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Por
Roseli Rudnick Ueta
Recife, 2002
Dedicat ria,
AGRADECIMENTOS
O perodo em que desenvolvi o trabalho de tese foi um dos mais ricos em experincias de
vida! Estas experincias foram as mais variadas possveis, envolvendo sentimentos opostos,
como alegria e tristeza, realizao e perda! Esse conjunto de emoes me transformou vrias
vezes deixando impresses definitivas em meu corao.
Gostaria de iniciar os agradecimentos a Flamarion, pela orientao neste trabalho, tarefa que
demandou muito tempo e dedicao, mas acima de tudo por contar com a sua compreenso
para com meus momentos de vida! E ressaltar que o seu apoio foi determinante para a
concluso deste trabalho.
Ao Departamento de Qumica Fundamental pela formao acadmica e em especial na pessoa
do Prof. Bencio Barros Neto.
Ao Prof. Luis Bezerra de Carvalho Junior, pela conversa inspiradora que frutificou neste
trabalho!
Ao grupo de Eletroqumica pela convivncia agradvel que nos permitiu compartilhar muito
mais do que trabalho e espao fsico! E em especial aos amigos: Alziana, Elvira, rika,
Fellipe, Jailson, Lda, Lucila, Ktia, Madalena, Rogrio, Sibele e Suzana!
Alziana, Rogrio e Sibele pela amizade e empenho no desenvolvimento dos trabalhos de
iniciao cientfica.
Lucila e Jailson! Amigos de todas as horas e muitas horas! Nesta oportunidade de forma
simples expresso o meu agradecimento pela sorte de t-los como amigos!
Madalena pela amizade, uma presena renovadora e entusiasta no laboratrio e confeco
das figuras deste trabalho!
Aos amigos da ps-graduao: Beate, Bruno, lcio, Eliete, Expedito, Idlia, Jucemar, Patrcia,
Suzana Villanova!
s funcionrias da biblioteca Ana e Joana pela delicadeza sempre presente no atendimento.
Aos funcionrios Maurlio e Dora pelas gentilezas ao longo desses anos.
Ao CNPq pela bolsa concedida.
ndice
ndice de Figuras ..................................................................................... iv
ndice de Tabelas ..................................................................................... xi
Lista de Smbolos .................................................................................. xiii
Resumo ................................................................................................. xvi
Abstract ................................................................................................ xvii
1) INTRODUO ................................................................................... 01
1.1) Adsoro de Protenas .................................................................... 03
1.1.2) Efeitos que Influenciam a Interao Entre a Protena e a Superfcie
Slida .................................................................................................. 06
1.1.2.1) Efeito de Carga ...................................................................... 06
1.1.2.2) Efeito Hidrofbico ................................................................. 07
1.1.2.3) Efeito da Temperatura ............................................................ 07
1.2) Lectinas ......................................................................................... 07
1.2.1) Lectinas Leguminosas .................................................................. 08
1.2.1.1) Concanavalina A .................................................................... 09
1.2.1.2) Lentil ....................................................................................... 10
1.2.3) Interao da Lectina e o Carboidrato ............................................. 11
1.2.4) Aplicaes das Lectinas ............................................................... 12
1.2) Filme de xido de Platina ............................................................... 13
1.4) Espectroscopia de Impedncia ......................................................... 15
1.4.1) Conceitos Bsicos ........................................................................ 16
1.4.2) Circuito Equivalente de uma Cela Eletroqumica............................ 21
1.4.3) Representao dos Espectros de Impedncia ..................................................... 23
1.4.4) Utilizao do Programa de Circuitos Equivalentes ......................... 26
1.4.4.1) Princpios para a Utilizao do EQUIVCRT ............................. 28
1.4.5) Impedncia em Sistemas Biolgicos .............................................. 30
2) TCNICAS EXPERIMENTAIS...................................................................................... 33
2.1) Sistema Eletroqumico .................................................................... 34
2.1.1) Eletrodos .................................................................................... 34
2.1.1.1) Eletrodo de Trabalho .............................................................. 35
2.1.1.2) Eletrodo Auxiliar ................................................................... 35
2.1.1.3) Eletrodo de Referncia ........................................................... 35
2.1.2) Preparo da superfcie do eletrodo de trabalho ................................ 35
2.1.3) Solvente...................................................................................... 37
2.1.4) Eletrlito suporte ........................................................................ 37
2.1.5) Sistema Redox ............................................................................. 37
2.1.6) Lectinas adsorvidas na superfcie da platina .................................. 37
2.1.6) Carboidratos utilizados para testar a sensibilidade e seletividade das
lectinas adsorvidas ................................................................................ 38
2.1.7) Cela eletroqumica ....................................................................... 38
2.2) Equipamentos Utilizados para a Realizao dos Experimentos
Eletroqumicos ...................................................................................... 39
2.3) Voltametria Cclica ........................................................................ 40
2.4) Espectroscopia de Impedncia ......................................................... 41
2.4.1) Verificao da adsoro das lectinas ............................................. 41
2.4.2) Verificao da seletividade das lectinas frente aos carboidratos ...... 43
2.5) Formao da Camada de xido ........................................................ 45
2.5.1) Camada de x ido formada quimicamente ....................................... 45
2.5.2) Camada de xido formada eletroquimicamente ............................... 46
2.5.2.1) Parmetros experimentais para a formao da camada de xido . 46
