20 tubos de ensaio com o volume de 2 mL (no entanto, s foram necessrios 18). A coluna de gel Sephadex G-100, previamente preparada com 10 cm3 da soluo de NaCl, foi deixada eluir at que o limite da soluo de NaCl ficasse aproximadamente a 3 mm do limite do gel (neste passo foi feita uma primeira tentativa em que o gel ficou seco, devido ao facto de se ter removido demasiado eluente, tendo portanto de se recorrer a uma coluna de gel substituta). De seguida, fechou-se a sada da coluna. Mediu-se um 1 mL da amostra com uma pipeta de 2 mL, transferindo-se com movimentos circulares e lentos para o topo da coluna de gel, para no danificar a superfcie do gel. De seguida, colocou-se o tubo de ensaio n1 na sada da coluna, abrindo-se a sua sada. Deixou-se a amostra penetrar no gel, perfazendo-se depois a coluna com eluente. Desta forma se foram enchendo todos os tubos, completando-se sempre a coluna com NaCl, quando esta soluo escasseava. Posteriormente, mediu-se a absoro no espectrofotmetro de cada uma das fraces recolhidas para os comprimentos de onda = 410 nm e = 620 nm, a fim de se calcular o volume de eluio de cada componente. Utilizou-se como branco a gua destilada.

Discusso dos resultados

Tabela 1: Absorvncia das fraces recolhidas aos comprimentos de onda =410 nm e =620 nm

Fraco n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 -0.2 5

A410 0,000 -0,005 0,000 0,175 1,004 1,168 0,253 1,157 0,798 0,519 0,580 0,872 0,178 0,372 0,193 0,155 0,056 -0,013

A620 0,000 0,000 -0,100 0,073 0,324 0,142 0,059 0,045 0,029 0,012 0,004 0,001 -0,003 -0,004 -0,004 -0,003 -0,007 0,007

Absorvncia(410nm) Absorvncia(620nm)

10

15

20

Figura 1- Grfico de eluio da mistura.