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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DA NATUREZA


DEPARTAMENTO DE QUMICA FUNDAMENTAL

A ESPECTROSCOPIA DE IMPEDNCIA ELETROQUMICA


APLICADA AO ESTUDO DA INTERFACE PLATINA/LECTINA

Por
Roseli Rudnick Ueta

Tese submetida ao Departamento de Qumica Fundamental como parte dos requisitos


para obteno do ttulo de Doutor em Cincias

Orientador: Prof. Dr. Flamarion Borges Diniz

Recife, 2002

Dedicat ria,

s minhas filhas, Vivian e Valeria,


Por ampliarem a minha definio de amor,
e desta forma me fazer uma pessoa melhor!
A Anselmo por uma vida compartilhada!
Aos meus pais, Alice e Aristides,
Pela imensa saudade deixada!

AGRADECIMENTOS
O perodo em que desenvolvi o trabalho de tese foi um dos mais ricos em experincias de
vida! Estas experincias foram as mais variadas possveis, envolvendo sentimentos opostos,
como alegria e tristeza, realizao e perda! Esse conjunto de emoes me transformou vrias
vezes deixando impresses definitivas em meu corao.
Gostaria de iniciar os agradecimentos a Flamarion, pela orientao neste trabalho, tarefa que
demandou muito tempo e dedicao, mas acima de tudo por contar com a sua compreenso
para com meus momentos de vida! E ressaltar que o seu apoio foi determinante para a
concluso deste trabalho.
Ao Departamento de Qumica Fundamental pela formao acadmica e em especial na pessoa
do Prof. Bencio Barros Neto.
Ao Prof. Luis Bezerra de Carvalho Junior, pela conversa inspiradora que frutificou neste
trabalho!
Ao grupo de Eletroqumica pela convivncia agradvel que nos permitiu compartilhar muito
mais do que trabalho e espao fsico! E em especial aos amigos: Alziana, Elvira, rika,
Fellipe, Jailson, Lda, Lucila, Ktia, Madalena, Rogrio, Sibele e Suzana!
Alziana, Rogrio e Sibele pela amizade e empenho no desenvolvimento dos trabalhos de
iniciao cientfica.
Lucila e Jailson! Amigos de todas as horas e muitas horas! Nesta oportunidade de forma
simples expresso o meu agradecimento pela sorte de t-los como amigos!
Madalena pela amizade, uma presena renovadora e entusiasta no laboratrio e confeco
das figuras deste trabalho!
Aos amigos da ps-graduao: Beate, Bruno, lcio, Eliete, Expedito, Idlia, Jucemar, Patrcia,
Suzana Villanova!
s funcionrias da biblioteca Ana e Joana pela delicadeza sempre presente no atendimento.
Aos funcionrios Maurlio e Dora pelas gentilezas ao longo desses anos.
Ao CNPq pela bolsa concedida.

ndice
ndice de Figuras ..................................................................................... iv
ndice de Tabelas ..................................................................................... xi
Lista de Smbolos .................................................................................. xiii
Resumo ................................................................................................. xvi
Abstract ................................................................................................ xvii

1) INTRODUO ................................................................................... 01
1.1) Adsoro de Protenas .................................................................... 03
1.1.2) Efeitos que Influenciam a Interao Entre a Protena e a Superfcie
Slida .................................................................................................. 06
1.1.2.1) Efeito de Carga ...................................................................... 06
1.1.2.2) Efeito Hidrofbico ................................................................. 07
1.1.2.3) Efeito da Temperatura ............................................................ 07
1.2) Lectinas ......................................................................................... 07
1.2.1) Lectinas Leguminosas .................................................................. 08
1.2.1.1) Concanavalina A .................................................................... 09
1.2.1.2) Lentil ....................................................................................... 10
1.2.3) Interao da Lectina e o Carboidrato ............................................. 11
1.2.4) Aplicaes das Lectinas ............................................................... 12
1.2) Filme de xido de Platina ............................................................... 13
1.4) Espectroscopia de Impedncia ......................................................... 15
1.4.1) Conceitos Bsicos ........................................................................ 16
1.4.2) Circuito Equivalente de uma Cela Eletroqumica............................ 21
1.4.3) Representao dos Espectros de Impedncia ..................................................... 23
1.4.4) Utilizao do Programa de Circuitos Equivalentes ......................... 26
1.4.4.1) Princpios para a Utilizao do EQUIVCRT ............................. 28
1.4.5) Impedncia em Sistemas Biolgicos .............................................. 30

2) TCNICAS EXPERIMENTAIS...................................................................................... 33
2.1) Sistema Eletroqumico .................................................................... 34
2.1.1) Eletrodos .................................................................................... 34
2.1.1.1) Eletrodo de Trabalho .............................................................. 35
2.1.1.2) Eletrodo Auxiliar ................................................................... 35
2.1.1.3) Eletrodo de Referncia ........................................................... 35
2.1.2) Preparo da superfcie do eletrodo de trabalho ................................ 35
2.1.3) Solvente...................................................................................... 37
2.1.4) Eletrlito suporte ........................................................................ 37
2.1.5) Sistema Redox ............................................................................. 37
2.1.6) Lectinas adsorvidas na superfcie da platina .................................. 37
2.1.6) Carboidratos utilizados para testar a sensibilidade e seletividade das
lectinas adsorvidas ................................................................................ 38
2.1.7) Cela eletroqumica ....................................................................... 38
2.2) Equipamentos Utilizados para a Realizao dos Experimentos
Eletroqumicos ...................................................................................... 39
2.3) Voltametria Cclica ........................................................................ 40
2.4) Espectroscopia de Impedncia ......................................................... 41
2.4.1) Verificao da adsoro das lectinas ............................................. 41
2.4.2) Verificao da seletividade das lectinas frente aos carboidratos ...... 43
2.5) Formao da Camada de xido ........................................................ 45
2.5.1) Camada de x ido formada quimicamente ....................................... 45
2.5.2) Camada de xido formada eletroquimicamente ............................... 46
2.5.2.1) Parmetros experimentais para a formao da camada de xido . 46
2.8) Teste de Atividade Biolgica da Concanavalina A ............................ 50

3) RESULTADOS E DISCUSSES ......................................................... 51


3.1) Voltametria Cclica do Eletrodo de Platina ....................................... 52
3.1.1) Voltametria Cclica em cido Sulfrico ........................................ 52
3.1.2) Voltametria Cclica em Ferri-ferrocianeto de Potssio .................... 53
3.2) A camada de xido Formada Eletroquimicamente ............................. 55
3.2.1) Caracterizao da Camada de xido pela Voltametria Cclica ......... 55
3.2.2) Caracterizao da Camada de xido pela Espectroscopia de
Impedncia ........................................................................................... 58
ii

3.2.2.1) Comparao dos Resultados Obtidos com a Voltametria Cclica e


a Impedncia ...................................................................................... 59
3.2.2.2) Caracterizao da Camada de xido pela Espectroscopia de
Impedncia na Frequncia de 25 Hz ..................................................... 62
3.2.3) Circuitos Equivalentes ................................................................. 64
3.2.3.1) Modelo 1 ............................................................................... 64
3.2.3.2) Modelo 2 ............................................................................... 66
3.2.3.3) Modelo 3 ............................................................................... 68
3.2.3.4) Modelo 4 ............................................................................... 70
3.2.4) Clculo da Espessura da Camada de xido .................................... 73
3.2.5) Como a Interface Eletrodo Soluo Foi Alterada pela Presena de
xido? ................................................................................................. 75
3.2.6) Comparativo Entre as Camadas de xidos Produzidas Quimicamente
e Eletroquimicamente ............................................................................ 79
3.3) Adsoro da Con A e a Camada de xido ......................................... 82
3.3.1) O circuito Equivalente ................................................................. 83
3.3.2) Efeito da Quantidade de xido na Adsoro da Protena ................. 87
3.3.2) Caracterizao da Adsoro da Con A ........................................... 89
3.4) Especificidade e Seletividade da Con A Adsorvida ........................... 99
3.5) Caracterizao da Adsoro da Lentil ............................................ 102
3.5.1) Especificidade da Lentil Adsorvida ............................................. 105
3.6)

Desdobramentos

do

Trabalho

com

Lectinas

no

Laboratrio

de

eletroqumica ....................................................................................... 107

4) CONCLUSES ................................................................................. 109


4.1) Camada de xido de Platina ............................................................ 109
4.2) Adsoro de Protena ...................................................................... 110
4.3) Sensibilidade da Protena Frente aos Carboidratos ............................. 112

5) Perspectivas Futuras ........................................................................114


6) Referncias Bibliogrficas ................................................................ 116

iii

ndice de Figuras
Cap tulo 1

Figura 1.1: Correlao entre o aumento da concentrao e a configurao da


protena adsorvida ................................................................................... 05

Figura

1.2:

Representao

da

localizao

dos

ons

Ca 2 +

Mn 2 +

na

concanavalina A e a sua interao com um carboidrato (metil-manose) ......... 10


Figura 1.3: a) Circuito eltrico puramente resistivo.b) Relao entre a
voltagem e a corrente em um circuito resistivo. c) Mostra a mesma relao de
b, porm na forma de vetores. ................................................................... 16
Figura 1.4: a) Circuito eltrico puramente capacitivo. b) Relao entre a
voltagem e a corrente em um circuito puramente capacitivo.c) Mostra a
mesma relao de b, porm na notao de vetores. ...................................... 17
Figura 1.5: Representao vetorial da impedncia ...................................... 19
Figura 1.6: Analogia entre a interface eletrodo/soluo e um capacitor
eltrico. .................................................................................................. 20
Figura 1.7: (a) circuito equivalente de uma interface eletrodo/soluo. (b)
desdobramento de Z f em R s e C s ou R c t e Z W . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Figura 1.8: a)Grfico Nyquist de um circuito RC em srie, b) e o seu
respectivo grfico de Bode ngulo de fase, c) Grfico Nyquist de um circuito
RC em paralelo, d) e o seu respectivo grfico de Bode ngulo de fase. ......... 24

iv

Figura 1.9: Grfico Nyquist para o circuito de Randles, com os seguintes


valores: R =100 , R c t =1000 , C d l = 1F e =2000 .s 0 , 5 . ........................ 25
Figura 1.10: Grfico de Bode para o circuito de Randles: relacionando o
ngulo de fase vs. log frequncia. Com os seguintes valores: R =100 ,
R c t =1000 , C d l = 1F e =2000 .s 0 , 5 . ...................................................... 26
Figura 1.11: Esquema proposto para a interao antgeno-anticorpo na
interface eletrodo/soluo. ........................................................................ 30

Cap tulo 2

Figura 2.1: Circuito de uma cela eletroqumica composta por trs eletrodos . 34
Figura 2.2: Esquema para a verificao da limpeza e reprodutibilidade da
superfcie do eletrodo ............................................................................... 36
Figura 2.3: Celas eletroqumicas: a) com capilar de Luggin-Harber; b) sem
capilar de Luggin-Harber. ......................................................................... 39
Figura 2.4: Organograma dos equipamentos utilizados para as medidas de
impedncia. ............................................................................................. 40
Figura 2.5: Esquema mostrando as etapas 1 e 2 anteriores adsoro da
lectina e a adsoro propriamente dita, etapa 3, e a sua posterior verificao
na etapa4. ................................................................................................ 43
Figura 2.6: Esquema mostrando a adsoro de carboidratos, sobre uma
superfcie com lectina (mostradas na figura 2.4) e a verificao da adsoro
do carboidrato com voltametria cclica e espectroscopia de impedncia. ....... 44

Figura 2.7: Esquema resumindo os procedimentos para a produo de uma


camada de xido quimicamente. ................................................................ 46
Figura 2.8: Esquema dos potenciais estabelecidos no eletrodo de trabalho
para se produzir camada de xido eletroquimicamente. A) Limpeza do
sistema eletroqumico, onda triangular de potencial utilizado na voltametria
cclica da platina em H 2 SO 4 1M. B) Formao da camada de xido. ............. 48
Figura

2.9:

Esquema

explicativo

das

etapas

de

limpeza,

formao

verificao da camada de xido produzida eletroquimicamente. ................... 49

Cap tulo 3

Figura 3.1: Voltamograma cclico do eletrodo de platina em cido sulfrico


1 M......................................................................................................... 53
Figura 3.2: Voltamograma cclico do eletrodo de platina em ferri-ferrocianeto
de potssio 1mM. ..................................................................................... 54
Figura 3.3: Voltamograma cclico do eletrodo de platina em ferri-ferrocianeto
de potssio: (+) eletrodo de platina; ( ) eletrodo de platina modificado com
filme de xido, 61 C para a formao do filme. ........................................ 56
Figura 3.4: Corrente de pico andica (i p a ) versus carga para o eletrodo de
platina em uma soluo de ferri-ferrocianeto de potssio. ............................ 57
Figura 3.5: Diferena no potencial de pico (E p ) versus carga para o eletrodo
de platina em uma soluo de ferri-ferrocianeto de potssio. ....................... 57

vi

Figura 3.6: Grfico Nyquist do eletrodo de platina em ferri-ferrocianeto de


potssio: (+) eletrodo de platina; ( ) eletrodo de platina modificada com
filme de xido, 61 C para a formao do filme. ........................................ 58
Figura 3.7: Grfico de Bode ngulo de fase do eletrodo de platina em ferriferrocianeto de potssio: (+) eletrodo de platina; ( ) eletrodo de platina
modificada com filme de xido, 61 C para a formao do filme. ................ 59
Figura 3.8: R c t versus E p , R c t foi obtido da equao 3.5, onde: A=0,038 cm 2 ,
=valores tabelados, D O =D R =1,211x10 - 5 cm 2 /s para K 4 Fe(CN) 6 , v=50 mV/s,
C*=1mM, =0,5, n, F, R e T com seus valores usuais. ................................ 62
Figura 3.9: a) Zre versus carga, esses dados foram obtidos na frequncia de
25 Hz dos espectros de impedncia. b) Capacitncia versus carga, onde a
capacitncia dada por 1/Zim., esses dados foram obtidos na frequncia de
25 Hz dos espectros de impedncia. ........................................................... 63
Figura 3.10: a) modelo 1; b) ajuste entre a curva experimental de xido com
carga de 268 C ( )e o modelo (*). .......................................................... 65
Figura 3.11: a) relao da R c t obtida com o modelo 1 versus carga; b) relao
da C d l obtida com o modelo 1 versus carga. ................................................ 65
Figura 3.12: Comparao entre os valores obtidos de R c t ( ! ) com o modelo 1
e o previsto pela curva de trabalho apresentada na figura 3.8 (). ............... 66
Figura 3.13: a) o modelo 2; b) ajuste entre a curva experimental de xido
com carga de 268 C ( ) e o modelo 2(*). ................................................. 67
Figura 3.14: a) relao da R o x obtida com o modelo 2 versus carga; b) relao
da C o x obtida com o modelo 2 versus carga. ............................................... 67

vii

Figura 3.15: Comparao entre os valores obtidos de R c t ( ! ) e o previsto pela


curva de trabalho apresentada na figura 3.8 (). ........................................ 68
Figura 3.16: a) o modelo 3, b) ajuste entre a curva experimental de xido
com carga de 268 C ( ) e o modelo 3(*). ................................................. 69
Figura 3.17: a) relao da R o x obtida com o modelo 3 versus carga; b) relao
da C o x obtida com o modelo 3 versus carga. ............................................... 69
Figura 3.18: Comparao entre os valores obtidos de R c t ( ! ) e o previsto pela
curva de trabalho apresentada na figura 3.8 (). ........................................ 70
Figura 3.19: a) o modelo 4, b) ajuste entre a curva experimental de xido
com carga de 268 C ( ) e o modelo 4(*). .................................................. 71
Figura 3.20: a) relao da R o x obtida com o modelo 4 versus carga; b) relao
da C o x obtida com o modelo 4 versus carga. ............................................... 71
Figura 3.21: Comparao entre os valores obtidos de R c t ( ! ) e o previsto pela
curva de trabalho apresentada na figura 3.8 (). ........................................ 72
Figura 3.22: Log i p a versus carga, para o eletrodo de platina em uma soluo
de ferri-ferrocianeto de potssio. O coeficiente de correlao da reta de
0,84. ....................................................................................................... 77
Figura 3.23: Log R c t versus carga, os valores de R c t foram obtidos para o
modelo 4. ................................................................................................ 78
Figura 3.24: Log R c t versus carga, valores de R c t obtidos com o modelo 4
para camadas de xido formadas eletroquimicamente (); valor da carga para
as camadas de xido formadas quimicamente (). ....................................... 79
Figura 3.25: Grfico de Bode ngulo de fase para o eletrodo de platina em
uma soluo de ferri-ferrocianeto de potssio para uma camada de xido
viii

formada

quimicamente

(),para

uma

camada

de

xido

formada

eletroquimicamente com carga 1000 C ( - - - - ) e 50 C (-o-). ......................... 80


Figura 3.26: Resultado dos valores dos componentes eltricos obtidos com o
ajuste ao modelo 4. Os valores so resultado da mdia de 7 experimentos para
camada eletroqumica (carga mdia de 61 C) e 2 experimentos para camada
qumica. Colunas brancas para C o x e R o x e colunas cinzas para C d l e R c t .O
intervalo de confiana de 90%. ............................................................... 81

Figura

3.27:

Desenho

esquemtico:

a)

camada

de

xido

formada

quimicamente; b) camada de xido formada eletroquimicamente. ................. 82


Figura 3.28: a)Voltamograma cclico, b) Grfico Nyquist; para o eletrodo de
platina em uma soluo de ferri-ferrocianeto de potssio, () superfcie sem
xido recoberta com protena desativada; (o) superfcie com xido e recoberta
com protena desativada. .......................................................................... 83
Figura 3.29: a) ajuste entre a curva experimental da adsoro da con A na
forma desativada () e o modelo 4 (*); b) comparao entre os valores da R c t
obtidos com o modelo 4 para a con A adsorvida na forma: desativada sobre
xido eletroqumico (+), desativada sobre xido qumico (); ativada sobre
xido eletroqumico (*), ativada sobre xido qumico( ) e curva de trabalho
()......................................................................................................... 84
Figura 3.30: Resultados da adsoro da con A ativada e desativada sobre
xido qumico e eletroqumico, esses resultados so mdias de 7 experimentos
obtidos para os seguintes componentes do modelo 4: a) R c t ; b) R p r o . ............ 86
Figura 3.31: Resultados obtidos para a adsoro da con A ativada e
desativada sobre xido qumico e eletroqumico, esses resultados so mdias
de 7 experimentos obtidos para a componente C d l no modelo 4. ................... 87

ix

Figura 3.32: Variao da R c t com a carga, resultados obtidos para o eletrodo


de platina em ferri-ferrocianeto de potssio utilizando o modelo 4. .............. 87
Figura 3.33: R c t

(xido+protena)

versus carga para o eletrodo de platina exposto

30 min em con A desativada em ferri-ferrocianeto de potssio. .................... 88


Figura 3.34: Log R c t versus espessura da camada de xido (d), para o
eletrodo de platina em ferri-ferrocianetode potssio. ................................... 92
Figura 3.35: Desenho esquemtico da transferncia de eltrons atravs da
camada de protena e o tunelamento. ......................................................... 94

ndice de Tabelas

Tabela 1.1: Cdigo para descrio de circuitos do programa EQUIVCRT. .... 29


Tabela 3.1: Valores calculados para a espessura da camada de xido
utilizando as expresses 3.8 e 3.7.............................................................. 75
Tabela 3.2: Valores das componentes R p r o , C p r o R c t e C d l obtidos para a
adsoro da con A em diversas condies experimentais utilizando o modelo
4............................................................................................................. 85
Tabela 3.3: Valores do percentual de rea recoberta com protena obtida a
partir da carga Qads%, da voltametria cclica R c t % (VC) e impedncia R c t %
(IM). ....................................................................................................... 90
Tabela 3.4: Valores da espessura da con A utilizando a R c t e aplicando a
curva de trabalho mostrada na figura 3.34. ................................................. 93
Tabela 3.5: Valor da espessura da camada de con A obtida utilizando a
componente R p r o para vrias condies experimentais. ................................ 95
Tabela 3.6: Valor da espessura da con A obtida utilizando a componente C p r o
para vrias condies experimentais. ......................................................... 98
Tabela 3.7: Resultados mostrando o aumento relativo da resistncia do
carboidrato

em

relao

con

%R p r o ,

para

diversas

condies

experimentais. ...................................................................................... 100


Tabela 3.8: Valores das componentes R p r o , C p r o R c t e C d l obtidos para a
adsoro da lentil em diversas condies experimentais utilizando o modelo
4.......................................................................................................... 102

xi

Tabela 3.9: Valor da espessura da camada de lentil obtida utilizando a


componente R p r o para vrias condies experimentais. ............................. 103
Tabela 3.10: Distncia obtida para a conformao das cadeias da lentil obtida
utilizando a componente C p r o para vrias condies experimentais. ........... 104
Tabela 3.11: Resultados mostrando o aumento relativo da resistncia do
carboidrato

em

relao

lentil

%R p r o ,

para

diversas

condies

experimentais. ...................................................................................... 105

xii

Lista de S mbolos
A

rea do eletrodo (m 2 )

Aprotena

rea ocupada pela protena (m 2 )

capacitncia (F)

C*

concentrao no seio da soluo (mol/L)

Cdl

capacitncia da dupla camada (F)

Cox

capacitncia do xido (F)

Cpro

capacitncia da protena (F)

Cs

capacitncia em srie num circuito eltrico (F)

dmdia

espessura mdia da camada composta por regies recobertas com


protenas e outras com xido (m)

dxido

espessura de regies recoberta com xido (m)

DO e DR

coeficientes de difuso da espcie oxidada e reduzida (cm 2 .s - 1 )

dprotena

espessura de regies recoberta com protenas (m)

potencial (V)

E p

separao entre os picos catdicos e andicos (mV)

eT

queda do potencial atravs de um circuito eltrico (V)

constante de Faraday ( 9,65x10 4 C/equiv).

ia

corrente andica (A)

ic

corrente para o processo capacitivo (A)

if

corrente para o processo faradaico (A)

io

corrente de troca (A)

ipa

corrente de pico andica (A)

ka

fator pr-exponencial, no modelo de Damjanovic, dependente da


escolha do eletrodo de referncia

constante heterognea de velocidade (cm.s - 1 )

Da

dalton, unidade de massa muito prxima do tomo de hidrognio

indutncia (H)

xiii

parmetro experimental determinado no modelo de Damjanovic


por (E/q) i (VC - 1 m 2 )

nmero total de eltrons transferidos

carga (C) no modelo de Damjanovic equivalente espessura do


filme ou a largura da barreira para o tunelamento

Qads%

percentual

da

superfcie

recoberta

com

protena

dada

pela

carga (%)
Q(sem protena)

carga obtida integrando-se no voltamograma cclico a rea sob os


picos de ferri-ferrocianeto de potssio (C/m 2 )

Q ( c o m p r o t e n a ) carga obtida integrando-se no voltamograma cclico a rea sob os


picos de ferri-ferrocianeto de potssio aps a adsoro da
protena (C/m 2 )
R

constante dos gases ( 8,31 J.mol - 1 .K - 1 )

resistncia ()

Rcar

resistncia do carboidrato somada a resistncia da protena e


ainda se presente somada a resistncia do xido ()

Rct

resistncia de transferncia de eltron ()

Rct%

percentual da superfcie recoberta com protena, dada pela


resistncia (%)

Rox

resistncia do xido ()

Rpro

resistncia

da

protena

somada

resistncia

do

xido

se

presente ()
%R p r o

aumento relativo da resistncia (%)

Rs

resistncia em srie em um circuito equivalente ()

resistncia hmica oferecida pela soluo no transporte dos ons


entre o eletrodo de trabalho e o de referncia ()

temperatura (K)

tempo (s)

Xc

reatncia capacitiva, 1/C. ()

impedncia ()

Zf

impedncia faradaica ()

Zim

componente

capacitiva

ou

imaginria

na

medida

de

xiv

impedncia ()
Zre

componente resistiva ou real na medida de impedncia ()

ZW

impedncia de Warburg que indica a resistncia na transferncia


de massa ()

coeficiente de transferncia

fator de simetria que est relacionado a

parmetro determinado experimentalmente utilizado no modelo de


Damjanovic dado por 2(lni/d) ( - 1 )

constante

dieltrica

do

material

que

est

na

interface

eletrodo/soluo
o

constante de permissividade do vcuo (8,85 x 10 - 1 2 F. m - 1 )

potencial de Galvani (V)

potencial no equilbrio (V)

sobrepotencial (V)

velocidade de varredura na voltametria cclica ( V.s - 1 )

ngulo de fase que mostra a defasagem entre a tenso e a corrente


(Hz)

coeficiente de Warburg (.s - 1 / 2 )

resistividade (.cm)

frequncia angular da onda senoidal (rad.s - 1 )

parmetro cintico adimensional da voltametria cclica associado


a E p

xv

Resumo
O objetivo deste trabalho foi estudar a interface platina/lectina utilizando
mtodos

impedimtricos.

