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Efeito do pH na Atividade Cataltica

das Enzimas
Grupo 15
Alunos:
Disciplina: Bioqumica de Alimentos (TA514)
Professora: Hlia Harumi Sato
PED's: Jessika Gonalves dos Santos
Ricardo Rodrigues de Melo
Campinas
21!
"#$%&D'()&
As enzimas so substncias orgnicas, em geral protenas, que so
consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular. sso porque elas
possuem como funo principal catalisar reaes biolgicas pouco espontneas ou
muito lentas. Sua alta especificidade e poder cataltico so aproveitados acelerando a
velocidade das reaes, diminuindo a energia gasta, sem participar como reagente ou
produto. (FONSECA, 2009)
Para que a velocidade das reaes seja mxima preciso que alguns fatores
sejam observados, como a concentrao da enzima, a concentrao do substrato que
ir reagir, a temperatura e o pH do meio. Quanto maior a concentrao enzimtica,
maior ser a velocidade de reao, seguindo a proporo de seu teor com a
quantidade de substrato necessrio para ocorrer a reao, caindo a velocidade
conforme o consumo dos reagentes. J com o aumento da concentrao de substrato,
a velocidade atinge um limite conforme a quantidade disponvel de enzima. Em baixas
temperaturas as enzimas podem ser desativadas e altas temperaturas podem causar
sua desnaturao. (FONSECA, 2009)
Em relao ao pH, cada enzima possui uma faixa de pH que d condies
favorveis para sua atuao e, alm disso, possui um pH timo em que a interao
entre ela e o substrato mxima (FONSECA, 2009). O pH timo aquele na qual a
conformao da protena a mais adequada para atividade cataltica, onde os grupos
ionizveis presentes nas cadeias laterais de seus aminocidos possuiro suas cargas
de acordo com essa conformao. importante conhecer a faixa de atividade das
enzimas por conta de sua alta sensibilidade, pois elas podem sofrer desnaturao
conforme a variao do pH (KELNG, 2002).
Para determinar o pH timo de uma enzima podem ser utilizados diversos
mtodos: anlise do consumo de substrato, que avaliam a quantidade de substrato
no consumido em uma reao adequada; anlise do produto formado, que avaliam a
quantidade de produto formado atravs de uma reao adequada; anlise da variao
de absoro da coenzima que participa da reao enzimtica; mtodos otimizados;
entre outros (LOPES, 1998). Ao ser montada uma curva do efeito do pH na atividade
enzimtica, o mximo da curva ser o pH timo. Existem curvas que possuem no
apenas um pH timo, e sim uma faixa de pH timo, indicando a mxima atuao da
enzima em diferentes valores de pH (BANCON, 2006).
As amilases so enzimas que catalisam reaes de hidrlise de ligaes d-1,4
glicosdicas de polissacardeos. No organismo humano ela produzida na saliva e no
pncreas, mas na natureza tambm produzida por diversos tipos de fungos,
bactrias e vegetais. Dentro das amilases existem dois grupos diferentes de enzimas:
as exoamilases, que catalisam apenas hidrlises de ligaes glicosdicas de d-1,4 ou
ambas ligaes d-1-4 e d-1,6; e as endoamilases, que hidrolisam de forma aleatria
dentro da molcula de amido, formando ramos lineares de oligossacardeos que
acabam por quebrar as ligaes d-1,4 no interior das cadeias de amilose ou
amilopectina. A d-amilase a endoamilase mais conhecida, mas tambm uma
exoamilase, dependendo do substrato (EMBRAFARMA, 2010).
A Alpha-Amilase Fngica uma multi-enzima. Ela capaz de realizar mais de
30 funes enzimticas, como a quebra de gorduras, gerando glicerol e cidos graxos;
a quebra de protenas, resultando em proteases; e a quebra de derivados do amido,
produzindo dextrina e acares mais simples. Na converso de amido em maltose, ela
transforma uma quantidade maior do que 450 vezes o seu peso. importante
destacar que seu pH timo est prximo de 7,0 (EMBRAFARMA, 2010).
Na rea de alimentos essa enzima comumente utilizada na correo e no
tratamento de farinhas, em produtos de panificao e na fabricao de biscoitos. Alm
disso, so tambm utilizadas na fabricao de bebidas obtidas a partir de cereais
(GAVA, 1977).
*A$E%"A"+ E *,$&D&+
*ateriais
Soluo de d-amilase n 3 (enzima bacteriana comercial Termamyl 120L
diluda 1:1400);
Soluo 1% de amido solvel em gua destilada;
Dez tubos de ensaio contendo 0,4 mL de solues tampo 0,1 Mol/L de
diferentes valores de pH (Tampo Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 2,6; 3,0; 4,0;
5,0; 6,0; 7,0); (Tampo Borato 0,1 Mol/L pH 8,0; 9,0); (Tampo Borato-NaOH
0,1 Mol/L 10,0; 11,0);
Soluo de odo-K
