Universidade do Vale do Paraba

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

INGLID FONTOURA DA SILVA












CARACTERIZAO E IDENTIFICAO RPIDA DE BACTRIAS EM
CULTURAS PURAS E MISTAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR






















So Jos dos Campos, SP
2010








INGLID FONTOURA DA SILVA














CARACTERIZAO E IDENTIFICAO RPIDA DE BACTRIAS EM
CULTURAS PURAS E MISTAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR


Dissertao apresentada no Programa de Ps-graduao
em Engenharia Biomdica, como complementao dos
crditos necessrios para obteno do ttulo de Mestre em
Engenharia Biomdica.

Orientador: Prof. Dr. Airton A. Martin.
Co-orientadora: Prof. Dr. Maria Anglica G. Cardoso.
















So Jos dos Campos, SP
2010


INGLID FONTOURA DA SILVA
"cARAcrERrzAo
E IDENTIFTCAo RPDA DE BAcrRrs EM cur-TnRAs
PURAS E MISTAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR''
Dissertao aprovada como rcquisito parcial obteno do grau de Mestre en Engenharia
Biomdica, do Programa de Ps-Gaduao em Engenharia Biomdica, do Instituto de Pesquisa
e Desenvolmnto da Universidade do Vale do Pafaba, So Jos dos Campos, SP, pela seguinte
banca examinadora:
PTOf. DTA. MARIA ANGLICA GARGIONE CARDOSO
(TINIVAP)
Prof. Dr. AIRTON A. MARTIN (UNIVAP)
Prof. Dr. FRNCISCO GARCIA SORIAIIO
Prof. Dra. Sandra Mar;a Fonseca da Costa
Diretordo lP&D Univap
So Jos dos Campos, 21 demai ode2010.




Aos meu pais pelo amor incondicional, por mais uma vez confiarem em mim e por
mais uma vez abrirem mos de sonhos.
Aos meu tios, meus pais em So Jos dos Campos, pela dedicao, pelo ombro e
pelo colo.
Ao meu irmo e meus primos (Anderson e Clia) pela amizade, companheirismo e
favores prestados durante todo o mestrado.
Ao meu tio Germino (in memoriam) por ter sido um GRANDE tio e por ter me
ensinado tantos valores.
A Frei Dilson e Dewar por me ajudarem dar o primeiro passo rumo a este mestrado.
A Mara por me ensinar a me encontrar.
A Primeira Igreja Batista, ao PG e ao meu grupo de apoio por me conduzirem ao
caminho do Pai.
Ao Pr. Paulo Mizoguchi, Min. Flvio, Diogo, Douglas, Robson e Priscila pelas
oraes.


A Deus (meu Pai) por abrir caminhos, por me sustentar, por ter me dado foras e por
ter colocado tantas pessoas essenciais na execuo deste trabalho.
Ao Prof. Airton pela orientao, pela pacincia, pela confiana, por acreditar nos
meus sonhos e por ter me apresentado a famlia LEVB.
A Prof Dr Maria Anglica Gargione Cardoso pela co-orientao deste trabalho, pela
sinceridade e por abrir as portas de seu laboratrio, onde foi possvel dar os
primeiros passos deste trabalho.
Ao CNPq por bolsa de mestrado concedida.
As professoras: Ms. Snia Khouri e Dr. Kumiko Sakane, que me ensinaram a base
de microbiologia e espectroscopia no infravermelho e no mediram esforos para
me ajudar.
Ao Prof. Dr. Leandro Raniero por ter me acompanhado no incio do trabalho, quando
tudo era sonho, no trmino, nas tradues e nas discusses. O seu apoio foi
essencial.
Ao Prof. Dr. Mituo Uehara pela preparao de trabalho (Uberlndia).

A Ricardo Belo, meu anjinho da guarda, sem ele dificilmente este trabalho seria
realizado, obrigada por sonhar comigo e me ajudar na execuo do mesmo.
A Maira, minha amiga, que tanto me ouviu, que tanto me aconselhou e que tanto me
ajudou. Perua, no tenho palavras para lhe agradecer. Origin, Minitab, clculo de
nmero de onda e etc. Ah o meu foco ?...e est em?...no alto!...JESUS!
As minhas amigas: Vanessa Santos, Elizngela Carvalho, Ludmila Guimares,
Nikele Nadur, Simone Lapena e Maria; por passarem comigo esta jornada de aulas,
trabalhos, provas e apresentaes. Saudades!
A famlia LEVB, alunos e professores, por TUDO, ensinamentos, amizade...quantas
histrias. Amo vocs!
A famlia NUFABI (Carol e Ana Carla) pelo apoio, por me socorrer.
A professora Sandra e a Maria Alice pelo apoio na fase final do mestrado.
A Rbia, Valria, D. Ivone e D. Neuza pelo carinho.
A todos que direta ou indiretamente contriburam para a execuo deste trabalho, o
meu muito obrigada!
































Fiz mais do que posso
Vi mais do que agento
E a areia dos meus olhos a mesma
Que acolheu minhas pegadas
Depois de tanto caminhar
Depois de quase desistir
Os mesmos ps cansados voltam pra Voc.
Pra Voc.
Eu lutei contra tudo
Eu fugi do que era seguro
Descobri que possvel viver s
Mas num mundo sem verdade.
Depois de tanto caminhar
Depois de quase desistir
Os mesmos ps cansados voltam pra Voc.
Pra Voc.
Sem medo de Te pertencer.
Voltam pra Voc.
Depois de tanto caminhar
Depois de quase desistir
Os mesmos ps cansados voltam pra Voc.
Pra Voc.
Meus ps cansados de lutar
Meus ps cansados de fugir
Os mesmos ps cansados voltam pra Voc.
Pra Voc.
(S. Leah)




Caracterizao e identificao rpida de bactrias em culturas puras e mistas por
microespectroscopia FT-IR


RESUMO



As doenas infecciosas so uma das causas mais frequentes de mortalidade
mundial, ficando atrs somente das doenas cardacas, cerebrovasculares e
cnceres. O tempo exigido para a identificao de microrganismos patognicos
responsveis pelas doenas infecciosas causa determinante de taxas de
mortalidade relacionadas a infeces de pacientes hospitalizados. A maioria dos
sistemas de identificao disponveis em hospitais baseada na observao de
caractersticas fisiolgicas e nutritivas dos microrganismos e aplicao de testes
bioqumicos com uma estadia de 24 h at 5 dias para o resultado. Uma tcnica
diferente aos mtodos tradicionais de identificao de microrganismo baseada em
espectroscopia no infravermelho. Esta tcnica caracterizada por mnima
manipulao da amostra e no so exigidos testes bioqumicos fornecendo uma
alternativa potencial para a identificao rpida de bactrias. Com o objetivo de investigar
a potencialidade da espectroscopia no infravermelho como uma ferramenta para identificao rpida
de bactrias responsveis por infeces em ambiente clnico o estudo foi realizado. As bactrias
usadas no estudo foram obtidas da coleo de cultura do Instituto Oswaldo Cruz
Brasil. Escherichia coli ATCC 10799, Proteus mirabilis ATCC 25933, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 14456, Staphylococcus
epidermidis ATCC 9300 e Enterococcus faecalis ATCC 10100 foram analisadas. O
estudo foi realizado em culturas puras e mistas e examinadas em triplicata. Os
inculos foram preparados segundo a escala de McFarland 0,5, incubados a 37C
por 6 horas, diludos em soluo salina, depositados em janela de CaF2 e
submetidos a estufa para obteno de filme fino. As amostras foram mensuradas no
Spectrum Spotlight 400 (Perkin-Elmer) no intervalo de 4000-900 cm
-1
com 32
varreduras realizadas por transmitncia em modo de ponto e imagem. Os dados
tratados serviram de entrada para anlise de cluster usando a primeira derivada e o
algoritmo Wards foi aplicado, uma excelente discriminao entre as bactrias foi
obtida. A microespectroscopia FT-IR associado anlise de cluster demonstrou ser
uma ferramenta efetiva na identificao de bactrias em culturas puras e na
identificao de culturas puras e mistas com mnima manipulao de amostra e com
tempo de incubao de apenas 6 horas. A tcnica se mostrou rpida, reprodutvel,
com os espectros das triplicatas classificados corretamente.


Palavras-chave: Identificao rpida, bactrias, cultura pura, cultura mista,
microespectroscopia FT-IR, anlise estatstica multivariada.