Lectinas

pertencem

um

grupo

de

protenas

com

especificidade a carboidratos, caracterstica que ampliou o foco da tese tambm para a


interao da protena e o carboidrato.
Neste trabalho foi verificado que as lectinas, concanavalina A e lentil,
adsorvem espontaneamente sobre a platina e esse processo fortemente afetado pela
presena de xido. Essa forte adsoro, ocasionada pela modificao da superfcie com
um filme de xido, foi constatada na voltametria cclica pelo bloqueio da superfcie
que praticamente suprimiu os picos de xido-reduo do ferri-ferrocianeto de potssio.
Na espectroscopia de impedncia houve um aumento de pelo menos 10 vezes na
componente resistiva do sistema.
A adsoro da protena foi explicada por um modelo que prev uma camada
contnua, porm, permevel. Nesse modelo o parmetro definido como resistncia da
protena informa a quantidade de protena adsorvida. Os resultados mostraram que em
uma superfcie sem xido a adsoro est associada formao de uma monocamada e
sobre uma superfcie modificada com xido a adsoro foi associada formao de
multicamadas de protena. O valor encontrado para uma monocamada de concanavalina
A foi de 28 e para a lentil de 20 , no se observando uma diferena significativa
entre as forma ativada e desativada das mesmas. Na formao de multicamadas, o valor
da espessura para a forma ativada da concanavalina A de 108 e para desativada de
277 , para a lentil foram respectivamente de 84 e 239 . Neste caso, a diferena
obtida entre a forma ativada e desativada foi atribuda presena dos sais de ativao,
clcio e mangans, que proporcionam uma estrutura mais compacta protena ativada.
O parmetro associado capacitncia da protena pde ser relacionado conformao
da mesma, os resultados mostraram que sobre uma superfcie com xido a protena
adsorve em uma conformao mais compacta.
A sensibilidade da concanavalina A, adsorvida sobre uma superfcie com xido,
foi verificada frente glicose, glicognio e galactose e observou-se que esta mais
sensvel a glicose, acar para o qual especfica e menos sensvel a galactose, acar
para o qual no especfica. Esse resultado mostra que a protena retm sua
especificidade e seletividade mesmo quando adsorvida. Para a lentil, apenas foi
verificada a sensibilidade frente ao glicognio e que relativamente a con A apresentou
uma sensibilidade menor.

xvi

Abstract
The aim of this work was to study the platinum/lectin interface by
impedimetric

methods.

Lectins

belong

to

group

of

proteins

specific

to

carbohydrates. This characteristic also amplified the focus of this thesis to the
protein-carbohydrate interaction.
In

this

work

was

verified

spontaneous

adsorption

of

the

lectins,

concanavalin A and lentil, and this process is strongly affected by the presence of
an oxide film. Cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy
yielded measurable response to this strong adsorption, improved by the presence of
the

oxide

film.

The

first

technique

shows

decrease

of

the

peaks

of

ferricyanide/ferrocyanide and the second a 10 fold increase in the resistive


component.
The model to explain the protein adsorption was that of a continuous, but
permeable layer. The protein resistance, extracted from this model, indicates the
amount of protein adsorbed. The results show that the protein adsorption forms a
monolayer when no oxide is present and a multilayer when oxide is present. A
monolayer of concanavalin A was estimated to be about 28 and and for the lentil
to be about 20 no distinction was made between the activated or deactivated form
of the lectin. For multilayers the thickness of the concanavalin A and lentil were of
108 and 84 for the activated form and 277 and 239 for the deactivated
form. The reason for the difference between the activated and deactivated form is
explained due to the presence of calcium and manganese salts, which confer to the
protein a higher compactness. The capacitance of the protein is related to
conformational changes, in this way, protein adsorption over surfaces modified by
oxide films displays a more compact conformation.
The interactions of concanavalin A with glucose, glycogen and galactose
have been investigated. The protein, in this case, was adsorbed over a surface
covered with an oxide film. The results show that the protein is more sensible to
glucose, carbohydrate for which it is specific, and less sensible to galactose,
carbohydrate for which it is not specific. In this manner, the protein retains its
specificity and selectivity even when adsorbed. For the lentil, only was verified the
interaction with glycogen and comparatively to concanavalin A, lentil was less
sensible.

xvii

___________________________________________________________________ Introduo

CAPTULO 1
1) INTRODUO

Existe um grande interesse em se conhecer mais amplamente interaes


de protenas com slidos metlicos para o desenvolvimento de materiais
biocompatveis 1, 2. Exemplos dessas interaes so vistas em prteses sseas 3,
dentrias 4, transplantes, equipamentos na industria alimentcia 5 e sensores 6, 7.
No entanto, observa-se nessas interfaces, um desgaste dos materiais por
corroso 8, incrustao 9 ou ainda no caso das prteses e transplantes, a
rejeio 10, 11. Esses efeitos despertaram a ateno para a necessidade de se
compreender melhor a interface protena/metal para assim se poder evitar ou
pelo menos minimizar esses problemas.
Os objetivos da tese foram ento estabelecidos em duas frentes: uma
entender melhor a interao de uma protena com um eletrodo slido e a outra
verificar a aplicabilidade da espectroscopia de impedncia como mtodo de
deteco em sensores. Visando-se esses objetivos escolheu-se uma protena
pertencente famlia das lectinas que possui especificidade a carboidratos. A
1

___________________________________________________________________ Introduo
especificidade da lectina permite que a pesquisa tambm seja direcionada ao
desenvolvimento de sensores. Nesse caso a interao lectina/carboidrato no
envolve transferncia de eltrons, que seria um requisito indispensvel na
deteco eletroqumica usual (potenciomtrica ou amperomtrica), por isso,
utilizou-se a espectroscopia de impedncia, que uma tcnica sensvel a
fenmenos interfaciais. Alm disso, esse tipo de interao semelhante s do
tipo

antgeno/anticorpo,

interao

que

atualmente

empregada

em

imunoensaios realizados por dispositivos que utilizam esses princpios no


ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays), tcnica eficiente, no entanto
cara e demorada. Esforos vm sendo feitos na procura de um imunosensor
que efetue a deteco de forma direta e contnua.
No incio da investigao cogitou-se a necessidade de se imobilizar a
protena ao eletrodo por meio de um agente qumico, no entanto, esse
procedimento foi dispensado depois de se verificar que a lectina adsorvia
espontaneamente ao eletrodo, a seguir veio a tarefa de obter-se superfcies
reprodutveis uma vez que a medida da impedncia se mostrou sensvel aos
procedimentos do preparo da superfcie. A adsoro da lectina foi verificada
em ouro, carbono vtreo e platina, dentre esses metais a platina foi escolhida
como superfcie trabalho. Com a finalizao dessas etapas e visando verificar
qual o efeito na adsoro da protena, props-se a modificao da superfcie
da platina com um filme de xido. Verificou-se a sensibilidade e a
seletividade da protena adsorvida sobre platina e platina modificada com um
filme de xido frente ao glicognio, glicose e galactose.
Paralelamente foi necessrio desenvolver um mtodo para interpretar os
eventos que ocorriam na interface eletrodo/soluo e a forma como seriam
apresentados, isto , transformar a medida da impedncia, numa grandeza de
fcil compreenso como, por exemplo, a medida da corrente e potencial.
No

primeiro

captulo

da

tese

sero

apresentados

conceitos

informaes sobre a adsoro de protenas, lectinas, filme de xido de platina


e

espectroscopia

de

impedncia.

No

segundo

captulo

ser

feita

apresentao dos mtodos experimentais, no terceiro captulo a apresentao


dos resultados e discusses e finalmente no quarto captulo, as concluses.

__________________________________________________________ Adsoro de Prote nas

1.1) Adsoro de Prote nas

A adsoro de protenas a interfaces tem resultado em numerosas


aplicaes, como por exemplo, no desenvolvimento de biosensores, na
separao de protenas por cromatografia, como emulsificante, na indstria
farmacutica e cosmtica, no processamento de alimentos. Existem tambm
consequncias negativas desse processo, como a incrustao e/ou corroso
nos equipamentos industriais de processamento de alimentos; entupimento das
membranas de dilise renais devido afinidade superficial das protenas, a
formao de placa dentaria, rejeio em prteses sseas e em transplantes de
rgos.
Protenas so molculas muito grandes resultantes da combinao de
aminocidos. Os aminocidos tm vrios tipos de cadeias laterais com
naturezas fsico-qumicas diferentes. Algumas destas cadeias laterais contm
hidrocarbonetos tais como a valina, leucina, iso-leucina, outras contm
grupos cidos como o cido glutmico, cido asprtico, e ainda outras com
grupos bsicos como a lisina, arginina e histidina. , portanto uma tendncia
natural das protenas se associarem com quase todas as superfcies, dada a
variedade de grupos (polares e apolares) presentes em sua estrutura.
Dois aspectos importantes so investigados na adsoro de protenas, as
mudanas conformacionais originadas pela adsoro e a quantidade de
protena adsorvida 12.
A orientao e conformao das molculas adsorvidas determinam a sua
atividade biolgica por isso de grande interesse determinar a configurao
da protena adsorvida e como essas so influenciadas pela superfcie. Elas
podem desdobrar-se ou desnaturar-se devido quebra de ligaes internas que
seguram as cadeias dos aminocidos em uma dada conformao. A facilidade
da protena desnaturar sobre uma superfcie depende das propriedades da
superfcie e pode ser tomada como medida das interaes entre uma dada
protena e uma dada superfcie. A desnaturao de protenas uma das causas
para a maioria dos materiais no poder ser incorporado em tecidos biolgicos
sem causar reaes indesejveis.

__________________________________________________________ Adsoro de Prote nas


A quantidade de protena adsorvida influenciada por vrios fatores
dados pelas propriedades 13 da mesma e da superfcie do substrato. As
protenas

com

alta

estabilidade

interna,

chamadas

protenas

duras,

adsorvem pouco sobre superfcies hidroflicas, a no ser por foras de atrao


eletrostticas, enquanto sobre superfcies hidrofbicas, a adsoro ocasiona
mudanas estruturais. Por outro lado, protenas com menor estabilidade
interna, denominadas protenas moles, tendem a adsorver em todas as
superfcies,

independente

de

foras

eletrostticas,

ajustando

sua

conformao a superfcie.
Geralmente a espessura de uma camada adsorvida de uma monocamada 14,
no entanto a estrutura detalhada da camada complicada, depende do tipo de
protena e do tipo de superfcie. As protenas podem aderir umas sobre as
outras formando multicamadas 1 de espessura ilimitada, a no ser que a adio
de uma nova monocamada represente um rearranjo eletrosttico muito alto.
Contudo a adsoro pode induzir a mudanas conformacionais que alterem a
distribuio de carga e ligaes de hidrognio. Portanto, tambm afetando a
capacidade da protena ligar-se a outra protena, permitindo assim a formao
de multicamadas. Isso foi verificado com protenas bem flexveis, mas de
modo geral a formao de uma monocamada a regra.
A maioria das protenas globulares tm a forma de uma elipse 1 7 , o que
permite dois tipos de configuraes para a adsoro, uma lateral ou paralela
(com o eixo mais longo da protena voltada para a superfcie) e a outra frontal
ou perpendicular (com o eixo menor voltado para a superfcie). Algumas
vezes o tipo de configurao 15 estimado simplesmente a partir da quantidade
de protena adsorvida.
A quantidade mxima de protena adsorvida geralmente em torno do ponto
isoeltrico 16,

devido

uma

repulso

menor

tanto

internamente

como

lateralmente entre as molculas adsorvidas.


Existe

tambm

uma

correlao 17 entre

adsoro

mxima

concentrao da protena, quanto maior a concentrao em soluo da


protena, maior a adsoro mesmo que a adsoro seja irreversvel. Trs
diferentes interpretaes foram propostas para esse fato:

__________________________________________________________ Adsoro de Prote nas


1) A protena adsorve em mais de uma orientao: A molcula tende a
maximizar o contato com a superfcie para fixar mais firmemente saindo da
forma perpendicular para a paralela, mas isso s acontece se nas proximidades
no houver outra molcula. Assim em uma alta concentrao a orientao
favorecida aquela perpendicular superfcie, veja a figura 1.1.

Protena

Superfcie
Adsoro lateral

Aumento na
concentrao

Adsoro frontal

Figura 1.1: Correlao entre o aumento da concentrao e a configurao da


protena adsorvida.

2) A protena forma uma estrutura bidimensional ordenada: A protena na


superfcie pode cristalizar num arranjo mais prximo e ordenado do que se
depositar ao acaso. Uma concentrao mais alta favorece a nucleao dos
cristais enquanto em baixas concentraes de protena estas encontram amplo
espao para se acomodar em uma configurao mais achatada.

3) A protena pode desnaturar devido interao com a interface, o que


essencialmente similar ao processo de reorientao da protena. A protena
pode desnaturar tendo mais espao pra relaxar sobre a superfcie e ao mesmo
tempo esse processo pode ser bloqueado pela chegada de outras molculas
vizinhana.

__________________________________________________________ Adsoro de Prote nas

Prote
1.1.2) Efeitos que Influenciam a Interao Entre a P rote na e
a Superf cie S lida

1.1.2.1) Efeito de Carga

Quando a superfcie adsorvente dotada de carga 1 6 a massa adsorvida


cresce com o aumento do contraste de carga entre a superfcie e a protena. A
presena de eletrlitos em soluo favorece a separao dessas cargas, tanto
que geralmente o aumento da fora inica ocasiona um aumento na quantidade
de protena adsorvida. A influncia da concentrao do eletrlito no
facilmente explicada, mas quando esse efeito presente diz-se que a adsoro
determinada por interaes internas ou entre molculas da protena.
Direcionando a discusso apenas para a presena de carga na protena.
Observa-se que a adsoro maximizada na regio isoeltrica 18 da protena,
que pode ser explicada pela minimizao da repulso intra e intermolecular
prximo interface. A estabilidade das protenas globulares decresce com o
aumento da carga lquida na molcula e assim mudanas estruturais podem
ocorrer

quando

adsoro

ocorre

longe

do

ponto

isoeltrico.

distanciamento do ponto isoeltrico ocasiona a reduo na adsoro, o que


explicada devido a um rearranjo estrutural da protena e tambm a repulso
lateral entre as protenas adsorvidas. Apesar dessa caracterstica ser freqente
entre as protenas no uma regra, como por exemplo, a ribonuclease adsorve
em toda a superfcie hidrofbica independente da carga; sobre superfcies
hidroflicas somente se houver atrao eletrosttica.
Do ponto vista macroscpico, protenas moles adsorvem em uma
superfcie mudando a sua estrutura para se adaptar a superfcie. E protenas
duras adsorvem em superfcies com carga oposta com pouca mudana
estrutural a no ser por uma forte interao hidrofbica.

__________________________________________________________ Adsoro de Prote nas


1.1.2.2) Efeito Hidrofbico

O termo interao hidrofbica se refere a desidratao espontnea e a


subseqente agregao de componentes apolares em um meio aquoso. Essas
interaes so caracterizadas por um grande aumento na entropia e um efeito
relativo pequeno na entalpia.
A tendncia de grupos apolares, hidrofbicos 1 2 de uma protena
globular, em resistir ao contato com o ambiente aquoso faz com que a
protena adquira uma conformao que proteja esses grupos desse contato. A
adsoro da protena facilitada em superfcies isentas de gua, no entanto
pode ocorrer a desidratao espontnea de partes da protena promovidas pelo
ganho da entropia, e, portanto, a adsoro ocorre espontaneamente.
Foi observado que a hidrofobicidade da superfcie causa mudanas
estruturais mais pronunciadas na protena. Em superfcies hidrofbicas existe,
portanto uma fora atuando na protena tentando girar (virar a direo) desses
terminais para a superfcie.
O carter hidrofbico ou hidroflico de uma superfcie pode ocasionar
uma diferente orientao 19 na protena no momento de sua adsoro.

1.1.2.3) Efeito da Temperatura

A estrutura da protena drasticamente afetada pela temperatura 20. Por


isso a temperatura tem uma grande influncia na isoterma de adsoro. No
existe uma regra para o efeito da temperatura atuar na quantidade de protena
adsorvida, depende das mudanas estruturais sofridas pela mesma.

_____________________________________________________________________ Lectinas

1.2) Lectinas

A pesquisa das lectinas 21, 22 tem o seu incio desde o final do sculo
XIX,

quando

em

1888-1889

Hermann

Stillmark 23,

estava

estudando

toxicidade das sementes de Ricinus communis (mamona), motivado pelos


problemas causados por essa planta aos animais. Ele observou que o extrato
dessas

sementes

quando

misturado

ao

sangue,

aglutinava

as

clulas

vermelhas, ou seja, a hemaglutinao. Ele demonstrou ainda, que o material


que promovia essa aglutinao era uma protena, que foi denominada de
ricina.
O termo lectina se origina do latim lectus que significa selecionado,
escolhido, mas antes de ser utilizado para definir um grupo de substncias,
outros

termos

definio

24

foram

empregados,

como

por

exemplo:

aglutininas.

hoje para essas substncias que so protenas ou glicoprotenas

de origem no imunolgica que apresentam um ou mais stios de ligao para


carboidratos.
As lectinas foram isoladas de plantas, animais e microorganismos e que
apesar delas possurem muitas propriedades em comum, representam um
grupo

bastante

diversificado

de

protenas

com

respeito

ao

tamanho,

composio e estrutura. Neste estudo a ateno direcionada as lectinas


provenientes das leguminosas.

1.2.1) Lectinas Leguminosas

A famlia das lectinas leguminosas 25 a maior e mais amplamente das


famlias estudada, onde 100 membros foram caracterizados, quase todos
isolados de sementes.
Tipicamente as lectinas derivadas das leguminosas so constitudas por
2 ou 4 subunidades idnticas ou pelo menos quase. Cada subunidade com 25 a
30 KDa, com um stio especfico a carboidrato, dois stios para os ctions
8

_____________________________________________________________________ Lectinas
divalentes clcio e mangans, esses metais so fundamentais para a ligao do
carboidrato. Alm disso, muitas lectinas possuem stios hidrofbicos 26 que
ligam compostos no polares tais como a adenina e o cido indolactico.
As subunidades das lectinas leguminosas so normalmente compostas
por cadeias simples de polipeptdeos com cerca de 250 aminocidos.
A concanavalina A e a lentil, so lectinas pertencentes a famlia das
leguminosas, ambas so especficas a manose/glicose e sero apresentadas em
maiores detalhes respectivamente nas sees 1.2.1.1 e 1.2.1.2.

1.2.1.1) Concanavalina A

A primeira lectina obtida de forma pura, foi isolada de extratos da


Canavalia ensiformis 2 2 (feijo de porco), denominada de concanavalina A (ou
con A). A concanavalina A, foi isolada em 1919 por James Summer, mas
somente em 1936, Summer e Howell 27, verificaram que ela precipitava
glicognio em soluo e que sua atividade hemaglutinante era inibida pela
cana de acar. Esse teste verifica a capacidade da lectina aglutinar
eritrcitos e como essa propriedade pode ser inibida por carboidratos, no caso
da con A, demonstrou-se a sua especificidade por manose/glicose.
A con A existe como um dmero, no pH 5,0 de peso molecular 55000 e
composto por duas subunidades idnticas 28. No pH 7, passa de uma forma
dimrica para uma tetramrica com um peso molecular de 110000. As
subunidades tm a forma de uma elipse com as seguintes dimenses 42 x 40 x
39 .
A

estrutura

molecular 29 consiste

de

duas

folhas

antiparalelas

pregueadas, uma com 6 fitas, com a forma quase plana e a outra com 7 fitas,
com a forma cncava. No esto presentes -hlices. Cerca de 50% dos
resduos se encontram nas regies dos loops e nas voltas que conectam as
fitas. Os stios especficos ao carboidrato e aos ons metlicos localizam-se
no topo de cada subunidade. A forma cncava da folha, aquela composta por 7
fitas, fornece um stio raso e de fcil acesso ao carboidrato. O clcio e o

_____________________________________________________________________ Lectinas
mangans esto afastados entre si em 4,25 , estes metais so ligados a
quatro aminocidos e 2 molculas de gua, conforme representado na figura
1.2. Os aminocidos que coordenam o clcio protena so o cido asprtico
(Asp 208) e a asparagina (Asn 14) que tambm formam ligaes de hidrognio
com o monossacardeo. Da a importncia desses metais, que auxiliam a
posicionar os aminocidos para receber o monossacardeo (sem, no entanto se
ligarem diretamente ao mesmo) e auxiliam a manter a integridade da
subunidade.

Tir 100

Asp 208

O
Asp 10

Ca2+

4,3

C
Asp 19

O2

O5

O O

Mn2+

NH2

O6

OH 2 H

Leu 99

1O

Asn 14

CH3

Arg 228

Tir 12
8,2

Figura

1.2:

Representao

da

localizao

dos

ons

Ca 2 +

Mn 2 +

na

concanavalina A e a sua interao com um carboidrato (metil-manose).

1.2.1.2) Lentil

A lentil obtida da leguminosa Lens culinaris, ou popularmente


lentilha, a sua atividade hemaglutinante foi identificada em 1908 por

10

_____________________________________________________________________ Lectinas
Lansteiner e Raubitschek 30. A lentil e a con A fazem parte do grupo especfico
a glicose/manose, embora entre elas existam algumas diferenas quanto
sensibilidade frente a esses acares. A con A comparada a lentil apresenta
maior sensibilidade 31, 32 a glicose e manose, no entanto a inverso dessa
caracterstica foi observada com a frutose.
A lentil na forma dimrica 33 constituda por uma cadeia (leve) e
outra (pesada) e similarmente a con A tambm necessita dos ons metlicos
clcio e mangans para reter a atividade biolgica. O peso molecular 34 gira em
torno de 42000, apresenta uma estrutura compacta em pH neutro formada
principalmente por folhas .

1.2.3) Interao da Lectina e o Carboidrato

A interao 35 entre a lectina e o carboidrato segue um modelo do tipo


chave-fechadura como ocorre para a enzima e o seu substrato. A formao do
complexo envolve o deslocamento de molculas de gua associada a grupos
polares da protena com a regio de alta polaridade do acar, com o
estabelecimento de novas ligaes de hidrognio, estas ltimas e os contatos
de van der Waals so foras dominantes na estabilidade das ligaes. As
ligaes de hidrognio so formadas entre os grupos hidroxila do acar e os
grupos NH e tomos de oxignio da protena.
Na con A assim como nas demais lectinas 36 de leguminosas existem trs
aminocidos sempre presentes e invariantes para a ligao do carboidrato: um
aspartato (Asp 208), uma asparagina (Asn 14) e uma Arginina (Arg 228), em
outras lectinas a arginina substituda por uma glicina, independente da
especificidade. Os cidos asprtico e a asparagina tambm participam na
coordenao do on clcio, presente em todos os membros dessa famlia, o
que explica a necessidade desse on para a ligao do carboidrato.
Os trs aminocidos envolvidos na ligao do carboidrato esto
presentes em todas as lectinas leguminosas e tm uma disposio espacial
idntica,

discriminao

entre

os

monossacardeos

ocorre

porque

os
11

_____________________________________________________________________ Lectinas
monossacardeos (manose/glicose) so orientados de forma diferente da
galactose. Por exemplo, na con A, a ligao da manose/glicose orientada de
tal forma que o cido asprtico faa duas pontes de hidrognio com o OH-6 e
OH-4 do acar e a asparagina uma ligao entre o NH e o OH-4 do acar
enquanto para uma lectina especfica a galactose, o cido asprtico faz duas
pontes de hidrognio com OH-3 e OH-4 do acar e a asparagina uma ligao
entre o NH e o OH-3 do acar. Como esperado as lectinas especficas a
manose/glicose no formam ligaes em OH-2 justamente a hidroxila que
diferencia esses dois acares. claro, portanto, que os aminocidos de
contato no so necessariamente os maiores determinantes na especificidade,
mas a composio e a precisa disposio dos aminocidos que envolvem o
stio combinatrio. Pequenas mudanas na estrutura do stio podem, portanto
resultar em uma grande mudana na especificidade da protena.