Soluo de HCl 0,1 Mol/L
Banho de gua termostizado a 50C
Pipeta
Pera volumtrica
Estantes para tubo de ensaio
Espectofotmetro
*-todos
O preparo da amostra de amido para a realizao do experimento foi
previamente realizada pelos tcnicos do laboratrio e consistiu no aquecimento da
suspenso de amido por cinco minutos at a ebulio e posterior resfriamento da
amostra a temperatura ambiente.
Primeiramente foi pipetado 0,5mL da soluo de amido solvel previamente
preparada nos tubos de ensaio numerados contendo 0,4mL de soluo tampo
0,1Mol/L e diferentes pH.
Com os tubos prontos, todos foram submergidos em banho de gua
termostizado a 50C por 10 minutos para equilibrar a temperatura das amostras.
Aps o tempo estipulado de 10 minutos, com os tubos ainda submergidos no banho de
gua, foi adicionado 0,1mL de soluo d-amilase em cada um dos tubos contendo o
substrato e foi iniciada a contagem de 5 minutos para ocorrer as reaes necessrias.
O tempo de adio da enzima em cada tubo foi estipulado como sendo 30
segundos para um maior controle do tempo de reao equivalente para todos os
tubos. Com o final da contagem, foi adicionado 0,5mL de HCl 0,1Mol/L para a
finalizao da reao dentro dos tubos contendo o substrato.
Antes de adicionar o reagente final de odo-K, foram preparados os tubos
branco e controle para a anlise dos resultados finais. Para o tubo branco, foram
adicionados 14,9mL de gua destilada. Para o tubo controle, foram pipetados 0,5mL
de soluo de amido 0,1Mol/L em um tubo, juntamente com 0,5mL de gua destilada e
0,5mL de soluo de HCl de 0,1Mol/L. Aps a preparao de todos os tubos, foi
adicionado 0,1mL de soluo de odo-K (0,3% de iodo e 3% de K) e foi completado o
volume de cada um deles para 15mL com a adio de gua destilada.
Com todos os tubos finalizados, foi calibrado o espectrofotmetro com o tubo
branco, para ajustar o ponto de zero absorbncia e foram medidas as absorbncias
dos demais tubos a 620nm.
%E+'.$AD&+ E D"+C'++/E+
A atividade da enzima d-amilase definida em termos de clculos como a
diminuio de 0,001 de absorbncia por minuto de reao por mL de enzima comercial
utilizada, no caso, foi equivalente a 1:1400.
' 0 'nidades de atividade de 12amilase 3'4m.5
' 0 (Abs. Controle Abs. Soluo) x (Diluio da enzima)
0,001 x Tempo de reao em minutos x Quantidade adicionada de enzima
' 0 (Abs. Controle Abs. Soluo) x 1400
0,001 x 5 x 0,1
Para a realizao das contas utilizada a absorbncia do tubo controle j que
a mesma no possui a enzima d-amilase, e como o iodo se complexa com o todo o
amido presente, nesse tubo ento formaria uma colorao muito mais forte que os
demais tubos que contm a enzima. Porm, pelos dados da Tabela 1 possvel
perceber que o tubo controle, que deveria possuir maior absorbncia, tem nmeros
inferiores ao do tubo contendo Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 2,6, por isso, este ser
utilizado como controle. Esse erro pode ter sido causado por falhas na execuo do
experimento.
No caso do clculo da atividade relativa, a soluo que possua menor valor de
absorbncia e, portanto maior atividade de d-amilase foi usada como referncia.
Tabela 1. Efeito do pH na Atividade da d-amilase bacteriana.
Tampes Absorbncia
620 nm
Unidades de
Atividade de d-
amilase (U/mL
de enzima
comercial)
% de
Atividade
Relativa
% de
Atividade
Relativa
(Mais
Correta)
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 2,6 1,801 0 0,00% 0,00%
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 3,0 1,770 86800 2,26% 2,83%
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 4,0 1,527 767200 19,96% 25,02%
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 5,0 0,735 2984800 77,64% 97,35%
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 6,0 0,860 2634800 68,54% 85,93%
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 7,0 0,706 3066000 79,75% 100%
Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 8,0 0,845 2676800 69,63% 87,30%
Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 9,0 1,730 198800 5,17% 6,48%
Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 10,0 0,521 3584000 93,23% -
Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 11,0 0,428 3844400 100,00% -
Tubo controle 1,547
*Clculos desconsiderando os pontos de pH 10 e 11 sendo o ponto mximo de pH 7,0.
Grfico 1. Atividade Relativa da d-amilase com a mudana de pH.
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
90,00%
100,00%
0 2 4 6 8 10 12
pH
A
t
i
v
i
d
a
d
e