Characterization and rapid identification of bacteria in pure cultures and mixed by FT-
IR microspectroscopy


ABSTRACT


Infectious diseases are one of the most frequent causes of death worldwide,
behind heart disease, strokes, and cancers. The time required to identify pathogenic
microorganisms responsible for infection is a determinant of mortality related to
nosocomial infections. Most identification systems available in hospitals are based on
observing the physiological and nutritional characteristics of microorganisms and
application of biochemical tests with a delay of 24 h to 5 days for the result. A
different technique from traditional methods of identifying microorganisms is based
on infrared spectroscopy. This technique is characterized by minimal sample
handling and does not require biochemical tests to provide a potential alternative for
rapid identification of bacteria. This study investigated the potential of infrared
spectroscopy as a tool for rapid identification of bacteria responsible for infections in
the clinical environment. The bacteria used in this study were obtained from the
culture collection of Oswaldo Cruz Institute - Brazil. Escherichia coli ATCC 10799,
Proteus mirabilis ATCC 25933, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442
Staphylococcus aureus ATCC 14456, Staphylococcus epidermidis ATCC 9300 and
Enterococcus faecalis ATCC 10100 were analyzed. The study was performed in pure
and mixed cultures in triplicate. The inoculations were prepared according to
McFarland 0.5, incubated at 37 C for 6 hours, diluted in saline solution, deposited
on CaF
2
window and heated to obtain a thin film. The samples were measured by the
Spectrum Spotlight 400 (Perkin-Elmer) in the range of 4000-900 cm
-1
with 32 scans
performed by transmittance in point and image mode. The first derivative and Wards
algorithm was used as input data for cluster analysis. This method provided an
excellent discrimination between different classes of bacteria. The FT-IR
microspectroscopy associated with cluster analysis proved to be an effective tool to
identify bacteria in pure cultures. It was also able to identify pure and mixed cultures
with minimal sample preparation and a short incubation time of only six hours. The
technique is rapid, reproducible, and correctly classified the triplicate spectra.

Keywords: Rapid Identification, bacteria, pure culture, mixed culture, FT-IR
microspectroscopy, multivariate statistical analysis.














LISTA DE ILUSTRAES



Figura 1 - Principais formas das bactrias .......................................................... 23
Figura 2 - Estrutura do Fosfolipdeo .................................................................... 26
Figura 3 - Arranjo das protenas em estrutura secundria .................................. 27
Figura 4 - Componentes de cidos nuclicos ...................................................... 28
Figura 5 - Esquema bsico de estrutura de clula bacteriana ............................. 29
Figura 6 - Estrutura do peptideoglicano .............................................................. 31
Figura 7 - Parede celular de bactrias Gram-positivas ....................................... 32
Figura 8 - Unidades de cidos teicicos .............................................................. 33
Figura 9 - Parede celular de bactrias Gram-negativas ...................................... 34
Figura 10 - Estrutura do Lipopolissacardeo ........................................................ 35
Figura 11 - Curva de Crescimento bacteriano ..................................................... 37
Figura 12 - Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus e Staphylococcus
epidermidis...........................................................................................................

39
Figura 13 - Escherichia coli, Proteus mirabilis e Pseudomonas aeruginosa ........ 41
Figura 14 - Espectro eletromagntico .................................................................. 44
Figura 15 - Diagrama de nveis de energia .......................................................... 44
Figura 16 - Variao do momento dipolar ............................................................ 45
Figura 17 - Vibraes de um grupo de tomos .................................................... 47
Figura 18 - Componentes bsicos de um espectrmetro FTIR............................ 50
Figura 19 - Princpio de funcionamento de um Interfermetro de Michelson ....... 51
Figura 20 - Comparao do microscpio com luz branca com o microscpio IR. 53
Figura 21 - Espectro de bactria com diversos tratamentos ................................ 56
Figura 22 - Espectros tpicos de microrganismos patognicos ............................ 57
Figura 23 - Dendograma resultado da anlise de cluster de clulas microbianas
intactas .................................................................................................................

61
Figura 24 - Etapas da preparao de cultura bacteriana para anlise em FT-IR. 62
Figura 25 Etapas da preparao de amostra bacteriana para anlise em FT-
IR .........................................................................................................................

64
Figura 26 - Espectrofotmetro utilizado no experimento...................................... 64
Figura 27 - Micrografia dos filmes finos de bactrias Gram-negativas e bactrias
Gram-positivas .....................................................................................................

68

Figura 28 - Espectro de absoro da janela de CaF
2
........................................... 69
Figura 29 - Espectro tpico de fundo .................................................................... 69
Figura 30 - Mapa da amostra de Proteus mirabilis associado aos vinte
espectros realizados aleatoriamente na amostra e mapa da amostra de
Staphylococcus aureus associado aos vinte espectros realizados na borda da
amostra ................................................................................................................



70
Figura 31 Regies do filme fino de Staphylococcus aureus ....................................................... 71
Figura 32 - Espectro caracterstico de bactria com as principais bandas de
vibraes moleculares..........................................................................................

71
Figura 33 - Movimentos moleculares de amida I e amida II de protenas ............ 72
Figura 34 - Espectro FT-IR representativo de Escherichia coli, Proteus mirabilis,
Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis.................................................................................


75
Figura 35 - Primeira derivada de ordem espectral em regies significativamente
diferentes de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa,
Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis .....


77
Figura 36 - Dendograma resultado da anlise de cluster das seis bactrias
examinadas em triplicata .....................................................................................

78
Figura 37 - Dendograma resultado da anlise de cluster da triplicata de
Escherichia...........................................................................................................

79
Figura 38 - Micrografia dos filmes finos de Escherichia coli, Staphylococcus
aureus e Escherichia coli com Staphylococcus aureus ......................................

80
Figura 39 - Espectro FT-IR representativo de Escherichia coli, Staphylococcus
aureus e Escherichia coli com Staphylococcus aureus .......................................

81
Figura 40 - Primeira derivada da mdia espectral das amostras utilizadas no
estudo, demonstrando diferenas de absoro nas regies de 3000-2800 cm
-1
,
1470-1410 cm
-1
e 1176-950 cm
-1
.........................................................................


82
Figura 41 - Dendograma resultado da anlise de cluster das trs inoculaes
examinadas em triplicata .....................................................................................

84
Figura 42 Filme fino de Escherichia coli associado ao mapa de absoro
qumica de uma amostra e aos 64 espectros extrados da matriz ......................

85
Figura 43 Filme fino de Staphylococcus aureus associado ao mapa de
absoro qumica de uma amostra e aos 64 espectros extrados da matriz .......

86

Figura 44 Filme fino de Escherichia coli com Staphylococcus aureus
associado ao mapa de absoro qumica de uma amostra e aos 64 espectros
extrados da matriz ..............................................................................................


87
Figura 45 Espectro FT-IR extrado da matriz de imagem representativo de
Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Escherichia coli com Staphylococcus
aureus ..................................................................................................................


88
Figura 46 - Espectros de primeira derivada da cultura mista mostrando regies
espectrais heterogneas ......................................................................................

89
Figura 47 - Dendograma resultado da anlise de cluster das trs inoculaes
examinadas em triplicata em modo de imagem ..................................................

90
Figura 48 - Identificao de trs diferentes microrganismos em cultura mista
pela tcnica de estampa .....................................................................................

96
Figura 49 - Mtodo de estampagem ................................................................... 97
































LISTA DE TABELAS


Tabela 1 - Ocorrncia e caractersticas de alguns grupos funcionais ................. 24
Tabela 2 - Estruturas bacterianas correlacionadas composio bioqumica .... 29
Tabela 3 - Comparao da parede celular de bactrias Gram-positivas e Gram-
negativas .............................................................................................................

34
Tabela 4 - Caractersticas usadas para identificao de bactrias ..................... 41
Tabela 5 - Principais grupos funcionais e suas respectivas energias vibracionais
.............................................................................................................................

54
Tabela 6 - Meios seletivos onde as bactrias foram inoculadas .......................... 63
Tabela 7 - Sumrios dos estudos realizados, espectros coletados e modo de
aquisio .............................................................................................................

66
Tabela 8 - Atribuio de bandas detalhada associada composio bioqumica
e estrutura celular ................................................................................................

73
Tabela 9 Simulao do crescimento exponencial de Escherichia coli com
tempo de incubao de 6 horas a partir de uma clula bacteriana .....................

83
Tabela 10 Simulao do crescimento exponencial de Staphylococcus aureus
com tempo de incubao de 6 horas a partir de uma clula bacteriana .............

83
























LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS



a - assimtrico
A - adenina
A/D - analgico-digital
ANN (artificial neural network) - rede neural artificial
ATCC (American Type Culture Collection) - Coleo de cultura americana
BaF2 - fluoreto de brio
BHI (brain heart infusion) - infuso de crebro e corao
C - grau Celsius
C - citosina
CaF2 - fluoreto de clcio
CLTs - cadeias laterais de tetrapeptdeos
Cm
-1
- centmetro a -1
Dn - dina
DNA - cido desoxirribonuclico
DTGS - sulfato de triglicina
E. coli - Escherichia coli
FIR - infravermelho distante
FT - transformada de Fourier
g - grama
G - guanina
HCA (Hierarchical Cluster Analysis) - anlise de cluster
IR - infravermelho
K - Kelvin
LPS - lipopolissacardeos
MCT - telureto de cdmio e mercrio
m - micrmetro
MIR - infravermelho mdio
NAG - N-acetilglicosamina
NAM - cido N-acetilmurmico
NIR - infravermelho prximo
OMP (Outer membrane proteins) - protenas de membrana externa

PCA (Principal Component Analysis) - anlise de componentes principais
RNA - cido ribonuclico
rRNA - RNA ribossmico
s - segundo
s simtrico
S. aureus Staphylococcus aureus
SIMCA (soft independent modeling by class analogy) Modelagem independente
flexvel por analogia de classe
T - timina
U - uracila
U.A. - unidades de absorbncia
ZnSe - seleneto de zinco

































LISTA DE SMBOLOS



- alfa
- beta
- constante de ligao
- deformao
- estiramento
- grau
- mi (massa reduzida)
- - negativo
- pi
% - por cento
+ - positivo






