2.8) Teste de Atividade Biolgica da Concanavalina A ............................ 50
Desdobramentos
do
Trabalho
com
Lectinas
no
Laboratrio
de
iii
ndice de Figuras
Cap tulo 1
Figura
1.2:
Representao
da
localizao
dos
ons
Ca 2 +
Mn 2 +
na
iv
Cap tulo 2
Figura 2.1: Circuito de uma cela eletroqumica composta por trs eletrodos . 34
Figura 2.2: Esquema para a verificao da limpeza e reprodutibilidade da
superfcie do eletrodo ............................................................................... 36
Figura 2.3: Celas eletroqumicas: a) com capilar de Luggin-Harber; b) sem
capilar de Luggin-Harber. ......................................................................... 39
Figura 2.4: Organograma dos equipamentos utilizados para as medidas de
impedncia. ............................................................................................. 40
Figura 2.5: Esquema mostrando as etapas 1 e 2 anteriores adsoro da
lectina e a adsoro propriamente dita, etapa 3, e a sua posterior verificao
na etapa4. ................................................................................................ 43
Figura 2.6: Esquema mostrando a adsoro de carboidratos, sobre uma
superfcie com lectina (mostradas na figura 2.4) e a verificao da adsoro
do carboidrato com voltametria cclica e espectroscopia de impedncia. ....... 44
2.9:
Esquema
explicativo
das
etapas
de
limpeza,
formao
Cap tulo 3
vi
vii
formada
quimicamente
(),para
uma
camada
de
xido
formada
Figura
3.27:
Desenho
esquemtico:
a)
camada
de
xido
formada
ix
(xido+protena)
ndice de Tabelas
em
relao
con
%R p r o ,
para
diversas
condies
xi
em
relao
lentil
%R p r o ,
para
diversas
condies
xii
Lista de S mbolos
A
rea do eletrodo (m 2 )
Aprotena
capacitncia (F)
C*
Cdl
Cox
Cpro
Cs
dmdia
dxido
DO e DR
dprotena
potencial (V)
E p
eT
ia
ic
if
io
ipa
ka
Da
indutncia (H)
xiii
Qads%
percentual
da
superfcie
recoberta
com
protena
dada
pela
carga (%)
Q(sem protena)
resistncia ()
Rcar
Rct
Rct%
Rox
resistncia do xido ()
Rpro
resistncia
da
protena
somada
resistncia
do
xido
se
presente ()
%R p r o
Rs
temperatura (K)
tempo (s)
Xc
impedncia ()
Zf
impedncia faradaica ()
Zim
componente
capacitiva
ou
imaginria
na
medida
de
xiv
impedncia ()
Zre
ZW
coeficiente de transferncia
constante
dieltrica
do
material
que
est
na
interface
eletrodo/soluo
o
sobrepotencial (V)
resistividade (.cm)
xv
Resumo
O objetivo deste trabalho foi estudar a interface platina/lectina utilizando
mtodos
impedimtricos.
Lectinas
pertencem
um
grupo
de
protenas
com
xvi
Abstract
The aim of this work was to study the platinum/lectin interface by
impedimetric
methods.
Lectins
belong
to
group
of
proteins
specific
to
carbohydrates. This characteristic also amplified the focus of this thesis to the
protein-carbohydrate interaction.
In
this
work
was
verified
spontaneous
adsorption
of
the
lectins,
concanavalin A and lentil, and this process is strongly affected by the presence of
an oxide film. Cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy
yielded measurable response to this strong adsorption, improved by the presence of
the
oxide
film.
The
first
technique
shows
decrease
of
the
peaks
of
xvii
___________________________________________________________________ Introduo
CAPTULO 1
1) INTRODUO
___________________________________________________________________ Introduo
especificidade da lectina permite que a pesquisa tambm seja direcionada ao
desenvolvimento de sensores. Nesse caso a interao lectina/carboidrato no
envolve transferncia de eltrons, que seria um requisito indispensvel na
deteco eletroqumica usual (potenciomtrica ou amperomtrica), por isso,
utilizou-se a espectroscopia de impedncia, que uma tcnica sensvel a
fenmenos interfaciais. Alm disso, esse tipo de interao semelhante s do
tipo
antgeno/anticorpo,
interao
que
atualmente
empregada
em
primeiro
captulo
da
tese
sero
apresentados
conceitos
espectroscopia
de
impedncia.
No
segundo
captulo
ser
feita
com
alta
estabilidade
interna,
chamadas
protenas
duras,
independente
de
foras
eletrostticas,
ajustando
sua
conformao a superfcie.
Geralmente a espessura de uma camada adsorvida de uma monocamada 14,
no entanto a estrutura detalhada da camada complicada, depende do tipo de
protena e do tipo de superfcie. As protenas podem aderir umas sobre as
outras formando multicamadas 1 de espessura ilimitada, a no ser que a adio
de uma nova monocamada represente um rearranjo eletrosttico muito alto.
Contudo a adsoro pode induzir a mudanas conformacionais que alterem a
distribuio de carga e ligaes de hidrognio. Portanto, tambm afetando a
capacidade da protena ligar-se a outra protena, permitindo assim a formao
de multicamadas. Isso foi verificado com protenas bem flexveis, mas de
modo geral a formao de uma monocamada a regra.
A maioria das protenas globulares tm a forma de uma elipse 1 7 , o que
permite dois tipos de configuraes para a adsoro, uma lateral ou paralela
(com o eixo mais longo da protena voltada para a superfcie) e a outra frontal
ou perpendicular (com o eixo menor voltado para a superfcie). Algumas
vezes o tipo de configurao 15 estimado simplesmente a partir da quantidade
de protena adsorvida.
A quantidade mxima de protena adsorvida geralmente em torno do ponto
isoeltrico 16,
devido
uma
repulso
menor
tanto
internamente
como
tambm
uma
correlao 17 entre
adsoro
mxima
Protena
Superfcie
Adsoro lateral
Aumento na
concentrao
Adsoro frontal
Prote
1.1.2) Efeitos que Influenciam a Interao Entre a P rote na e
a Superf cie S lida
quando
adsoro
ocorre
longe
do
ponto
isoeltrico.
_____________________________________________________________________ Lectinas
1.2) Lectinas
A pesquisa das lectinas 21, 22 tem o seu incio desde o final do sculo
XIX,
quando
em
1888-1889
Hermann
Stillmark 23,
estava
estudando
sementes
quando
misturado
ao
sangue,
aglutinava
as
clulas
termos
definio
24
foram
empregados,
como
por
exemplo:
aglutininas.
bastante
diversificado
de
protenas
com
respeito
ao
tamanho,
_____________________________________________________________________ Lectinas
divalentes clcio e mangans, esses metais so fundamentais para a ligao do
carboidrato. Alm disso, muitas lectinas possuem stios hidrofbicos 26 que
ligam compostos no polares tais como a adenina e o cido indolactico.
As subunidades das lectinas leguminosas so normalmente compostas
por cadeias simples de polipeptdeos com cerca de 250 aminocidos.
A concanavalina A e a lentil, so lectinas pertencentes a famlia das
leguminosas, ambas so especficas a manose/glicose e sero apresentadas em
maiores detalhes respectivamente nas sees 1.2.1.1 e 1.2.1.2.
