CIDO JASMNICO E A ATIVIDADE DA FOSFATASE CIDA E -AMILASE EM SEMENTES DE SOJA

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ATIVIDADE TOTAL DA FOSFATASE CIDA E DA -AMILASE INDUZIDAS POR CIDO JASMNICO EM SEMENTES DE SOJA1
FERNANDA COSTA MAIA2, DARIO MUNT DE MORAES3 E RITA DE CSSIA PINHEIRO DE MORAES3

RESUMO - Praticamente todos os processos relacionados com o desenvolvimento e metabolismo das plantas so controlados por um ou mais reguladores do crescimento vegetal. O cido jasmnico vem sendo considerado como pertencente uma nova classe de fitohormnios e quando aplicado exogenamente, pode promover ou inibir alteraes morfo-fisiolgicas. Em sementes de soja, cultivar BR-4, foram instalados testes de germinao e de determinao da atividade total das enzimas fosfatase cida e -amilase, com a finalidade de se analisar e descrever os efeitos de doses diferentes do cido jasmnico (zero, 20, 30 e 50M) sobre a qualidade de suas sementes. Constatou-se que a porcentagem da germinao decrescia a medida que a dose do cido aumentava. No entanto, a atividade total da fosfatase cida e da -amilase aumentava com o incremento das doses do cido jasmnico. Termos para indexao: Glycine max, germinao, enzimas, hormnios. TOTAL ACTIVITY OF PHOSPHATASE ACID AND -AMILASE INDUCED BY JASMONIC ACID ON SOYBEAN SEEDS ABSTRACT - Practically all processes related to the development and metabolism of plants are controlled by one or more regulators of plant growth. The jasmonic acid is considered as a new phytohormone class and when applied exogenally can promote or inhibit morfo-physiological alterations. Germination and determination of the total activity of enzymes acid phosphatase and -amilase tests were installed, with the purpose of analysing and describing the effects of different jasmonic acid doses (zero, 20, 30 and 50M) over the soybean seed quality. The results indicated that the germination percentage decreased as the jasmonic acid doses increased. However, the total activity of acid phosphatase and -amilase increased with the increment of jasmonic acid doses. Index terms: Glycine max, germination, enzymes, hormones.

INTRODUO O cido jasmnico uma nova classe de substncias do crescimento vegetal, tendo sido isolado pela primeira vez em 1962 do leo essencial de Jasminum grandiflorum L. Atualmente, os jasmonatos tm sido encontrados em duzentas e seis espcies de plantas, representando cento e cinqenta famlias incluindo samambaias, fungos e musgos, sugerindo estarem distribudos em todo o reino Plantae (Sembdner & Gross, 1985 e Sembdner & Parthier, 1993). Apesar de se sa-

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Aceito para publicao em 18.08.2000. Enga Agra, MSc., no perodo do desenvolvimento da pesquisa era bolsista do PIBIC/CNPq; R. Carlos Gomes n 93, 96055-450, Pelotas-RS. Profs. do Depto. de Botnica, Inst. Biologia/UFPel, Cx. Postal 354, 96010900, Pelotas-RS.