SUMRIO


1 INTRODUO .......................................................................................... 18
2 OBJETIVOS .............................................................................................. 22
2.1 GERAL ................................................................................................... 22
2.2 ESPECFICOS ....................................................................................... 22
3 REVISO DE LITERATURA ..................................................................... 23
3.1 BACTRIAS ........................................................................................... 23
3.1.1 Estrutura qumica e composio de clulas ........................................ 24
3.1.1.1 Carboidratos ..................................................................................... 25
3.1.1.2 Lipdeos ............................................................................................ 25
3.1.1.3 Protenas .......................................................................................... 26
3.1.1.4 cidos Nuclicos .............................................................................. 28
3.1.2 Citologia Bacteriana ............................................................................ 29
3.1.2.1 Parede Celular ................................................................................. 30
3.1.2.1.1 Parede celular de bactrias Gram-positivas .................................. 32
3.1.2.1.2 Parede celular de bactrias Gram-negativas ................................ 33
3.1.2.1.2.1 Lipopolissacardeo....................................................................... 34
3.1.3 Fases de crescimento ......................................................................... 36
3.1.4 Bactrias Gram-Positivas .................................................................... 38
3.1.4.1 Enterococcus faecalis ....................................................................... 38
3.1.4.2 Staphylococcus aureus .................................................................... 38
3.1.4.3 Staphylococcus epidermidis ............................................................. 39
3.1.5 Bactrias Gram-Negativas .................................................................. 39
3.1.5.1 Escherichia coli ................................................................................ 39
3.1.5.2 Proteus mirabilis ............................................................................... 40
3.1.5.3 Pseudomonas aeruginosa................................................................. 40
3.1.6 Identificao de bactrias pelo mtodo tradicional ............................... 41
3.2 Espectroscopia no Infravermelho............................................................ 43
3.2.1 Absoro no Infravermelho ................................................................. 43
3.2.2 Vibrao Molecular .............................................................................. 45
3.2.3 Espectro de Infravermelho .................................................................. 47
3.2.4 Instrumentao .................................................................................... 48

3.2.4.1 Espectrmetro FT-IR ........................................................................ 49
3.2.4.1.1 Fonte de Radiao Infravermelha ................................................. 50
3.2.4.1.2 Interfermetro ................................................................................ 50
3.2.4.1.3 Detectores Infravermelho .............................................................. 52
3.2.5 Microespectroscopia FTIR ................................................................... 52
3.2.6 Anlise Espectral ................................................................................. 54
3.2.6.1 Interpretao .................................................................................... 54
3.2.6.2 Pr-processamento espectral ........................................................... 55
3.3 Identificao de bactrias por espectroscopia no infravermelho ............ 56
3.3.1 Anlise Estatstica Multivariada ........................................................... 60
4. MATERIAIS E MTODOS ........................................................................ 62
4.1 Cepas Bacterianas e crescimento ......................................................... 62
4.2 Preparao da amostra .......................................................................... 63
4.3 Microespectroscopia no infravermelho e mensurao ........................... 64
4.4 Tratamento dos dados e anlise estatstica ........................................... 65
5 RESULTADOS........................................................................................... 67
5.1 Caracterizao, diferenciao e identificao de bactrias Gram-
negativas e Gram-positivas ..........................................................................

67
5.2 Diferenciao de culturas puras e mistas ............................................... 79
5.2.1 Culturas mistas e anlise de imagem FT-IR ........................................ 84
6 DISCUSSO ............................................................................................. 91
7 CONCLUSO ............................................................................................ 95
8 SUGESTES/TRABALHOS FUTUROS ................................................... 96
9 DIVULGAO DOS RESULTADOS DA PESQUISA ................................ 98
REFERNCIAS ............................................................................................ 100








18

1 INTRODUO


As doenas infecciosas so uma das causas mais frequentes de mortalidade
mundial sendo responsveis por 25% das mortes globais, mais de 14 milhes de
mortes por ano; ficando atrs somente das doenas cardacas, cerebrovasculares e
cnceres. Elas so responsveis por 29 das 96 principais causas de morbidade e
mortalidade humanas listadas pela Organizao Mundial de Sade (MURRAY;
LOPEZ, 1997; TAYLOR; LATHAM; WOOLHOUSE, 2001; WENZEL, 1998; WHO,
2004). Essas manifestaes so frequentes em pacientes graves internados em
Unidade de Terapia Intensiva, com infeces comumente relatadas em locais como:
corrente sangunea, trato-urinrio, trato-respiratrio, stios intra-abdominais e feridas
cirrgicas (IBRAHIM et al., 2000; REIMER; WILSON; WEINSTEIN, 1997).
A estimativa da incidncia de infeces e suas consequncias, como a sepse,
crescente, principalmente em idosos, em pacientes contaminados com
microrganismos resistentes ao tratamento, ou com sistema imunolgico
comprometido ou at aqueles pacientes que se submetem cirurgia de alto risco por
tempo prolongado (RUSSEL, 2006) .
Uma abrangente reviso de literatura identifica 1415 espcies de organismos
infecciosos conhecidos por serem patognicos aos humanos, so eles: bactrias,
vrus, fungos ou parasitas, entre os quais esto presentes 538 bactrias (TAYLOR;
LATHAM; WOOLHOUSE, 2001).
O tempo exigido para a identificao destes microrganismos patognicos
causa determinante de taxas de mortalidade relacionadas a infeces de pacientes
hospitalizados (IBRAHIM et al., 2000). Apesar dos esforos no desenvolvimento de
mtodos diretos para o diagnstico rpido de doenas infecciosas ou deteco de
microrganismos, o mtodo de cultura permanece o padro-ouro para a identificao
bacteriana devido sua sensibilidade, simplicidade, baixo custo e alta qualidade. A
maioria dos sistemas de identificao disponveis em hospitais baseada neste
mtodo, que requer a observao de caractersticas fisiolgicas e nutritivas dos
microrganismos e aplicao de testes bioqumicos. Estes sistemas exigem uma
cultura microbiana pura e 24 h at 5 dias para o resultado. Entretanto em situaes
de emergncia onde so necessrias aes imediatas, mesmo antes do resultado
19
de identificao, comum a administrao do tratamento emprico com antibiticos
de largo-espectro baseado na experincia clnica e conhecimento da patognese e
epidemiologia das infeces. O risco desta prtica pode conduzir efeitos secundrios
txicos adversos, entre eles resistncia aos agentes antimicrobianos e a
nefrotoxicidade (ATLAS, SNYDER, 2006; SANDT et al., 2006; STENDER et al.,
2002, MAQUELIN et al., 2003).
A administrao inicial inadequada da terapia antimicrobiana aos pacientes
criticamente doentes com infeco est tambm associada a uma mortalidade maior
(IBRAHIM et al., 2000).
Estudos conduzidos por Barefanger, Drake e Kacich (1999), Doern et al. (1994)
e Kerremans et al. (2008) demonstram que a identificao do microrganismo, em um
menor tempo, permite ao clnico administrar um antimicrobiano mais especfico e
consequentemente mais eficaz, o que reduziria a durao de permanncia em leito
hospitalar, dos custos associados doena e da taxa de morbidade e mortalidade.
A questo da identificao rpida do microrganismo ainda so dificuldades
encontradas nos dias atuais. Nos ltimos anos novas tcnicas tm sido
desenvolvidas para a identificao de microrganismos, existindo um interesse na
descoberta de novos mtodos analticos, principalmente aqueles que permitem a
execuo mais rpida da anlise do material de pacientes com suspeita de infeco.
Entre as tcnicas que oferecem possibilidades para a anlise rpida, os mtodos
de biologia molecular se destacam por serem sensveis para a identificao de
microrganismos patognicos. A maioria dos testes baseada em sequncias
especficas de DNA permitindo a identificao especfica. Entretanto, estas tcnicas
diagnsticas moleculares possuem custos elevados e so pouco prticas para
utilizao em laboratrios de rotina, principalmente para estudos em controle de
infeco que exige uma rpida e simples metodologia para a identificao
(ERUKHIMOVITCH et al., 2005; KIRSCHNER et al, 2001).
Uma tcnica diferente aos mtodos tradicionais de identificao de
microrganismo baseada em espectroscopia no infravermelho. Esta tcnica
caracterizada por mnima manipulao da amostra, e no so exigidos testes
bioqumicos fornecendo uma alternativa potencial aos mtodos convencionais. Com
esta tcnica possvel fazer a anlise do microrganismo em um tempo de cultura
reduzido em comparao com os mtodos comumente utilizados, permitindo a
discriminao de clulas microbianas intactas, sem a sua destruio e fornecendo
20
impresses bioqumicas especficas que so reprodutveis e distintas para diferentes
microrganismos (MAQUELIN et al., 2002).
O mtodo fornece um espectro de absoro bioqumica devido s vibraes de
ligaes qumicas de componentes celulares, tais como protenas, cidos nuclicos,
carboidratos e lipdios de membrana e componentes de parede celular; fornecendo
assim a informao sobre a composio bioqumica da clula microbiana
(BALDAUF et al., 2007; AMIALI et al, 2007; KIRSCHNER et al., 2001).
O sistema de FT-IR pode ainda ser acoplado a um microscpio fornecendo um
verstil instrumento para a anlise microbiolgica rpida. A deteco, a identificao
e a diferenciao microbiana podem estar disponveis dentro de um nico
instrumento, fornecendo resultados diagnsticos potenciais em um dia de trabalho
(MAQUELIN et al., 2002).
O mtodo aplicvel em microbiologia, pois realiza com alta especificidade
identificao rpida de microrganismos patognicos, permite investigaes
epidemiolgicas, estudo de populaes bacterianas sob condies diferentes de
cultura, conduz estudos de caso, elucida correntes de infeco, controle de terapia e
deteco de infeces peridicas (NAUMANN, 2000; BECKER et al., 2006).
Diante deste contexto de fundamental importncia a identificao rpida de
bactrias responsveis pela infeco. Aliada a esta realidade apresentada,
evidenciou-se a necessidade da avaliao do potencial da microespectroscopia de
FT-IR para rpida identificao de bactrias.
Esta dissertao encontra-se dividida em sete sees. Na seo 2
apresentado os objetivos gerais e especficos do trabalho.
Na seo 3 feita uma reviso sobre bactrias, sua composio bioqumica e
estruturas celulares e mecanismo de crescimento, alm da descrio das principais
bactrias responsveis por infeco e uma breve descrio do mtodo tradicional de
identificao de bactrias. Ainda na seo 3 feita uma reviso sobre
espectroscopia no infravermelho onde so explicados seus principais conceitos,
descreve-se a instrumentao necessria para obter um espectro infravermelho,
bem como um breve relato sobre anlise e pr-processamento espectral; em
sequncia so apresentados trabalhos recentes que envolvem a espectroscopia no
infravermelho como mtodo para identificao de bactrias e anlise estatstica
multivariada utilizada frequentemente para anlise.
21
Na seo 4 redigido a metodologia empregada para a realizao dos
experimentos, desde o protocolo de cultura bacteriana e preparao de amostra,
passando pelos parmetros adotados para aquisio de espectros e anlise
estatstica.
Nas sees 5 e 6 so apresentados os resultados e as discusses.
Na seo 7 so apresentadas as principais concluses deste trabalho e as sees
8 e 9 so apresentadas algumas sugestes e trabalhos futuros, bem como a
divulgao dos resultados da pesquisa.


