1.2.1.1) Concanavalina A
estrutura
molecular 29 consiste
de
duas
folhas
antiparalelas
pregueadas, uma com 6 fitas, com a forma quase plana e a outra com 7 fitas,
com a forma cncava. No esto presentes -hlices. Cerca de 50% dos
resduos se encontram nas regies dos loops e nas voltas que conectam as
fitas. Os stios especficos ao carboidrato e aos ons metlicos localizam-se
no topo de cada subunidade. A forma cncava da folha, aquela composta por 7
fitas, fornece um stio raso e de fcil acesso ao carboidrato. O clcio e o
_____________________________________________________________________ Lectinas
mangans esto afastados entre si em 4,25 , estes metais so ligados a
quatro aminocidos e 2 molculas de gua, conforme representado na figura
1.2. Os aminocidos que coordenam o clcio protena so o cido asprtico
(Asp 208) e a asparagina (Asn 14) que tambm formam ligaes de hidrognio
com o monossacardeo. Da a importncia desses metais, que auxiliam a
posicionar os aminocidos para receber o monossacardeo (sem, no entanto se
ligarem diretamente ao mesmo) e auxiliam a manter a integridade da
subunidade.
Tir 100
Asp 208
O
Asp 10
Ca2+
4,3
C
Asp 19
O2
O5
O O
Mn2+
NH2
O6
OH 2 H
Leu 99
1O
Asn 14
CH3
Arg 228
Tir 12
8,2
Figura
1.2:
Representao
da
localizao
dos
ons
Ca 2 +
Mn 2 +
na
1.2.1.2) Lentil
10
_____________________________________________________________________ Lectinas
Lansteiner e Raubitschek 30. A lentil e a con A fazem parte do grupo especfico
a glicose/manose, embora entre elas existam algumas diferenas quanto
sensibilidade frente a esses acares. A con A comparada a lentil apresenta
maior sensibilidade 31, 32 a glicose e manose, no entanto a inverso dessa
caracterstica foi observada com a frutose.
A lentil na forma dimrica 33 constituda por uma cadeia (leve) e
outra (pesada) e similarmente a con A tambm necessita dos ons metlicos
clcio e mangans para reter a atividade biolgica. O peso molecular 34 gira em
torno de 42000, apresenta uma estrutura compacta em pH neutro formada
principalmente por folhas .
discriminao
entre
os
monossacardeos
ocorre
porque
os
11
_____________________________________________________________________ Lectinas
monossacardeos (manose/glicose) so orientados de forma diferente da
galactose. Por exemplo, na con A, a ligao da manose/glicose orientada de
tal forma que o cido asprtico faa duas pontes de hidrognio com o OH-6 e
OH-4 do acar e a asparagina uma ligao entre o NH e o OH-4 do acar
enquanto para uma lectina especfica a galactose, o cido asprtico faz duas
pontes de hidrognio com OH-3 e OH-4 do acar e a asparagina uma ligao
entre o NH e o OH-3 do acar. Como esperado as lectinas especficas a
manose/glicose no formam ligaes em OH-2 justamente a hidroxila que
diferencia esses dois acares. claro, portanto, que os aminocidos de
contato no so necessariamente os maiores determinantes na especificidade,
mas a composio e a precisa disposio dos aminocidos que envolvem o
stio combinatrio. Pequenas mudanas na estrutura do stio podem, portanto
resultar em uma grande mudana na especificidade da protena.
caracterizao
de
glicoprotenas,
glicolipdeos
12
_____________________________________________________________________ Lectinas
oligossacardeos 39, 40, 41. Estudo histoqumico de clulas e tecidos, rastreamento
de caminhos neurais, tipagem sangunea 42, 43.
Alm disso, as lectinas so excelentes modelos para examinar reaes
especficas que ocorrem entre protenas e outros tipos de molculas, como por
exemplo,
protena
as
6 , 3 9 , 44, 45,
ligaes
antgeno-anticorpo,
substrato-enzima,
droga-
adsoro
rpida,
com
alta
estabilidade,
impedindo
desnaturao da protena.
A formao de xidos sobre eletrodos de platina e outros metais nobres
um assunto bastante estudado devido importncia dessas superfcies para
as reaes catalticas como, por exemplo, na evoluo de O 2 e Cl 2 , para a
eletroorgnica no estudo de reaes andicas, pois esses filmes podem afetar
a cintica dos processos de transferncia de eltrons.
O mecanismo de formao da camada de xido tem algumas propostas e
estas variam conforme a espessura do filme e condies de formao desse
mesmo filme. Para filmes finos de xido, apresenta-se no esquema 1, um
mecanismo proposto por Kozlowska, Conway e Sharp 49.
13
formao
reduo
de
camadas
de
xido
produzidas
mais
extenso
quase
3-D
que
pode
ser
formado
potenciais
surgiram
algumas
controvrsias,
pois
filmes
com
diferentes
{1.1}
da
superfcie
maior
do
que
discutido
no
modelo
de
15
desse
modo
que
os
fenmenos
que
ocorrem
na
interface
Conceitos
1.4.1) Conceito s Bsicos
Antes de se falar propriamente da espectroscopia de impedncia se far
uma breve reviso do comportamento de uma tenso senoidal em circuitos
eltricos contendo um resistor e/ou um capacitor. 54
Considere uma tenso do tipo:
e = Esen(t)
{1.2}
onde,
E a amplitude da onda (Volt).
a frequncia angular (rad.s - 1 )
t tempo (s).