1.2.4) Aplica es das Lectinas

Lectinas podem ser utilizadas para explorar superfcies celulares pela


sua afinidade pela poro carboidrato das glicoprotenas e glicolipdeos
projetados na clula. Glicoprotenas e glicolipdeos so molculas complexas
que esto presentes na superfcie celular e que esto intimamente envolvidas
em fenmenos importantes como nas interaes entre bactrias, vrus e
clulas cancerosas 37. No campo da glicobiologia, estas interaes carboidratoprotena tm sido foco de intenso interesse na ltima dcada, especialmente
no desenvolvimento de mtodos para a caracterizao de estruturas complexas
de carboidratos 38 em superfcies celulares. A interao entre uma lectina e um
carboidrato uma maneira controlada de se investigar uma superfcie celular,
o que pode ser uma ferramenta para se obter informaes nessa rea da
biologia.
As lectinas so teis como matrizes em colunas de cromatografia para a
separao

caracterizao

de

glicoprotenas,

glicolipdeos

12

_____________________________________________________________________ Lectinas
oligossacardeos 39, 40, 41. Estudo histoqumico de clulas e tecidos, rastreamento
de caminhos neurais, tipagem sangunea 42, 43.
Alm disso, as lectinas so excelentes modelos para examinar reaes
especficas que ocorrem entre protenas e outros tipos de molculas, como por
exemplo,
protena

as

6 , 3 9 , 44, 45,

ligaes

antgeno-anticorpo,

substrato-enzima,

droga-

1.2) Filme de xido de Platina

A formao de um filme de xido sobre a platina teve um grande


impacto na adsoro das lectinas estudadas. A diferena observada na
afinidade dessas protenas pela superfcie motivou o estudo da interface
platina/xido de platina/protena. Na literatura encontram-se trabalhos que
relatam vantagens da adsoro de protenas sobre xido de titnio 46, xido de
zinco 47 e xido de alumnio 48. comentado que as interaes em tais filmes
so principalmente de origem eletrostticas, e observou-se que nessas
superfcies

adsoro

rpida,

com

alta

estabilidade,

impedindo

desnaturao da protena.
A formao de xidos sobre eletrodos de platina e outros metais nobres
um assunto bastante estudado devido importncia dessas superfcies para
as reaes catalticas como, por exemplo, na evoluo de O 2 e Cl 2 , para a
eletroorgnica no estudo de reaes andicas, pois esses filmes podem afetar
a cintica dos processos de transferncia de eltrons.
O mecanismo de formao da camada de xido tem algumas propostas e
estas variam conforme a espessura do filme e condies de formao desse
mesmo filme. Para filmes finos de xido, apresenta-se no esquema 1, um
mecanismo proposto por Kozlowska, Conway e Sharp 49.

13

_________________________________________________________________ Filme de xido


Esquema 1:

Na etapa quase reversvel (I) da eletrodeposio do OH sobre a Pt pode


ocorrer a formao do PtO mostrado em (II). As etapas (III) e (IV) so
possibilidades da espcie O e/ou OH sofrer um rearranjo com a estrutura da
Pt, esse rearranjo tanto pode ser uma reconstruo da superfcie ou uma troca
de posio entre as espcies O e OH com a Pt. As etapas (VI) e (VII) se
referem a reduo da camada de xido. De uma forma geral filmes de xidos
formados eletroquimicamente envolvem a Pt no estado de oxidao 2 +
correspondendo formao do PtO.
Para filmes formados a potenciais 50 mais altos (acima de 2-3 V/NHE)
existe um consenso de que espcies Pt(IV) so predominantemente formadas,
na forma de PtO 2 , Pt(OH) 4 ou ainda estas formas hidratadas. A potenciais
mais baixos, a interpretao mais difcil e formas como PtO a d s ., Pt(OH) 2 ,
PtO e PtO.H 2 O podem ser formadas, mas a maioria concorda que espcies Pt 2 +
esto presentes.
A

formao

reduo

de

camadas

de

xido

produzidas

eletroquimicamente geram uma histerese entre a corrente de formao em


funo do potencial e a corrente de reduo, onde quanto mais positivo o
potencial (e/ou o tempo) para a formao de um filme xido, menos positivo
o potencial de reduo. Este comportamento reflete o aumento da estabilidade
do filme formado a potenciais oxidativos mais altos e no se aplica somente a
monocamada de xido, 2-D de OH ou O, reconstruda, mas tambm ao
filme

mais

extenso

quase

3-D

que

pode

ser

formado

potenciais

substancialmente mais elevados.


No modelo de Mott-Cabrera 51 proposto que o metal recoberto por um
filme de espcies adsorvidas contendo oxignio e que ons e eltrons se
movem independentemente no filme; os eltrons passam do metal para as
14

_________________________________________________________________ Filme de xido


espcies adsorvidas atravs de um processo de tunelamento. Em conseqncia
desse processo, um forte campo eltrico estabelecido atravs da interface
xido/metal e este responsvel por injetar ctions metlicos da superfcie
metlica atravs do filme. O modelo consta de duas etapas: a primeira a
formao de ons metlicos na interface metal/xido; e a segunda etapa, a
migrao desses ons atravs do filme.
O primeiro mecanismo proposto (Kozlowska, Conway e Sharp) sugere
que o crescimento do filme ocorre num processo de troca entre o metal e
oxignio e assim sucessivamente enquanto o segundo, de Mott-Cabrera,
sugere o deslocamento do on metlico, motivado por um campo eltrico.
Leis para explicar o crescimento desses filmes tambm foram propostas,
mas

surgiram

algumas

controvrsias,

pois

filmes

com

diferentes

caractersticas eram obtidos inclusive com diferentes espessuras. Atualmente


se tem conhecimento de que esses filmes podem ser constitudos por dois
tipos de estruturas 52: a primeira que atinge um limite de crescimento, um
filme tipo 2-D que se estende por uma a duas monocamadas; e a segunda
estrutura, um filme tipo 3-D que no tem limite para o crescimento.
Damjanovic 53 pesquisou detalhadamente a reao de evoluo de
oxignio sobre a platina e props a seguinte equao 1.1 para a velocidade de
reao:
V
i = i0 exp

{1.1}

Onde, i o corrente de troca, o coeficiente de transferncia, d a


espessura do filme e V=(V-V o ) o campo interno ao filme de xido, V o o
potencial onde d=0.
A equao 1.1 se baseia no mecanismo de Mott-Cabrera, nesse
caso, o potencial para a formao do xido mais alto e o grau de
recobrimento

da

superfcie

maior

do

que

discutido

no

modelo

de

Kozlowska, Conway e Sharp. Deste modo, as espcies geradas no so to


facilmente reduzidas, pois provavelmente o grau de reconstruo muito

15

_________________________________________________________________ Filme de xido


maior e existe a possibilidade de uma completa irreversibilidade nas etapas de
formao/reduo do xido.

1.4) Espectroscopia de Impedncia

A espectroscopia de impedncia uma tcnica conhecida por ser


bastante sensvel s modificaes que ocorrem na interface eletrodo/soluo e
a adsoro de protenas ocorre nessa interface, por isso, essa tcnica foi
escolhida para o monitoramento desse processo.
A impedncia, de forma generalizada, a medida de uma resistncia.
Observa-se

desse

modo

que

os

fenmenos

que

ocorrem

na

interface

eletrodo/soluo sero interpretados utilizando-se elementos eltricos, tais


como: resistores e capacitores. Ento para se fazer uma boa conexo entre os
conceitos fsico-qumicos e eltricos se far uma breve reviso de alguns
conceitos bsicos.

Conceitos
1.4.1) Conceito s Bsicos
Antes de se falar propriamente da espectroscopia de impedncia se far
uma breve reviso do comportamento de uma tenso senoidal em circuitos
eltricos contendo um resistor e/ou um capacitor. 54
Considere uma tenso do tipo:
e = Esen(t)

{1.2}

onde,
E a amplitude da onda (Volt).
a frequncia angular (rad.s - 1 )
t tempo (s).

16

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

Em um circuito eltrico contendo somente um elemento resistivo, figura 1.3,

Figura 1.3: a) Circuito eltrico puramente resistivo.b) Relao entre a


voltagem e a corrente em um circuito resistivo. c) Mostra a mesma relao
de b, porm na forma de vetores .

a queda do potencial, e T , atravs do circuito apresentado ser dado por:

e T = R.i

{1.3}

Isolando a corrente e substituindo a tenso obtm-se,

i = E/Rsen(t)

{1.4}

Observa-se que num circuito puramente resistivo, a tenso e a corrente esto


em fase, figura 1.3b-c, diferindo apenas na amplitude por um fator de 1/R,
visto na equao 1.4.

Em um circuito eltrico contendo somente um elemento capacitivo, figura


1.4,

17

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

Figura 1.4: a) Circuito eltrico puramente capacitivo. b) Relao entre a


voltagem e a corrente em um circuito puramente capacitivo.c) Mostra a
mesma relao de b, porm na notao de vetores.

a queda de potencial no circuito da figura apresentado ser dado por:


e T = q/C

{1.5}

Para se obter a corrente, deriva-se a equao 1.5 e substitui-se a tenso:


i = CEcost

{1.6}

i = CEsen(t + /2)

{1.7}

ou

Definindo-se X c = 1/C , como reatncia capacitiva.


i = E/X c sen(t + /2)

{1.8}

Observa-se que em um circuito puramente capacitivo a tenso e a corrente


diferem na amplitude por um fator de 1/X c . A reatncia capacitiva um tipo
de resistncia, pois tem unidade de ohm, mas que difere das resistncias
comuns por variar com a frequncia. Na equao 1.8 verifica-se que a
corrente precede a voltagem por um fator de /2, fato ilustrado na figura 4b.
Para a representao vetorial, mostrada na figura 1.4c, a componente na
ordenada, multiplicada por j = 1 , tambm denominada de imaginria. A
componente na abcissa denomina-se de real.

18

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

Em um circuito eltrico em que se combina um resistor e um capacitor em


srie tem-se que a queda de potencial dada por:
eT = eR + eC

{1.9}

expressando apenas a amplitude da equao acima, obtm-se:


E = i(R - jX c )

{1.10}

E = i.Z

{1.11}

ou

Onde Z, representa a impedncia 55 e resultado da razo entre a tenso e a


corrente, a representao grfica de Z=R - jX c mostrada na figura 1.5.

Figura 1.5: Representao vetorial da impedncia

Analisando-se

figura

acima

se

identificam

as

seguintes

igualdades trigonomtricas:
= tan

-1

(X c /R)

{1.12}

Onde o ngulo de fase que mostra a defasagem entre a tenso e a


corrente.
Z = [(R) 2 + (X c ) 2 ] 0 . 5

{1.13}

Onde |Z| a impedncia total.

19

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

No modelo de Helmholtz, a interface 56 eletrodo/soluo, tem sido


comparada a um capacitor de placas paralelas, figura 1.6, onde uma das
placas est no eletrodo e a outra na soluo.

Equivalente Eltrico

Eletrodo

Soluo

Capacitor

Figura 1.6: Analogia entre a interface eletrodo/soluo e um capacitor


eltrico.

Um capacitor um elemento de circuito composto por duas placas


condutoras separadas por um dieltrico, o seu comportamento dado pela
expresso 1.14.
C=q/E

{1.14}

Onde,C a capacitncia (Faraday),q a carga (Coulombs) acumulada em uma


das placas, E a diferena de potencial (Volts) entre as placas.
Para um capacitor de placas paralelas contendo um dieltrico 57, a capacitncia
dada por:

C=

. 0 . A
d

{1.15}

Onde C a capacitncia em Faraday (F), o a constante de permissividade


do vcuo (8,85 x 10 - 1 2 F. m - 1 ), constante dieltrica do material que est
entre as placas, neste caso entre o eletrodo/soluo, A a rea de cada placa,
d distncia entre as placas.
20

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

1.4.2) Circuito Equivalente de uma Cela Eletroqu mica

A impedncia causada por uma reao simples de xido-reduo pode


ser descrita por um circuito eltrico equivalente, composto por resistores e
capacitores como mostrado na figura 1.7. Essa uma representao tpica de
um circuito equivalente para uma interface eletrodo/soluo, o qual se
denomina de circuito de Randles 58.

Figura 1.7: (a) circuito equivalente de uma interface eletrodo/soluo.


(b) desdobramento de Z f em R s e C s ou R c t e Z W .

A resistncia hmica R , a resistncia oferecida pela soluo no transporte


dos ons entre o eletrodo de trabalho e o de referncia. No circuito acima, a
resistncia hmica R esta em srie, uma vez que a corrente total (capacitiva
e faradaica) do circuito passa pela soluo. A introduo dos elementos em
paralelo devido separao da corrente para o processo capacitivo (i c ) e
processo faradaico (i f ). A dupla camada tem um comportamento muito
semelhante a um capacitor, C d l , por isso assim representada. O processo
faradaico representado como uma impedncia geral Z f , que por sua vez pode

21

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

ser subdividida por uma resistncia R s com uma pseudocapacitncia C s em


srie, figura 1.7b:

A R s e C s so definidas como:

R s = R c t + / 0 , 5

{1.16}

Onde o coeficiente de Warburg

C s = 1/ 0 , 5

{1.17}

A impedncia faradaica pode ento ser escrita como:

Z f = R s + 1/jC s

{1.18}

Substituindo R s e C s ,

Z f = R c t + / 0 , 5 + /j 0 , 5

{1.19}

A equao 1.19 soma de um termo resistivo, R c t , que indica a facilidade na


transferncia do eltron, e os outros dois tambm resistivos, porm um tipo
especial que dependente da frequncia. Definem-se os dois ltimos termos
como a impedncia de Warburg, Z W , que indica a resistncia na transferncia
de massa, e definida na equao 1.20.

22

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

Z W = / 0 , 5 + /j 0 , 5

{1.20}

Os elementos R e C d l so os que mais se aproximam dos elementos de


um circuito puro. As componentes da impedncia faradaica (R s e C s ) no so
ideais e variam com a frequncia ( ) da excitao.

Impedncia
1.4.3) Representao dos Espectros de Impedncia

Os
freqncia,

espectros
so

de

geralmente

impedncia 59,
apresentados

obtidos
em

quando

grficos

se

varia

Nyquist,

estes

relacionam a impedncia imaginaria (Zim) e a real (Zre).Um outro tipo de


grfico, chamado Bode, relaciona-se a impedncia ou o ngulo de fase com a
freqncia, a vantagem desse grfico que a dependncia com a frequncia
mostrada

claramente,

alm

do

espaamento

logartmico

permitir

uma

visualizao melhor dos processos. No caso de um grfico de Bode ngulo


de fase, um resistor puro apresenta um ngulo de 0 e um capacitor puro de
90 e a impedncia de Warburg, 45, lembrando que esse ngulo a
defasagem entre a tenso e a corrente.
Na figura 1.8a-b, apresenta-se exemplo de um circuito RC em srie
e na figura 1.8c-d um circuito RC em paralelo, mostrando o aspecto dos
respectivos grficos Nyquist e de Bode ngulo de fase.

23

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

Grfico Nyquist

Grfico de Bode

a)

b)
100

1800

1400

Zim (kohm)

1200

1000
800
600
400
200
0
0,90

Interseco=R
0,95

1,00

C
ngulo de fase (graus)

1600

1,05

1,10

80
60
40
20
0
-1
10

R
0

10

Zre (kohm)

10

10

10

10

frequncia (Hz)

c)

d)
C
100
ngulo de fase (graus)

1000

Zim (ohm)

800

R
600

400
200

200

400

600

800

60
40
20
R

0
-1

10

Interseco=R
0

80

10

10

10

10

10

frequncia (Hz)

1000

Zre (ohm)

Figura 1.8: a)Grfico Nyquist de um circuito RC em srie, b) e o seu


respectivo grfico de Bode ngulo de fase, c) Grfico Nyquist de um
circuito RC em paralelo, d) e o seu respectivo grfico de Bode ngulo de
fase.

A figura 1.8 acima mostra o comportamento de elementos de


circuito puros, nas figuras 1.9 apresenta-se os grficos para o circuito de
Randles, que uma representao tpica de uma interface eletrodo/soluo,
onde

alm

da

resistncia

da

capacitncia

tambm

se

apresenta

impedncia de Warburg.

24

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

2.5

Zim (kohm)

2.0
1.5

aumenta

1.0

controle cintico

0.5
0.0

Impedncia
de Warburg

=1/RctCdl

controle de transporte
de massa

R + Rct

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Zre (kohm)

Figura 1.9: Grfico Nyquist para o circuito de Randles, com os seguintes


valores: R =100 , R c t =1000 , C d l = 1F e =2000 .s 0 , 5 .

A anlise do grfico Nyquist mostrado na figura 1.9 evidencia duas


regies distintas, uma de controle cintico, na alta frequncia e outra de
controle de transporte de massa, na baixa frequncia. A primeira regio
formada por um semi-crculo, cujo dimetro dado pelos valores de R e
R c t . A descrio do semi-crculo comea com um deslocamento no eixo x,
devido a R , e passa por um mximo que igual a =1/R c t .C d l . Na parte
linear do grfico ou na regio de controle de transporte de massa se observa
a impedncia de Warburg. A inclinao da reta igual a 1, se somente tiver
a influncia de Z W .
Na figura 1.10, apresenta-se o grfico Bode ngulo de fase,
tambm para o circuito de Randles.

25

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

Cdl

ngulo de fase (graus)

60
Impedncia
50 de Warburg
40
30
20
10

R +Rct

0
-4

10

-3

10

-2

10

-1

10

10

10

10

10

10

10

frequncia (Hz)

Figura 1.10: Grfico de Bode para o circuito de Randles: relacionando o


ngulo de fase vs. log frequncia. Com os seguintes valores: R =100 ,
R c t =1000 , C d l = 1F e =2000 .s 0 , 5 .

Na figura 1.10, o ngulo de fase para os componentes resistivos se


aproxima de 0, os capacitivos de 90 e para a impedncia de Warburg de 45.
Nesse caso, por exemplo, a C d l no atinge o valor de 90, porque outros
componentes tambm esto atuando nesse mesmo intervalo de freqncia
abaixando o valor do ngulo, o mesmo acontece para a R c t , que apenas se
aproxima de 0.

1.4.4) Utilizao do Programa de Circuitos Equivalentes

A espectroscopia de impedncia bastante usada no estudo de sistemas


eletroqumicos, as curvas obtidas so geralmente analisadas com um modelo
de circuito eltrico, um circuito equivalente, onde os vrios elementos de
circuito so relacionados a respectivos processos como a resistncia na

26

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

transferncia de eltrons, capacitncia da dupla camada ou a resistncia de


Warburg.
Os

elementos

de um circuito equivalente representam os vrios

processos envolvidos no transporte de massa e carga. Os grficos so bastante


simples para elementos como a resistncia e a capacitncia. Os diagramas
mostram caractersticas distintas que podem ser facilmente relacionadas a
processos fsicos especficos e a anlise do circuito se torna bastante simples.
Contudo, essa anlise torna-se mais difcil medida que os processos
qumicos envolvidos tambm se tornam mais complicados solicitando modelos
eltricos mais complexos.
A modelagem dos dados experimentais aos circuitos equivalentes, no
seria uma tarefa simples se tivesse que ser feito manualmente para cada um
dos elementos, mas programas escritos para essa finalidade facilitaram
enormemente essa anlise. O programa 60, 61, EQUIVCRT.PAS, escrito por
Bernard A. Boukamp foi utilizado para modelar os dados experimentais, este
ajusta simultaneamente todos os parmetros do circuito equivalente. A tcnica
emprega o ajuste no linear de mnimos quadrados (NLLSF), o parmetro S,
d a noo da qualidade do ajuste, 1.21.

] [

2
2
S = Wi (Zrei Zre( i )) (Zimi Zim( i ))
i

{1.21}

Onde Zre i e Zim i , so os parmetros experimentais, Zre( i ) e Zim( i ) so os


parmetros calculados pelo programa segundo o modelo escolhido, W i =1/|Z i | 2
o peso das medidas.

27

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

1.4.4.1) Princpios para a Utilizao do EQUIVCRT

Para a utilizao do EQUIVCRT 62, necessrio que se conhea algumas


regras para que o programa possa entender corretamente a descrio de um
circuito eltrico. Tais como:

1) Elemento simples: um elemento com dois terminais e est relacionado


com um processo simples, como por exemplo, a resistncia da soluo R , a
capacitncia

da

dupla

camada

Cdl.

Esses

elementos

no

podem

ser

transformados em elementos eltricos mais simples. Os smbolos para os


elementos simples so: R, resistncia, C, capacitncia, L, indutncia e W,
impedncia de Warburg.

2) Elemento complexo: definido como uma caixa com dois terminais


contendo elementos em srie e/ou paralelo, esses elementos podem ser
simples ou complexos.

A ordem de um circuito complexo dada pelo nmero de caixas que


contm o elemento complexo.
Os elementos que esto em um nvel par so elementos em srie,
quando esto em um nvel mpar so elementos em paralelo. No nvel zero
sempre os elementos (simples ou complexos) esto em srie, no nvel seguinte
em paralelo, e desta maneira alternando at que apenas restem elementos
simples, exemplos do cdigo para a descrio de circuitos so mostrados na
tabela 1.1:

28

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

Tabela 1.1: Cdigo para descrio de circuitos do programa EQUIVCRT.

Circuito

Cdigo para Descrio do


Circuito

Um circuito em srie de elementos


simples:
RCL

Um circuito em paralelo de

elementos simples:

(RCL)

Um circuito com elementos

Nvel 0

complexos:
Nvel 1
C
R1

R 1 (C(R 2 W))

Nvel 2
R2
W

Portanto, seguindo essas, convenes dadas pelo programa, fcil


escrever um circuito equivalente e obter os seus valores.

29

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

Sistemas
1.4.5) Impedncia em Sistemas Biol gicos
A medida de impedncia uma tcnica sensvel a variaes que
ocorrem na capacitncia da dupla camada, C d l , esse parmetro fortemente
influenciado por espcies que adsorvem na interface eletrodo/soluo. Por
isso a medida da capacitncia tambm pode ser utilizada para monitorar a
adsoro de protenas e estas no precisam ser eletroativas, o que uma
vantagem no estudo de complexos imunolgicos. Alm da sensibilidade da
tcnica, esta permite uma anlise contnua e sem utilizar reagentes marcados.
Outra vantagem, que o sistema sob investigao no sofre o impacto da
aplicao de um potencial externo o que poderia modificar as condies do
sistema. O sinal aplicado de pequena amplitude a-c e pode ser realizado no
potencial de repouso entre a molcula biolgica e o metal, preservando ao
mximo as condies naturais do processo.
A capacitncia, vide equao 1.15, diretamente relacionada a camada
dieltrica, modificaes na espessura (d) ou na sua constante dieltrica ()
iro refletir em modificaes na capacitncia.
Em
anticorpo

alguns
63, 64

trabalhos

onde

se

monitora

interao

antgeno-

com medidas de capacitncia, esse processo representado por

um modelo eltrico bastante simples: considerou-se que a capacitncia medida


(C t ) era a soma das capacitncias do antgeno (C a ) e do anticorpo (C b ), dada
por 1.22:

da

db

1
1
1
=
+
Ct Ca Cb

{1.22}

Figura 1.11: Esquema proposto para a interao antgeno-anticorpo na


interface eletrodo/soluo.