22
2 OBJETIVOS


2.1 GERAL


Identificar por espectroscopia no infravermelho as principais bactrias
responsveis por infeco hospitalar.


2.2 ESPECFICOS


Caracterizar o espectro vibracional de cada bactria;
Diferenciar e identificar os espectros de amostras bacterianas em culturas puras
e mistas por anlise estatstica multivariada;
Avaliar reprodutibilidade do mtodo.

















23
3 REVISO DE LITERATURA


3.1 BACTRIAS


As bactrias so seres unicelulares de estrutura relativamente simples, so
microrganismos procariotos que podem se apresentar isolados ou reunidos com
outros microrganismos semelhantes, constituindo colnias. O tamanho de sua clula
varia entre 0,3 a 5 m, podendo ser mveis ou imveis; quando mveis so dotadas
de flagelos que permitem sua movimentao. Podem ser classificadas em relao
ao hospedeiro e o meio ambiente em saprfitas e patognicas (KAYSER et al.,
2005; MURRAY; ROSENTAHL; PFALLER, 2006).
As bactrias podem se apresentar sob formas esfricas ou comumente
chamadas de cocos, bacilos e espirilos (Figura 1). Os cocos so redondos, podendo
ser ovais, alongados ou achatados em uma das extremidades. Os bacilos
assemelham-se a lanas, com extremidade arredondadas ou retas. Os espirilos
assemelham-se a vrgulas ou vibries. A organizao dos cocos em pares, cadeias
ou cachos define grupos de microrganismos denominados diplococos, estreptococos
e estafilococos, respectivamente. Os organismos em forma de basto podem ser de
morfologia regular, mais curtos (cocobacilares) ou podem aparecer sob forma de
basto ou halteres (corineformes). As clulas em forma de vrgula definem uma
caracterstica bsica de certas espcies (espcies de Vibrio) (TRABULSI et al.,
2008; KONEMAN et al., 2001).








Figura 1 - Principais formas das bactrias: cocos (A), bacilos (B) e espirilos (C). Fonte: ( KAYSER et
al., 2005)

(A) (B) (C)
24
Quanto nutrio, muitas bactrias utilizam compostos orgnicos encontrados
na natureza a partir de organismos vivos ou mortos. Algumas bactrias sintetizam
seu prprio alimento por fotossntese, e algumas obtm seu alimento a partir de
substncias inorgnicas. Estes organismos se reproduzem assexuadamente por
fisso binria, processo pelo qual uma clula parenteral d origem a duas clulas-
filhas (HOGG, 2005; TORTORA et al., 2008; RYAN; RAY, 2004).


3.1.1 Estrutura qumica e composio de clulas


As clulas de todos os organismos vivos, desde os microrganismos at o
homem, das clulas mais simples a mais complexa compartilham certas
propriedades fundamentais e caractersticas estruturais, todas elas so constitudas
por compostos qumicos. Vrios compostos inorgnicos (sdio, potssio, ferro,
magnsio, clcio, cloro) so encontrados em todos os organismos, porm os
compostos orgnicos tm um maior significado biolgico, atuando em muitas etapas
cruciais do metabolismo e na definio de estruturas celulares. Existem milhares
desses compostos orgnicos, a maioria dos quais podem ser agrupados em uma
das quatro categorias principais: carboidratos, lipdeos, protenas e cidos nuclicos
(DNA e RNA) (TRUN; TREMPY, 2003).
Alguns dos grupos funcionais mais comuns que ocorrem em molculas
orgnicas simples, bem como nas macromolculas so apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 - Ocorrncia e caractersticas de alguns grupos funcionais. Fonte: Hogg, 2005 (adaptado).
Grupo Funcional Frmula Tipo de molcula Encontrado em:
Hidroxila


lcoois Carboidratos
Carbonila



Aldedos

Cetonas
Carboidratos

Carboidratos
25
Carboxila

cidos carboxlicos Carboidratos, Lipdeos
e Protenas
Amino

Aminas Protenas
Amida (carbonila e
amino)




Amidas Protenas
Sulfidril

Tiis Protenas
Fosfato



Fosforil Fosfolipdeos,
cidos nuclicos


3.1.1.1 Carboidratos


Os carboidratos so um grande grupo de compostos orgnicos que inclui
acares e amidos, so compostos de tomos de carbono, hidrognio e oxignio;
tem a frmula geral (CH
2
O)
n
, so encontrados em paredes celulares das clulas
bacterianas e atuam como fonte de reserva nutritiva e precursores de protenas,
lipdeos e cidos nuclicos. Sua funo principal fornecer combustvel para as
atividades celulares. Podem ser classificados em trs grupos principais, com base
no tamanho: monossacardeos, dissacardeos e polissacardeos (MARZZOCO;
TORRES, 2007; BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2004).


3.1.1.2 Lipdeos

Os lipdeos so o segundo maior grupo de compostos orgnicos encontrados na
matria viva. Assim como os carboidratos, so compostos de tomos de carbono,
26
hidrognio e oxignio. Existem trs categorias principais de lipdeos biologicamente
importantes: triglicerdeos, fosfolipdeos e esteris.
Os triglicerdeos, denominados gorduras ou lipdeos simples so constitudos de
dois tipos de grupamentos: glicerol e cidos graxos.
Os lipdeos complexos conhecidos como fosfolipdeos so componentes
importantes de membrana celulares, so compostos de: glicerol, dois cidos graxos
e em um lugar de um terceiro cido graxo um grupo fosfato ligado a um dentre
vrios grupos orgnicos (Figura 2).













Figura 2 Estrutura do Fosfolipdeo: grupo orgnico, fosfato, glicerol e cidos graxos. Fonte:( HOGG,
2005).

Os esteris so constituintes importantes das membranas plasmticas das
clulas animais e so constitudos de vrios anis de tomos de carbono ligados
entre si.


3.1.1.3 Protenas


As protenas so macromolculas orgnicas que contm carbono, hidrognio,
oxignio e nitrognio, so longos polmeros de aminocidos. A complexidade da
estrutura protica analisada considerando-se a molcula em termos de quatro
Grupo orgnico Fosfato Glicerol cidos Graxos



27
nveis organizacionais, denominados: primrios, secundrios, tercirios e
quaternrios. (HOGG, 2005; MARACULLA; GOI, 2000).
A estrutura primria de uma protena determinada pela natureza de
aminocidos que a compe.
O arranjo das protenas em trs dimenses atribudo a sua estrutura
secundria. So dois os tipos principais de arranjo secundrio regular: -hlice e
folha- (Figura 3), ambas as estruturas unidas por pontes de hidrognio entre os
tomos de oxignio ou nitrognio que fazem parte do esqueleto polipeptdico
(MAHADEVAN-JANSEN; RICHARDS-KORTUM, 1996).
















Figura 3 - Arranjo das protenas em estrutura secundria: -hlice e folha-. Fonte: Hogg (2005)

A estrutura terciria resulta do enrolamento da -hlice ou da folha-, sendo
estabilizada por pontes de hidrognio e pontes dissulfeto.
A juno de duas ou mais cadeias polipeptdicas, cada uma com sua prpria
estrutura secundria e terciria, combinam-se para gerar a estrutura quaternria.