ber muito pouco sobre esta nova substncia, indcios tem mostrado que no pice do caule, frutos imaturos, extremidade das razes e folhas jovens, ou seja, em regies meristemticas existem altos nveis de jasmonatos (Sembdner & Parthier, 1993). Os jasmonatos formam-se a partir do cido linolico e sua estrutura bsica caracterizada por uma anel pentano. Ainda no conhecido como ocorre seu transporte e onde se localiza dentro da clula (Sembdner & Parthier, 1993). Existem algumas evidncias mostrando o envolvimento dos jasmonatos na regulao de uma ampla variedade de processos fisiolgicos da planta, incluindo a senescncia (Ueda & Kato, 1980; Weidhase et al., 1987 e Parthier, 1990), acumulao de protenas de armazenamento (Staswick et al., 1991 e Mason et al., 1993), desenvolvimento de embries (Wilen et al., 1991) e biossntese de metablitos secundrios (Fachini
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et al., 1996). Os jasmonatos parecem mediar muitos desses processos por induzirem alteraes na expresso de genes (Reinboth et al., 1994). O papel especfico dos jasmonatos em sementes at o momento no est elucidado. Alguns trabalhos mostram-no como inibidor da germinao, entre eles, com Agrostenima (Sembdner & Gross, 1986), Avena (Satler & Thimann, 1981) e Lactuca (Yamane et al., 1981). Por outro lado, h espcies em que atua como promotor, por exemplo, em Acer tatarium e Spirodela (Yamane et al., 1981). Portanto, este trabalho teve por finalidade verificar o efeito de doses crescentes do cido jasmnico na germinao e a atividade total das enzimas fosfatase cida e -amilase. MATERIAL E MTODOS Sementes de soja (Glycine max (L.) Merrill), cv BR-4, foram tratadas com doses crescentes de cido jasmnico (zero, 20, 30 e 50M), durante 24 horas. Aps tratadas, foram submetidas ao teste de germinao, de acordo com as prescries das Regras para Anlise de Sementes (Brasil, 1992), utilizando-se 200 sementes (quatro repeties de 50 sementes para cada tratamento). O teste foi conduzido em cmara de germinao, Modelo 347 CDG, 25C constantes, no escuro, utilizando-se como substrato rolo de papel do tipo germitest, com quatro folhas umedecidas com gua destilada, correspondendo a 2,5 vezes o seu peso seco. Os resultados foram expressos em porcentagem. As atividades das enzimas fosfatase cida e -amilase foram determinadas pela metodologia proposta por Ching (1973). Procedeu-se um teste de germinao com trs repeties de 20 sementes para cada tratamento, em rolo de papel, umedecido com um volume de gua em quantidade equivalente a 2,5 vezes o peso do substrato, e a temperatura de 25C. De cada repetio retirou-se cinco plntulas nas idades de quatro a oito dias. As plntulas de cada repetio foram trituradas em 20ml de acetato de potssio (soluo tampo) com pH 5,0. Para a determinao da fosfatase cida, colocou-se a mistura em centrfuga refrigerada (-4C a 0C) a 15000rpm. Aps 15 minutos, obteve-se o sobrenadante. Retirou-se 0,2ml de cada extrato, obtendo-se quatro subamostras de cada repetio. Adicionou-se 0,8ml da soluo tampo e 0,1ml do substrato (P-nitrofenil fosfato 0,018M). Os tubos foram incubados a 30C por 5min. Posteriormente, adicionou-se 1ml de hidrxido de sdio 0,5N e procedeu-se a leitura em espectofotmetro a 400nm, aps o branco (1ml de soluo tampo e 2ml de gua destilada). Para facilitar a leitura no

espectofotmetro, adicionou-se 15ml de gua destilada. A atividade total/semente foi dada pela frmula: (400/leitura) x (15gua/5min.) x (20extrao/5sementes x 0,2alquota) e os resultados foram expressos em nm.min-1.semente-1. Para a determinao da -amilase, colocou-se o extrato a 70C por 20 minutos. Posteriormente, procedeu-se a centrifugao por 15minutos, obtendo-se o sobrenadante. Foi necessria a diluio do extrato das plntulas com quatro dias, retirando-se quatro alquotas de 0,1ml de cada repetio e adicionando-se 0,9ml de soluo tampo em cada. Para o extrato das plntulas com oito dias, retirou-se 0,5ml do extrato e adicionou-se 0,5ml da soluo tampo em cada. Adicionou-se ento 1ml de soluo de amido e colocou-se as subamostras em incubadora a 30C. Aps 5min. adicionou-se 1ml de I2+KI e 9ml de gua destilada. Procedeu-se a leitura no espectofotmetro a 620nm, aps o branco (1ml soluo tampo + 9ml de gua destilada) e o substrato (1ml de soluo de amido + 1ml I2+KI + 9ml de gua destilada). A atividade total da enzima foi dada pela frmula: {[(substrato) x 620 - (amostra) x 620]/5X} x 20extrao/(0,1alquota x 5sementes), onde X=1g amido = [(substrato) x 620]/1000, sendo os resultados expressos em g amido hidrolisado.min-1.semente-1. Os resultados foram expressos em nmole/minuto/semente para a fosfatase cida e M amido hidrolizado/minuto/semente para a -amilase O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 3x4, com trs repeties. Os dados foram analisados atravs do programa Multiv (verso 10/Jul/99) pelo teste de aleatorizao com base na soma de quadrados entre grupos, onde obtm-se uma dada P(Qb0>=Qb), sendo Qb0 a soma de quadrados entre grupos gerada com base na hiptese de nulidade de que os tratamentos no diferem e Qb a soma de quadrados entre grupos encontrada no experimento. Neste teste, a probabilidade gerada a partir dos prprios dados atravs de permutaes aleatrias das unidades amostrais ou das variveis, 10000 no caso, considerando as condies estabelecidas na hiptese de nulidade, j que no h o pressuposto das variveis apresentarem uma distribuio normal. Como medida de semelhana para comparao entre unidades amostrais, cuja significncia foi avaliada pelo mtodo descrito anteriormente, utilizou-se a distncia euclidiana entre unidades amostrais. Para comparao de variveis utilizou-se a medida da correlao entre estas, realizando-se previamente uma transformao escalar logartmica (log(|x+1|)) para cada observao, buscando padronizar os dados das variveis. A significncia da correlao tambm foi avaliada pelo teste de aleatorizao. Os dados estatsticos foram interpretados com base em = 0,05.