16
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
e T = R.i
{1.3}
i = E/Rsen(t)
{1.4}
17
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
{1.5}
{1.6}
i = CEsen(t + /2)
{1.7}
ou
{1.8}
18
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
{1.9}
{1.10}
E = i.Z
{1.11}
ou
Analisando-se
figura
acima
se
identificam
as
seguintes
igualdades trigonomtricas:
= tan
-1
(X c /R)
{1.12}
{1.13}
19
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
Equivalente Eltrico
Eletrodo
Soluo
Capacitor
{1.14}
C=
. 0 . A
d
{1.15}
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
21
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
A R s e C s so definidas como:
R s = R c t + / 0 , 5
{1.16}
C s = 1/ 0 , 5
{1.17}
Z f = R s + 1/jC s
{1.18}
Substituindo R s e C s ,
Z f = R c t + / 0 , 5 + /j 0 , 5
{1.19}
22
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
Z W = / 0 , 5 + /j 0 , 5
{1.20}
Impedncia
1.4.3) Representao dos Espectros de Impedncia
Os
freqncia,
espectros
so
de
geralmente
impedncia 59,
apresentados
obtidos
em
quando
grficos
se
varia
Nyquist,
estes
claramente,
alm
do
espaamento
logartmico
permitir
uma
23
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
Grfico Nyquist
Grfico de Bode
a)
b)
100
1800
1400
Zim (kohm)
1200
1000
800
600
400
200
0
0,90
Interseco=R
0,95
1,00
C
ngulo de fase (graus)
1600
1,05
1,10
80
60
40
20
0
-1
10
R
0
10
Zre (kohm)
10
10
10
10
frequncia (Hz)
c)
d)
C
100
ngulo de fase (graus)
1000
Zim (ohm)
800
R
600
400
200
200
400
600
800
60
40
20
R
0
-1
10
Interseco=R
0
80
10
10
10
10
10
frequncia (Hz)
1000
Zre (ohm)
alm
da
resistncia
da
capacitncia
tambm
se
apresenta
impedncia de Warburg.
24
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
2.5
Zim (kohm)
2.0
1.5
aumenta
1.0
controle cintico
0.5
0.0
Impedncia
de Warburg
=1/RctCdl
controle de transporte
de massa
R + Rct
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Zre (kohm)
25
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
Cdl
60
Impedncia
50 de Warburg
40
30
20
10
R +Rct
0
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
10
10
10
10
10
10
frequncia (Hz)
26
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
elementos
] [
2
2
S = Wi (Zrei Zre( i )) (Zimi Zim( i ))
i
{1.21}
27
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
da
dupla
camada
Cdl.
Esses
elementos
no
podem
ser
28
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
Circuito
Um circuito em paralelo de
elementos simples:
(RCL)
Nvel 0
complexos:
Nvel 1
C
R1
R 1 (C(R 2 W))
Nvel 2
R2
W
29
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
Sistemas
1.4.5) Impedncia em Sistemas Biol gicos
A medida de impedncia uma tcnica sensvel a variaes que
ocorrem na capacitncia da dupla camada, C d l , esse parmetro fortemente
influenciado por espcies que adsorvem na interface eletrodo/soluo. Por
isso a medida da capacitncia tambm pode ser utilizada para monitorar a
adsoro de protenas e estas no precisam ser eletroativas, o que uma
vantagem no estudo de complexos imunolgicos. Alm da sensibilidade da
tcnica, esta permite uma anlise contnua e sem utilizar reagentes marcados.
Outra vantagem, que o sistema sob investigao no sofre o impacto da
aplicao de um potencial externo o que poderia modificar as condies do
sistema. O sinal aplicado de pequena amplitude a-c e pode ser realizado no
potencial de repouso entre a molcula biolgica e o metal, preservando ao
mximo as condies naturais do processo.
A capacitncia, vide equao 1.15, diretamente relacionada a camada
dieltrica, modificaes na espessura (d) ou na sua constante dieltrica ()
iro refletir em modificaes na capacitncia.
Em
anticorpo
alguns
63, 64
trabalhos
onde
se
monitora
interao
antgeno-
da
db
1
1
1
=
+
Ct Ca Cb
{1.22}
30
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
representao
qualitativa
da
interao
antgeno/anticorpo
_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia
32
CAPTULO 2
2) TCNICAS EXPERIMENTAIS
33
2.1.1) Eletrodos
Fonte
i
Eletr.
Auxiliar
Eletr.
Trabalho
Eletr.
Referncia
Figura 2.1: Circuito de uma cela eletroqumica composta por trs eletrodos
34
tratamento
da
superfcie
do
eletrodo
fundamental
na
35
que
apesar
dos
experimentos
terem
sido
cuidadosamente
a) Voltametria
Cclica
i(A)
b) Impedncia
Zim(ohm)
E(V)
Zre(ohm)
2.1.3) Solvente
37
Os
carboidratos
utilizados
foram
glicose
(Ridel-de
Han),
qual
se
encaixam
os
eletrodos
o sistema de nitrogenao. A
38
a)
b)
Tampa-vista superior
3
2
4
1
1) Eletrodo auxiliar
2) Eletrodo de trabalho
3) Borbulhador de
nitrognio
4) Eletrodo de referncia
39
Software
398 EG&G
BJ-200
Impressora
GPIB IEEE - 488
Interface
273A EG&G
5210 EG&G
Potenciostato
Lock-in
Cela Eletroqumica
software
so
dirigidas
informaes
aos
mesmos.
potenciostato
40
experimentos
foram
realizados
no
potencial
de
repouso
de
aproximadamente 0,23 V.
2.4.1)
2.4.1) Verificao da adsoro das lectinas
41
(CaCl 2
MgCl 2 )
glicognio
tambm
foram
efetuados
42
3) Imerso do
eletrodo em Lectina
a) Voltametria
Cclica
b) Impedncia
i(A)
Zim(ohm)
Zre(ohm)
E(V)
2.4.2)
Verificao
da
seletividade
das
lectinas
frente
aos
carboidratos
carboidratos
A superfcie modificada com a lectina conforme j descrita em 2.4.1 era
testada frente a alguns acares, como a glicose, galactose e glicognio. Esse
43
a) Voltametria
Cclica
i(A)
b) Impedncia
Zim(ohm)
E(V)
Zre(ohm)
44
superfcie
do
eletrodo
foi
modificada
quimicamente
ocasionada
pela
protena.
No
primeiro
caso
efetuava-se
voltametria cclica e espectroscopia de impedncia no segundo caso imergiase o eletrodo em uma soluo de lectina, conforme as especificaes dadas em
2.1.6, lavava-se o eletrodo com gua e efetuava-se voltametria cclica e
espectroscopia de impedncia, um esquema apresentando essas etapas
mostrado na figura 2.7.