Ponte de
Hidrognio

-hlice

folha-
Amida


Amida
28
3.1.1.4 cidos Nuclicos


Como protenas, os cidos nuclicos so grandes molculas, formada por longas
cadeias de nucleotdeos. So compostos de carbono, hidrognio, oxignio,
nitrognio e tomos de fsforo. Existem dois tipos principais de cidos nuclicos: o
cido desoxirribonuclico (DNA) com funo de armazenar informao e o cido
ribonuclico (RNA) com etapas envolvendo a biosntese protica e a expresso
gnica (CAMPBELL; SMITH; PETERS, 2006; ALCAMO, 1996).
Cada nucleotdeo constitudo de trs componentes: uma molcula de
carboidrato, um grupo fosfato e uma base nitrogenada. As bases nitrogenadas no
DNA so: adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T). No RNA a adenina,
guanina e citosina esto presentes, porm uracila (U) encontra-se no lugar da timina
(T) (Figura 4) (CAMPBELL; SMITH; PETERS, 2006; POMMERVILLE, 2004).



















Figura 4 - Componentes de cidos nuclicos. Fonte: (NELSON; COX, 2005)
Uracila Timina Citosina
Adenina Guanina
Bases Nitrogenadas
Ribose Desoxirribose
Carboidrato
29
3.1.2 Citologia Bacteriana


A clula bacteriana possui, como qualquer clula viva, um genoma, um
citoplasma e uma membrana citoplasmtica (com exceo dos micoplasmas) todas
as bactrias possuem tambm uma parede celular e algumas possuem ainda uma
cpsula externa. A figura 5 apresenta esquematicamente uma clula bacteriana
tpica com as principais estruturas externas e internas membrana citoplasmtica.
Na tabela 2 so listadas estas estruturas associada a sua composio qumica.













Figura 5 Esquema bsico de estrutura de clula bacteriana. Fonte: (KAYSER et al., 2005)

Tabela 2 Estruturas bacterianas correlacionadas composio qumica. Fonte LEVINSON;
JAWETZ et al., 1998)
Estrutura Composio qumica
Componentes essenciais
Parede celular
Peptideoglicano


Esqueleto de carboidrato com cadeias
laterais peptdicas entrecruzadas
Membrana externa
Organismos gram positivos

cido teicico
Organismos gram negativos Polissacardeos
Ribossomos 70S
Membrana
Citoplasmtica
Plasmdeo
Cpsula
Flagelo
Membrana externa
observada somente
em bactrias Gram-
negativas
Parede Celular
Peptideoglicano
Nucleide
Grnulos
(Substncias de depsito)
- Metafosfatos (Volutina)
- Glicognio (Granulose)
Pili (Pilus)
30
Membrana Citoplasmtica Bicamada lipoprotica sem esteris
Ribossomo RNA e protena em subunidades 50S e
30S
Nucleide DNA
Componentes no-essenciais
Cpsula

Polissacardeo
Pili (fmbria) Protrena (pilina)
Flagelo Protena (flagelina)
Plasmdeo DNA
Grnulos Glicognio, lipdeos, polifosfatos


3.1.2.1 Parede Celular


As bactrias se diferenciam pela estrutura da parede celular, seus componentes
e suas funes, em relao estrutura de parede celular so classificadas em
bactrias Gram-positivas e Gram-negativas, de acordo com a capacidade de
reteno do corante de Gram. Esta uma diviso emprica clssica que, de acordo
com a colorao revela diferenas importantes na composio qumica e na
estrutura de parede celular (MURRAY; ROSENTAHL; PFALLER, 2006; BARBOZA;
TORRES, 2005).
A parede celular uma estrutura comum a todas as bactrias que, promove
rigidez estrutural, conferindo forma clula e criando uma barreira fsica contra o
ambiente externo, possui componentes de superfcie como: a capsula, o flagelo e o
pili. Possui uma estrutura com camadas mltiplas localizada externamente
membrana citoplasmtica. composta por uma camada interna de peptideoglicano,
envolta por uma membrana externa, que varia em espessura e em composio
qumica dependendo do tipo de bactria (LEVINSON; JAWETZ et al., 1998,
KONEMAN et al., 2001).
O peptideoglicano uma rede macromolecular, conhecido tambm como
murena, que est presente isoladamente ou em combinao com outras
substncias. Consiste em um dissacardeo repetitivo unido por polipeptdeos para
31
formar uma rede que circunda e protege toda a clula. formado por um esqueleto
de resduos de carboidratos formados por unidades alternadas de N-
acetilglicosamina (NAG) e cido N-acetilmurmico (NAM). A este ltimo encontram-
se ligadas, covalentemente, cadeias laterais de tetrapeptdeos (CLT). A maior parte
das CLTs composta de L-alanina, D-glutamato, mesodiaminopimelato e D-alanina
(Figura 6). As CLTs podem-se interligar diretamente como na maioria das bactrias
Gram-negativas ou por meio de outros aminocidos como ocorre nas bactrias
Gram-positivas (KONEMAN et al., 2001; TORTORA et al.,2008; TRABULSI et al.,
2008).





























Figura 6 - Estrutura do peptideoglicano. O peptideoglicano um polmero composto de alternncia
molculas de N-acetilglicosamina (NAG) e cido N-acetilmurmico (NAM). Uma cadeia de tetra
peptdeo est ligada aos resduos NAM (ver texto para detalhes). Esta configurao importante para
a formao de uma rede rgida. Fonte: (TRUN; TREMPY, 2003)









N-acetilglicosamina
N-acetilmurmico
L-alanina
D-alanina
D-glutamato
mesodiaminopimelato
32
3.1.2.1.1 Parede celular de bactrias Gram-positivas


Nas bactrias Gram-positivas, aproximadamente 90% da parede so compostos
de peptideoglicano. Alm desta macromolcula, so encontradas protenas e cidos
teicicos que podem representar at 50% da massa seca da parede (figura 7).
Os cidos teicicos so polmeros que contribuem para a rigidez da parede, so
formados por cerca de 30 resduos de glicerol ou ribitol (Figura 8), unidos por
ligaes fosfodister e esto ligados ao peptideoglicano tambm por ligao
fosfodister. So encontrados em dois tipos: cidos teicicos de parede ligado ao
peptideoglicano e cidos lipoteicicos, que apesar de serem encontrado ao longo da
parede, encontram-se intimamente ligados frao lipdica da membrana plasmtica
(BARBOZA; TORRES, 2005; RYAN, RAY, 2004).
















Figura 7 Parede celular de bactrias Gram-positivas. Fonte: (KAYSER et al., 2005)




Peptideoglicano
Membrana
Citoplasmtica
Polissacardeo
especfico de
parede celular
cido teicico de parede celular
cido lipoteicico de membrana
Protenas
associadas
parede celular
33








Figura 8 Unidades de cidos teicicos: Glicerol (A) ou Ribitol (B). Fonte: (RYAN; RAY, 2004)


3.1.2.1.2 Parede celular de bactrias Gram-negativas


A parede celular das bactrias gram-negativas tem uma composio qumica
mais complexa que a das bactrias gram-positivas, conferindo propriedades
bioqumicas, fisiolgicas e genticas peculiares (diferenas apresentadas na tabela
3). formada por poucas camadas de peptideoglicano e por uma membrana
externa. Na parte externa da membrana citoplasmtica, acima da camada de
peptideoglicano localiza-se o espao periplasmtico (figura 9), um compartimento
que contm uma alta concentrao de enzimas de degradao e protenas de
transporte. O peptideoglicano est ligado membrana externa da parede atravs de
pequenas lipoprotenas (localizadas no espao periplasmtico). Esta membrana
externa uma estrutura em dupla camada; sua camada interna composta de
fosfolipdios (20%) e protenas (50%) assemelhando-se da membrana
citoplasmtica, possui canais especiais constitudo de molculas proticas
denominadas porinas (protenas de membrana externa (Outer membrane proteins -
OMP)) que permitem a difuso passiva de acares, aminocidos e certos ons;
enquanto a camada externa possui em sua composio lipopolissacardeos (LPS)
(30%) (JAWETZ et al., 1998; LEVINSON; JAWETZ, 1998; RYAN; RAY, 2004).



Resduos de Glicerol
Resduos de Ribitol
D-alanina
D-alanina
34
Tabela 3 - Comparao da parede celular de bactrias Gram-positivas e gram-negativas. Fonte:
(LEVINSON; JAWETZ, 1998)
Componente Clulas Gram Positivas Clulas Gram Negativas
Peptideoglicano Espessa (15-80 nm);
camadas mltiplas
Fina; ~2 nm; camada
nica
cido teicico Presente Ausente
Lipopolissacardeo Ausente Presente
Lipoprotena e
Fosfolipdeos
Ausente Presente
















Figura 9 Parede celular de bactrias Gram-negativas. Fonte: ( KAYSER et al., 2005.)