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RESULTADOS E DISCUSSES A germinao das sementes de soja no foi afetada significativamente pela presena de doses crescentes do cido jasmnico neste experimento (P = 0,1562). A atividade total da enzima fosfatase cida (Figura 1) aos quatro dias de germinao e submetidas a doses crescentes do cido jasmnico aumentou em relao ao controle, sendo o mesmo observado aos oito dias de germinao, com P = 0,0001. Os contrastes mais significativos foram entre o controle e as doses 20 e 30M, com P = 0,001 e 0,0096, respectivamente. A partir de 30M nota-se um decrscimo na atividade aos quatro dias da germinao, enquanto que aos oito dias da germinao, este decrscimo ocorre a partir de 20M. Isto mostra que, de maneira geral, doses acima de 30M de cido jasmnico comeam a ter efeito negativo na atividade da enzima. Estes resultados sugerem que o cido jasmnico tem efeito semelhante ao do cido giberlico (Ashford & Jacobsen, 1974), ou seja, induzem maior atividade da enzima dentro de certos limites de doses. Baseando-se no princpio de que em lotes mais vigorosos a atividade da fosfatase cida maior do que em lotes de menor vigor, ento a aplicao do cido jasmnico promoveria aumento do vigor em sementes de soja. A correlao entre a atividade da

enzima aos quatro e aos oito dias da germinao alta e positiva (r2 = 0,86), com P = 0,0002. Doses crescentes do cido jasmnico afetam significativamente a atividade da enzima -amilase (P = 0,0004), estimulando-a aos quatro dias da germinao, em relao ao controle. J aos oito dias da germinao, o cido jasmnico, quando comparado ao controle, teve efeito negativo para todas as doses estudadas, provavelmente devido ao esgotamento do substrato (Figura 2). Filner & Varner (1967), mostraram que a -amilase produzida em resposta ao cido giberlico produzido pelo embrio e transferido para a camada de aleurona da clula, onde a -amilase produzida via sntese de novo, promovendo a converso do amido para acar que usado no crescimento da plntula. Os resultados sugerem que o cido jasmnico, a semelhana do cido giberlico, tambm exerce ao na sntese de novo da enzima.

CONCLUSES # O cido jasmnico no tem efeito na germinao de sementes de soja; # a atividade das enzimas fosfatase cida e -amilase estimulada pela presena do cido jasmnico.

5000

Atividade total da fosfatase cida (nmole/min/semente)

4000

3000

2000

1000

0 0 20 30 Dose do cido jasmnico (uM) 50

FIG. 1. Efeito de doses crescentes do cido jasmnico na atividade total da enzima fosfatase cida aos quatro (!) e oito (") dias da germinao de sementes de soja.

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30000 Atividade da alfa-amilase M amido hidrolisado/min/semente) (ug

25000

20000

15000

10000

5000

0 0 20 30 50

Doses do cido jasmnico (uM) FIG. 2. Efeito de doses crescentes do cido jasmnico na atividade da -amilase aos quatro (!) e oito (") dias da germinao de sementes de soja.

TABELA 1. Mdias, desvios padres e coeficientes de variao das variveis analisadas em sementes de soja, tratadas com doses crescentes de cido jasmnico. Variveis testadas Germinao Atividade da fosfatase cida aos 4 dias Atividade da fosfatase cida aos 8 dias Atividade da -amilase aos 4 dias Atividade da -amilase aos 8 dias Mdia 83,75 4055,3 3382,3 16901,0 6649,8 Desvio padro 2,9886 821,43 615,34 10732,0 1280,4 Coeficiente de variao (%) 3,083 8,91 5,97 12,88 15,85

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