45
Enxage em H2O
Imerso em lectina
46
cclico,
de
que
sistema
se
encontra
limpo,
inicia-se
A)
B)
1,6V
t=x
1,3V
0,7V
-0,12V
-0,12 V
0,7V
60s
-0,12V
48
etapas
de
formao
verificao
da
camada
de
xido
formada
Cela de dois
compartimentos
com H2SO4 1M
Intervalo de potencial
usado na voltametria
cclica
Voltametria cclica
em H2SO4
1,3V
-0,12V -0,12
Ciclos a 1 V/s - 2 min.
Ciclos a 50 mV/s - 6 min.
0,7V
0,7V
60s
Esquema mostrando o
programa de potenciais usados
na formao da camada de
xido em H2SO4 1M, aps
obteno da voltametria cclica
-0,12V
a)
Voltametria
Cclica
b) Impedncia
Zim(ohm
i(A)
E(V)
Zre(ohm
49
Teste
2.8) Teste de Atividade Biol gica da Concanavalina A
50
CAPTULO 3
3) RESULTADOS E DISCUSSES
As
eletrodo/protena
tcnicas
foram
utilizadas
voltametria
para
estudo
cclica
da
interface
espectroscopia
de
discusso
dos
resultados
so
propostos
circuitos
eltricos
modelagem
dos
resultados
experimentais
deles
foram
51
Os
preparao
procedimentos
da
experimentais,
superfcie
da
platina,
descritos
tm
em
2.1.1.1,
para
objetivo
de
garantir
52
II
III
Corrente (A)
2
0
-2
-4
-6
-200
contaminao,
que
pode,
portanto,
afetar
resultado
dos
experimentos.
8
6
Corrente (A)
4
2
0
-2
-4
-6
-8
100
200
300
400
500
Potencial / mV(E/Ag/AgClsat)
Figura
3.2:
Voltamograma
cclico
do
eletrodo
de
platina
em
ferri-
54
55
8
6
Corrente (A)
4
2
0
-2
-4
-6
-8
100
200
300
400
500
Potencial / mV(E/Ag/AgClsat)
Figura
3.3:
Voltamograma
cclico
do
eletrodo
de
platina
em
ferri-
56
7,0
ipa (A)
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
0
200
400
600
800
1000
Carga (C)
100
90
80
70
60
0
200
400
600
800
1000
Carga (C)
57
6.0
Zim (kohm)
4.5
16 Hz
3.0
1.5
151 Hz
0.0
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
Zre (kohm)
O mesmo resultado tambm pode ser visto num grfico de Bode, figura
3.7, onde relaciona-se o ngulo de fase ( ) e o mdulo da impedncia
frequncia. Uma forma de associar as informaes desses dois grficos
58
40
10
10
10
30
20
| Z | (ohm)
50
10
0
-2
10
10
-1
10
10
10
10
10
10
frequncia (Hz)
Figura 3.7: Grfico de Bode ngulo de fase do eletrodo de platina em ferriferrocianeto de potssio: (+) eletrodo de platina; ( ) eletrodo de platina
modificada com filme de xido, 61 C para a formao do filme.
Uma inspeo nas figuras 3.3 e 3.7 mostra que o efeito da presena do
xido sobre a platina aparentemente menos evidenciado na voltametria
cclica do que na impedncia. Essa diferena na resposta entre as duas
59
[Dov(nF / RT )]1/ 2
k =
( Do / DR ) / 2
o
{3.1}
io = nFAk o C *
{3.2}
[Dov(nF / RT )]1/ 2 *
io = nFA
C
( Do / DR ) / 2
{3.3}
60
i = io (
nF
)
RT
{3.4}
R ct =
RT
=
i nFio
{3.5}
61
obtidos
na
voltametria
cclica
relacionados
aos
respectivos
Rct (kohm)
6
4
2
0
60
Figura
A=0,038
3.8:
Rct
cm 2 ,
versus
=valores
E p ,
Rct
foi
tabelados 7 7 ,
obtido
da
equao
D O =D R =1,211x10 - 5
3.5,
onde:
cm 2 /s
para
b)
a)
8.5
8.0
1/Zim. (F) - 25 Hz
Zre (kohm) - 25 Hz
2.0
1.8
1.6
1.4
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
1.2
4.5
200
400
600
800
1000
200
400
600
800
1000
carga (C)
carga (C)
Figura 3.9: a) Zre versus carga, esses dados foram obtidos na frequncia de
25 Hz dos espectros de impedncia.
b) Capacitncia versus carga, onde a capacitncia dada por 1/Zim., esses
dados foram obtidos na frequncia de 25 Hz dos espectros de impedncia.
63
3.2.3.1) Modelo 1
O circuito de Randles, figura 3.10a, foi o primeiro circuito a ser
utilizado para modelar as curvas experimentais. Nesse circuito, definido como
modelo 1, as modificaes causadas pela presena do xido so verificadas
tanto na capacitncia da dupla camada (C d l ) como na resistncia da
transferncia do eltron (R c t ). Na figura 3.10b, mostra-se o resultado da
modelagem entre a curva experimental e o modelo 1. Observa-se que modelo
foi adequado no ajuste da alta e baixa regio de frequncia, no entanto falhou
na regio intermediria (10 2 10 3 Hz), onde o valor do ngulo de fase no
adequado.
64
b)
60
50
R
Rct
10
40
30
3
10
20
| Z | (ohm)
Cdl
10
2
0
-2
10
-1
10
10
10
10
10
10
10
10
frequncia (Hz)
a)
1,30
2.1
1,25
Cdl (F)
1,35
2.4
Rct (kohm)
2.7
1.8
1.5
1,20
1,15
1.2
1,10
0.9
1,05
200
400
600
800
200
1000
400
600
800
1000
carga (C)
carga (C)
2.5
Rct (kohm)
2.0
1.5
1.0
0.5
80
90
100
110
120
Ep (mV)
3.2.3.2) Modelo 2
66
b)
60
Cox
R
Cdl
Rct
10
50
40
30
10
20
| Z | (ohm)
Rox
10
0
-2
10
-1
10
10
10
10
10
10
10
10
frequncia (Hz)
Para
complementar
anlise
desse
modelo
verificou-se
qual
b)
0,22
200
0,20
0,18
150
Cox (F)
Rox (kohm)
175
125
100
0,16
0,14
0,12
0,10
75
0,08
200
400
600
800
1000
200
carga (C)
400
600
800
1000
carga (C)
2.5
Rct (kohm)
2.0
1.5
1.0
0.5
80
90
100
110
120
Ep (mV)
3.2.3.3) Modelo 3
Visto que a modelagem com o circuito que assume uma camada com
ilhas de xido (fig.3.13a) no ter resultado em melhoras no ajuste j obtido
com o circuito de Randles props-se um terceiro circuito equivalente. Nesse
modelo, que se denominou modelo 3, assume-se uma camada contnua e
compacta de xido, para tal adiciona-se um circuito RC em srie ao circuito
de Randles, como mostra a figura 3.16a. A incluso desse circuito melhorou o
ngulo de fase na regio intermediria, deficiente no modelo anterior, no
entanto ainda houve um desvio da curva experimental no intervalo de 10 2
10 1 Hz, esse resultado mostrado na figura 3.16b.