3.1.2.1.2.1 Lipopolissacardeo (LPS)


LPS, um componente da membrana externa de bactrias gram-negativas,
aparentemente, uma das principais toxinas responsveis pelo incio de reaes
fisiopatolgicas observadas durante graves infeces e choques spticos. Essas
Lipopolissacardeo
(LPS)
Membrana externa
Espao
Periplasmtico
Peptideoglicano
Membrana
Citoplasmtica
Lipdio A
Antgeno K Cadeia O
Cerne
Porinas
Ex. OmpF
Lipoprotena
OmpA
Fosfolipdeo
35
reaes frequentemente observadas so: febre, leucopenia, taquicardia, taquipnia,
hipotenso, coagulao intravascular disseminada e insuficincia de mltiplos
rgos. (LAMPING et al, 1998; ULMER et al, 2000).
Os LPSs so compostos por trs segmentos ligados covalentemente: (1) lipdeo
A, firmemente embebido na membrana; (2) cerne do polissacardeo, localizado na
superfcie da membrana; e (3) cadeia O (antgenos O), que so polissacardeos que
se estendem como plos a partir da superfcie da membrana em direo ao meio
circundante.
O lipdio A consiste em unidades dissacardicas de glicosamina fosforilada, s
quais esto ligados vrios cidos graxos de cadeia longa (Figura 10 A). O cerne do
polissacardeo (Figura 10 B) semelhante em todas as espcies de bactrias Gram-
negativas que possuem LPS. Em geral, as unidades de repetio consistem em
trissacardeos lineares, tetrassacardeos ou pentassacardeos ramificados. A cadeia
O um polissacardeo externo consistindo de at 25 unidades repetidas de trs a
oito acares(Figura 10 C) (KAYSER et al., 2005).
A poro hidrofbica do lipdio A tem sido identificado como o princpio
endotxico do LPS (ULMER et al, 2000).














Figura 10 Estrutura do Lipopolissacardeo: lipdio A (A), cerne do polissacardeo (B) e cadeia O (C)
Fonte: (KAYSER et al., 2005)


cidos graxos
Fosfato
Diglucosamina
Lipdio
Lipdio A
- Diglucosamina
- cidos graxos
Cerne do
polissacardeo
Cadeia O
(A) (B) (C)
36
3.1.3 Fases de crescimento


A curva de crescimento bacteriano tpico de uma populao ilustra os eventos
que ocorrem ao longo do tempo. Esta curva pode ser traada ao inocular um meio
com nmeros de clulas conhecidas, determinando a populao microbiana em
intervalos de tempo e ento estabelecidos os valores logaritmicos de clulas
viveis. Fases distintas de crescimento ocorrem: (A) fase lag (latente), (B) fase de
acelerao,(C) fase logartmica (crescimento exponencial), (D) fase de
desacelerao, (E) fase estacionria e (F) fase de declnio (morte celular) (Figura 11)
(PELCZAR; CHAN; KRIEG 1997; KAYSER et al., 2005; POMMERVILLE, 2004).
(A) Fase lag (latente) Representa um perodo durante o qual as clulas esto
passando por uma intensa atividade metablica, principalmente sntese de enzimas
e de molculas variadas, considerado um perodo de adaptao ao novo meio
para que haja um reincio do crescimento.
(C) Fase logaritmica (crescimento exponencial) Aps a adaptao ao novo
meio e sntese das enzimas necessrias para utilizar os substratos disponveis, as
bactrias so capazes de iniciar a diviso celular por fisso binria. Este evento leva
ao crescimento exponencial da populao bacteriana presente na cultura. Esta
situao prossegue at que ocorra uma de duas alternativas: um ou mais nutrientes
no meio se esgotam ou ocorre acmulo de produtos metablicos txicos, que inibem
o crescimento.
(E) Fase estacionria Como discutido acima a fase logaritmica limitada por
fatores no ambiente (meio), e como a taxa de crescimento desacelera, a cultura
entra em uma prxima fase. O nivelamento da curva de crescimento no significa
que a diviso celular tenha cessado completamente, mas sim que o aumento
(devido s clulas recm-formadas) similar ao de mortes celular.
(F) Fase de declnio Se os nutrientes no ambiente externo continuam sendo
limitados, a populao entra em fase de declnio (morte). Agora, o nmero de morte
celular se torna superior ao nmero de novas clulas formadas. O glicoclice
bacteriano pode evitar a morte, agindo como um tampo para o ambiente, flagelos
podem permitir que determinadas bactrias movam para um novo local, porm para
muitas espcies, a histria da populao termina com a morte da ltima clula.
37
(B) Fase de acelerao e (D) Fase de desacelerao Perodo de transio
entre uma nova fase.












Figura 11 - Curva de Crescimento bacteriano. Fonte: (KAYSER et al., 2005)

O tempo de gerao, tempo necessrio para uma clula se dividir, s pode ser
determinado durante a Fase C, graficamente ou por determinao da contagem de
clulas (n) em dois diferentes tempos e aplicando a frmula:
1 2 log 2 2 log
1 2
n n
t t
g

Onde:
g = tempo de gerao;
t1 = tempo no incio da fase logartmica de crescimento;
t2 = tempo no final da fase logartmica de crescimento;
log 2 = 0.30;
n2 = n de clulas bacterianas no t2;
n1 = n de clulas bacterianas no t1.
Este tempo pode sofrer variaes entre os organismos e depende das condies
ambientais, em geral a maioria das bactrias apresentam um tempo de gerao de 1
a 3 horas. Uma clula com o tempo de gerao de 20 minutos como exemplo a
bactria Escherichia coli crescendo em condies ideais de cultivo aumentar seu
nmero, aps 20 geraes, para aproximadamente 1 milho de clulas. Este
aumento ocorrer em aproximadamente 7 horas (POMMERVILLE, 2004).
Curva de Crescimento de Cultura Bacteriana
x
(Horas) Tempo (Dias)
N

d
e

c

l
u
l
a
s

v
i

v
e
i
s

(
l
o
g
)

A = Fase lag (latente),
B = Fase de acelerao,
C = Fase log (crescimento
exponecial),
D = Fase de desacelerao,
E = Fase estacionria,
F = Fase de declnio (morte)

t1
t2
38
3.1.4 Bactrias Gram-Positivas


3.1.4.1 Enterococcus faecalis


Enterococcus faecalis uma bactria frequentemente associada a infeces em
humanos, agente causal em infeces urinrias, intra-abdominais, endocardite e
sepse, comportando-se, muitas vezes, como um agente oportunista em infeces
hospitalares. Podem ser causa de pelo menos 10% das infeces hospitalares e em
algumas casusticas situa-se em terceiro lugar como causa destas infeces, aps
Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Espcie de bactrias do gnero
Enterococcus, habitante do trato gastrointestinal de homens e animais. So cocos
Gram-positivos, no mveis e anaerbios facultativos (Figura 12 A) (DAZEVEDO et
al., 2004; KIRSCHNER et al., 2001; TAVARES, 2000).


3.1.4.2 Staphylococcus aureus


Staphylococcus aureus o patgeno humano mais importante entre os
estafilococos, atua como agente de uma ampla gama de infeces, variando desde
aquelas localizadas, geralmente superficiais, at algumas disseminadas. Est
enquadrado como um dos principais agentes de infeces hospitalares.
considerado membro persistente da microbiota endgena humana, encontrado
principalmente no trato respiratrio alto. Possuem 0,5-1,5 micrmetros de dimetro,
ocorrendo em arranjos individuais em pares, e agrupamentos irregulares. So cocos
Gram-positivos, no mveis, no esporulados, anaerbios facultativos, algumas
cepas produzem um exopolissacardeo (cpsula) que pode impedir a fagocitose do
microrganismo (Figura 12 B). (COHEN, 1986; LOWY, 2003; KONEMAN et al., 2001).



3.1.4.3 Staphylococcus epidermidis
39


Staphylococcus epidermidis um dos principais membros da microbiota normal
do ser humano, est regularmente presente na pele e nas mucosas, a causa
predominante de infeces associadas a corpo estranho (cateteres, sondas). Alm
disso, S. epidermidis isolado com frequncia como o patgeno causador da sepse
hospitalar e outras infeces nosocomiais, classificado entre os cinco mais
frequentes patgenos hospitalares. A patognese das infeces S. epidermidis
correlacionada com a capacidade de formar biofilmes em superfcies de polmeros.
So cocos Gram-positivos arranjados em cachos e ttrades (Figura 12 C)
(KNOBLOCH, 2001; TRABULSI et al., 2008).






Figura 12 - Enterococcus faecalis (A), Staphylococcus aureus (B) e Staphylococcus epidermidis (C).
Fonte: (ARE et al., 2008; TODAR, 2008; TRABULSI et al., 2008)


3.1.5 Bactrias Gram-Negativas


3.1.5.1 Escherichia coli


Escherichia coli, gnero da espcie Escherichia, foi descrita pela primeira vez,
em 1885, por Theobald Escherich. Este gnero um membro tpico de
enterobactrias que habitam principalmente no intestino de humanos e animais,
colonizando o trato gastro-intestinal infantil poucas horas aps o nascimento.
Geralmente trs sndromes clnicas podem resultar de infeces por cepas
patognicas de E. coli: sepse como consequncia de meningite , infeco do trato
urinrio e diarria. uma bactria frequentemente isolada em hemoculturas de
pacientes internados em Unidades de Terapia Intensiva. Elas so classificadas
(A) (B) (C)
40
como bacilos Gram-negativos, no esporulados, anaerbios facultativos; possuem
motilidade atravs de flagelos ou so imveis, a cpsula ou microcpsula so
frequentemente presentes (Figura 13 A) (SUSSMAN, 1997, STENUTZ;
WEINTRAUB; WIDMALM, 2006; ALCAMO, 1996).


3.1.5.2 Proteus mirabilis


Proteus mirabilis, espcie de bactria do gnero Proteus so bacilos Gram-
negativos pertencentes famlia de Enterobactrias. Estas bactrias causam
infeces oportunistas principalmente em imunodeprimidos e considerada uma
das bactrias mais importantes entre as uropatognicas, produzem grandes
quantidades de urase que degrada a uria formando amnia e outros produtos.
Possuem motilidade atravs de flagelo e possuem fmbrias que promovem a
aderncia bacteriana (Figura 13 B) (ALLISON, 1992).


