AULA PRTICA 04

PROPRIEDADES FSICAS E QUMICAS DAS PROTENAS 02

I.Objetivos Analisar o efeito do aumento da temperatura na solubilidade de protenas; Observar o efeito de agentes alcalides, metais pesados e de solvente orgnico na solubilidade de protenas; Relacionar as observaes prticas com a teoria de propriedades gerais, estrutura e isolamento de protenas.

II. Introduo Um processo para caracterizar as protenas a solubilidade em determinados solventes e/ou sob determinadas condies. A solubilidade o resultado de um balano entre as diferentes interaes energticas que ocorrem inter e intramolecular, via os grupos dos resduos de aminocidos (protena:protena) e entre a protena e o solvente (protena:solvente). Alm disso, a presena de grupos carregados positivo ou negativamente de alguns resduos de aminocidos favorece a interao entre protenas e ons presentes na soluo. De uma maneira geral, qualquer fator que interfere na estabilidade e equilbrio desse conjunto de interaes provoca uma alterao na solubilidade de protenas. Assim sendo, a precipitao de protenas ocorre quando as interaes intermoleculares protena:protena se tornam mais fortes do que as interaes protena:solvente. Desta forma, a solubilidade de uma protena (assim como sua estrutura tridimensional) dependente da concentrao e natureza dos sais, polaridade do solvente, pH e temperatura. As protenas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que est relacionada com suas propriedades fsicas e biolgicas. A desnaturao pode ser definida como a modificao na estrutura tridimensional nativa de uma protena com conseqente alterao de suas propriedades funcionais. A desnaturao caracterizada por diminuio da solubilidade, perda da atividade biolgica, aumento da reatividade dos grupos da cadeia polipeptdica, etc. A desnaturao envolve alteraes nas estruturas quaternria, terciria e secundria das protenas, mas no da estrutura primria. So vrios os agentes desnaturastes de protenas como, por exemplo, calor, cidos, lcalis, solventes orgnicos, solues concentradas de uria e guanidina, sais de metais pesados, detergentes, etc. As reaes de precipitao, alm de serem utilizadas para caracterizar a presena de protenas em soluo, tambm so teis para proceder a desproteinizao de solues biolgicas para anlise de componentes no proticos. Neste caso especfico, a remoo de protenas contaminantes freqentemente acompanhada por mtodos drsticos de precipitao que acarretam em simultnea desnaturao protica (agentes desnaturantes). Por outro lado, existem condies que

promovem precipitao de protenas sem, contudo causar desnaturao. Estas condies so preferencialmente usadas em protocolos de purificao de protenas que visam manuteno da atividade biolgica da protena purificada. As protenas demonstram uma enorme variabilidade na solubilidade em funo da concentrao e natureza dos sais. Estes efeitos, freqentemente complexos, podem envolver interaes especficas entre grupos de aminocidos carregados e ons em soluo ou, particularmente, concentraes altas de sais podem refletir mudanas nas propriedades do solvente. Salting in O efeito salting in: pode ser definido como sendo a propriedade de certos sais em aumentar a solubilidade de uma protena. Esta propriedade freqentemente relacionada com a capacidade de certos sais, como por exemplo: NaCl, em aumentar a fora inica da soluo, o que leva a uma maior interao eletrosttica entre os ons salinos e os grupos carregados da protena. Cada um dos grupos inicos da molcula protica fica protegido por uma camada de ons salinos de carga oposta, impedindo interaes mtuas entre as molculas proticas. Salting out O efeito salting out: embora o aumento da concentrao da maioria dos sais inorgnicos resulte em aumento na solubilidade das protenas, existem alguns poucos exemplos, tais como (NH 4)2SO4 e Na2SO4, que causam um efeito inverso. Nestes casos, em altas concentraes, esses sais provocam uma diminuio significativa na solubilidade das protenas. Esse efeito oposto denominado salting out e ocorre com sais que efetivamente competem com a protena pelas molculas disponveis de gua, abaixando o grau de solvatao das protenas. Neste caso, as molculas das protenas tendem a se associarem entre elas porque em altas concentraes de sais as interaes protena:protena se tornam energeticamente mais favorveis do que as interaes protena:solvente. De uma maneira geral, ons que diminuem a solubilidade de protenas estabilizam a estrutura nativa de tal forma que as protenas que precipitam pela adio de sais no so desnaturadas. III. Materiais e reagentes Tubos de ensaio Becker Pipetas graduadas Pipetas Pasteur Manta de aquecimento Soluo de ovoalbumina 10% cido tricloroactico (TCA 10%) NaCl 0,1M Soluo saturada de sulfato de amnio lcool etlico absoluto

Acetato de chumbo 10% gua destilada IV. Procedimentos experimentais a) Desnaturao pelo calor: 1. Bater uma clara de ovo por alguns minutos. Juntar gua suficiente para duplicar o volume obtido. 2. Filtrar a mistura obtida e guardar em geladeira. Tubos Solues 1 1,0 mL clara de ovo(albumina) Banho Maria fervente 3 min

Observe, anote os resultados e explique. Anotaes:

b) Desnaturao por reagentes dos alcalides: 1. Enumere 2 tubos de ensaios. 2. Ao tubo 1, adicione 1,0 mL de H2O e acrescente 1,0 mL de TCA 10%. 3. Ao tubo 2, adicione 1,0 mL de clara de ovo e acrescente 1,0 mL de TCA 10%. Tubos Solues TCA 10% 1 1,0 mL de H2O 1,0 mL 2 1,0 mL de clara de ovo a 10% 1,0 mL

Observe, anote os resultados e explique. Anotaes:

c) Desnaturao por metais pesados 1. Ao tubo 1, adicione 1,0 mL de H2O e 5 gotas de acetato de chumbo 10%

2. Ao tubo 2 adicione 1,0 mL de clara de ovo e acrescente 5 gotas de acetato de chumbo 10% Tubos Solues Acetato de chumbo 1 1,0 mL de H2O 5 gotas 2 1,0 mL de clara de ovo a 10% 5 gotas

Observe, anote os resultados e explique. Anotaes:

d) Desnaturao por solventes orgnicos 3. Enumere 2 tubos de ensaios. 4. Ao tubo 1, adicione 1,0 mL de H2O e 3,0 mL de etanol. 5. Ao tubo 2, adicione 1,0 mL de clara de ovo e acrescente 3,0 mL de etanol 10%. Tubos Solues Etanol 1 1,0 mL de H2O 3,0 mL 2 1,0 mL de clara de ovo a 10% 3,0 mL

Observe, anote os resultados e explique. Anotaes:

Questes 1. Qual o papel do aumento da temperatura na desnaturao das protenas? 2. O que ocorre quando TCA , acetato de chumbo e etanol so adicionados soluo de clara de ovo? 3. Qual o efeito do NaCl sobre a solubilidade de protenas? 4. Quais os nveis de organizao que compe a estrutura protica e as foras que as estabilizam? 5. Como podemos definir desnaturao? Quais os nveis de organizao que afetam a desnaturao? A desnaturao sempre irreversvel?