Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Unesp

Instituto de Biociências de Botucatu – IBB

Departamento de Física e Biofísica

Relatório de Aulas Práticas

Cristalografia de Proteínas

Trabalho apresentado como

parte da avaliação do
rendimento dos alunos na
disciplina de Biofísica
Molecular.

Carina Miranda Carvalho

Paulo Roberto da Fonseca Filho
 1. Introdução e Objetivos

Durante as últimas décadas a cristalografia tornou-se um dos métodos mais eficientes

para se elucidar a estrutura de uma proteína porque apresenta altíssima resolução e
eficiência. Nela os cristais são analisados mediante difração de raios-X e então submetidos
a uma modelagem computacional para resolver o espectro da difração e retornar à estrutura
responsável pelo padrão de difração. Para trabalhar com esses dados, foram desenvolvidos
softwares com alto poder de processamento e diversas ferramentas dedicadas à estrutura de
proteínas. Desenvolver os caminhos para a cristalização de uma proteína nem sempre é uma
tarefa simples.
Ao colocar os alunos em contato com esse tipo de aula prática, o objetivo foi a
familiarização com métodos atuais de pesquisa e com o trabalho em laboratório para a
cristalização da lisozima.
Em 1922, Alexander Fleming, bacteriologista de Londres, teve um resfriado. Ele não
era de perder nenhum momento, e,por conseguinte, usou seu resfriando como oportunidade
para fazer uma experiência. Deixou que algumas gostas de seu muco nasal caíssem em uma
placa de cultura contendo bactérias. Ficou entusiasmado ao cosntatar, algum tempo depois,
que as bactérias perto do muco tinham sido dissolvidas. Ele mostrou que a substância
antibacteriana era uma enzima, a qual denominou lisozima – liso, devido à sua capacidade
de quebrar bactérias e zima, porque era uma enzima. Também descobriu uma pequena
bactéria esférica, que era particularmente sensível à lisozima, chamou-se de Micrococcus
lysodeikticus, porque era um evidenciador de lise. Fleming descobriu que as lágrimas eram
uma fonte rica de lisozima. Voluntários forneceram lágrimas após sofrerem alguns jatos de
limão – uma tortura “com limão”. Ele desapontou-se ao descobrir que a lisozima não era
eficaz contra a maioria das bactérias patogências. Mas, sete anos depois, realmente
descobriu um antibiótico altamente eficaz: a penicilina – uma notável ilustração do
comentário de Pasteur, de que a sorte favorece a mente preparada.

2. Materiais e Métodos

Para a realização dessas aulas, foram usadas duas placas com 24 poços de cristalização
em cada uma, micropipetas de tamanho variado, lamínulas, soluções cloreto de sódio (4
mol / l), acetado de sódio (pH= 4,6 1 mol / l), proteína com concentração 50 mg/ml e água.
Como proteínas e ácidos nucléicos necessitam pH e força iônica definidas para a sua
estabilidade e função, cristais de macromoléculas biológicas têm de ser crescidos a partir de
soluções aquosas complexas. A cristalização começa com a fase de nucleação (i.e. a
formação dos primeiros agregados ordenados) que é seguida pela fase de crescimento. As
condições para se atingir a nucleação são algumas vezes difíceis de se repetir, e desta forma
os procedimentos de semeação com um material cristalino pré-formado se faz necessário.
Em muitos casos este é o único método para se obter resultados reprodutíveis. A nucleação
requer um estado de supersaturação maior do que aquele da fase de crescimento.
A velocidade da cristalização aumenta com a supersaturação, desta forma nucleação e
crescimento deveriam ser desacoplados, o que quase nunca é realizado concientemente. A
cessação de crescimento de uma macromolécula biológica pode ter diversas causas,
desconsiderando as triviais, como remoção da macromolécula o meio de cristalização,
temos causas tais como, defeitos de crescimento, envenenamento das faces, ou
envelhecimento da macromolécula.

Figura 1: gráfico para caracterizar as diferentes zonas (etapas) do crescimento de

um cristal.

Uma gota contendo a macromolécula biológica a ser cristalizada em tampão com o

agente de cristalização e aditivos é equilibrada contra um reservatório contendo a solução
do agente de cristalização a uma concentração mais alta do que na gota. O equilíbrio
prossegue por meio da difusão das espécies voláteis (água e solventes orgânicos) até que a
pressão de vapor na gota se iguale àquela do reservatório. Se o equilíbrio ocorre por meio
de troca da água (da gota para o reservatório), isto leva a uma diminuição do volume da
gota, e conseqüentemente a um aumento na concentração de todos os constituintes da gota
de cristalização. Para espécies químicas com pressão de vapor maior que a pressão de vapor
da água, a troca ocorre do reservatório para a gota. São esses princípios que regem o
método de gotas suspensas (hanging drops). Abaixo, apresentamos uma figura esquemática
de um poço de handing drops.

Figura 2: esquema da montagem da gota sobre o poço.