3.1.5.3 Pseudomonas aeruginosa


Pseudomonas aeruginosa, o mais frequente bacilo gram-negativo no
fermentador, um patgeno humano oportunista que causa uma variedade de
infeces em imunodeprimidos e portadores de fibrose cstica, um dos mais
importantes agentes de infeco hospitalar. So fisiologicamente aerbios (podendo
crescer anaerobicamente quando h presena de nitrato), no esporulados, mvel
por um simples flagelo polar, aderentes s clulas epiteliais atravs das fimbrias
(Figura 13 C) (PASSADOR, 1993).






41





Figura 13 Escherichia coli (A), Proteus mirabilis (B) e Pseudomonas aeruginosa (C). Fonte:
(KUNKEL, 2004)


3.1.6 Identificao de bactrias pelo mtodo tradicional


Inmeras tcnicas de identificao de bactrias tm sido descritas na literatura,
entretanto indiscutvel o sucesso da identificao de bactrias pelo mtodo
tradicional de cultura, considerado padro ouro. Este mtodo requer o uso de
diversas tcnicas para a determinao bacteriana guiados pelo Bergeys Manual of
Systematic Bacteriology. O princpio essencial atribuio de uma cultura
desconhecida dentro do sistema de classificao taxonmica com base na
observao de um conjunto complexo de caractersticas tais como; composio de
parede celular, morfologia, caractersticas culturais e fisiolgicas. A forma, o
tamanho e o arranjo da bactria, observados ao microscpio aps colorao
diferencial; a capacidade de metabolizao de substratos particulares so alguns
dos indicadores utilizados na identificao de uma bactria, algumas dessas
caractersticas so apresentadas na tabela 4 (COLWELL, GRIGOROVA, 1987;
KAYSER et al, 2005; WILKINS; LAY, 2006).

Tabela 4 Caractersticas usadas para identificao de bactrias. Fonte: (KAYSER et al, 2005)
Caractersticas usadas para identificao de bactrias
Caractersticas morfolgicas
Forma (coco, bacilo, espirilo);
Tamanho, agrupamento (cachos, cadeias, diplococos);
Colorao (Gram-positiva, Gram-negativa), flagelos (presente, ausente), cpsula
(presente, ausente), esporos (forma, na formao de clulas).
(A) (B) (C)
42
Caractersticas fisiolgicas
Enzimas de cadeia respiratria (oxidase, catalase);
Enzimas que quebram carboidratos, alcois, glicosdeos;
Enzimas do metabolismo de protenas (ex: gelatinase, colagenase);
Enzimas do metabolismo de aminocidos (ex: dercarboxilase, urase);
Outras enzimas: hemolisina, lpase, DNases e etc;
Produtos de Metabolismo (cidos orgnicos detectados por cromatografia a gs);
Resistncia/ sensibilidade a substncias qumicas;
Caractersticas de metabolismo anablico (ex: citrato como nica fonte de carbono).

Esta tcnica geralmente requer uma primeira cultura onde as amostras de fluidos
corporais (por exemplo, sangue, urina, lquido cefalorraquidiano) de pacientes com
suspeita de infeco so semeadas em meio de enriquecimento, que permite o
crescimento de inmeros microrganismos, nesta etapa so realizadas as contagens
de clulas. Na segunda etapa so utilizados meios seletivos que contm substncias
inibidoras que permitem o isolamento de determinados microrganismos, a partir do
isolamento destes microrganismos so realizados os testes bioqumicos para a
identificao. Estes sistemas exigem um tempo de crescimento de 24 h para cada
etapa, podendo levar alguns dias para o resultado (BARON, 1996; SANDT et al.,
2006; MURRAY; ROSENTAHL; PFALLER, 2006).
A seleo e o nmero de testes para identificao bacteriana dependem da
categoria de bactrias presentes (aerbio versus anaerbio, Gram-positivas versus
Gram-negativas, cocos versus bacilos) e da experincia do microbiologista ao
analisar a cultura. Cocos gram-positivos, aerbios ou anaerbios facultativos podem
ser identificados por um nmero relativamente pequeno de testes. Enquanto a
identificao da maioria dos bacilos gram-negativos muito mais complexa e exige
muitas vezes painis de 20 testes para determinar caractersticas bioqumicas e
fisiolgicas (BARON, 1996; MURRAY, 2006).
Em um contexto clnico a identificao do microrganismo refere-se ao uso prtico
de um esquema de classificao para isolar e identificar o agente etiolgico de uma
determinada doena, para ento permitir a seleo de um tratamento farmacolgico
especificamente orientado para a sua erradicao (JAWETZ et al., 2000).

43
3.2 Espectroscopia no Infravermelho


A espectroscopia no infravermelho o estudo da interao da luz na regio do
infravermelho com a matria, uma tcnica baseada em vibraes dos tomos de
uma molcula (FREIFELDER, 1982). uma modalidade relativamente antiga que
fornece um retrato de vibraes moleculares (NAUMANN, 2008).
E certamente uma das mais importantes tcnicas analticas disposio dos
pesquisadores. Na rea Biomdica tem sido utilizada para distinguir entre diferentes
tipos celulares, estruturas de tecido, biofludos e at mesmo para detectar mudanas
nesses materiais biolgicos induzidos por processos patolgicos. Em estudos de
processos patolgicos esta tcnica foi utilizada para caracterizao e deteco de
clulas cancergenas, clulas infectadas por vrus e para monitoramento de
substncias farmacolgicas injetadas em animais (ERUKHIMOVITCH et al, 2005;
STUART, 2004; NAUMANN, 2008).
Nos ltimos 20 anos tem sido utilizada para identificao rpida de
microrganismos, identificando de espcie a subespcie de bactrias, leveduras e
fungos de importncia clnica e industrial (MAQUELIN et al., 2003; OUST, 2004).


3.2.1 Absoro no Infravermelho


A radiao infravermelha estende-se da regio visvel do espectro
eletromagntico regio da microonda (10.000 - 10 cm
-1
), subdividida em
infravermelho prximo (NIR) de 10.000 a 4000 cm
-1
, infravermelho mdio (MIR) de
4000 a 400 cm
-1
e infravermelho distante (FIR) de 400 a 10 cm
-1
(Figura 14 )
(GAUGLITZ; VO-DINH, 2003; NAUMANN, 2000).
A absoro de luz infravermelha induz excitao na molcula promovendo
transies entre os nveis de energia. Os nveis de energia principais so
determinados pelas possveis distribuies espaciais dos eltrons e so chamados
nveis eletrnicos de energia, sobre estes existem os nveis vibracionais, que
indicam as vrias modalidades de vibrao da molcula. Todos estes nveis so
geralmente descritos por um diagrama de nveis de energia (Figura 15). O primeiro
44
nvel eletrnico chamado de estado fundamental e os demais so estados
excitados (WARTEVIG, 2003; FREIFELDER et al, 1982).








Figura 14 Espectro eletromagntico. Fonte: (NAUMANN, 2000)
A energia pode residir nas molculas em diversas formas, entre as mais
importantes esto energia rotacional, vibracional e eletrnica. A espectroscopia no
infravermelho baseada em vibraes moleculares e monitora a transio entre os
nveis de energia vibracionais.









Figura 15 - Diagrama de nveis de energia mostrando o estado fundamental e o primeiro estado
excitado. Fonte: Adaptado de (FREIFELDER, 1982).

A condio para que ocorra absoro da radiao infravermelha que haja
variao do momento de dipolo eltrico da molcula como consequncia de seu
movimento vibracional ou rotacional (o momento de dipolo determinado pela
magnitude da diferena de carga e a distncia entre dois centros de carga) (Figura
16). Somente nessas circunstncias, o campo eltrico alternante da radiao
Primeiro estado excitado
Nveis Vibracionais
Estado fundamental
E
N
E
R
G
I
A

Comprimento de
onda
Nmero de onda
Freqncia
Regio espectral
45
incidente interage com a molcula, originando os espectros. De outra forma, pode-se
dizer que o espectro de absoro no infravermelho tem origem quando a radiao
eletromagntica incidente tem uma componente com frequncia correspondente a
uma transio entre dois nveis vibracionais, quando sua frequncia idntica ao da
vibrao molecular.








Figura 16 - Variao do momento dipolar. Fonte: (STUART, 2004)

A grande maioria das molculas tm bandas de infravermelho na faixa espectral
entre 400 e 4000 cm
-1
(MIR), isso se deve, principalmente, ao fato de nessa regio
ocorrerem, essencialmente, transies fundamentais e existncia de uma faixa
espectral conhecida como regio de impresso digital. Nessa regio, pequenas
alteraes na estrutura e na constituio de uma molcula resultam em mudanas
significativas na distribuio das bandas de absoro do espectro, que so
relacionados com a estrutura da molcula (NAUMANN, 2000; WARTEWIG, 2003).


