Deteco de IL-1 por ELISA sanduche

Andra Calado andreabelfort@hotmail.com

ELISA

O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas; PRINCIPAIS TIPOS: INDIRETO: Detecta principalmente Ac SANDUCHE: Detecta principalmente Ag

COMPETIO: Detecta Ag com baixo peso molecular (monovalentes)

CAPTURA: Deteco de Acs (principalmente IgM, evitando a ao do fator reumatide).

Avidia + peroxidase

Amostra contendo Ag Substrato Ac conjungado com biotina

Kit ELISA IL-1

Placa

96 poos revestido com Ac Padro liofilizado + diluente Reagente de deteco A + diluente Reagente de deteco B + diluente Substrato TMB Tampo de lavagem Soluo Stop

A placa do kit foi pr-revestido com um anticorpo monoclonal especfico para IL1;
Amostras so ento adicionados aos poos; Depois o anticorpo policlonal conjugado com biotina, anticorpo especfico para a preparao IL1; Em seguida, avidina conjugada com peroxidase (HRP) adicionado a cada microplaca e incubadas. Pra finalizar, uma soluo de substrato TMB adicionada a cada poo.

 Apenas

os poos que contm IL1, anticorpo conjugado com biotina e avidina conjugado com enzima ir apresentar uma mudana de cor.
reao enzima-substrato terminada pela adio de uma soluo de cido sulfrico e a mudana de cor medida espectrofotometricamente a um comprimento de onda de 450 nm 10 nm. concentrao de IL1 nas amostras em seguida, determinada por comparao do OD das amostras para a curva padro.

Materiais necessrios
Leitor Pipetas

de preciso Ponteiras descartveis Eppendorf para amostras de diluio gua destilada Papel absorvente Recipiente para soluo de lavagem

Preparao das amostras

Reconstituir

a soluo padro com 1mL do diluente e agitar suavemente; A concentrao dessa soluo 1000pg/mL. Colocar 0,5mL de diluente nos 8 tubos.

Procedimento
Preparar

sete poos para o padro e um para o branco. 100L de cada soluo padro, do branco e das amostras nos poos. Cubrir com o vedante de placa. Incubar durante 2 horas a 37oC.

Adicionar

Preparao das amostras

Preparar

o diluente A e B: 6mL do diluente (2x) com 6mL de agua destilada: Soluo de diluio A: 12mL Soluo de diluio B: 12mL Preparar os reagente A e B na diluio 1:100
1

100

Reagente A

1:100

Sol. Diluio A (diluente + agua)

 Soluo

de lavagem: 20mL da soluo de lavagem + 580mL de gua destilada

Procedimento
Preparar

sete poos para o padro e um para o branco. Adicionar 100L de cada soluo padro, do branco e das amostras nos poos. Cubrir com o vedante de placa. Incubar durante 2 horas a 37oC. Retirar o lquido de cada poo, no lavar. Adicionar 100L da soluo de deteco A em cada poo e incubar durante 1 hora a 37oC depois de cobrir com o vedante de placa

Procedimento
Aspirar

e lavar com 350L com soluo de lavagem; Adicionar 100L da soluo de deteco B em cada poo. Incubar durante 30 minutos a 37oC e depois cobrir com o vedante de placa. Repetir a aspirao e lavagem Adicionar 90L de Substrato e Incubar por 15 25 minutos a 37oC. Adicionar 50L de soluo de paragem em cada poo. O lquido ficar amarelo com a adio de soluo de paragem. Em seguida, execute o leitor de microplacas e medio a 450 nm imediatamente

Observaes
Adicionar

cuidadosamente amostras aos poos e misturar suavemente para evitar a formao de espuma. tempo total para a adio de distribuio de reagentes ou amostras para a placa de ensaio no deve exceder 10 minutos. evitar a contaminao cruzada, mudar as ponteiras entre as adies de cada nvel padro, entre as adies de amostra e de reagente

Para

Observaes
O

tempo de incubao e a temperatura devem ser observados. O procedimento de lavagem crtico. A remoo completa do lquido em cada passo essencial para a boa desempenho. Aps a ltima lavagem, remover qualquer soluo de lavagem remanescente, remover qualquer gota de gua e de impresses digitais na parte inferior da placa. Lavagem insuficiente resultar em m preciso e leitura de absorbncia falsamente elevado

Clculo dos resultados

Mdia

das leituras em duplicata para cada padro, controle e amostras; Criar uma curva padro em log, grfico com concentrao IL1 sobre o eixo y e absorbncia no eixo x. Desenhar a melhor reta atravs dos pontos padro e pode ser determinada por anlise de regresso. Se as amostras foi diluda, a concentrao lida a partir da curva padro deve ser multiplicada pelo fator de diluio.

Sensibilidade e especificidade
SENSIBILIDADE A dose mnima detectvel de IL1 canino menor do que 7.3pg/mL ESPECIFICIDADE Este ensaio tem uma alta sensibilidade e especificidade excelentes para a deteco de IL1 canino. No significativa reatividade cruzada ou interferncia entre IL1 caninos e anlogos foi observada. Nota: Limitada por habilidades e conhecimentos atuais, impossvel para ns completar a deteco de reatividade cruzada entre IL1 canino e todos os anlogos, portanto, reao cruzada, podem ainda existir