68
b)
50
Cdl
Rox
Cox
Rct
40
30
10
20
| Z | (ohm)
10
10
2
0
-2
10
-1
10
10
10
10
10
10
10
10
frequncia (Hz)
a)
1.0
22
20
18
16
Cox (F)
Rox (kohm)
0.8
0.6
14
12
10
8
6
0.4
200
400
600
800
200
1000
400
600
800
1000
carga (C)
carga (C)
69
2.5
Rct (kohm)
2.0
1.5
1.0
0.5
80
90
100
110
120
Ep (mV)
3.2.3.4) Modelo 4
Uma outra maneira ainda de se analisar o filme xido, seria como uma
camada isolante e rugosa sobre o eletrodo. Esse circuito 79,
80
, que se
70
Cox
Cdl
Rox
Rct
10
40
30
3
10
20
| Z | (ohm)
a)
10
2
0
-2
10
-1
10
10
10
10
10
10
10
10
frequncia (Hz)
b)
a)
1,20
1.6
1,15
1.4
Cox (F)
Rox (kohm)
1,10
1.2
1.0
1,05
1,00
0,95
0.8
0,90
0.6
200
400
600
800
200
1000
400
600
800
1000
carga (C)
carga (C)
71
2.5
Rct (kohm)
2.0
1.5
1.0
0.5
80
90
100
110
120
Ep (mV)
Na
escolha
de
um
modelo
para
descrever
interface
72
Clculo
3.2.4) C lculo da Espessura da Camada de xido
82
da camada de xido
R=
d
A
{3.6}
73
filmes
extremamente
finos)
que
seriam
os
preferenciais
para
86
apenas
caractersticas
intrnsecas
do
xido,
mas
tambm
de
propriedades interfaciais.
A expresso 3.7 aplicada a capacitores de placas paralelas com um
dieltrico ():
C=
. 0 . A
d
{3.7}
74
carga
Espessura calculada
Espessura calculada
=10 3 .cm
=10
=15
60 C
0,049 cm
4,10
6,18
265 C
0,044 cm
4,24
6,37
500
C
0,052 cm
3,88
5,82
1000 C
0,061 cm
4,38
6,58
3.2.5)
3.2.5 ) Como a Interface Eletrodo Soluo Foi Alterada pela
Presena de xido?
75
ia = k a e
mFq (1 ) F
)
RT
2 RT e
{3.8}
i a , corrente andica
k a , fator pr-exponencial dependente da escolha do eletrodo de referncia
m, parmetro experimental [=(dE/dq) i ]
q, carga (Coulomb), equivalente espessura do filme e a largura da barreira
para o tunelamento
, potencial de Galvani
, fator de simetria que esta relacionado a .
Com
objetivo
de
se
verificar
comportamento
descrito
por
76
-5,26
-5,27
-5,28
Log ipa
-5,29
-5,30
-5,31
-5,32
-5,33
-5,34
0
200
400
600
800
1000
carga (C)
Figura 3.22: Log i p a versus carga, para o eletrodo de platina em uma soluo
de ferri-ferrocianeto de potssio. O coeficiente de correlao da reta de
0,84.
io = k a
mFq
F
(1 ) e
RT e
RT
e
{3.9}
e = potencial no equilbrio
Substituindo i o na equao 3.5
Rct =
RT
mFq (1 ) e F
nF k a e 2 RT e RT
{3.10}
77
e F
mFq
RT
+
(1 )
nFka 2 RT 2,303
RT 2,303
{3.11}
3.3
3.2
Log Rct
3.1
3.0
2.9
2.8
0
200
400
600
800
1000
carga (C)
78
xidos
3.2.6) Comparativo Entre as Camadas de xidos Produzidas
Quimicamente e Eletroquimicamente
3.3
3.2
Log Rct
3.1
3.0
2.9
2.8
2.7
0
200
400
600
800
1000
carga (C)
60
50
40
30
20
10
0
-3
-2
-1
10 10 10
10
10
10
10
10
10
frequncia (Hz)
quimicamente
(),para
uma
camada
de
xido
formada
qumica
eletroqumica
seja um
associou-se
uma
carga
em
torno
de
50
ou
menos,
b)
2.0
1.6
1.2
0.8
+0,02
+4,0
+0,3
0.4
Capacitncia (F)
+0,1
+0,1
1.0
0.8
+0,2
0.6
0.4
+0,9
+0,003
0.2
0.0
0.0
Resistncia (kohm)
1.2
2.4
Cdl
x. eletroqumico
x. qumico
Cox
x. eletroqumico
x. qumico
Rct
Rox
Figura 3.26: Resultado dos valores dos componentes eltricos obtidos com o
aj uste ao modelo 4. Os valores so resultado da mdia de 7 experimentos
para camada eletroqumica (carga mdia de 61 C) e 2 experimentos para
camada qumica. Colunas brancas para xido qumico e colunas cinzas para
xido eletroqumico. O intervalo de confiana de 90%.
81
b)
a)
xido eletroqumico
xido qumico
Figura
3.27:
Desenho
esquemtico:
a)
camada
de
xido
formada
a)
b)
4
Zim (kohm)
20
0
-2
-4
10 Hz
100 Hz
Zim (kohm)
Corrente (A)
63,1 Hz
25
15
Zre (kohm)
15,8 Hz
10
2,9 Hz
10 Hz
5 100 Hz
-6
0
100
200
300
400
500
Potencial / mV (E/Ag/AgClsat)
10
15
20
25
Zre (kohm)
b)
a)
70
60
50
40
30
10
20
Rct (kohm)
10
| Z | (ohm)
80
6
5
4
3
2
10
0
-3
-2
-1
10 10 10
10
10
10
frequncia (Hz)
10
10
10
10
80
100
120
140
160
180
200
220
Ep (mV)
84
Cpro (F)
(k
Rct (k)
Cdl (F)
0,532 a0,022
0,411a0,212
2,19a0,099
Pt
0,848 a0,427
0,554 a0,035
0,447a0,184
2,24a1,02
Pt\
Pt\PtOeq
Ativ.