30

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

representao

qualitativa

da

interao

antgeno/anticorpo

facilmente visualizada com o modelo da figura 1.11, onde se observa um


aumento da espessura d devido interao antgeno-anticorpo, no entanto
quantitativamente esse modelo se mostra deficiente. Entre as explicaes
apresentadas est a simplicidade do modelo, onde no foram consideradas,
por exemplo, o fato das protenas no recobrirem uniformemente a superfcie
do eletrodo ou ainda fatores como a rugosidade, impurezas e filmes de xidos
influenciarem a resposta impedimtrica.
A adsoro pode ocasionar a corroso de equipamentos metlicos o que
representa prejuzo para indstria e perigo de contaminao dos produtos. Em
um estudo realizado com a albumina de soro bovino 65 sobre ao inox se
monitorou o valor da R c t , que nesse caso representa a medida direta da
velocidade de corroso. Esse parmetro diminua medida que aumentava a
quantidade de protena adsorvida na superfcie, o que representa a medida
direta da dissoluo do metal. Essas informaes podem ser utilizadas para se
otimizar as melhores condies para se evitar a corroso dos metais em
contato com protenas.
Os defeitos no recobrimento de superfcie com uma membrana lipdica 66
ou polimrica 67, 68, que podem ser utilizadas em sensores, criam regies de
contato direto do metal com a soluo, nesses locais a condutividade alta.
Isso resulta em uma capacitncia e resistncia devido a presenas desses
defeitos e que desse modo pode-se avaliar a eficincia no recobrimento. A
anlise impedimtrica pode ser aplicada para observar a deposio de
membranas e se obter informaes estruturais com a avaliao da capacitncia
e a resistncia.
A obteno da constante da velocidade de transferncia de eltrons, k o ,
que esta relacionada a R c t , tambm pode ser obtida por medidas de
impedncia. Foi observado que a k o da reao de xido-reduo para o ferriferrocianeto de potssio diminui com a adsoro de um peptdeo 69, portanto
essa molcula dificulta a transferncia de eltrons. A adsoro verificada
com um aumento da resistncia no grfico Nyquist.
A medida da capacitncia da dupla camada tambm pode ser usada para
determinar a cintica 70 da adsoro da protena na superfcie do eletrodo. Um
dos modos mais simples utilizados para descrever esse processo uma reao
31

_________________________________________________________________Espectroscopia de Impedncia

em duas etapas: a primeira relativa adsoro irreversvel da protena e a


outra associada modificao na estrutura das molculas adsorvidas.O
decrscimo do valor da C d l associado adsoro da protena. Essa variao
na C d l tambm foi associada ao rearranjo da protena sobre o eletrodo. Esse
fato, por exemplo, no pode ser acompanhado com uma balana de quartzo,
pois essa mudana conformacional no implica em mudana na massa,
portanto essa mudana no pde ser verificada com essa tcnica. Em outro
trabalho se verificou que de acordo com a concentrao 71 da protena se
observava mudanas na orientao da protena adsorvida.
Em alguns trabalhos a capacitncia tambm foi utilizada para se obter
informao a respeito da conformao e/ou orientao 7 1 das protenas. Esse
um aspecto relevante no processo de adsoro, por exemplo, para os sensores
a imobilizao 72 da protena deve ocorrer com uma orientao que preserve os
stios especficos livres.
A medida impedimtrica, como visto acima, uma ferramenta utilizada
para se estudar adsoro de protenas, oferecendo informaes de orientao,
conformao e cintica das mesmas.

32

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

CAPTULO 2
2) TCNICAS EXPERIMENTAIS

Para a obteno das medidas de impedncia foram fundamentais as


etapas de compreenso dos princpios tericos da tcnica e manuseio dos
equipamentos, para ento se iniciar o trabalho experimental. Neste percurso
tornou-se evidente a importncia do tratamento da superfcie do eletrodo para
que os resultados fossem reprodutveis. Alm disso, tambm se verificou que
a forma da cela eletroqumica, cabos e conexes metlicas tm influncia
marcante na qualidade dos dados.

33

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

2.1) Sistema Eletroqu mico

O sistema eletroqumico composto pelo solvente, eletrlito


suporte, eletrodos e a cela eletroqumica. Para facilitar a discusso dos
resultados apresenta-se de uma forma geral a especificao e o tratamento
recebido conforme o experimento realizado.

2.1.1) Eletrodos

Os experimentos eletroqumicos utilizam um sistema composto por


trs eletrodos, figura 2.1, o eletrodo de trabalho, auxiliar e o de referncia.
No primeiro ocorre a reao de interesse o segundo mantm o fluxo eltrico
e o terceiro estabelece o potencial de referncia.

Fonte

i
Eletr.
Auxiliar

Eletr.
Trabalho

Eletr.
Referncia

Figura 2.1: Circuito de uma cela eletroqumica composta por trs eletrodos

34

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

2.1.1.1) Eletrodo de Trabalho


O eletrodo de trabalho utilizado nos experimentos tem as seguintes
especificaes:
Eletrodo de platina disco de 2,2 mm dimetro
Modelo MF 2013 - BAS (Bioanalytical Systems)

2.1.1.2) Eletrodo Auxiliar


O eletrodo auxiliar utilizado nos experimentos de espectroscopia
de impedncia e voltametria cclica era constitudo de uma placa de platina
com as dimenses de 1,0cm x 3,0cm x 0,01cm.
Para os experimentos destinados a produo eletroqumica da
camada de xido em cido sulfrico, o eletrodo auxiliar utilizado foi um fio
de platina.
O tratamento de limpeza desses eletrodos consiste de uma imerso
em cido ntrico concentrado por 5 minutos e enxge em gua.

2.1.1.3) Eletrodo de Referncia


A limpeza do eletrodo de referncia, Ag/AgCl/KCl saturada,
efetuada somente com enxge em gua, e o eletrodo armazenado em uma
soluo saturada de KCl.

2.1.2) Preparo da superf cie do eletrodo de trabalho


O

tratamento

da

superfcie

do

eletrodo

fundamental

na

reprodutibilidade dos resultados uma vez que a tcnica prev a medida da


capacitncia da dupla camada. Portanto deve-se ter um cuidado rigoroso no

35

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

polimento do eletrodo e na retirada do material de polimento (alumina),


lembrando que todos os procedimentos devem ser repetidos igualmente para
todos os experimentos a fim de que a superfcie seja sempre a mesma.
O tratamento de limpeza recebido por esse eletrodo consistiu de
polimento com alumina 0.05 por 5 minutos, enxge em gua, imerso em
ultra-som com gua, por 7 minutos. Aps a esse tratamento o eletrodo foi
colocado ainda molhado no meio eletroltico.
Destaca-se que a reprodutibilidade dos experimentos no uma
tarefa fcil tanto no que diz respeito a preparao da superfcie de platina
como nas etapas seguintes de produo da camada de xido e adsoro da
protena,

que

apesar

dos

experimentos

terem

sido

cuidadosamente

repetidos se observava dificuldade na sua reproduo.


Na figura 2.2 apresenta-se um esquema mostrando as etapas de
polimento do eletrodo e a verificao da limpeza e reprodutibilidade da
superfcie com a realizao da voltametria cclica (VC) e espectroscopia de
impedncia eletroqumica (EIE).

1) Polimento do eletrodo e imerso em ultra-som

2)Verificao da limpeza e reprodutibilidade da


superfcie do eletrodo

a) Voltametria
Cclica

i(A)

b) Impedncia

Zim(ohm)

E(V)

Zre(ohm)

Figura 2.2: Esquema para a verificao da limpeza e reprodutibilidade da


superfcie do eletrodo
36

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

2.1.3) Solvente

A gua foi utilizada como solvente em todos os experimentos


descritos. Esta gua obtida pelo sistema de purificao MilliQ-plus com
uma resistividade de 18 M.cm. Esta mesma gua foi utilizada para lavagem
dos eletrodos e materiais.

2.1.4) Eletr lito suporte

O cloreto de sdio foi utilizado como eletrlito suporte numa


concentrao de 0,15 M. Esta concentrao a mesma de uma soluo
fisiolgica adequada para testes com a molcula bioativa a ser empregada.

2.1.5) Sistema Redox


O par redox utilizado foi o ferri-ferrocianeto de potssio
K 3 [Fe(CN) 6 ] e K 4 [Fe(CN) 6 ] (Vetec) na concentrao de 1 mM. A presena
do sistema redox tem a funo de indicar um possvel bloqueio da superfcie
do eletrodo de trabalho, uma vez que estas espcies apresentam picos de
corrente andico/catdico bem definidos.

2.1.6) Lectinas adsorvidas na superf cie da platina

A concanavalina A (Sigma tipo IV) e a lentil (Sigma) foram


preparadas numa concentrao de 0,01 mg/mL em cloreto de sdio. As

37

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

lectinas podem estar na forma ativada ou desativada conforme a adio ou


no dos ctions Ca 2 + e Mn 2 + de ativao. O termo desativada, neste caso, se
refere protena em contato com uma soluo em que no houve a adio de
sais de clcio e mangans, o que, no entanto no significa que a protena no
possua os referidos sais na sua estrutura.
a) Lectina na forma ativada: em NaCl 0,15 M, CaCl 2 .H 2 O (Merck) e
MnCl 2 .4H 2 O (Carlo Erba) ambos a 3 mM
b) Lectina na forma desativada: em NaCl 0,15 M sem presena dos sais de
ativao
O tempo de imerso do eletrodo de platina nessas solues variou
de 1, 5, 15 e 30 min.

2.1.6) Carboidratos utilizados para testar a sensibilidade e


seletividade das lectinas adsorvidas
adsorvidas

Os

carboidratos

utilizados

foram

glicose

(Ridel-de

Han),

galactose (Merck) e glicognio (Sigma tipo II) nas concentraes de 0,01


mg/mL em cloreto de sdio 0,15 M. Estas substncias foram utilizadas para
testar a especificidade e seletividade da con A.

2.1.7) Cela eletroqu mica

A cela eletroqumica tem capacidade para 20 ml de soluo,


podendo apresentar compartimento para o eletrodo de referncia e capilar de
Luggin-Harber, figura 2.3a. A cela se adapta uma tampa de material inerte
na

qual

se

encaixam

os

eletrodos

o sistema de nitrogenao. A

38

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

desoxigenao da soluo efetuada por borbulhamento com nitrognio


durante 30 minutos e atmosfera inerte mantida durante os experimentos. O
nitrognio passa por tratamento de desoxigenao (coluna preenchida com
cobre metlico e aquecimento) e purificao (duas colunas com peneiras
moleculares).Os experimentos efetuados com o eletrodo de platina na
soluo contendo ferri-ferrocianeto de potssio utilizou uma cela que no
possui o capilar de Luggin-Harber, figura 2.3b.

a)

b)

Tampa-vista superior
3
2

4
1

1) Eletrodo auxiliar
2) Eletrodo de trabalho
3) Borbulhador de
nitrognio
4) Eletrodo de referncia

Figura 2.3: Celas eletroqumicas: a) com capilar de Luggin-Harber; b) sem


capilar de Luggin-Harber

2.2) Equipamentos Utilizados para a Realizao dos Experimentos


Eletroqu micos

Na figura 2.4, se apresenta um organograma dos equipamentos


utilizados para a realizao dos experimentos de voltametria cclica e
espectroscopia de impedncia.

39

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

Software
398 EG&G

BJ-200
Impressora
GPIB IEEE - 488
Interface
273A EG&G

5210 EG&G

Potenciostato

Lock-in

Cela Eletroqumica

Figura 2.4: Organograma dos equipamentos utilizados para as medidas de


impedncia

O potenciostato e o lock-in so interfaceados pelo computador e atravs


do

software

so

dirigidas

informaes

aos

mesmos.

potenciostato

possibilita a aplicao de um potencial dc entre o eletrodo de trabalho e o de


referncia, alm de gerar a onda senoidal. O potenciostato gera ondas com
freqncias no intervalo de 100KHz a 10Hz, abaixo dessa freqncia a onda
gerada pelo loock-in. O lock-in um equipamento que compara dois sinais
senoidais e gera uma resposta que usada para se obter a diferena de fase
entre os sinais e a razo entre as amplitudes dos picos.

2.3) Voltametria C clica

Na voltametria cclica o potencial ciclado linearmente a uma


velocidade constante entre dois limites de potencial, registrando-se a

40

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

corrente obtida. A voltametria cclica realizada antes dos experimentos de


impedncia como recurso para se verificar se o sistema se encontra limpo e
se a desoxigenao foi eficiente. Para tanto se efetuam em mdia 5 ciclos
com uma velocidade de 50 mV/s, em uma soluo de ferri-ferrocianeto de
potssio e cloreto de sdio, no intervalo de 0 a 450 mV.

2.4) Espectroscopia de Impedncia

Os experimentos foram realizados numa soluo de ferri-ferrocianeto de


potssio e cloreto de sdio, uma atmosfera de nitrognio mantida sobre a
soluo.
O intervalo de frequncia de 100 KHz a 8,85 mHz, a amplitude da onda
de 10 mV r.m.s, com um tempo de condicionamento do eletrodo de 30
segundos e foram coletados 5 pontos por dcada de frequncia.
Os

experimentos

foram

realizados

no

potencial

de

repouso

de

aproximadamente 0,23 V.

2.4.1)
2.4.1) Verificao da adsoro das lectinas

Verificou-se a adsoro da con A e da lentil sobre superfcies de platina


onde esta era recoberta ou no por uma camada de xido, estas superfcies so
identificadas pela seguinte notao:
a) Pt/lectina: eletrodo de platina sem nenhuma modificao, apenas o
polimento, imerso em soluo de lectina

41

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

b) Pt/PtO q /lectina: eletrodo de platina modificado com xido produzido


quimicamente e ento imerso em soluo de lectina.
c) Pt/PtO e q /lectina: eletrodo de platina modificado com xido produzido
eletroquimicamente e ento imerso em soluo de lectina.

O tempo de imerso do eletrodo na soluo contendo protena variou de


1, 5, 15 e 30 minutos, na seqncia o eletrodo enxaguado com gua.
A modificao da superfcie, devido adsoro da lectina, foi
verificada realizando-se voltametria cclica e espectroscopia de impedncia.
Para verificar se as modificaes observadas tanto na voltametria
cclica e na impedncia eram devido adsoro da protena e no devido a
outras substncias como o eletrlito suporte (NaCl 0,15 M), os sais de
ativao

(CaCl 2

MgCl 2 )

glicognio

tambm

foram

efetuados

experimentos onde se colocava o eletrodo de platina nestas solues. Deste


modo, o eletrodo de platina com e sem xido tambm foi imerso nas
substncias acima citadas onde no se verificaram mudanas como as
observadas na presena de protena.
Na figura 2.5 apresenta-se um esquema resumido mostrando as etapas
acima comentadas: de preparao e modificao do eletrodo, imerso em
protena e verificao da adsoro.

42

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

1) Limpeza do eletrodo conforme 2.1.2

2) Modificao da superfcie do eletrodo com xido


conforme 2.5.1 ou 2.5.2

3) Imerso do
eletrodo em Lectina

4) Verificao da adsoro da lectina

a) Voltametria
Cclica

b) Impedncia

i(A)

Zim(ohm)

Zre(ohm)

E(V)

Figura 2.5: Esquema mostrando as etapas 1 e 2 anteriores adsoro da


lectina e a adsoro propriamente dita, etapa 3, e a sua posterior verificao
na etapa 4.

2.4.2)

Verificao

da

seletividade

das

lectinas

frente

aos

carboidratos
carboidratos
A superfcie modificada com a lectina conforme j descrita em 2.4.1 era
testada frente a alguns acares, como a glicose, galactose e glicognio. Esse

43

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

procedimento uma continuao das etapas 1, 2, 3, 4 e 5 mostradas na figura


2.6, na sequncia d-se a imerso por 1, 5, 15 ou 30 min dessa superfcie
modificada com lectina em uma soluo contendo um dos acares acima
mencionados, e uma nova voltametria cclica e espectroscopia de impedncia
so efetuadas. Um esquema resumido dessas etapas mostrado na figura 2.6.

1) Eletrodo modificado pela adsoro da lectina


( esquema mostrado na figura 2.5)

2) Imerso do eletrodo em uma soluo de carboidrato

3) Verificao da interao entre a lectina e o carboidrato

a) Voltametria
Cclica

i(A)

b) Impedncia

Zim(ohm)

E(V)

Zre(ohm)

Figura 2.6: Esquema mostrando a adsoro de carboidratos, sobre uma


superfcie com lectina (mostradas na figura 2.5) e a verificao da adsoro
do carboidrato com voltametria cclica e espectroscopia de impedncia.

44

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

2.5) Formao da Camada de xido

Observou-se que, a modificao da superfcie do eletrodo de platina


com uma camada de xido, altera bastante a adsoro das protenas estudadas.
Inicialmente

superfcie

do

eletrodo

foi

modificada

quimicamente

posteriormente para se obter um maior controle desse processo produziu-se


essa camada de xido por via eletroqumica. Os procedimentos utilizados
nessas prticas sero descritos a seguir:

2.5.1) Camada de xido formada quimicamente

Aps o tratamento recebido pela superfcie de platina conforme descrito


em 2.1.2 efetuava-se uma voltametria cclica em ferri-ferrocianeto de potssio
e uma espectroscopia de impedncia. Esse procedimento era para se investigar
tanto a limpeza como a reprodutibilidade do processo de preparao do
eletrodo. Aps essa etapa o eletrodo de platina era retirado da clula,
enxaguado e imerso por 5 min em cido ntrico concentrado (Merck) e
enxaguado novamente com gua. Numa etapa seguinte, ou a superfcie foi
investigada para verificar-se a modificao ocorrida devido o contato com o
cido ntrico ou colocada em contato com a lectina e verificando-se assim a
modificao

ocasionada

pela

protena.

No

primeiro

caso

efetuava-se

voltametria cclica e espectroscopia de impedncia no segundo caso imergiase o eletrodo em uma soluo de lectina, conforme as especificaes dadas em
2.1.6, lavava-se o eletrodo com gua e efetuava-se voltametria cclica e
espectroscopia de impedncia, um esquema apresentando essas etapas
mostrado na figura 2.7.

45

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

1) Preparo da superfcie do eletrodo conforme 2.1.2

2) Imerso em HNO3 conc.

Enxage em H2O

Verificar com voltametria cclica e


impedncia a modificao
causada pelo HNO3.

Imerso em lectina

Figura 2.7: Esquema resumindo os procedimentos para a produo de uma


camada de xido quimicamente.

2.5.2) Camada de xido formada eletroquimicamente

2.5.2.1) Parmetros experimentais para a formao da camada de xido


O objetivo de se produzir uma camada de xido eletroquimicamente era
se obter um maior controle e reprodutibilidade dessa camada. A tentativa de
se reproduzir os resultados j obtidos com a camada formada quimicamente
levou a pesquisa de cidos menos oxidantes que o cido ntrico, no qual a
simples imerso j produzia a camada de xido.
Os testes realizados com o cido sulfrico e o cido clordrico ambos
concentrados tambm produziram modificaes na superfcie do eletrodo com
a simples imerso, embora menos intensas.

46

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

Uma outra alternativa foi o cido p-tolueno sulfnico 3,5 M, que em um


primeiro teste de simples imerso no causava modificaes na superfcie.
Passou-se ento aos testes eletroqumicos, nos quais, de acordo com a
voltametria cclica obtida aplicou-se um potencial de 1,2 V por um perodo de
1 hora. O resultado foi satisfatrio, no entanto considerou-se que por se tratar
de um cido orgnico poderia haver complicaes devido presena de
material orgnico no filme de xido.
Os testes com o cido sulfrico 1M iniciaram com a imerso do
eletrodo de platina nessa soluo para verificar se havia a produo de uma
camada de xido. Visto que nessas condies no houve a oxidao do
eletrodo passou-se para a prxima etapa, na qual foram definidos os
parmetros para a produo eletroqumica da camada.
Inicialmente se pesquisou qual seria o potencial para a formao da
camada de xido. Os potenciais de oxidao estudados variaram de 1,0 V at
1,9 V, onde se observou que acima de 1,6 V h formao de bolhas sobre a
superfcie do eletrodo. Para diminuir o efeito da formao de bolhas e com
isso dificultar a reprodutibilidade da camada de xido, introduziu-se uma
intensa agitao no sistema, no permitindo dessa maneira a fixao dessas
bolhas. O potencial de 1,6V foi o escolhido para produzir todos os filmes de
xido comentados neste trabalho.
A prxima etapa foi definir a quantidade de carga que seria utilizada
para a formao da camada. Foram efetuados testes com as seguintes cargas:
30mC, 20 mC, 10 mC, 5,0 mC, 4,0 mC, 2,0 mC, 1,0 mC, 500 C, 250 C e
60 C.
Aps a formao da camada de xido, seja em qualquer das condies
de potencial e carga acima citados, finalizou-se com um procedimento para
uniformizar ou estabilizar a camada. Para tal, varreu-se linearmente, a partir
do potencial aplicado, no sentido catdico at um dos seguintes potenciais:
0,6 V; 0,7 V, 0,8 V; 0,9 V; 1,25 V e 1,30 V. O tempo de permanncia nesses
potenciais foi de 60 s, 100 s, 300 s e 600 s. Estabeleceu-se que o potencial
seria varrido linearmente at 0,7V e permanecendo no mesmo por 60s.
A escolha dos melhores parmetros, para a produo eletroqumica da
camada se baseou em dois critrios: o primeiro, formar uma camada pouco
espessa, ou melhor, com um comportamento impedimtrico semelhante ao
47

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

obtido com as camadas formadas quimicamente; o segundo, obter-se uma boa


reprodutibilidade das mesmas.
Na figura 2.8, apresenta-se o programa de potenciais usados na
formao da camada de xido. Na figura 2.8a, inicia-se o processo de limpeza
do sistema eletroqumico com uma ciclagem rpida no intervalo de 0,12 a
1,3 V com durao de dois minutos a uma velocidade de 1V/s e por 6 minutos
a 50 mV/s. Esses procedimentos auxiliam na obteno de uma voltametria
cclica adequada para a formao da camada de xido. Os experimentos foram
realizados na cela eletroqumica mostrada na figura 2.3a com intenso
borbulhamento de nitrognio na soluo. Aps a verificao, atravs do
voltamograma

cclico,

de

que

sistema

se

encontra

limpo,

inicia-se

imediatamente o procedimento para a formao da camada de xido. Esta


etapa pode ser acompanhada na figura 2.8b, onde o ltimo ciclo terminado
aproximadamente em 0,7 V, quando se aplica o potencial de 1,6 V, at passar
60 C de carga (em mdia 4-5 segundos, esse tempo varia com a quantidade
de carga oxidada), ento varre-se linearmente o potencial at 0,7 V,
permanecendo-se por 60 segundos nesse potencial.

A)

B)
1,6V
t=x

1,3V
0,7V
-0,12V

-0,12 V

0,7V
60s

-0,12V

Ciclos a 1 V/s - 2 min.


Ciclos a 50 mV/s - 6 min.

Figura 2.8: Programa dos potenciais estabelecidos no eletrodo de trabalho


para se produzir camada de xido eletroquimicamente. A) Limpeza do
sistema eletroqumico, onda triangular de potencial utilizado na voltametria
cclica da platina em H 2 SO 4 1M. B) Formao da camada de xido

48

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

Terminado o processo de formao da camada o eletrodo lavado com


gua, iniciando-se agora a etapa da verificao da mesma que composta pela
realizao de 3 ciclos de voltametria cclica em ferri-ferrocianeto de potssio
seguida pela espectroscopia de impedncia nessa mesma soluo. Um resumo
das

etapas

de

formao

verificao

da

camada

de

xido

formada

eletroquimicamente apresentado na figura 2.9.

ETAPA 1: LIMPEZA DO ELETRODO DE Pt

Cela de dois
compartimentos
com H2SO4 1M

Intervalo de potencial
usado na voltametria
cclica

Voltametria cclica
em H2SO4

1,3V

-0,12V -0,12
Ciclos a 1 V/s - 2 min.
Ciclos a 50 mV/s - 6 min.