Para preparar as diferentes soluções, nós usamos o método de hanging drops, para testar
as condições de cristalização. O volume da solução do poço foi mantido fixo em 0,500 ml,
assim o volume da gota, que continha 0,002 ml de proteína e de solução do poço.
Os poços foram organizados de acordo com a tabela 1:
 Tabela 1: Composição dos diferentes poços.
Concentração A1 A2 A3 A4 A5 A6
(microlitro)
Cloreto de sódio 25 75 150 200 225 275
Acetato de sódio 50 50 50 50 50 50
Água 425 375 300 250 225 175
Em uma segunda etapa, analisamos os cristais anteriores e procuramos refinar o
método, chegando à uma nova série, conforme a tabela 2:

Tabela 2: Composição dos diferentes poços para refinamento do método.

Concentração B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7
(microlitro)
Cloreto de sódio 75 125 150 175 200 150 150
Acetato de sódio 50 50 50 50 50 50 50
Água 375 325 300 275 250 300 300
pH 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 3,6 5,6

3. Resultados e Discussão

Os resultados obtidos nas duas etapas da cristalização são apresentados abaixo:

Figura 3: A1, não há cristais.

 Figura 4: A2, cristais mal formados.

Figura 5: A3, policristais em meio a pequenos cristais.

Figura 6: A4, ouriços à esquerda e formação de policristais.

Figura 7: A5, policristais dentre uma “multidão” de ouriços.

Figura 8: A6, ouriços.

Figura 9: zoom na lâmina A3, pequenos cristais.

Figura 10: zoom na lâmina A3, pequenos cristais com má formação.

Figura 11: zoom na lâmina A3.

Figura 12: zoom na lâmina A4, ouriços e policristais.

 Figura 13: zoom na lâmina A4.

Figura 14: zoom na lâmina A5, pequenos policristais com má formação.

Figura 15: zoom na lâmina A5.

 Figura 16: zoom na lâmina A2, cristais mal formados.

Figura 17: zoom na lâmina A2, cristal se desfazendo.

Considerando os resultados anteriores, numa tentativa de melhorar os resultados, alteramos

as concentrações e/ ou pH das soluções, obtivemos os seguintes resultados:
Figura 18: lâmina B1, poucos cristais com boa qualidade.

Figura 19: zoom na lâmina B1.

Figura 20: zoom na lâmina B1.

Figura 21: zoom na lâmina B1.

Figura 22: lâmina B2, poucos cristais bem formados. Ocorrem alguns policristais.

Figura 23: zoom na lâmina B2, cristal bem formado.

Figura 24: zoom na lâmina B2, policristal.

 Figura 25: zoom na lâmina B2.

Figura 26: zoom na lâmina B2, cristal bem formado.

Figura 27: zoom na lâmina B2.

 Figura 28: zoom na lâmina B2.

Figura 29: zoom na lâmina B3, policristais e ouriços numa mesma lâmina.

Figura 30: zoom na lâmina B3, ouriço.

 Figura 30: zoom na lâmina B3, cristal mal formado.

Figura 31: zoom na lâmina B3, cristal mal formado.

Figura 32: zoom na lâmina B3, cristal mal formado junto de um bem estruturado.
 Figura 33: zoom na lâmina B3, diversas formações de ouriço.

Figura 34: zoom na lâmina B4, ocorrem vários ouriços e raros policristais espalhados.

Figura 35: zoom na lâmina B4, cristal mal formado, dentre ouriços.
Figura 36: zoom na lâmina B4, cristal mal formado, dentre ouriços

Figura 37 zoom na lâmina B4, cristal mal formado, dentre ouriços

Figura 38: lâmina B5, cristais mal formados, dentre ouriços.

 Figura 39: zoom na lâmina B5, policristal dentre ouriços.

Figura 40: zoom na lâmina B5, policristal dentre ouriços.

Figura 41: lâmina B6, variação de pH da B3, resultando em vários microcristais.

Figura 42: zoom na lâmina B6, diversos microcristais bem formados.

Figura 43: zoom na lâmina B6, diversos microcristais bem formados.

Figura 44: zoom na lâmina B6, diversos microcristais bem formados.

Figura 45: zoom na lâmina B7, diversos cristais mal formados resultantes de variação de
pH da B3.

Figura 46: zoom na lâmina B7, cristais mal formados.

Figura 48: zoom na lâmina B7, cristais mal formados.

 Os resultados obtidos para a série B2 foram bem-sucedidos para proporcionar o
crescimento dos cristais, resultando em cristais 2,5 vezes maiores que os da série A3, em
média.
4. Conclusões
Notamos que nossos melhores resultados foram obtidos na configuração B2, onde
foram usados 150 microlitros da solução de cloreto de sódio. Os resultados são
apresentados nas figuras 27,28 e 29.
Com isso, vê-se que é possível cristalizar macromoléculas biológicas com eficiência
usando o método de handing drop.

5. Referências Bibliográficas
• Cristalização de Macromoléculas Biológicas, Walter Filgueira de Azevedo Jr.
www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/ xtal/cristal_wfa.pdf, acessado em 02
de dezembro de 2005.
• Bioquímica, Lubert Stryer, 4ª edição.