4,28 b 1,68
0,69 b 0,078
3,15b1,45
1,12b0,079
Pt\
Pt\PtOq
Ativ.
2,99 a0,786
0,639 a0,029
1,87 a0,698
1,46a1,81
Pt\
Pt\PtOeq
Desativ.
8,70 b3,48
0,694 b0,107
5,16 b1,80
1,92b1,85
Pt\
Pt\PtOq
a
Desativ.
Desativ.
7,44 b1,35
0,701 b0,047
6,14 b1,46
1,25b0,027
md ia d e 5 e xp e r imento s,
md ia d e 7 e xp e r imento s
No ta 1 : O inter va lo d e c o nfian a d e 9 5 %;
No ta 2 : a carga utilizad a fo i d e 6 1 C p a r a a p r o d u o d e filme d e xid o e le tr o q umico
85
sobre
uma
superfcie
modificada
com
xido
qumico
como
eletroqumico.
b)
a)
6.0
1.5
6
4
2
0.0
Desativada
Desativada
Ativada
eletroqumico
Rpro (kohm)
3.0
Rct (kohm)
4.5
Ativada
qumico
eletroqumico
qumico
qumico
eletroqumico,
esses
resultados
so
mdias
de
86
1.0
Cdl (F)
1.5
0.5
0.0
Desativada
Ativada
eletroqumico
qumico
Rct (kohm)
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0
200
400
600
800
1000
carga ( C)
87
50
40
30
20
10
0
200
400
600
800
1000
carga (C)
Figura 3.33: R c t
(xido+protena)
(xido+protena)
aumenta com o
(xido+protena)
aumento proporcional devido ao xido, uma vez que essas curvas apresentam
inclinaes diferentes.
88
P + nM P(M) n , a d s + ne
{3.12}
89
Q( semprotena ) _ Q( comprotena )
Qads % =
100
Q( semprotena )
Onde Q ( s e m
{3.13}
protena)
protena)
a carga
obtida integrando-se no voltamograma cclico a rea sob os picos de ferriferrocianeto de potssio aps a adsoro da protena.
Os valores Q a d s %, apresentados na tabela 3.3, expressam um crescente
aumento no bloqueio da superfcie mostrando que a transferncia de eltrons
ocorre com mais dificuldade em uma superfcie de platina/xido/protena do
que em platina/protena. Mas como saber se esse valor percentual pode ser
relacionado ao grau de recobrimento da superfcie? Com a finalidade de
esclarecer
essa
questo
estabeleceu-se
um
paralelo
entre
os
valores
Tabela 3.3: Valores do percentual de rea recoberta com protena obtida a partir da
carga Qads%, da voltametria cclica R c t % (VC) e impedncia R c t % (IM).
Superfcie
Qads%
R c t % (VC)
R c t %(IM)
Pt/con A desativada
3,54
44,8
57,6
Pt/PtO e q /con A
18,3
57,9
48,1
43,1
87,5
86,8
ativada
Pt/PtO e q /con A
desativada
90
esses
dois
ltimos
parmetros
com
valores
semelhantes.
91
mFq
= d
2 RT
{3.14}
(1 ) e F
d
RT
+
nFk a 2,303
2,303RT
{3.15}
3,6
3,4
log Rct
3,2
3,0
2,8
2,6
5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4
d (ngstrons)
92
superfcie
ativao da
protena
R c t (k )
d ()
xido+protena xido+protena
Pt/PtO e q
ativada
3,151,45
8,94
Pt/PtO q
ativada
1,870,698
7,80
Pt/PtO e q
desativada
5,161,80
10,2
Pt/PtO q
desativada
6,141,46
10,4
No ta 1 : O inter va lo d e c o nfian a d e 9 5 %
No ta 2 : a s md ia s so r e sultad o s d e 7 e xp e r imento s
Uma anlise geral na tabela 3.4 indica que os valores obtidos para a
espessura da camada foram inferiores a dimenso da prpria protena, levando
a cogitar-se a possibilidade desses valores se referirem a uma espessura
mdia. Essa espessura mdia (d m d i a ) seria a soma de regies com protena
(d p r o t e n a ) e sem protena(d x i d o ):
d mdia = d protena
Onde d protena =
Aprotena .R pro
Aprotena
A
+ d xido
( A Aprotena )
A
{3.16}
{3.17}
93
3+
e Fe
Fe2+
Eletrodo
Protena
94
Ativao da
R p r o (kohm)
d () a
d ()
d ()
protena
xido+protena
xido+protena
xido
protena
Pt
ativada
0,729 a 0,256
27,79,73
Pt
desativada
0,848 a 0,427
32,216,2
Pt/PtO e q
ativada
4,28 b 1,68
16363,9
6,19
15763,9
Pt/PtO q
ativada
2,99 b 0,786
11429,9
5,45
1088,35
Pt/PtO e q
desativada
8,70 b 3,48
331132,1
6,00
325132,1
Pt/PtO q
desativada
7,44 b 1,35
28351,2
5,45
27751,2
superfcie
md ia d e 5 e xp e r imento s,
md ia d e 7 e xp e r imento s
Alm
101
disso,
adsoro
tambm
pode
ocorrer
em
vrias
Os
resultados
mostram
que
essa
habilidade
bastante
115
, , o valor de 20.