ETAPA 2: FORMAO DA CAMADA DE XIDO ELETROQUIMICAMENTE EM H2SO4


1,6V
t=x

0,7V

0,7V
60s

Esquema mostrando o
programa de potenciais usados
na formao da camada de
xido em H2SO4 1M, aps
obteno da voltametria cclica

-0,12V

ETAPA 3: VERIFICAO DA CAMADA DE XIDO

a)

Voltametria
Cclica

b) Impedncia

Zim(ohm

i(A)

E(V)

Zre(ohm

Figura 2.9: Esquema explicativo das etapas de limpeza, formao e


verificao da camada de xido produzida eletroquimicamente.

49

______________________________________________________________________ Tcnicas Experimentais

Teste
2.8) Teste de Atividade Biol gica da Concanavalina A

A turbidez causada pela reao entre a con A e o glicognio uma


indicao da atividade ligante da con A aos sacardeos 73, 74, 75. A reao foi
iniciada pela adio de 200 g/mL de con A em 0,05 M de tampo tris-HCl
(pH 7,4, 3 mM de CaCl 2 , 3 mM de MnCl 2 , 0,15 M NaCl ) a 60 g/mL de
glicognio em 0,05 M de tampo tris-HCl (pH 7,4). Esse teste tambm foi
efetuado com a glicose. A turbidez foi monitorada espectrofotometricamente
no comprimento de 460 nm. A reao tambm foi acompanhada na situao
em que a con A no est na presena dos sais de ativao.

50

_________________________________________________________ Resultados e Discuss es

CAPTULO 3
3) RESULTADOS E DISCUSSES

As
eletrodo/protena

tcnicas

foram

utilizadas

voltametria

para

estudo

cclica

da

interface

espectroscopia

de

impedncia. A associao dessas duas tcnicas possibilitou o monitoramento


da superfcie do eletrodo e a sua modificao. Para o acompanhamento dessas
modificaes enfatiza-se os cuidados com a preparao das superfcies, o que
inclui o polimento do eletrodo, a formao de uma camada de xido e a
adsoro da protena.
Na

discusso

dos

resultados

so

propostos

circuitos

eltricos

equivalentes que possam traduzir as condies das interfaces platina/soluo,


platina/xido, platina/xido/con A e platina/con A. Esses circuitos so obtidos
com

modelagem

dos

resultados

experimentais

deles

foram

extrados a resistncia, a capacitncia e parmetros cinticos que esclarecem


a natureza de cada uma das interfaces citadas.

51

____________________________________________________________ O eletrodo de Platina

3.1) Voltametria C clica do Eletrodo de Platina

Os
preparao

procedimentos
da

experimentais,

superfcie

da

platina,

descritos
tm

em

2.1.1.1,

para

objetivo

de

garantir

reprodutibilidade nas caractersticas dessa superfcie. Essas caractersticas


foram observadas em uma soluo de cido sulfrico e em ferri-ferrocianeto
de potssio. Nesses meios o voltamograma cclico apresenta processo redox
bem definido, onde a alterao no comportamento voltamtrico indica alguma
modificao na interface eletrodo/soluo. Essas modificaes sinalizam a
presena de contaminantes que podem alterar os resultados e, por conseguinte
levar a concluses enganosas.
A anlise dos voltamogramas cclicos da platina em cido sulfrico e
em ferri-ferrocianeto de potssio sero discutidas em maiores detalhes na
sequncia deste captulo.

3.1.1) Voltametria C clica em cido Sulfrico

As caractersticas desses voltamogramas so bastante conhecidas e


amplamente discutidas na literatura 76. De forma breve, o voltamograma da
figura 1 pode ser dividido em trs regies:
I) Regio do hidrognio, localizada no intervalo de 120 a 200 mV, onde se
observam os picos de adsoro e desoro do hidrognio.
II) Regio da dupla camada, localizada no intervalo de 200 a 600 mV
(varredura andica), onde no se observa nenhum processo faradaico, a
corrente medida consequncia do carregamento da dupla camada.

52

____________________________________________________________ O eletrodo de Platina


III) Regio do sistema Pt/O 2 , localizado entre 600 a 1300 mV (varredura
andica), inicialmente ocorre a oxidao da superfcie da platina relacionados
com a adsoro de OH, a potenciais superiores ocorre a formao de
monocamadas de xido. Na varredura catdica ocorre a reduo dos xidos
formados na varredura andica.
A presena de qualquer impureza no sistema eletroqumico compromete essas
reaes e consequentemente no se obtm o resultado mostrado na figura 3.1.

II

III

Corrente (A)

2
0
-2
-4
-6
-200

200 400 600 800 1000 1200 1400


Potencial / mV (E/Ag/AgClsat)

Figura 3.1: Voltamograma cclico do eletrodo de platina em cido sulfrico


1 M.

3.1.2) Voltametria C clica em Ferri-ferrocianeto de Potssio


FerriPotssio

O voltamograma cclico da platina em ferri-ferrocianeto de potssio


mostrado na figura 3.2, apresenta os picos andico/catdico em 260/200 mV e
o potencial de repouso que se estabelece nessa interface de 230 mV. Para
sistemas como esse se deve observar uma diferena nos potenciais de pico de
aproximadamente 60 mV e a razo entre as correntes andica e catdica de
aproximadamente 1.
53

____________________________________________________________ O eletrodo de Platina


A adio do par redox ao sistema tem as funes de estabelecer um
potencial na dupla camada com espcies conhecidas e atuar como um
indicador de um possvel bloqueio na superfcie do eletrodo. Esta ltima
funo se deve s caractersticas bem definidas desse par redox, tanto na
posio dos picos andico/catdico, como na relao proporcional desses
picos. A modificao dessas caractersticas indica que o sistema apresenta
alguma

contaminao,

que

pode,

portanto,

afetar

resultado

dos

experimentos.

8
6

Corrente (A)

4
2
0
-2
-4
-6
-8

100

200

300

400

500

Potencial / mV(E/Ag/AgClsat)

Figura

3.2:

Voltamograma

cclico

do

eletrodo

de

platina

em

ferri-

ferrocianeto de potssio 1mM.

54

____________________________________________________________ O eletrodo de Platina

3.2) A camada de xido Formada Eletroquimicamente

O filme de xido teve um papel importante na adsoro da protena,


pois a partir de uma aparente pequena modificao da superfcie obteve-se
uma resposta muito intensa na adsoro. Devido a essa modificao na
intensidade de adsoro da protena fez-se necessrio um controle mais rgido
das condies de formao desse filme de xido e desta forma reproduzir as
mesmas caractersticas do filme.

3.2.1) Caracterizao da Camada de xido pela Voltametria C clica

A camada de xido foi produzida sobre a platina em meio cido a um


potencial constante de 1,6 V, os detalhes experimentais foram apresentados
em 2.5.2.
Para a caracterizao da formao do filme de xido foram realizados
experimentos de voltametria cclica e espectroscopia de impedncia.
Na figura 3.3, apresenta-se o voltamograma cclico do eletrodo de
platina em ferri-ferrocianeto de potssio antes e aps a modificao com o
filme de xido. Comparando-se esses voltamogramas observa-se que houve a
diminuio dos picos andico/catdico e um deslocamento nos potenciais de
pico (E p ). O decrscimo nas correntes andica/catdica indica que houve um
certo bloqueio da superfcie da platina, e o aumento na diferena do potencial
de pico (E p ) sugere uma cintica mais lenta para o processo redox.

55

_____________________________________________________________ A camada de xido

8
6

Corrente (A)

4
2
0
-2
-4
-6
-8

100

200

300

400

500

Potencial / mV(E/Ag/AgClsat)

Figura

3.3:

Voltamograma

cclico

do

eletrodo

de

platina

em

ferri-

ferrocianeto de potssio: (+) eletrodo de platina; ( ) eletrodo de platina


modificado com filme de xido, 61 C para a formao do filme .

Para verificar como a camada de xido afetada pela carga andica


usada na produo desse filme, foram realizados experimentos utilizando-se
cargas no intervalo de 50 a 1000 C.
A variao da corrente de pico andica (i p a ) em funo da carga pode
ser visto na figura 3.4. Nessa figura pode ser visto o decrscimo de
aproximadamente 20% da corrente na regio de carga de 0 a 50 C e um
decrscimo mais sutil de apenas 8,5% na regio acima de 50 C, semelhante a
um decaimento exponencial da corrente com a carga.

56

_____________________________________________________________ A camada de xido

7,0

ipa (A)

6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
0

200

400

600

800

1000

Carga (C)

Figura 3.4: Corrente de pico andica (i p a ) versus carga para o eletrodo de


platina em uma soluo de ferri-ferrocianeto de potssio.

Na figura 3.5, apresenta-se a variao da E p com a carga. A presena


do xido deslocou a E p de 60-70 mV do eletrodo sem xido (carga 0) para
aproximadamente 90 mV ( 50 a 500 C) e para cargas de 1000 C os valores
da E p so maiores que 90 mV. Como j foi mencionado para sistemas
reversveis o E p 60 mV, a presena do xido desloca o sistema para um
regime quase-reversvel. Esse fato implica que a cintica da reao de xidoreduo do ferri-ferrocianeto de potssio sobre o eletrodo recoberto por xido
mais lenta.
120
110
Ep (mV)

100
90
80
70
60
0

200

400

600

800

1000

Carga (C)

Figura 3.5: Diferena no potencial de pico (E p ) versus carga para o


eletrodo de platina em uma soluo de ferri-ferrocianeto de potssio.

57

_____________________________________________________________ A camada de xido

3.2.2) Caracterizao da Camada de xido pela Espectroscopia de


Impedncia

A modificao da superfcie de platina tambm foi detectada pela


espectroscopia de impedncia. Na figura 3.6, apresenta-se o grfico de
Nyquist para a platina e para a platina modificada pelo xido. A curva para a
platina apresenta um pequeno semicrculo que aumentado algo em torno de
70% quando modificada pelo xido. Esse aumento indica que tanto Zim
(componentes capacitivos) como Zre (componentes resistivos) do sistema
foram significativamente mudados.

6.0

Zim (kohm)

4.5

16 Hz

3.0

1.5

151 Hz

0.0
0.0

1.5

3.0

4.5

6.0

Zre (kohm)

Figura 3.6: Grfico Nyquist do eletrodo de platina em ferri-ferrocianeto de


potssio: (+) eletrodo de platina; ( ) eletrodo de platina modificada com
filme de xido, 61 C para a formao do filme.

O mesmo resultado tambm pode ser visto num grfico de Bode, figura
3.7, onde relaciona-se o ngulo de fase ( ) e o mdulo da impedncia
frequncia. Uma forma de associar as informaes desses dois grficos
58

_____________________________________________________________ A camada de xido


atravs da constante de tempo ( = RC). No grfico da figura 3.6 o valor
mximo de Zim na regio semicircular dada por =1/R c t C d l , portanto o
inverso de . O eletrodo de platina modificado com o filme xido alm de
aumentar o valor do mdulo da impedncia apresenta uma curvatura mais bem
resolvida do que a platina, observe a figura 3.7, os valores de maiores do
que 29 o e em frequncias menores do que 1000 Hz. O deslocamento para uma
frequncia mais baixa indica que o processo est ocorrendo com uma
constante de tempo menor, portanto mais lenta e o aumento no ngulo de fase
indica um sistema com uma maior contribuio capacitiva.

40

10

10

10

30
20

| Z | (ohm)

ngulo de fase (graus)

50

10
0
-2
10

10

-1

10

10

10

10

10

10

frequncia (Hz)

Figura 3.7: Grfico de Bode ngulo de fase do eletrodo de platina em ferriferrocianeto de potssio: (+) eletrodo de platina; ( ) eletrodo de platina
modificada com filme de xido, 61 C para a formao do filme.

3.2.2.1) Comparao dos Resultados Obtidos com a Voltametria Cclica e


a Impedncia

Uma inspeo nas figuras 3.3 e 3.7 mostra que o efeito da presena do
xido sobre a platina aparentemente menos evidenciado na voltametria
cclica do que na impedncia. Essa diferena na resposta entre as duas

59

_____________________________________________________________ A camada de xido


tcnicas surge porque a constante heterognea de velocidade, k o , que um
parmetro cintico que indica a facilidade de uma reao ocorrer, se
manifesta de uma maneira mais sutil na voltametria cclica do que na
impedncia.
Nicholson 77, desenvolveu um mtodo para se estimar a k o a partir da
voltametria cclica relacionando um parmetro com a separao entre os
picos (E p ). Os valores de , parmetro cintico adimensional da voltametria
cclica, so tabelados 5 4 e a sua relao com a k o dada conforme equao 3.1.

[Dov(nF / RT )]1/ 2
k =
( Do / DR ) / 2
o

{3.1}

Nessa relao por exemplo, uma variao de k o dada pela modificao da E p


de 61 mV para 92 mV, implica em um decrscimo no parmetro de 20 para
0,75, portanto uma grande modificao na k o , mais de 20 vezes, enquanto para
a E p uma modificao de apenas 1,5.
Uma outra forma de expressar k o atravs da corrente de troca, i o . A
relao direta entre esses dois parmetros cinticos pode ser vista na equao
3.2.

io = nFAk o C *

{3.2}

Substituindo-se a equao 3.2 na equao 3.1, verifica-se que i o tambm est


relacionado a como mostra a equao 3.3.

[Dov(nF / RT )]1/ 2 *
io = nFA
C
( Do / DR ) / 2

{3.3}

60

_____________________________________________________________ A camada de xido


Existe uma dependncia linear entre o sobrepotencial, = E-E e q , e a
corrente quando prximo ao potencial de equilbrio, essa relao pode ser
vista na equao 3.4.

i = io (

nF
)
RT

{3.4}

De modo similar a lei de Ohm, o termo (/i), tem a dimenso de resistncia e


usualmente denomina-se esse termo como a resistncia de transferncia do
eltron, R c t , veja a equao 3.5.

R ct =

RT
=
i nFio

{3.5}

Na equao 3.5, tem-se a relao inversa de i o com R c t , deste modo toda


variao que houver na i o tem um efeito inverso na R c t enquanto na
voltametria essa relao no ocorre diretamente, mas pelo intermdio do
parmetro tabelado que ento possibilita estimar-se i o .
O parmetro R c t tambm pode ser mensurado pela impedncia, nessa
tcnica, em um grfico Nyquist um aumento na R c t dado pelo aumento no
semicrculo, como, por exemplo, foi visto na figura 3.6.
Portanto a diminuio na cintica do processo redox devido presena
da camada do xido mais facilmente observada na impedncia do que na
voltamentria cclica. Alm disso a medida da E p mais difcil devido ao
aspecto arredondado da curva onde pequenas variaes implicam em erro na
avaliao da i o . J na impedncia, uma tcnica mais sensvel, a medida da R c t
d imediatamente a relao com a cintica da reao, por exemplo, uma
reao com uma cintica rpida tm uma R c t pequena e vice-versa.
O confronto dos resultados obtidos com a voltametria cclica e a
impedncia pode ser feito atravs do clculo da R c t , veja a equao 3.5. Com

61

_____________________________________________________________ A camada de xido


essa equao pode-se prever o valor da R c t , utilizando-se a estimativa de k o
feita pela voltametria cclica. Para o clculo da R c t , utiliza-se os valores de
E p

obtidos

na

voltametria

cclica

relacionados

aos

respectivos

tabelados 7 7 , D O =D R 78= 1,211x10 - 5 cm 2 .s - 1 para K 4 Fe(CN) 6 e = 0,5 . Os


pontos obtidos com esses clculos podem ser vistos na figura 3.8. A partir
desses pontos se traa a curva de trabalho, dada pela linha slida. Essa curva
ser til na anlise dos circuitos equivalentes em 3.2.3.

Rct (kohm)

6
4
2
0

60

80 100 120 140 160 180 200 220


Ep (mV)

Figura
A=0,038

3.8:

Rct

cm 2 ,

versus
=valores

E p ,

Rct

foi

tabelados 7 7 ,

obtido

da

equao

D O =D R =1,211x10 - 5

3.5,

onde:

cm 2 /s

para

K 4 Fe(CN) 6 , v=50 mV/s, C*=1mM, =0,5, n, F, R e T com seus valores


usuais.

3.2.2.2) Caracterizao da Camada de xido pela Espectroscopia de


Impedncia na Frequncia de 25 Hz

Para verificar qual a tendncia que os dados dos espectros de


impedncia apresentam com a carga, coletou-se os dados de Zre e Zim na
frequncia de 25 Hz.
Na figura 3.9a observa-se que h um aumento na Zre (componente
resistiva do sistema) com o aumento da carga. Esse um comportamento
62

_____________________________________________________________ A camada de xido


esperado se o aumento da carga implicar em um aumento na quantidade de
xido sobre a superfcie do eletrodo o que por sua vez ocasionaria um
aumento na resistncia nessa interface.
Na figura 3.9b, tem-se o resultado da variao da Zim (componente
capacitiva do sistema) com o aumento da carga. Nesse caso Zim relaciona-se
inversamente com a capacitncia (Zim = 1/C), portanto o aumento da Zim,
indica que houve um decrscimo na capacitncia. Seguindo o mesmo
raciocnio de que um aumento na carga resulta em um aumento na espessura
da camada de xido e que esse xido esteja relacionado ao dieltrico de um
capacitor, ocorre que um aumento na espessura do dieltrico resulta em uma
diminuio no valor da capacitncia.

b)

a)

8.5
8.0

1/Zim. (F) - 25 Hz

Zre (kohm) - 25 Hz

2.0
1.8
1.6
1.4

7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0

1.2

4.5

200

400

600

800

1000

200

400

600

800

1000

carga (C)

carga (C)

Figura 3.9: a) Zre versus carga, esses dados foram obtidos na frequncia de
25 Hz dos espectros de impedncia.
b) Capacitncia versus carga, onde a capacitncia dada por 1/Zim., esses
dados foram obtidos na frequncia de 25 Hz dos espectros de impedncia.

Portanto Zre e Zim apresentaram um comportamento compatvel com a


idia de que o aumento da carga resulta em um aumento na quantidade de
xido sobre a superfcie do eletrodo.

63

_____________________________________________________________ A camada de xido


A tendncia das componentes Zre aumentar com a carga e Zim diminuir
com a carga foi verificada em todo o intervalo de 100KHz a 80 mHz, e a
medida que a freqncia ia diminuindo este comportamento se tornava mais
claro, os resultados foram apresentados em 25 Hz, porque nesta freqncia
esta tendncia melhor evidenciada.

3.2.3) Circuitos Equivalentes

Para a anlise dos resultados experimentais foram propostos vrios


circuitos equivalentes com possibilidades de explicar os resultados, mas para
a discusso foram selecionados quatro circuitos, que sero discutidos quanto
qualidade do ajuste e o significado fsico-qumico dos seus elementos.
A escolha do circuito equivalente para a modelagem dos dados
experimentais deve a princpio trazer as mesmas relaes para a resistncia e
capacitncia vistas nas figuras 3.9a-b.

3.2.3.1) Modelo 1
O circuito de Randles, figura 3.10a, foi o primeiro circuito a ser
utilizado para modelar as curvas experimentais. Nesse circuito, definido como
modelo 1, as modificaes causadas pela presena do xido so verificadas
tanto na capacitncia da dupla camada (C d l ) como na resistncia da
transferncia do eltron (R c t ). Na figura 3.10b, mostra-se o resultado da
modelagem entre a curva experimental e o modelo 1. Observa-se que modelo
foi adequado no ajuste da alta e baixa regio de frequncia, no entanto falhou
na regio intermediria (10 2 10 3 Hz), onde o valor do ngulo de fase no
adequado.

64

____________________________________________________________ Circuitos Equivalentes


a)

b)
60
50

R
Rct

10

40
30
3

10

20

| Z | (ohm)

ngulo de fase (graus)

Cdl

10
2

0
-2
10

-1

10

10

10

10

10

10

10

10

frequncia (Hz)

Figura 3.10: a) modelo 1; b) aj uste entre a curva experimental de xido com


carga de 268 C ( )e o modelo (*).

Com o resultado do ajuste pode-se extrair os valores da R c t e C d l em


funo da carga. Na figura 3.11a, apresenta-se o grfico da R c t versus carga,
nesse grfico clara a tendncia de aumentar a R c t com o aumento da carga.
Para a C d l , figura 3.11b, no h uma relao clara de aumento ou diminuio
com a carga. Pode-se dizer que a capacitncia manteve-se praticamente
constante pois a variao entre o valor mximo e mnimo foi de apenas
0,25 F.
b)

a)

1,30

2.1

1,25

Cdl (F)

1,35

2.4

Rct (kohm)

2.7

1.8
1.5

1,20
1,15

1.2

1,10

0.9

1,05

200

400

600

800

200

1000

400

600

800

1000

carga (C)

carga (C)

Figura 3.11: a) relao da R c t obtida com o modelo 1 versus carga; b)


relao da C d l obtida com o modelo 1 versus carga.
65

____________________________________________________________ Circuitos Equivalentes


Os valores encontrados para a R c t , quando confrontados com a curva de
trabalho, figura 3.12, encontram-se prximos curva, situados ligeiramente
acima da linha. Esse comportamento indica que a R c t dada pelo ajuste
semelhante a observada na voltametria cclica.

2.5

Rct (kohm)

2.0

1.5

1.0

0.5
80

90

100

110

120

Ep (mV)

Figura 3.12: Comparao entre os valores obtidos de R c t ( ! ) com o modelo 1


e o previsto pela curva de trabalho apresentada na figura 3.8 ().

3.2.3.2) Modelo 2

Com o objetivo de separar a contribuio da camada do xido dos


demais elementos do circuito de Randles, adicionou-se um circuito RC. Este
circuito RC foi inicialmente colocado em paralelo ao circuito de Randles,
como mostra a figura 3.13a, assumindo-se com esse circuito que se chamou de
modelo 2, uma camada com ilhas de xido onde a transferncia de eltrons
pode ocorrer pela platina ou pela camada de xido. A adio do circuito em
paralelo no melhorou a modelagem, observe a figura 3.13b, inclusive piorou
o resultado na regio de baixa frequncia e continuou no ajustando o valor
do ngulo de fase na regio intermediria (10 2 -10 3 Hz).

66

____________________________________________________________ Circuitos Equivalentes


a)

b)
60

ngulo de fase (graus)

Cox
R

Cdl

Rct

10

50

40
30

10
20

| Z | (ohm)

Rox

10
0
-2
10

-1

10

10

10

10

10

10

10

10

frequncia (Hz)

Figura 3.13: a) o modelo 2; b) aj uste entre a curva experimental de xido


com carga de 268 C ( ) e o modelo 2(*).

Para

complementar

anlise

desse

modelo

verificou-se

qual

comportamento dos parmetros R o x e C o x (o ndice ox se refere ao xido)


frente carga, note que agora a resistncia e a capacitncia so em relao ao
xido e no mais a R c t e C d l . Para os parmetros R o x e C o x , resultado mostrado
respectivamente nas figuras 3.14c-d, no se observou uma tendncia clara de
aumento ou diminuio em funo da carga. A incluso de um circuito em
paralelo ao modelo 1 no melhorou a modelagem dos dados. A componente
R o x apresentou valores 100 vezes maiores dos demais modelos, e C o x no
apresentou nenhuma tendncia definida.
a)

b)
0,22

200

0,20
0,18

150
Cox (F)

Rox (kohm)

175

125
100

0,16
0,14
0,12
0,10

75

0,08

200

400

600

800

1000

200

carga (C)

400

600

800

1000

carga (C)

Figura 3.14: a) relao da R o x obtida com o modelo 2 versus carga; b)


relao da C o x obtida com o modelo 2 versus carga.
67

____________________________________________________________ Circuitos Equivalentes


A R c t da mesma forma do que comentado para o modelo anterior, teve
seus valores prximos curva de trabalho, como mostra a figura 3.15.

2.5

Rct (kohm)

2.0

1.5

1.0

0.5
80

90

100

110

120

Ep (mV)

Figura 3.15: Comparao entre os valores obtidos de R c t ( ! ) e o previsto


pela curva de trabalho apresentada na figura 3.8 ().