%
e
l
a
t
i
v
a

3
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5
Grfico 2. Atividade Relativa* da d-amilase com a mudana de pH.
Atividade Relativa da d-amilase com a mudana de pH
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
90,00%
100,00%
0 2 4 6 8 10 12
pH
A
t
i
v
i
d
a
d
e

%
e
l
a
t
i
v
a

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6
5
*Clculos desconsiderando os pontos de pH 10 e 11 sendo o ponto mximo de pH 7,0.
De acordo com a literatura, a faixa tima de pH dessa enzima entre 6,0 e 7,0
(GUPTA et al., 2003). Porm, essa caracterstica no foi observada no experimento,
cujo resultado, ou seja, o pH timo da d-amilase encontrado foi de 11, muito longe do
esperado. Mas, como os pontos de pH 10 e pH 11 apresentaram alta disperso em
relao continuao correta da curva padro construda, mesmo com as maiores
porcentagens de atividade relativa, devem ser ignorados. Assim, encontramos que a
enzima analisada possuiu a maior porcentagem de atividade relativa correta entre o
pH 5 e o pH 8, podendo ser considerado como pH timo encontrado o pH 7. Esse
valor prximo ao esperado e o mais adequado. Os erros nos dados encontrados
podem ter ocorrido por inexatides nas tcnicas laboratoriais como, por exemplo,
maior tempo no banho-maria, quantidade errnea de iodo, e erro de leitura no
espectrofotmetro.
O ponto de pH 6 tambm apresentou erro, pois ele deveria possuir maior
porcentagem de atividade relativa do que o valor encontrado para que a faixa de pH
timo fosse determinada corretamente (a curva deveria apresentar crescimento nesse
ponto e no decaimento). O que podem ter sido causas desse erro j foi discutido.
C&#C.'+)&
Para obter o mximo de interaes entre enzimas e substratos necessria
uma combinao de fatores que favoream a maior atividade cataltica da enzima
utilizada. Dentro desses fatores foi determinado o pH timo do meio para esse
mximo. Como foi observado, o pH timo correto encontrado foi ao redor do pH 7 e
est adequado literatura. Os erros encontrados ocorreram devido ateno que no
foi dada aos diversos detalhes que o mtodo aplicado exige.
%E7E%8#C"A+ 9"9."&G%:7"CA+
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