97
Ativao da
C p r o ( F)
protena
xido+protena
Pt
ativada
0,532 a 0,022
12,60,510
Pt
desativada
0,554 a 0,035
12,10,752
Pt/PtO e q
ativada
0,689 b 0,078
9,701,06
Pt/PtO q
ativada
0,637 b 0,029
10,90,524
Pt/PtO e q
desativada
0,694 b 0,107
9,651,46
Pt/PtO q
desativada
0,701 b 0,047
9,540,629
superfcie
d ()
No ta 1 :O inter va lo d e c o nfian a d e 9 5 %
a
md ia d e 5 e xp e r imento s,
comparao
entre
os
md ia d e 7 e xp e r imento s
valores
obtidos
na
tabela
3.5
3.6,
respectivamente
formao
de
uma
monocamada
de
98
no
eletrodo
permanecia
com
capacidade
de
reconhecer
carboidratos e distingu-los.
Deste modo realizaram-se experimentos para se averiguar como a con A
adsorvida interagia com as seguintes substncias: glicognio, glicose e
galactose, lembrando que a con A no especfica a esse ltimo carboidrato.
A reao entre antgeno-anticorpo, semelhante a lectina-carboidrato,
quando monitorada por um sensor impedimtrico se d geralmente pelo
controle
da
capacitncia 116,
impedimtricos
tambm
117,
podem
118
ser
contudo
outros 119,
acompanhados.
120
Neste
componentes
trabalho,
resistncia foi o parmetro que melhor caracterizou a interao lectinacarboidrato, enquanto a capacitncia no se mostrou eficiente.
Na tabela 3.7, so mostrados os resultados do aumento relativo, %R p r o , da
resistncia do carboidrato (R c a r ) em relao a resistncia da protena (R p r o ), os
valores so obtidos segundo a expresso3.18. Lembrando que (R c a r ) no
apenas a resistncia do carboidrato, mas tambm da protena e do xido, se
presente. O mesmo ocorre para (R p r o ) que a resistncia da protena e do
xido quando este est presente.
% R pro =
Rcar R pro
R pro
100
{3.18}
99
%R p r o
Superfcie/con A/carboidrato
ativada
desativada
Pt/con A/glicognio
38,9 a 22,3
31,0 b 13,8
38,9 c 102
30,5 d 8,13
75,8 d 68,2
28,2 d 19,6
177 c 576
62,0 c 28,2
28,6 c 104
111 c 267
md ia d e 4 e xp e r imento s,
md ia d e 3 e xp e r imento s
md ia d e 5 e xp e r imento s,
md ia d e 2 e xp e r imento s,
da
%R p r o
variouse
as
condies
da
mesma.
Inicialmente
na
orientao
conseqentemente
favorecendo
tambm
101
apresentam-se
os
resultados
obtidos
com
modelagem
das
curvas
Rpro (k)
Cpro (F)
Rct (k)
Cdl (F)
Pt
Ativao da
Protena
Ativ.
0,516
0,479
0,225
1,58
Pt
Desativ.
0,619
0,474
0,442
2,59
Pt\PtOqa
Ativ.
2,361,24
0,5290,072
1,420,894
1,560,083
Pt\PtOqb
Desativ.
6,452,79
0,6390,099
4,692,24
1,400,036
md ia d e 4 e xp e r imento s,
md ia d e 5 e xp e r imento s
102
Ativao da
R p r o (k)
d ()
d ()
d ()
protena
xido+protena
xido+protena
xido
protena
Pt
ativada
0,516
19,62
Pt
desativada
0,619
23,51
Pt/PtO q
ativada
2,36 a 1,24
89,629,7
5,45
84,129,7
Pt/PtO q
desativada
6,45 b 2,79
245106
5,45
239106
superfcie
md ia d e 4 e xp e r imento s,
md ia d e 5 e xp e r imento s
103
As
espessuras,
relativamente
menores
para
lentil,
contudo
Tabela 3.10: Distncia obtida para a conformao das cadeias da lentil obtida
utilizando a componente C p r o para vrias condies experimentais.
Ativao da
C p r o ( F)
protena
xido+protena
Pt
ativada
0,479
14,0
Pt
desativada
0,474
14,1
Pt/PtO q
ativada
0,529 a 0,072
12,61,85
Pt/PtO q
desativada
0,639 b 0,099
10,51,71
superfcie
d ()
md ia d e 4 e xp e r imento s,
md ia d e 5 e xp e r imento s
104
numa
superfcie
com
xido.
Nesse
ltimo
caso,
as
Tabela
3.11:
Resultados
mostrando
aumento
relativo
da
resistncia
do
%R p r o
Superfcie/lentil/carboidrato
ativada
desativada
Pt/lentil/glicognio
28,1 a 5,89
35,7 a 17,7
Pt/PtO q /lentil/glicognio
30,1 a 36,6
22,6 b 13,9
md ia d e 3 e xp e r imento s
md ia d e 5 e xp e r imento s
105
106
3.6)
Desdobramentos
do
trabalho
com
Lectinas
no
108
________________________________________________________________________________ Conclus es
4) Conclus es
4.1) Camada de xido de Platina
(modelo
4).
Entre
os
parmetros
extrados
desse
modelo,
________________________________________________________________________________ Conclus es
xido
formado
eletroquimicamente.
Supe-se
que
esse
fato
esteja
(aumento
da
componente
resistiva).
Ambas
as
tcnicas
111
________________________________________________________________________________ Conclus es
espessuras
encontradas
para
con
nas
diversas
condies
mais
compacta
da
protena
sobre
superfcie
________________________________________________________________________________ Conclus es
duas
protenas
novamente
apresentaram
um
comportamento
________________________________________________________________________________ Conclus es
foi para a protena ativada sobre a ltima superfcie citada. Surpreende o fato
da superfcie com xido qumico no ter provocado nenhuma modificao no
resultado, mostrando que a quantidade e a estrutura do filme de xido
influenciam a sensibilidade da protena. Para a forma desativada, nessas
mesmas condies experimentais no se observou nenhuma modificao na
sensibilidade.
A comparao dos resultados obtidos para as duas protenas nas mesmas
condies experimentais, mostra que a forma ativada da con A apresenta
maior sensibilidade ao glicognio do que a lentil. Reforando dados na
literatura que indicam diferenas no grau de afinidade por um mesmo
carboidrato apesar de serem especficas aos mesmos carboidratos.
114
_________________________________________________________________________Perpectivas Futuras
5) Perspectivas Futuras
Os
resultados
obtidos
com
estudo
impedimtrico
do
sistema
115
_________________________________________________________________________Perpectivas Futuras
116
_____________________________________________________________________Referncias Bibliogrficas
6) Referncias Bibliogrficas
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