3.2.3.3) Modelo 3

Visto que a modelagem com o circuito que assume uma camada com
ilhas de xido (fig.3.13a) no ter resultado em melhoras no ajuste j obtido
com o circuito de Randles props-se um terceiro circuito equivalente. Nesse
modelo, que se denominou modelo 3, assume-se uma camada contnua e
compacta de xido, para tal adiciona-se um circuito RC em srie ao circuito
de Randles, como mostra a figura 3.16a. A incluso desse circuito melhorou o
ngulo de fase na regio intermediria, deficiente no modelo anterior, no
entanto ainda houve um desvio da curva experimental no intervalo de 10 2
10 1 Hz, esse resultado mostrado na figura 3.16b.

68

____________________________________________________________ Circuitos Equivalentes


a)

b)
50

Cdl
Rox

Cox

Rct

40
30

10

20

| Z | (ohm)

ngulo de fase (graus)

10

10
2

0
-2
10

-1

10

10

10

10

10

10

10

10

frequncia (Hz)

Figura 3.16: a) o modelo 3, b) aj uste entre a curva experimental de xido


com carga de 268 C ( ) e o modelo 3(*).

A variao dos parmetros R o x e C o x com a carga pode ser vista


respectivamente na figuras 3.17a e 3.17b. A R o x apresenta uma tendncia de
aumentar com a carga e C o x diminuir com a carga. Essas tendncias esto de
acordo com as expectativas discutidas quando se apresentou a relao de Zre
e Zim na frequncia de 25 Hz, figuras 3.8 e 3.9.
b)

a)
1.0

22
20
18
16

Cox (F)

Rox (kohm)

0.8

0.6

14
12
10
8
6

0.4

200

400

600

800

200

1000

400

600

800

1000

carga (C)

carga (C)

Figura 3.17: a) relao da R o x obtida com o modelo 3 versus carga; b)


relao da C o x obtida com o modelo 3 versus carga.

69

____________________________________________________________ Circuitos Equivalentes


Nesse modelo os valores da R c t situaram-se abaixo da curva de trabalho
e com pontos mais dispersos, como pode ser visto na figura 3.18.

2.5

Rct (kohm)

2.0

1.5

1.0

0.5
80

90

100

110

120

Ep (mV)

Figura 3.18: Comparao entre os valores obtidos de R c t ( ! ) e o previsto


pela curva de trabalho apresentada na figura 3.8 ().

3.2.3.4) Modelo 4

Uma outra maneira ainda de se analisar o filme xido, seria como uma
camada isolante e rugosa sobre o eletrodo. Esse circuito 79,

80

, que se

denominou modelo 4, apresenta uma capacitncia em paralelo, C o x , a uma


resistncia, R o x , e ao circuito de Randles, como mostra a figura 3.19a. A
utilizao desse modelo resultou tambm no ajuste adequado do ngulo de
fase havendo, no entanto, ainda uma pequena discrepncia entre o modelo e a
curva experimental na regio de 10 2 -10 1 Hz, esse resultado pode ser visto na
figura 3.19b.

70

____________________________________________________________ Circuitos Equivalentes


b)
50

ngulo de fase (graus)

Cox
Cdl
Rox
Rct

10

40
30
3

10

20

| Z | (ohm)

a)

10
2

0
-2
10

-1

10

10

10

10

10

10

10

10

frequncia (Hz)

Figura 3.19: a) o modelo 4, b) aj uste entre a curva experimental de xido


com carga de 268 C ( ) e o modelo 4(*).

A variao da R o x e C o x com a carga apresentaram o comportamento


previsto, de respectivamente aumentar e diminuir com a carga. Esses
resultados podem ser vistos nas figuras 3.20a-b.

b)

a)

1,20

1.6

1,15

1.4

Cox (F)

Rox (kohm)

1,10

1.2
1.0

1,05
1,00
0,95

0.8

0,90

0.6

200

400

600

800

200

1000

400

600

800

1000

carga (C)

carga (C)

Figura 3.20: a) relao da R o x obtida com o modelo 4 versus carga; b)


relao da C o x obtida com o modelo 4 versus carga.

71

____________________________________________________________ Circuitos Equivalentes


Os valores da R c t se localizaram prximos e um pouco abaixo da curva
de trabalho, esse resultado pode ser visto na figura 3.21.

2.5

Rct (kohm)

2.0

1.5

1.0

0.5
80

90

100

110

120

Ep (mV)

Figura 3.21: Comparao entre os valores obtidos de R c t ( ! ) e o previsto


pela curva de trabalho apresentada na figura 3.8 ().

Na

escolha

de

um

modelo

para

descrever

interface

eletrodo/xido/soluo, descartaram-se os modelos 1 e 2 devido m


qualidade no ajuste das curvas experimentais. Os modelos 3 e 4 vistos na
figuras 3.16a e 3.19a, tiveram o melhor resultado na modelagem das curvas
experimentais e no comportamento qualitativo esperado para R o x e C o x em
funo da carga. A diferena entre o modelo 3 e 4 est na forma como a
camada de xido participa na interface, no primeiro modelo, como uma
camada condutora e no segundo como uma camada isolante. Considerou-se o
modelo 4 o mais adequado para explicar os resultados obtidos, essa deciso
foi baseada em informaes encontradas em literatura 8 7 que sustentam que
filmes finos de xido podem ser tratados como isolantes essa questo ser
abordada em 3.2.5 com maiores detalhes. Esse modelo tambm apresentou o
comportamento da Rct versus E p , figura 3.21, o que mais se aproxima da
curva de trabalho.

72

____________________________________________________________ Circuitos Equivalentes


As informaes dadas pela resistncia e capacitncia devem ser
avaliadas quantitativamente para se verificar se refletem as propriedades do
xido, esse estudo descrito em 3.2.4.

Clculo
3.2.4) C lculo da Espessura da Camada de xido

Na literatura encontra-se que a espessura 81,

82

da camada de xido

produzida em condies similares as deste trabalho varia entre 6 a 7. Uma


maneira de verificar se os valores obtidos para R o x e C o x , obtidos com o
modelo 4, expressam as propriedades do xido de platina calcular a
espessura da camada. Para tal aplicaram-se esses valores a expresses
caractersticas de resistores e capacitores.
Na expresso 3.6, tpica para descrever resistores, se observa que a
resistncia (R) tem uma relao direta com a espessura (d), isto , um
aumento na resistncia implica tambm num aumento da espessura.

R=

d
A

{3.6}

Onde , a resistividade do xido em (.cm)


Esse comportamento pode ser observado na figura e 3.20a, onde se
relaciona R o x versus a carga.
Para o clculo da espessura da camada de xido avaliou-se inicialmente
a rea real do eletrodo. Para esse procedimento analisou-se a voltametria
cclica do eletrodo de platina em meio cido, onde a rea sob os picos de
adsoro e dessoro do hidrognio relacionada a carga de 210 C.cm - 2 ,
valor usualmente dado para uma monocamada 83 de hidrognio. O valor da rea
obtido com esse procedimento foi de 0,05 0,002 cm 2 .

73

___________________________________________________ Um modelo para o filme de xido


Na equao 3.6, o valor da resistividade, , utilizada 84 para o xido de
platina foi de 10 3 .cm, os valores obtidos para a espessura so apresentados
na tabela 3.1.
A tabela 3.1 mostra que o clculo da espessura utilizando a expresso
3.6 resulta em valores na ordem de centmetros o que um resultado absurdo
para as camadas de xido deste trabalho. Isto pode estar relacionado a uma
dificuldade na avaliao da rea utilizada na expresso. O recobrimento da
superfcie pode apresentar pontos fracos (regies no recobertas com xido ou
com

filmes

extremamente

finos)

que

seriam

os

preferenciais

para

transferncia dos eltrons. Portanto somente na rea correspondente a estes


pontos que deveria ser aplicada a expresso. Outra considerao ainda pode
ser feita quanto a resistividade 85,

86

pois outros valores foram citados para o

PtO/PtO 2 , como por exemplo 10 6 .cm ou ainda 10 3 .cm, no entanto apenas


uma resistividade com valor de 10 9 .cm resultaria em valores semelhantes
aos encontrados na literatura. A grande discrepncia entre os valores
divulgados para a resistividade deve-se provavelmente ao fato da preparao
do xido influenciar nessa determinao. Observe que os dados encontrados
na literatura variaram nove ordens de grandeza, portanto difcil se avaliar a
espessura utilizando a expresso 3.6. Deste modo acredita-se que, R o x , no
expresse

apenas

caractersticas

intrnsecas

do

xido,

mas

tambm

de

propriedades interfaciais.
A expresso 3.7 aplicada a capacitores de placas paralelas com um
dieltrico ():

C=

. 0 . A
d

{3.7}

Nessa equao um aumento na espessura d implica numa diminuio


no valor da capacitncia (C), esse comportamento tambm foi observado na
figura 3.20b onde se relaciona a C o x com a carga.

74

___________________________________________________ Um modelo para o filme de xido


Os resultados dos clculos das espessuras, utilizando-se a expresso 3.7
podem ser vistos na tabela 3.1; nesses clculos, assumiu-se para a constante
dieltrica do xido de platina () os valores 10 e 15. Nesse intervalo
encontram-se na literatura as constantes dieltricas 7 8 para o xido ferroso
(14,2), xido de tntalo (11,5), entre outros.

Tabela 3.1: Valores calculados para a espessura da camada de xido utilizando as


expresses 3.8 e 3.7.

carga

Espessura calculada

Espessura calculada

com a expresso 3.6

com a expresso 3.7

=10 3 .cm

=10

=15

60 C

0,049 cm

4,10

6,18

265 C

0,044 cm

4,24

6,37

500
C

0,052 cm

3,88

5,82

1000 C

0,061 cm

4,38

6,58

Os valores obtidos para a espessura utilizando a capacitncia (equao


3.7) so coerentes na ordem de grandeza e prximos aos valores encontrados
na literatura, vide tabela 3.1, mostrando que essa componente apropriada
para anlise das propriedades do xido. A rea nesse caso, no relacionada
aos pontos fracos de recobrimento, mas rea do eletrodo.

3.2.5)
3.2.5 ) Como a Interface Eletrodo Soluo Foi Alterada pela
Presena de xido?

Os resultados analisados at o momento mostram que o xido


modifica a interface eletrodo/soluo e que as informaes dadas pela

75

___________________________________________________ Um modelo para o filme de xido


resistncia e pela capacitncia esto ligadas as caractersticas interfaciais
associadas presena do xido. No trabalho de Damjanovic 87 e colaboradores
onde foram estudados processos com transferncia de eltrons sobre filmes
finos de xido, eles propuseram que esse processo ocorria pelo tunelamento 88
dos eltrons atravs desse filme. Nesse modelo 89 a velocidade de reao
decresce exponencialmente com a espessura do xido como pode ser visto na
equao 3.8:

ia = k a e

mFq (1 ) F
)
RT
2 RT e

{3.8}

i a , corrente andica
k a , fator pr-exponencial dependente da escolha do eletrodo de referncia
m, parmetro experimental [=(dE/dq) i ]
q, carga (Coulomb), equivalente espessura do filme e a largura da barreira
para o tunelamento
, potencial de Galvani
, fator de simetria que esta relacionado a .

Com

objetivo

de

se

verificar

comportamento

descrito

por

Damjanovic para os resultados apresentados na figura 3.4 (i p a versus carga),


traou-se o grfico do logaritmo da corrente de pico andica versus a carga
utilizada para a formao da camada de xido, figura 3.22. O resultado mostra
uma queda linear da corrente em funo da carga, comportamento que est de
acordo com o proposto por Damjanovic, permitindo assim a continuidade da
anlise dos resultados utilizando a equao 3.8. importante ressaltar ainda
que com esse resultado tambm se pode dizer que o aumento da carga
implicou num aumento da espessura da camada de xido.

76

___________________________________________________ Um modelo para o filme de xido

-5,26
-5,27
-5,28

Log ipa

-5,29
-5,30
-5,31
-5,32
-5,33
-5,34
0

200

400

600

800

1000

carga (C)

Figura 3.22: Log i p a versus carga, para o eletrodo de platina em uma soluo
de ferri-ferrocianeto de potssio. O coeficiente de correlao da reta de
0,84.

Reescrevendo a equao 3.8, quando = e q u i l b r i o , ento tem-se que


a corrente andica igual a corrente de troca (i a = i o ):

io = k a

mFq
F
(1 ) e
RT e
RT
e

{3.9}

e = potencial no equilbrio
Substituindo i o na equao 3.5

Rct =

RT
mFq (1 ) e F
nF k a e 2 RT e RT

{3.10}

77

___________________________________________________ Um modelo para o filme de xido


e finalmente a equao 3.10 resultando em:

log Rct = log

e F
mFq
RT
+
(1 )
nFka 2 RT 2,303
RT 2,303

{3.11}

Aplicando-se a relao da resistncia de transferncia do eltron e a carga,


mostrada na equao 3.11, para os valores da R c t encontrados com o modelo 4
obtm-se o grfico da figura 3.23.

3.3
3.2

Log Rct

3.1
3.0
2.9
2.8
0

200

400

600

800

1000

carga (C)

Figura 3.23: Log R c t versus carga, os valores de R c t foram obtidos para o


modelo 4.

Verifica-se que o modelo proposto por Damjanovic e colaboradores


tambm pde ser aplicado aos resultados apresentados nesse trabalho,
conforme pode ser visto na figura 3.23. Nessa figura observa-se que o
aumento da carga na formao da camada de xido dificulta o tunelamento
dos eltrons e consequentemente aumenta a resistncia na transferncia de
eltrons.

78

___________________________________________________ Um modelo para o filme de xido

xidos
3.2.6) Comparativo Entre as Camadas de xidos Produzidas
Quimicamente e Eletroquimicamente

Para se estabelecer um paralelo entre os resultados obtidos com


camadas formadas eletroquimicamente e quimicamente h a necessidade de se
associar uma carga s camadas qumicas. Com esse objetivo analisa-se os dois
valores da R c t obtidos para a camada qumica e verifica-se que um desses
valores se aproxima muito a uma R c t para uma carga de 50 C e o outro valor
ficou mais abaixo das curva o que pressupe uma carga inferior a 50 C e
portanto situada fora do intervalo estudado, observe a figura 3.24.

3.3
3.2

Log Rct

3.1
3.0
2.9
2.8
2.7
0

200

400

600

800

1000

carga (C)

Figura 3.24: Log R c t versus carga, valores de R c t obtidos com o modelo 4


para camadas de xido formadas eletroquimicamente (); valor da carga para
as camadas de xido formadas quimicamente ().

A anlise dos espectros de impedncia de vrias camadas de xido


mostrou diferenas entre um xido qumico e um eletroqumico no que diz
respeito regio onde o ngulo de fase apresenta seu ponto mximo. Na
figura 3.25, observa-se que xidos eletroqumicos com cargas de 1000 C e
79

___________________________________________________ Um modelo para o filme de xido


50 C apresentam o valor mximo do ngulo de fase em frequncias prximas
respectivamente em 204 Hz e 289 Hz, no entanto, esse valor mximo
deslocado para uma frequncia de 523 Hz quando se trata de uma camada
qumica. Admitindo-se que a camada qumica tenha aproximadamente uma
carga de 50 C, observa-se que a frequncia foi deslocada em pelo menos
duas vezes e meia quando comparada a camada eletroqumica de mesma carga.
Esses fatos mostram que existem diferenas entre essas duas camadas e que
no dizem respeito somente carga envolvida em sua formao.

60

xido eletroqumico - 1000 C


xido eletroqumico - 50 C
xido qumico

ngulo de fase (graus)

50
40
30
20
10
0
-3
-2
-1
10 10 10

10

10

10

10

10

10

frequncia (Hz)

Figura 3.25: Grfico de Bode ngulo de fase para o eletrodo de platina em


uma soluo de ferri-ferrocianeto de potssio para uma camada de xido
formada

quimicamente

(),para

uma

camada

de

xido

formada

eletroquimicamente com carga 1000 C ( - - - - ) e 50 C (-o-).

A modelagem das curvas de espectroscopia de impedncia ao modelo 4


com xido qumico e eletroqumico, pode ser apresentada num grfico de
colunas, onde cada coluna representa a mdia de vrios experimentos. Para a
construo desses grficos utilizou-se os dados de camadas eletroqumicas
formadas com uma carga mdia prxima, no caso de 61 C, camada
qumica. Na figura 3.26a, mostra-se variao da C o x e da C d l , o grfico
mostra que os valores desses componentes so maiores para o xido
80

___________________________________________________ Um modelo para o filme de xido


eletroqumico. Atribui-se esse fato ao xido eletroqumico possivelmente no
cobrir totalmente a rea do eletrodo, crescendo de uma forma mais irregular
enquanto para o xido qumico tem-se uma camada mais uniforme e compacta.
Na figura 3.26b, tem-se a R o x e a R c t , novamente essas componentes so
maiores para o xido eletroqumico, reforando a idia de que esta camada
seja mais rugosa e provavelmente mais espessa aumentando desse modo a
resistncia desse sistema. Acredita-se que o tempo envolvido na produo das
camadas

qumica

eletroqumica

seja um

fator de diferenciao das

caractersticas apresentadas pelos componentes eltricos. Na primeira o tempo


gasto para a sua produo foi de 5 minutos enquanto que na segunda foi de
poucos segundos, portanto uma formao mais rpida tende a ser mais
irregular, ou seja, mais rugosa. Outro fator seria a carga envolvida na
formao dessas camadas, que como visto anteriormente se relacionou a
espessura do filme de xido. Deste modo, tem-se que os filmes de xido
eletroqumico utilizaram em torno de 61 C enquanto que para a camada
qumica,

associou-se

uma

carga

em

torno

de

50

ou

menos,

consequentemente, a primeira mais espessa do que a segunda o que tambm


contribui para aumentar a resistncia do sistema.
a)

b)

2.0
1.6
1.2
0.8

+0,02
+4,0
+0,3

0.4

Capacitncia (F)

+0,1

+0,1

1.0
0.8

+0,2

0.6
0.4

+0,9

+0,003

0.2
0.0

0.0

Resistncia (kohm)

1.2

2.4

Cdl

x. eletroqumico

x. qumico

Cox

x. eletroqumico

x. qumico

Rct

Rox

Figura 3.26: Resultado dos valores dos componentes eltricos obtidos com o
aj uste ao modelo 4. Os valores so resultado da mdia de 7 experimentos
para camada eletroqumica (carga mdia de 61 C) e 2 experimentos para
camada qumica. Colunas brancas para xido qumico e colunas cinzas para
xido eletroqumico. O intervalo de confiana de 90%.
81

___________________________________________________ Um modelo para o filme de xido


Com base na discusso dos resultados da figura 3.27 sugere-se dois
possveis modelos para as camadas de xido. A camada de xido qumico
contnua e menos rugosa, figura 3.27a, e a camada eletroqumica, figura
3.27b, mais rugosa e tambm mais espessa.

b)

a)

xido eletroqumico

xido qumico

Figura

3.27:

Desenho

esquemtico:

a)

camada

de

xido

formada

quimicamente; b) camada de xido formada eletroquimicamente .

3.3) Adsoro da Con A e a Camada de xido

A adsoro da con A bastante afetada pela modificao da


superfcie da platina com xido. Essa modificao foi observada inicialmente
no voltamograma cclico do eletrodo de platina em ferri-ferrocianeto de
potssio, figura 3.28a, onde os picos de xido-reduo foram praticamente
suprimidos devido ao bloqueio 90 da superfcie com a protena. Na impedncia,
figura 3.28b, tambm se verificou que a protena bloqueia mais intensamente
quando o xido esta presente na superfcie. Observe que a R c t aumentou em
pelo menos 10 vezes em relao ao bloqueio de uma superfcie sem xido.
Adicionalmente, a comparao entre a R c t obtida para a superfcie com xido
e aps a adsoro da con A mostrou que essa componente aumentou
aproximadamente 6 vezes. Esse aumento tambm um indicativo de que a
superfcie foi recoberta pela protena.
82

__________________________________________________________ A adsoro da Lectina

a)

b)
4

Zim (kohm)

20

0
-2
-4

10 Hz
100 Hz

Zim (kohm)

Corrente (A)

63,1 Hz

25

15

Zre (kohm)

15,8 Hz

10

2,9 Hz

10 Hz

5 100 Hz

-6
0

100

200

300

400

500

Potencial / mV (E/Ag/AgClsat)

10

15

20

25

Zre (kohm)

Figura 3.28: a)Voltamograma cclico, b) Grfico Nyquist; para o eletrodo de


platina em uma soluo de ferri-ferrocianeto de potssio, () superfcie sem
xido recoberta com protena desativada; (o) superfcie com xido e
recoberta com protena desativada.

Na literatura discute-se que geralmente as protenas adsorvem mais


facilmente sobre superfcies hidrofbicas 1 6 , no entanto resultados obtidos
para a con A mostram que a adsoro foi intensificada sobre uma superfcie
mais hidroflica 91. Um resultado semelhante foi obtido com a adsoro de
ovalbumina sobre xido de alumnio 4 8 , onde inclusive se comenta que a
presena do xido evita a desnaturao da protena.

3.3.1) O circuito Equivalente

O modelo 4, j mostrado em 3.2.3, tambm foi utilizado para descrever


os resultados com protenas 92, 93, um exemplo do resultado dessa modelagem
83

__________________________________________________________ A adsoro da Lectina


pode ser visto na figura 3.29a. A relao da R c t obtida para esse modelo e a
E p muito prxima da prevista pela curva de trabalho, veja a figura 3.29b,
assegurando que o modelo esteja fornecendo valores compatveis para uma
R c t . Um outro aspecto importante desse grfico que se observa uma clara
separao das R c t , que aumentam quando se passa de uma situao em que a
con A est na forma ativada para a forma desativada, isso ocorrendo tanto
para o xido qumico como para o eletroqumico.

b)

a)

70

60

50
40
30

10

20

Rct (kohm)

10

| Z | (ohm)

ngulo de fase (graus)

80

6
5
4
3
2

10

0
-3
-2
-1
10 10 10

10

10

10

frequncia (Hz)

10

10

10

10

80

100

120

140

160

180

200

220

Ep (mV)

Figura 3.29: a) aj uste entre a curva experimental da adsoro da con A na


forma desativada () e o modelo 4 (*); b) comparao entre os valores da R c t
obtidos com o modelo 4 para a con A adsorvida na forma: desativada sobre
xido eletroqumico (+), desativada sobre xido qumico (); ativada sobre
xido eletroqumico (*), ativada sobre xido qumico() e curva de trabalho
().

Na tabela 3.2, apresenta-se os valores obtidos com a modelagem para os


parmetros R p r o , C p r o , R c t e C d l , nas condies experimentais estudadas.

84

__________________________________________________________ A adsoro da Lectina


Tabela 3.2: Valores das componentes R p r o , C p r o R c t e C d l obtidos para a adsoro da
con A em diversas condies experimentais utilizando o modelo 4.

Superf cie Ativao


(k
Rpro (k)
da
prote na
Ativ.
0,728 a0,256
Pt

Cpro (F)

(k
Rct (k)

Cdl (F)

0,532 a0,022

0,411a0,212

2,19a0,099

Pt

0,848 a0,427

0,554 a0,035

0,447a0,184

2,24a1,02

Pt\
Pt\PtOeq

Ativ.

4,28 b 1,68

0,69 b 0,078

3,15b1,45

1,12b0,079

Pt\
Pt\PtOq

Ativ.

2,99 a0,786

0,639 a0,029

1,87 a0,698

1,46a1,81

Pt\
Pt\PtOeq

Desativ.

8,70 b3,48

0,694 b0,107

5,16 b1,80

1,92b1,85

Pt\
Pt\PtOq
a

Desativ.

Desativ.

7,44 b1,35

0,701 b0,047

6,14 b1,46

1,25b0,027

md ia d e 5 e xp e r imento s,

md ia d e 7 e xp e r imento s

No ta 1 : O inter va lo d e c o nfian a d e 9 5 %;
No ta 2 : a carga utilizad a fo i d e 6 1 C p a r a a p r o d u o d e filme d e xid o e le tr o q umico

Destaca-se que R p r o e C p r o so componentes somados a R o x e C o x ,


portanto expressam as mudanas interfaciais devido presena do xido, e
que agora passam a expressar tambm as mudanas interfaciais devido
presena da protena. No caso da superfcie de platina sem xido, apenas a
contribuio da protena. A carga utilizada para a produo do filme de xido
eletroqumico foi em torno de 61 C.
Os resultados obtidos com a adsoro da protena sobre a platina sem
xido mostraram que os parmetros R p r o e R c t diferenciam sutilmente a forma
ativada e desativada, com valores ligeiramente superiores para a ltima forma
citada. Os valores de C p r o e C d l foram semelhantes para as duas formas.
No entanto quando se comparam os resultados para as situaes sem e
com xido, se observa um grande aumento na resistncia. Esse fato j havia
sido mostrado qualitativamente em 3.3, e agora se confirma comparando-se os
valores desses componentes, h pelo menos um aumento de 10 vezes para a
protena desativada.
De uma forma geral, os resultados para a R c t e para a R p r o com xido,
apresentados no grfico 3.30a-b, so os parmetros que diferenciam a protena

85

__________________________________________________________ A adsoro da Lectina


na forma ativada e desativada, com valores resistivos mais altos para a
protena desativada. Esse comportamento idntico tanto para a exposio da
protena

sobre

uma

superfcie

modificada

com

xido

qumico

como

eletroqumico.
b)

a)
6.0

1.5

6
4
2

0.0

Desativada

Desativada

Ativada
eletroqumico

Rpro (kohm)

3.0

Rct (kohm)

4.5

Ativada

qumico

eletroqumico

qumico

Figura 3.30: Resultados da adsoro da con A ativada e desativada sobre


xido

qumico

eletroqumico,

esses

resultados

so

mdias

de

experimentos obtidos para os seguintes componentes do modelo 4: a) R c t ;


b) R p r o .

A capacitncia do mesmo modo que a resistncia tambm bastante


modificada quando se comparam os resultados sem e com xido. No caso da
C d l , esta diminui pelo menos uma vez tanto para a forma ativada como
desativada. No caso da C p r o o efeito tambm verificado, no entanto nesse
caso h um aumento de pelo menos uma vez.
As capacitncias C d l e C p r o , para superfcies com xido, apresentam
resultados que no distinguem a forma ativada e desativada da con A,
apresentando valores semelhantes de C p r o para as duas formas. A C d l , figura
3.31, tem a tendncia de aumentar para a forma desativada quando a adsoro
ocorre sobre um xido eletroqumico, no entanto, essa tendncia inverte
quando a adsoro ocorre sobre um xido qumico.

86

__________________________________________________________ A adsoro da Lectina


2.0

1.0

Cdl (F)

1.5

0.5
0.0

Desativada
Ativada
eletroqumico

qumico

Figura 3.31: Resultados obtidos para a adsoro da con A ativada e


desativada sobre xido qumico e eletroqumico, esses resultados so mdias
de 7 experimentos obtidos para a componente C d l no modelo 4.

3.3.2) Efeito da Quantidade de xido na Adsoro da


Prote na
As propriedades interfaciais da platina so modificadas com a presena
do xido, essa modificao pde ser observada na R c t , que aumenta com o
aumento da carga para a formao do filme de xido, veja figura 3.32. E o
aumento da carga para a produo do filme de xido, como j comentado
anteriormente em 3.2.4, implica tambm em um aumento na quantidade de
xido sobre a superfcie.
1.6

Rct (kohm)

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0

200

400

600

800

1000

carga ( C)

Figura 3.32: Variao da R c t com a carga, resultados obtidos para o eletrodo


de platina em ferri-ferrocianeto de potssio utilizando o modelo 4.

87

__________________________________________________________ A adsoro da Lectina


A adsoro da con A tambm sensvel a essa mudana interfacial
provocada pelo xido, como pode ser verificado na figura 3.33.

Rct (xido+protena) (kohm)

50
40
30
20
10
0

200

400

600

800

1000

carga (C)

Figura 3.33: R c t

(xido+protena)

versus carga para o eletrodo de platina exposto

30 min em con A desativada em ferri-ferrocianeto de potssio.

Na figura acima se observa que a R c t

(xido+protena)

aumenta com o

aumento da carga indicando um aumento no bloqueio da superfcie do


eletrodo com a protena em funo do aumento da carga. Portanto quanto mais
xido sobre a superfcie do eletrodo melhor adsoro da protena. A
comparao das figuras 3.32 e 3.33 evidencia esse efeito, mostrando que a
Rct

(xido+protena)

aumentou aproximadamente 10 vezes e que no apenas um

aumento proporcional devido ao xido, uma vez que essas curvas apresentam
inclinaes diferentes.

88

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A

3.3.2) Caracterizao da Adsoro da Con A

O conhecimento da orientao e/ou conformao 1 da protena pode


auxiliar na interpretao dos resultados esclarecendo as diferenas observadas
na adsoro da protena em relao superfcie e sua forma ativada ou
desativada.
Jackson et al 94, utilizaram tcnicas eletroqumicas para determinar a
conformao da albumina de soro bovino e do fibrinognio sobre o titnio. A
idia foi associar densidade de carga obtida na voltametria cclica a
quantidade de protena adsorvida para assim ter acesso concentrao
superficial da protena. Essas protenas, por meio dos grupos carboxilatos 95,
adsorvem na superfcie metlica segundo a reao 3.12:

P + nM P(M) n , a d s + ne

{3.12}

Onde P, a protena; M, o metal e n o nmero de grupos


carboxilatos; a adsoro da protena ao metal esta associada transferncia
de n eltrons. Assim pde-se relacionar a densidade de carga com a
quantidade de molculas de protena.
No caso da con A, a adsoro no envolve uma reao eletroqumica.
No entanto esta protena bloqueia a reao de transferncia de eltrons do
ferri-ferrocianeto de potssio, assim considerou-se a possibilidade de se
avaliar a quantidade de protena atravs desse bloqueio. Deste modo o mesmo
princpio foi aplicado para se obter a densidade de carga (Q) para a con A. Os
resultados so apresentados na tabela 2 onde o valor Q a d s %, percentual da
rea recoberta com protena dada pela densidade carga, obtido segundo a
expresso 3.13.

89

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A

Q( semprotena ) _ Q( comprotena )
Qads % =
100
Q( semprotena )

Onde Q ( s e m

{3.13}

a carga obtida integrando-se no voltamograma cclico a

protena)

rea sob os picos de ferri-ferrocianeto de potssio, Q ( c o m

protena)

a carga

obtida integrando-se no voltamograma cclico a rea sob os picos de ferriferrocianeto de potssio aps a adsoro da protena.
Os valores Q a d s %, apresentados na tabela 3.3, expressam um crescente
aumento no bloqueio da superfcie mostrando que a transferncia de eltrons
ocorre com mais dificuldade em uma superfcie de platina/xido/protena do
que em platina/protena. Mas como saber se esse valor percentual pode ser
relacionado ao grau de recobrimento da superfcie? Com a finalidade de
esclarecer

essa

questo

estabeleceu-se

um

paralelo

entre

os

valores

encontrados para o percentual de recobrimento da superfcie dado pela Q e


pela R c t . O parmetro R c t foi escolhido porque um dado cintico da reao
que informa a facilidade ou no da mesma ocorrer e que pode ser afetado pela
presena da protena na superfcie do eletrodo. Pode-se obter o valor da R c t
com a voltametria cclica, utilizando-se a expresso 3.5, e tambm pela
impedncia. O clculo do percentual da superfcie recoberta com protena,
dada pela resistncia R c t %, foi obtido utilizando uma expresso anloga a
3.13.

Tabela 3.3: Valores do percentual de rea recoberta com protena obtida a partir da
carga Qads%, da voltametria cclica R c t % (VC) e impedncia R c t % (IM).

Superfcie

Qads%

R c t % (VC)

R c t %(IM)

Pt/con A desativada

3,54

44,8

57,6

Pt/PtO e q /con A

18,3

57,9

48,1

43,1

87,5

86,8

ativada
Pt/PtO e q /con A
desativada

90

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A

A anlise da tabela 3.3 mostra uma diferena muito grande no grau de


recobrimento dado pela Q a d s % e as R c t % dadas pela voltametria cclica e
impedncia,

esses

dois

ltimos

parmetros

com

valores

semelhantes.

Esperava-se que tanto Q quanto R c t fornecessem valores parecidos para o


bloqueio, no entanto concluiu-se que a quantidade de carga transferida pelo
sistema Fe 3 + /Fe 2 + , no um parmetro adequado para informar o grau de
bloqueio ou de recobrimento da superfcie, pelo menos no que diz respeito a
con A, pois embora a protena bloqueie a superfcie ela no impede a
transferncia dos eltrons, portanto os valores de Q a d s % vistos na tabela 3.3
mostram que a protena dificulta a transferncia de eltrons, mas, esses
valores no indicam o grau de recobrimento. No caso dos valores obtidos para
R c t % os valores parecem indicar o percentual de recobrimento da superfcie,
no entanto, no se tem conhecimento da relao desse parmetro com o
nmero de molculas adsorvidas ou a sua conformao. Essa relao no
envolve interaes eletroqumicas como ocorreu no trabalho com a albumina
de soro bovino e o fibrinognio 9 5 , onde foi possvel se fazer uma relao do
nmero de molculas com a densidade de carga porque as interaes com a
superfcie envolviam uma reao eletroqumica.
Como j apresentado anteriormente em 3.2.5, o modelo de Damjanovic
e colaboradores, foi utilizado para explicar o efeito da espessura camada de
xido sobre a velocidade de reao de oxi-reduo do ferri-ferrocianeto de
potssio. Sabendo-se que o tamanho da barreira para o tunelamento
influenciado pela espessura do xido e que esse processo independe da
natureza do material presente na barreira, cogitou-se a possibilidade de se
utilizar o mesmo modelo para o eletrodo recoberto com protena. Nesse caso a
protena tambm faria parte da barreira para o tunelamento juntamente com o
xido.
Na equao 3.11, relaciona-se a R c t com a carga, essa mesma equao
pode ser expressa em funo da espessura 96 do xido atravs da expresso
3.14.

91

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A

mFq
= d
2 RT

{3.14}

Onde um parmetro determinado experimentalmente.

Substituindo 3.14 na expresso 3.11 obtm-se:

log Rct = log

(1 ) e F
d
RT
+

nFk a 2,303
2,303RT

{3.15}

Um grfico semelhante ao mostrado na figura 3.24 reapresentado em funo


da espessura da camada de xido, essa espessura calculada conforme a
equao 3.7, como j comentado 3.2.4. A curva de trabalho obtida na figura
3.34, gera uma equao da reta com um inclinao caracterstica para a
reao do ferri-ferrocianeto de potssio, com esse procedimento pdese
obter nesse meio o valor da espessura da camada de protena.

3,6
3,4

log Rct

3,2
3,0
2,8
2,6
5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4
d (ngstrons)

Figura 3.34: Log R c t versus espessura da camada de xido (d), para o


eletrodo de platina em ferri-ferrocianetode potssio.

92

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A


De acordo com a curva de trabalho mostrada na figura 3.34, a espessura
obtida para a con A em cada condio experimental relacionada na tabela
3.4.

Tabela 3.4: Valores da espessura da con A utilizando a R c t e aplicando a curva de


trabalho mostrada na figura 3.34.

superfcie

ativao da
protena

R c t (k )

d ()

xido+protena xido+protena

Pt/PtO e q

ativada

3,151,45

8,94

Pt/PtO q

ativada

1,870,698

7,80

Pt/PtO e q

desativada

5,161,80

10,2

Pt/PtO q

desativada

6,141,46

10,4

No ta 1 : O inter va lo d e c o nfian a d e 9 5 %
No ta 2 : a s md ia s so r e sultad o s d e 7 e xp e r imento s

Uma anlise geral na tabela 3.4 indica que os valores obtidos para a
espessura da camada foram inferiores a dimenso da prpria protena, levando
a cogitar-se a possibilidade desses valores se referirem a uma espessura
mdia. Essa espessura mdia (d m d i a ) seria a soma de regies com protena
(d p r o t e n a ) e sem protena(d x i d o ):

d mdia = d protena

Onde d protena =

Aprotena .R pro

Aprotena
A

+ d xido

( A Aprotena )
A

{3.16}

{3.17}

93

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A


A resoluo da equao 3.16 fornece a rea ocupada pela protena (A p r o t e n a ),
que representou o equivalente a um recobrimento variando entre 9 a 13% da
rea total (A). Esse percentual pequeno de recobrimento no justificaria o
tunelamento atravs de regies recobertas com protena. E ainda, conforme
citado em literatura 1 0 3 , acredita-se que a protena esteja recobrindo toda a
rea do eletrodo e ainda de acordo com o mencionado por Lundstrm 97,
protenas no so bons isolantes eltricos, e que a impedncia muito
modificada nos pontos de contato entre a protena e a superfcie, resultando
que o recobrimento eltrico menor do que o recobrimento geomtrico.
Esse comentrio vem de encontro com o que j se havia observado na tabela
3.3 onde o recobrimento dado pela carga (recobrimento eltrico) muito
menor daquele dado pela resistncia (recobrimento geomtrico). Baseados
nesses comentrios prope-se que os valores dados na tabela 3.4 representam
a distncia mxima para o tunelamento dos eltrons. Na figura 3.35,
exemplifica-se com o transporte dos ons ferrosos atravs da protena at uma
distncia tal para que os eltrons possam tunelar, num processo anlogo os
ons frricos podem receber eltrons.

3+
e Fe

Fe2+

Eletrodo

Protena

Figura 3.35: Desenho esquemtico da transferncia de eltrons atravs da


camada de protena e o tunelamento.

Uma outra maneira de se tentar calcular a espessura da camada de


protena atribuir as componentes R p r o e C p r o as propriedades do filme

94

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A


protico deste modo esses parmetros podem ser substitudos respectivamente
nas equaes 3.6 e 3.7, das quais por sua vez obtm-se a espessura.
Na tabela 3.5 apresenta-se os resultados obtidos para a espessura
aplicando-se os valores de R p r o na equao 3.6, onde assumiu-se para a
resistividade 98, , o valor de 10 - 8 .cm - 1 .

Tabela 3.5: Valor da espessura da camada de con A obtida utilizando a componente


R p r o para vrias condies experimentais.

Ativao da

R p r o (kohm)

d () a

d ()

d ()

protena

xido+protena

xido+protena

xido

protena

Pt

ativada

0,729 a 0,256

27,79,73

Pt

desativada

0,848 a 0,427

32,216,2

Pt/PtO e q

ativada

4,28 b 1,68

16363,9

6,19

15763,9

Pt/PtO q

ativada

2,99 b 0,786

11429,9

5,45

1088,35

Pt/PtO e q

desativada

8,70 b 3,48

331132,1

6,00

325132,1

Pt/PtO q

desativada

7,44 b 1,35

28351,2

5,45

27751,2

superfcie

No ta: O intervalo d e co nfiana d e 9 5 %


a

md ia d e 5 e xp e r imento s,

md ia d e 7 e xp e r imento s

A anlise da tabela 3.5 mostra que a espessura da protena varia


bastante, 5 a 10 vezes, quando se modifica a superfcie de platina com xido e
ainda que esses valores so maiores quando a protena se encontra na forma
desativada. Este resultado est de acordo com o que j foi comentado
qualitativamente na seo 3.3.
Os valores encontrados na literatura para uma monocamada de con A
adsorvida, so similares aos valores obtidos aqui para a espessura da camada
de con A sobre a superfcie de platina sem xido. De Bono et al. 99
investigaram a adsoro da con A sobre ouro, e encontraram uma espessura de
28,1 , Revell et al. 100 obtiveram uma espessura de aproximadamente 27
tambm sobre ouro, Waner et al. 101 obtiveram uma espessura de 30 sobre
uma superfcie de mica.
95

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A


Esses valores a princpio no concordam com nenhuma das dimenses
propostas para um monmero, dmero ou tetrmero da con A, De Bono et al.
atriburam esse fato desnaturao da protena. No entanto, em um estudo
mais detalhado, Waner et al. consideraram o fato da interao protenasubstrato ocasionar um achatamento da protena sem, no entanto desnaturla 1 0 1 . Alm disso, mostrou que a orientao preferencial para a adsoro da
forma dimrica (80 x 40 x 40 ) ocorre lateralmente, isto , com o eixo de
maior contato entre a protena e a superfcie, essa proposta j havia sido
apresentada por Afshar-Rad et al. 102, 103, porm em um estudo menos detalhado.
Ressaltaram-se os trabalhos com a forma dimrica da protena porque o pH do
meio em que se processou a adsoro foi de 5,0; propcio a formao de
dmeros.
Portanto conclui-se que os valores obtidos na tabela 3.5 para a
espessura da camada de protena sobre uma superfcie sem xido esto de
acordo com os divulgados na literatura. Deste modo se fortalece o conceito de
que R p r o possa ser utilizada como parmetro para informar espessura.
Dando continuidade anlise dos resultados da tabela 3.5 e em
conformidade com o que j foi discutido, amplia-se a discusso para a
situao em que a platina foi modificada com um filme de xido. Embora no
se possa afirmar que neste caso a orientao da protena seja a mesma,
observa-se que h a formao de multicamadas 104 de protenas. Deste modo,
verifica-se que quando a protena se encontra na forma desativada h a
formao de um maior nmero de camadas do que quando ela est na forma
ativada, isto se a adsoro ocorrer com a mesma orientao para as duas
condies.
orientaes 1 ,

Alm
101

disso,

adsoro

tambm

pode

ocorrer

em

vrias

e assim dificultando a projeo de um nmero determinado de

monocamadas para cada situao da con A.


Nas pesquisas onde a adsoro da con A foi verificada sobre o ouro,
mica e a platina, a adsoro ocorreu atravs de interaes no especficas,
outros estudos tambm foram realizados explorando a adsoro especfica da
con A. Com esse intuito, Anzai et al. 105 modificaram a superfcie com glicoseoxidase ou no trabalho de Ebara et al. 106 onde a superfcie foi modificada com
um glicolipdio, observa-se que a orientao da con A frontal. Considera-se
a possibilidade da adsoro sobre um filme de xido tambm possa ocorrer de
96

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A


modo frontal, uma vez que nesse filme, a presena de hidroxilas possa
mimetizar as hidroxilas de um carboidrato. Essa possibilidade sugerida com
base nos resultados que sero apresentados na seo 3.4, onde se discute a
capacidade da con A adsorvida reter a sua caracterstica de especificidade a
carboidratos.

Os

resultados

mostram

que

essa

habilidade

bastante

diferenciada para a situao em que a protena foi adsorvida sobre um filme


de xido, o que poderia ser justificado pela diferena na orientao.
No caso da adsoro da protena sobre xido qumico, sempre se obteve
espessuras menores, independentes da forma da protena, provavelmente esse
fato esteja relacionado quantidade de xido, como j discutido em 3.2.6, ser
menor quando produzida dessa forma.
Uma clara diferenciao, tambm foi observada entre as espessuras
obtidas para a protena na forma ativada e desativada, estas so menores para
a ativada, sugerindo que a presena dos ctions metlicos confere uma forma
mais compacta protena, isso no caso de se ter o mesmo nmero de
monocamadas para as duas formas da protena.
A medida da capacitncia bastante sensvel a modificaes que
ocorrem na interface eletrodo/soluo 107, 108, 109, 110, esse um fato amplamente
divulgado na literatura e tambm verificada nesse trabalho. Mas que outras
informaes so possveis de se obter? Ivarson et al. 111, relacionaram as
diferenas observadas devido a mudanas na orientao e conformao da
albumina 112 e lisozina sobre a platina, xido de titnio e xido de zircnio. A
espessura 113, 7 0 da protena tambm foi relacionada capacitncia, no entanto
sem sucesso. A falha foi atribuda ao modelo eltrico escolhido que no
previa descontinuidades na camada de protena. Esses resultados reforam o
que j havia sido comentado por Lundstrm 9 7 , de que protenas no so bons
isolantes eltricos.
Neste trabalho tambm se tentou calcular a espessura da camada de
protena a partir da capacitncia. Na tabela 3.6 apresenta-se os resultados
obtidos para a espessura aplicando-se os valores de C p r o na equao 3.7, onde
assumiu-se para a constante dieltrica da protena 114,

115

, , o valor de 20.

97

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A


Tabela 3.6: Valor da espessura da con A obtida utilizando a componente C p r o para
vrias condies experimentais.

Ativao da

C p r o ( F)

protena

xido+protena

Pt

ativada

0,532 a 0,022

12,60,510

Pt

desativada

0,554 a 0,035

12,10,752

Pt/PtO e q

ativada

0,689 b 0,078

9,701,06

Pt/PtO q

ativada

0,637 b 0,029

10,90,524

Pt/PtO e q

desativada

0,694 b 0,107

9,651,46

Pt/PtO q

desativada

0,701 b 0,047

9,540,629

superfcie

d ()

No ta 1 :O inter va lo d e c o nfian a d e 9 5 %
a

md ia d e 5 e xp e r imento s,

comparao

entre

os

md ia d e 7 e xp e r imento s

valores

obtidos

na

tabela

3.5

3.6,

respectivamente obtidos com R p r o e C p r o , mostra uma diferena de pelo menos


uma ordem de grandeza entre os resultados. Uma possvel explicao para a
diferena nos valores de que a espessura obtida a partir de C p r o esteja
relacionado separao de cargas positivas e negativas entre as cadeias da
protena. Essas molculas so formadas por uma seqncia de aminocidos
que podem ser carregadas positiva e/ou negativamente, e essas cadeias se
organizam formando hlices- e/ou folhas pregueadas- , sugerindo assim que
os valores dados na tabela 3.6 se referem a conformao das cadeias e no
espessura de protena propriamente dita. Com essa premissa observou-se que
quando a protena foi adsorvida sobre uma superfcie sem xido essas
distncias so maiores, portanto as cadeias esto mais distantes ou em uma
orientao diferente daquela observada quando a protena foi adsorvida sobre
uma superfcie com xido. E sempre que a protena se encontra na forma
desativada esses valores so menores, a diferena sutil, mas presente em
todas as condies experimentais. Essa diferena entre as distncias, maiores
na superfcie sem xido e menores na superfcie com xido pode tambm estar
associada

respectivamente

formao

de

uma

monocamada

de
98

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A


multicamadas. A formao de multicamadas ocasionaria uma compactao da
protena devido a uma maior aproximao entre as cadeias da mesma.

3.4) Especificidade e Seletividade da Con A Adsorvida

Um dos objetivos do trabalho tambm foi verificar se a protena quando


adsorvida

no

eletrodo

permanecia

com

capacidade

de

reconhecer

carboidratos e distingu-los.
Deste modo realizaram-se experimentos para se averiguar como a con A
adsorvida interagia com as seguintes substncias: glicognio, glicose e
galactose, lembrando que a con A no especfica a esse ltimo carboidrato.
A reao entre antgeno-anticorpo, semelhante a lectina-carboidrato,
quando monitorada por um sensor impedimtrico se d geralmente pelo
controle

da

capacitncia 116,

impedimtricos

tambm

117,

podem

118

ser

contudo

outros 119,

acompanhados.

120

Neste

componentes
trabalho,

resistncia foi o parmetro que melhor caracterizou a interao lectinacarboidrato, enquanto a capacitncia no se mostrou eficiente.
Na tabela 3.7, so mostrados os resultados do aumento relativo, %R p r o , da
resistncia do carboidrato (R c a r ) em relao a resistncia da protena (R p r o ), os
valores so obtidos segundo a expresso3.18. Lembrando que (R c a r ) no
apenas a resistncia do carboidrato, mas tambm da protena e do xido, se
presente. O mesmo ocorre para (R p r o ) que a resistncia da protena e do
xido quando este est presente.

% R pro =

Rcar R pro
R pro

100

{3.18}

99

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A


Tabela 3.7: Resultados mostrando o aumento relativo da resistncia do carboidrato
em relao a con A %R p r o , para diversas condies experimentais.

%R p r o
Superfcie/con A/carboidrato

ativada

desativada

Pt/con A/glicognio

38,9 a 22,3

31,0 b 13,8

Pt/PtO q /con A/glicognio

38,9 c 102

30,5 d 8,13

Pt/PtO e q /con A/glicognio

75,8 d 68,2

28,2 d 19,6

Pt/PtO e q /con A/glicose

177 c 576

62,0 c 28,2

Pt/PtO e q /con A/galactose

28,6 c 104

111 c 267

No ta: O intervalo d e co nfiana d e 9 0 %


a

md ia d e 4 e xp e r imento s,

md ia d e 3 e xp e r imento s

md ia d e 5 e xp e r imento s,

md ia d e 2 e xp e r imento s,

Para verificar como a superfcie onde a con A est adsorvida afeta os


resultados

da

%R p r o

variouse

as

condies

da

mesma.

Inicialmente

apresentam-se os resultados da adsoro da con A sobre uma superfcie de


platina sem xido, em seguida sobre uma superfcie de platina modificada
com xido produzido quimicamente e por ltimo sobre a platina modificada
com xido produzido eletroquimicamente. Os trs primeiros valores na tabela
3.7 mostram o comportamento da con A sobre essas trs superfcies
interagindo com o glicognio: nota-se que os valores mais altos so para a
con A quando est ativada e sobre uma superfcie de xido produzida
eletroquimicamente. Esse resultado mostra que, a ativao da protena com os
ctions metlicos, so de fato importante para o reconhecimento dos
carboidratos e que a protena reteve a sua capacidade de reconhecimento
mesmo adsorvida ao eletrodo. A diferena entre os resultados obtidos sobre o
xido qumico e eletroqumico mostra como essas superfcies so diferentes.
A resposta da con A dobrou quando foi adsorvida sobre um filme de xido
eletroqumico. Este filme, como discutido em 3.2.6, mais espesso e
acredita-se que o mesmo seja mais rico em grupos OH, influenciando dessa
maneira

na

orientao

conseqentemente

favorecendo

tambm

reconhecimento dos carboidratos.


100

__________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Con A


A similaridade dos resultados obtidos para a con A sobre platina sem
xido e sobre xido qumico ficaram em torno de 35% e existe uma diferena
sutil entre os resultados para con A ativada e desativada, mostrando que
nessas superfcies a orientao no favorece o reconhecimento do carboidrato
nem quando a protena se encontra na forma ativada.
Esses resultados mostraram que a adsoro da con A sobre uma camada
de xido produzida eletroquimicamente com uma carga de 60 C, segundo
2.5.2.2, seria a mais indicada para se examinar a capacidade da con A
distinguir carboidratos. Deste modo os trs ltimos valores da tabela 3.7
mostram os resultados da interao da con A com o glicognio, a glicose e a
galactose. Nesse grupo de resultados observa-se muito mais claramente a
importncia da ativao da protena tanto na sensibilidade (os valores so
mais altos) como na seletividade (no reconheceu a galactose, alis foi o
nico valor que R p r o % foi mais alto para a con A na forma desativada).
Ainda quanto seletividade, observa-se que a con A foi mais sensvel
glicose do que ao glicognio, contrrio ao que divulgado na literatura. As
lectinas possuem afinidade pelos monossacardeos e pelos seus respectivos
oligossacardeos, com esses ltimos sugerido que existe uma interao
mltipla 2 5 , portanto maior, entre a protena-carboidrato obtida com ligaes
multivalentes e uma extenso da regio especfica capaz de interaes com
mais de um monossacardeo do respectivo oligossacardeo. Neste trabalho, a
con A est adsorvida ou imobilizada na superfcie, talvez esse fato, dificulte a
interao mltipla, devido falta de liberdade de rotao da protena assim
como pela alta concentrao de molculas de protenas prximas umas as
outras, dificultando a aproximao de uma molcula grande como a do
glicognio. Isto, portanto, explicaria a contradio com os dados na literatura
mencionados acima.

101

__________________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Lentil

3.5) Caracterizao da Adsoro da Lentil

Um estudo menos completo tambm foi efetuado com uma outra


protena denominada de lentil. A lentil um lectina com caractersticas
similares a con A, inclusive especficas aos mesmos carboidratos. Na tabela
3.8

apresentam-se

os

resultados

obtidos

com

modelagem

das

curvas

experimentais para a adsoro da lentil em vrias condies experimentais.

Tabela 3.8: Valores das componentes R p r o , C p r o R c t e C d l obtidos para a adsoro da


lentil em diversas condies experimentais utilizando o modelo 4.

Rpro (k)

Cpro (F)

Rct (k)

Cdl (F)

Pt

Ativao da
Protena
Ativ.

0,516

0,479

0,225

1,58

Pt

Desativ.

0,619

0,474

0,442

2,59

Pt\PtOqa

Ativ.

2,361,24

0,5290,072

1,420,894

1,560,083

Pt\PtOqb

Desativ.

6,452,79

0,6390,099

4,692,24

1,400,036

No ta: O intervalo d e co nfiana d e 9 5 %


a

md ia d e 4 e xp e r imento s,

md ia d e 5 e xp e r imento s

A presena do xido tambm afetou bastante a adsoro da lentil. A


comparao entre os resultados para a adsoro sobre uma superfcie sem e
com xido mostra que h um aumento na R p r o e na R c t de pelo menos 10 vezes
para o caso da lentil desativada. A capacitncia tambm refletiu essa
modificao, porm de uma forma mais discreta. A C p r o aumentou em 1,5 vez
e a C d l diminuiu em quase duas vezes, ambos parmetro em relao a lentil
desativada.
A distino entre a lentil ativada e desativada pde ser feita com maior
facilidade para a superfcie modificada com xido, onde os valores mais
elevados para R p r o e a R c t so obtidos para a protena desativada. Na

102

__________________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Lentil

superfcie sem xido essa distino observada para a R c t e C d l , que tambm


so mais elevadas para a protena desativada.
A componente R p r o foi utilizada para o clculo da espessura da camada
de protena. Para tanto se aplicou essa componente na equao 3.6, do mesmo
modo como j foi efetuado para a con A, veja 3.3.2. Esses resultados podem
ser vistos na tabela 3.9.

Tabela 3.9: Valor da espessura da camada de lentil obtida utilizando a componente


R p r o para vrias condies experimentais.

Ativao da

R p r o (k)

d ()

d ()

d ()

protena

xido+protena

xido+protena

xido

protena

Pt

ativada

0,516

19,62

Pt

desativada

0,619

23,51

Pt/PtO q

ativada

2,36 a 1,24

89,629,7

5,45

84,129,7

Pt/PtO q

desativada

6,45 b 2,79

245106

5,45

239106

superfcie

No ta: O intervalo d e co nfiana d e 9 5 %


a

md ia d e 4 e xp e r imento s,

md ia d e 5 e xp e r imento s

De acordo com a discusso apresentada para a con A, os valores obtidos


para a espessura sobre a platina sem xido estavam de acordo com a espessura
de uma monocamada de protena adsorvida lateralmente. Estendendo essa
possibilidade para a lentil, e observando os resultados da tabela 3.9, tem-se
que essa lectina apresentou valores menores para a espessura. No se
encontrou disponvel na literatura as dimenses da lentil, mas sabe-se que o
seu peso molecular 3 4 menor, o que certamente j uma indicao que suas
dimenses tambm o so. Talvez esse fato tambm esteja relacionado com a
diferena na estrutura, o dmero da lentil composto por uma cadeia e uma
hlice , enquanto a con A apenas formada por cadeias . Lembrando que as
cadeias so menos compactas 121 do que as hlices , o que tambm indicaria
que a con A teria dimenses maiores do que a lentil.

103

__________________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Lentil

As

espessuras,

relativamente

menores

para

lentil,

contudo

apresentaram um comportamento similar ao observado para a con A, estas


semelhanas so comentadas a seguir:
1) valores menores para a espessura sobre a platina sem xido, coerente com a
formao de uma monocamada;
2) formao de multicamadas quando a lectina adsorvida sobre a platina
modificada com xido qumico;
3) valores menores de espessura quando a lentil se encontra na forma ativada.

J foi comentado anteriormente que os valores dados pela componente


C p r o se referem conformao das cadeias da protena e no espessura da
protena, uma vez que no arranjo dessas cadeias pode ocorrer separao de
cargas negativas/positivas como ocorre em um capacitor. Na tabela 3.10,
mostram-se os resultados obtidos para d utilizando C p r o quando essa
componente aplicada equao 3.7.

Tabela 3.10: Distncia obtida para a conformao das cadeias da lentil obtida
utilizando a componente C p r o para vrias condies experimentais.

Ativao da

C p r o ( F)

protena

xido+protena

Pt

ativada

0,479

14,0

Pt

desativada

0,474

14,1

Pt/PtO q

ativada

0,529 a 0,072

12,61,85

Pt/PtO q

desativada

0,639 b 0,099

10,51,71

superfcie

d ()

No ta: O intervalo d e co nfiana d e 9 5 %


a

md ia d e 4 e xp e r imento s,

md ia d e 5 e xp e r imento s

104

__________________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Lentil

Os valores dados na tabela 3.10 so maiores daqueles apresentados nas


mesmas condies para a con A, no entanto o comportamento anlogo. Para
a lentil tambm foi observado que os valores dados para a conformao das
cadeias so maiores quando a adsoro ocorre sobre uma superfcie sem
xido. De modo anlogo ao efetuado para a con A associa-se esse fato a
diferena na formao de uma monocamada, na superfcie sem xido e
multicamadas,

numa

superfcie

com

xido.

Nesse

ltimo

caso,

as

multicamadas ocasionariam um maior compactao da protena e, portanto, as


cadeias estariam mais prximas.
Quando se comparam os valores para a conformao da lentil ativada e
desativada sobre uma superfcie com xido, os valores tambm so maiores
para a lentil ativada.

3.5.1) Especificidade da Lentil Adsorvida


Para a lentil tambm foi verificado se a mesma retinha a sua
capacidade de reconhecer carboidratos, e se essa habilidade alterada
conforme se modifica a superfcie sobre a qual esta adsorvida. Na tabela
3.11, so mostrados os resultados do aumento relativo da resistncia do
carboidrato (R c a r ) em relao a protena %R p r o , os valores so obtidos com
uma expresso anloga a 3.18.

Tabela

3.11:

Resultados

mostrando

aumento

relativo

da

resistncia

do

carboidrato em relao a lentil %R p r o , para diversas condies experimentais.

%R p r o
Superfcie/lentil/carboidrato

ativada

desativada

Pt/lentil/glicognio

28,1 a 5,89

35,7 a 17,7

Pt/PtO q /lentil/glicognio

30,1 a 36,6

22,6 b 13,9

No ta: O intervalo d e co nfiana d e 9 0 %


a

md ia d e 3 e xp e r imento s

md ia d e 5 e xp e r imento s

105

__________________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Lentil

Na tabela 3.11, observa-se que quando a lentil adsorvida sobre a


platina sem xido, o aumento da R p r o %, foi maior para a forma desativada,
contrario aos resultados obtidos para a con A. O segundo resultado, se refere
a lentil adsorvida sobre a platina modificada com xido qumico, nesse caso o
comportamento foi o esperado, um aumento relativo maior para a lectina na
forma ativada. De forma geral pode-se tecer os seguintes comentrios:

1) Relativamente a con A, os valores da R p r o % foram menores para a lentil


nas mesmas condies experimentais, com exceo do resultado da Pt/lentildesativada.
2) Para a lentil, a modificao da superfcie com xido qumico, aumentou a
sensibilidade para a forma ativada da protena, provavelmente esse efeito
seria amplificado se a superfcie fosse modificada com xido eletroqumico.

106

__________________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Lentil

3.6)

Desdobramentos

do

trabalho

com

Lectinas

no

Laborat rio de Eletroqu mica

A pesquisa com a adsoro de lectinas sobre eletrodos metlicos se


mostrou bastante frutfera uma vez que gerou uma srie de questionamentos e
estes por sua vez novos trabalhos. Neste contexto apresenta-se um resumo
destes trabalhos e a sua contribuio para o entendimento de interfaces
metais/molculas biolgicas.
Verificou-se que a urease adsorve espontaneamente em ouro e que
retm a sua especificidade uria. Inclusive diferentes concentraes de
substrato puderam ser detectadas. Nesse trabalho as mudanas ocorridas na
interface devido interao urease/uria, foram visualizadas melhor em um
grfico de bode-ngulo de fase do que em um grfico Nyquist. A resistncia e
a capacitncia aumentaram com a concentrao da uria. Esse aumento
inesperado na capacitncia um forte indicador de que a conformao
estabelecida pela interao enzima/substrato promove uma aproximao entre
as cargas da enzima/substrato 1 2 3 .
Um outro trabalho foi o monitoramento por medidas de impedncia, da
adsoro das protenas recombinantes CRA-FRA de Trypanossoma cruzi sobre
eletrodos slidos e verificar a interao antgeno-anticorpo utilizando o soro
de pacientes chagsicos 1 2 4 . Os antgenos adsorvem tanto no eletrodo de
platina como ouro e nesse trabalho tambm se verificou um aumento na
adsoro do antgeno quando o eletrodo de platina modificado com um filme
de xido. A resistncia tambm foi o parmetro que melhor apresentou a
interao antgeno/anticorpo, onde se observou um aumento de 72,4% quando
o antgeno exposto a um soro positivo e de 37,2% quando exposto a um soro
negativo. Nesses dois trabalhos citados pode-se observar que a molcula
biolgica mesmo adsorvida retm a sua especificidade, abrindo perspectivas
para o desenvolvimento de biosensores.
O conhecimento da carga do eletrodo sobre o qual a molcula biolgica
adsorvida tem um papel muito importante para a anlise da orientao que
molcula assume quando adsorve. Com o intuito de aprimorar as discusses
107

__________________________________________________ Caracterizao da Adsoro de Prote na/Lentil

apresentadas com as lectinas se iniciou o trabalho para a determinao da


carga do eletrodo de platina sem xido 1 2 2 . Resultados j foram obtidos para o
eletrodo de platina em uma soluo de NaCl 1,5 mM. A continuidade desse
trabalho ser no sentido de se determinar a carga do eletrodo de platina
modificado com um filme de xido em uma soluo de ferri-ferrocianeto de
potssio.

108

________________________________________________________________________________ Conclus es

4) Conclus es
4.1) Camada de xido de Platina

O filme de xido produzido neste trabalho foi bastante fino, em torno


de 6 , apesar da carga ter sido aumentada em 20 vezes a espessura aumentou
muito pouco, mostrando que grande parte da carga est envolvida na reao
de evoluo de oxignio e no propriamente na formao do filme de xido.
A camada de xido pde ser descrita mais adequadamente por um
modelo em que a mesma considerada contnua e isolante sobre o eletrodo
metlico

(modelo

4).

Entre

os

parmetros

extrados

desse

modelo,

capacitncia do xido, (C o x ), foi o que melhor caracterizou a camada,


possibilitando o clculo da espessura da mesma. Com base nesse modelo,
verificou-se que processo de transferncia de eltrons pde ser tratado de
acordo com o proposto por Damjanovic onde este prev o tunelamento dos
110

________________________________________________________________________________ Conclus es

eltrons atravs de filmes finos de xido. A resistncia de transferncia de


eltrons (R c t ), neste caso, relacionada carga utilizada para a formao da
camada de xido.
O xido formado quimicamente no apresenta as mesmas caractersticas
do

xido

formado

eletroquimicamente.

Supe-se

que

esse

fato

esteja

relacionado tanto com a quantidade de xido, menor para o qumico, como


tambm sua prpria organizao sobre a superfcie.
A constante dieltrica () do xido, utilizada no clculo da espessura da
camada, foi estabelecida em 15, com base na variao dos valores encontrados
na literatura para outros xidos de metais de transio.

4.2) Adsoro de Prote na

As lectinas estudadas adsorvem no eletrodo de platina e bloqueiam a


reao de transferncia de eltrons do ferri-ferrocianeto de potssio, isto ,
diminuem a constante heterognea de velocidade, k o .
Tanto a adsoro da con A como a da lentil so bastante afetadas pela
modificao da superfcie de platina com um filme de xido. Esse efeito
verificado tanto na voltametria cclica (diminuio dos picos andicos e
catdicos do ferri-ferrocianeto de potssio) como na espectroscopia de
impedncia

(aumento

da

componente

resistiva).

Ambas

as

tcnicas

registraram o bloqueio da superfcie devido presena da protena adsorvida


na mesma. A quantidade de xido tambm influi na adsoro de protena, isto
, quanto mais xido mais e/ou melhor, a protena adsorve.
O modelo para descrever a protena visto como uma camada contnua
que, no entanto, no isola completamente a superfcie. A resistncia devido
presena da protena (R p r o ) est em srie com a resistncia do xido (R o x ) e o
mesmo ocorre para a capacitncia da protena (C p r o ) que tambm se encontra
em srie com a capacitncia do xido (C o x ).
O melhor parmetro para de quantificar a protena adsorvida foi a
resistncia da protena (R p r o ). A adsoro da con A sobre a platina sem xido,

111

________________________________________________________________________________ Conclus es

forma uma monocamada com espessura de 28 com orientao paralela


superfcie.
A adsoro da con A sobre a platina modificada com xido de platina
resultou em uma camada com espessura de 108 para a forma ativada e
277 na forma desativada. Os resultados obtidos para a espessura da camada
de con A sobre um filme de xido eletroqumico foram de 156 e 318
respectivamente para a forma ativada e desativada. Nota-se que se obtm
valores mais elevados para a espessura da camada de protena quando o xido
produzido eletroquimicamente, o que se atribuiu maior quantidade de
xido que de acordo com o que j foi comentado afeta a adsoro.
Nesse momento pode-se efetuar duas comparaes. A primeira existe
uma grande diferena entre as espessuras obtidas sobre uma superfcie sem e
com xido. Esse fato foi associado respectivamente formao de mono e
multicamadas. A segunda comparao, em uma superfcie sem xido no se
observa uma diferenciao significativa entre a forma ativada e desativada da
protena. J em uma superfcie com xido, se observa essa diferenciao, com
valores maiores de espessura para a forma desativada.
As

espessuras

encontradas

para

con

nas

diversas

condies

experimentais so maiores do que as encontradas para a lentil. Relacionou-se


esse fato estrutura da lentil, diferente da Con A, ser formada tambm por
hlices- e a um peso molecular menor. Deste modo, tem-se para uma
superfcie sem xido a espessura em torno de 20 . Novamente no se
observa uma diferena significativa entre a forma ativada e desativada da
protena. Para uma superfcie com xido qumico a espessura obtida para a
lentil ativada foi de 84 e para a desativada de 239 . Esses resultados
mostram que a lentil apresentou um comportamento semelhante a con A,
quando submetida s mesmas condies experimentais.
A capacitncia da protena (C p r o ) est relacionada conformao das
cadeias da protena, isto , distncia entre as cadeias. Os valores para a
conformao da con A sobre uma superfcie sem xido so maiores do que
aquelas obtidas em uma superfcie com xido. Associa-se esse resultado
formao de multicamadas sobre a superfcie com xido que ocasionaria uma
conformao

mais

compacta

da

protena

sobre

superfcie

conseqentemente tambm uma distncia menor entre as cadeias.


112

________________________________________________________________________________ Conclus es

Observou-se que para uma superfcie com xido, a protena na forma


ativada, apresenta valores sutilmente maiores, o que se atribuiu presena
dos ctions metlicos que conferem uma maior estabilidade e integridade
molcula.
As

duas

protenas

novamente

apresentaram

um

comportamento

semelhante no que diz respeito conformao da protena, apenas com


valores levemente mais altos para a lentil.

4.3) Sensibilidade da Prote na Frente aos Carboidratos

O melhor parmetro para informar o grau de interao entre a protena e


o carboidrato foi a resistncia. Essa informao foi obtida verificando-se o
aumento relativo (R p r o %) da resistncia do carboidrato (R c a r ) em relao a
resistncia da protena e xido (R p r o ). Lembrando que (R c a r ) no apenas a
resistncia do carboidrato, mas tambm da protena e do xido, se presente. O
mesmo ocorre para (R p r o ) que a resistncia da protena e do xido quando
este est presente.
Na superfcie com xido eletroqumico, verificou-se a sensibilidade da
con A frente a glicose, glicognio e galactose. A protena na forma ativada se
mostrou mais sensvel a glicose (acar para o qual especfica) e menos
sensvel a galactose (acar para a qual no especfica). Esse resultado
invertido quando a protena se encontra na forma desativada. Mostrando,
portanto que a ativao importante tanto na sensibilidade como na
seletividade da protena. Complementando quanto seletividade, esperava-se
que a sensibilidade da protena frente ao glicognio fosse maior do que com a
glicose, uma vez que existe nesses casos uma interao mltipla com esse
polissacardeo. No entanto, no foi esse o resultado. Uma possvel explicao
estaria no fato da vizinhana da protena adsorvida estar ocupada por outras
molculas de protena dificultando a interao com uma molcula maior de
acar e dificultando tambm a interao mltipla.
A sensibilidade da con A frente ao glicognio foi verificada em uma
superfcie sem xido, com xido qumico e eletroqumico. O melhor resultado
113

________________________________________________________________________________ Conclus es

foi para a protena ativada sobre a ltima superfcie citada. Surpreende o fato
da superfcie com xido qumico no ter provocado nenhuma modificao no
resultado, mostrando que a quantidade e a estrutura do filme de xido
influenciam a sensibilidade da protena. Para a forma desativada, nessas
mesmas condies experimentais no se observou nenhuma modificao na
sensibilidade.
A comparao dos resultados obtidos para as duas protenas nas mesmas
condies experimentais, mostra que a forma ativada da con A apresenta
maior sensibilidade ao glicognio do que a lentil. Reforando dados na
literatura que indicam diferenas no grau de afinidade por um mesmo
carboidrato apesar de serem especficas aos mesmos carboidratos.

114

_________________________________________________________________________Perpectivas Futuras

5) Perspectivas Futuras
Os

resultados

obtidos

com

estudo

impedimtrico

do

sistema

platina/lectina trouxeram uma srie de informaes quanto adsoro das


lectinas. No entanto seria importante confrontar alguns resultados utilizandose outras tcnicas. Por exemplo, utilizar a elipsometria e/ou a microscopia de
fora atmica para confirmar as espessuras encontradas para a camada de
protena e tambm se a ativao da protena altera a conformao da mesma.
A adsoro dessas lectinas foi observada em platina, porm tambm
seria importante verificar se esse comportamento semelhante para outros
metais assim como sobre os seus xidos.
Confirmar com auxlio da microscopia de fora atmica, por exemplo, a
orientao da protena nas superfcies estudadas. Verificar se realmente
existem diferenas na orientao quando a adsoro ocorre sobre a platina e
sobre a platina modificada com filme de xido.
Aprofundar a discusso e as conseqentes concluses quanto presena
dos metais de ativao tanto na espessura como na conformao na protena.

115

_________________________________________________________________________Perpectivas Futuras

Compreender melhor a interao entre o filme de xido e a protena e


entender porque este favorece a adsoro das lectinas.
Determinar a carga do eletrodo com e sem xido para auxiliar a
interpretao dos resultados quanto orientao da protena. Esse tema foi
abordado no trabalho de iniciao cientfica de Rogrio T. Ribeiro 122.
Verificar se a con A quando adsorvida sobre a platina consegue
diferenciar entre a glicose e a galactose e assim tambm reforar as premissas
quanto diferenciao na orientao da protena quando a protena
adsorvida sobre a platina modificada com filme de xido. Esse trabalho
tambm foi tema do trabalho de iniciao cientfica da aluna Sibele R. de
Oliveira 123.
Verificar a importncia da camada de xido na adsoro de outras
protenas. Essa possibilidade foi verificada para protenas recombinantes tipo
CRA-FRA, trabalho de iniciao cientfica desenvolvido por Alziana M. C.
Pedrosa 124.
Estudar e concluir os resultados j obtidos com a cintica da adsoro da con
A, onde numa anlise prvia j se verificou uma cintica diferenciada para a
condio em que a adsoro se processa sobre uma superfcie com e sem filme
de xido. Nesses resultados tambm se diferencia claramente a condio em
que a protena esta ativada e desativada.

116

_____________________________________________________________________Referncias Bibliogrficas

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