3.2.2 Vibrao Molecular


Uma molcula no uma associao rgida de tomos. Uma molcula pode ser
comparada a um sistema de massas variveis, correspondentes aos tomos da
molcula, e molas de diversos comprimentos, correspondente s ligaes qumicas
da molcula.
A espectroscopia vibracional analisa as vibraes peridicas dos tomos dentro
de uma molcula. Essas vibraes no ocorrem aleatoriamente, mas de uma forma
rigorosamente definida. As vibraes moleculares podem ir desde simples
46
movimentos associados de dois tomos em uma molcula diatmica a movimentos
mais complexos de cada tomo em uma grande molcula poliatmica. As ligaes
covalentes que constituem as molculas orgnicas esto em constantes movimentos
axiais e angulares (SIEBERT; HILDEBRANDT, 2008; GRIFFITHS; HASETH, 2007).
Em uma molcula poliatmica, cada tomo possui trs graus de liberdade: ele
pode se mover de forma independente ao longo de cada um dos eixos de um
sistema de coordenadas cartesianas. Se N tomos constituem uma molcula,
existem 3N graus de movimentos livres. Para molculas no-lineares, trs destes
graus - os translacionais envolvem movimentos de todos os tomos que se
deslocam simultaneamente na mesma direo paralela aos eixos de um sistema de
coordenadas cartesianas no alterando a distncia entre os tomos. Outros trs
graus de liberdade, os rotacionais, tambm no alteram a distncia entre os tomos,
por exemplo, sobre os eixos principais da molcula. O restante 3N - 6 graus alteram
as distncias entre os tomos, os comprimentos das ligaes qumicas e os ngulos
entre eles. Uma vez que estas ligaes so elsticas, movimentos peridicos
ocorrem. Estes 3N-6 graus de liberdade determinam o nmero de modos de
vibrao molecular. As molculas lineares possuem apenas dois graus de liberdade
rotacional e, portanto tem 3n-5 graus de liberdade vibracional (DIAS, 1986;
SHRADER, 1995; CHALMERS; GRIFTHS, 2002).
Esses graus de liberdade correspondem aos diferentes modos normais de
vibrao de uma molcula. Um modo normal de vibrao aquele em que cada
ncleo realiza uma oscilao harmnica simples em torno de sua posio de
equilbrio, todos os ncleos se movem com a mesma frequncia e em fase e o
centro de gravidade da molcula permanece inalterado.
Existem dois modos fundamentais de vibrao de molculas: estiramento ou
deformao axial, em que distncia entre dois tomos aumenta ou diminui, mas os
tomos permanecem no mesmo eixo de ligao; e deformao angular, em que a
posio do tomo muda em relao ao eixo original da ligao. Vibraes de
estiramentos podem ocorrer em fase (estiramento simtrico) ou fora de fase
(estiramento assimtrico). Vibraes de deformao podem ocorrer no plano
(tesoura e balano) ou fora do plano (sacudida e toro) (Figura 17) (SIEBERT;
HILDEBRANDT, 2008; STUART, 2004).


47











Figura 17 Vibraes de um grupo de tomos (+ e significam vibraes perpendiculares). Fonte:
Stuart (2004)


3.2.3 Espectro de Infravermelho


Um espectro de infravermelho (IR) de uma amostra geralmente obtido
colocando-se a amostra em um espectrofotmetro infravermelho de feixe simples ou
duplo e fazendo-se uma varredura da intensidade da radiao de IR antes e depois
da passagem do feixe atravs da amostra, ou seja, medindo a intensidade relativa
da luz transmitida (ou absorvida) em funo do comprimento de onda (ou nmero de
onda (cm
-1
)).
Os espectros de IR consistem em um grande nmero de bandas de absoro,
originadas da troca de energia e movimentos mecnicos das molculas que so
excitadas pela absoro da radiao de IR. A energia de uma banda de absoro
originada no espectro corresponde frequncia de uma vibrao de parte de
molculas da amostra. (BEATTIE et al., 1998; NAUMANN, 2000).
Cada banda do espectro caracterizada pelos seguintes parmetros:
(a) A posio mxima da banda ( ), mais frequentemente, expressa em nmeros
de onda (cm
-1
). A posio mxima da banda est relacionada s massas dos
dois tomos (m1 e m2 em g) das ligaes qumicas em questo, velocidade
da luz (c em cm/s) e a fora constante da ligao ( em dn), expressa pela
seguinte equao:
Vibraes de Estiramento
Vibraes de Deformao
Estiramento simtrico Estiramento assimtrico
Tesoura Balano Sacudida Toro
48

c 2
1

Onde,
= massa reduzida
2 1
2 1
m m
m m

(b) A intensidade (absoro) da banda:
Mxima, I max
Integrada, I int
(c) A largura de banda.

A posio mxima da banda o parmetro mais importante, pois fornece
informao sobre a frequncia e por isso o tipo de vibrao. O deslocamento dessa
frequncia provocada por fatores externos, fornece dados essenciais sobre as
mudanas estruturais em uma molcula. A intensidade de uma banda produz
informaes sobre o nmero de grupos de vibrao. A intensidade mxima no um
parmetro muito importante, uma vez sob diferentes condies em torno de uma
molcula a banda pode ser mais abrangente, maior ou menor e mais estreita. A
intensidade integrada tem um sentido mais fsico, porque reflete a probabilidade de
transio entre os nveis. A largura de banda depende da funo instrumental e do
efeito a cerca da vibrao (TWARDOWSKI; ANZENBACHHER, 1994).


3.2.4 Instrumentao


Os instrumentos utilizados para obteno de espectros vibracionais so
chamados espectrmetros. Existem dois tipos bsicos de espectrmetros que so
utilizados em espectroscopia no infravermelho, so eles: os espectrmetros
dispersivos, baseados em princpios dispersivos (presena de prismas, redes de
difrao, fendas, etc) e os espectrmetros com transformada de Fourier (FT),
49
baseados em princpios interferomtricos (GAUGLITZ; VO-DINH, 2003;
TWARDOWSKI; ANZENBACHHER, 1994).
Desde a dcada de 40 os espectrmetros dispersivos vem sendo utilizados; no
entanto no final da dcada de 70 comearam a ser progressivamente substitudos
por espectrmetros com transformada de Fourier (FT), estes tem melhorado a
aquisio espectral de forma significativa, revolucionando este campo. Atualmente
os espectrmetros IR que trabalham em rotina ou instrumentos de pesquisa so
baseados neste princpio (SIEBERT; HILDEBRANDT, 2008).
A vantagem mais significativa dos espectrmetros FT que a radiao de todos
os comprimentos de onda medida simultaneamente enquanto que em
espectrmetros dispersivos todos os comprimentos de onda so avaliados de forma
consecutiva. Portanto, um espectrmetro FT muito mais rpido e mais sensvel,
permite a aquisio de centenas de espectros de infravermelho em apenas alguns
minutos (GAUGLITZ; VO-DINH, 2003).


3.2.4.1 Espectrmetro FT-IR


Um espectrmetro FT-IR um instrumento baseado na idia da interferncia
entre dois feixes de radiao para produzir um interferograma de um sinal de
amostra usando um interfermetro. Este interferograma pode ser tratado por meio
de um processo matemtico, denominado transformada de Fourier, originando um
espectro ou padro de absoro da amostra. Possui trs componentes bsicos: a
fonte, o interfermetro e o detector. Um diagrama esquemtico do espectrmetro FT-
IR apresentado na figura 18. A radiao emergente da fonte transmitida atravs
de um interfermetro amostra antes de chegar a um detector. Aps a amplificao
do sinal, em que as contribuies de alta frequncia foram eliminadas por um filtro,
os dados so convertidos em formato digital por um conversor analgico-digital (A/D)
e transferido para o computador por transformada de Fourier (STUART, 2004 ;
WATERWIG, 2003).



50



Figura 18 - Componentes bsicos de um espectrmetro FTIR. Fonte: (STUART, 2004; NAUMANN,
2000)


3.2.4.1.1 Fonte de Radiao Infravermelha


Todos os espectrmetros de infravermelho possuem uma fonte de radiao
infravermelha que geralmente um material slido inerte aquecido eletricamente a
uma temperatura entre 1.500 e 2.200 K, o resultado uma radiao contnua. O
emissor de Nernst uma fonte composta principalmente de xidos de terras raras
como o zircnio, trio e trio; e o emissor Globar uma barra de carbeto de silcio. A
principal desvantagem do emissor de Nernst o fato de que a emissividade dos
xidos bastante baixa, acima de 2000 cm
-1
. Se a regio abaixo de 2000 cm
-1
de
interesse, a melhor fonte um emissor Globar. Outros materiais para emisso
tambm tem sido utilizados com sucesso, como o arco de mercrio e a lmpada de
filamento de tungstnio. Todas estas fontes so emissores bastante eficientes de
radiao infravermelha (COLTHUP, 1990; GRIFTHS, 2007; STUART, 2004).


3.2.4.1.2 Interfermetro


O interfermetro mais comum usado em espectroscopia FT-IR o interfermetro
de Michelson, que consiste em dois espelhos (um fixo e um mvel) e um divisor de
feixe (beam-splitter) que transmite 50% da radiao incidente da fonte para o
espelho mvel e reflete os outros 50% para o espelho fixo. Os espelhos, por sua
vez, refletem os dois feixes para o divisor, onde se recombinam. Se os dois espelhos
encontram-se equidistantes do divisor, as amplitudes combinam-se
construtivamente. Se o espelho mvel mover-se a uma distncia de l/4 do divisor, as
amplitudes combinam-se destrutivamente. Para a radiao no infravermelho, a soma
de todas as interaes construtivas e destrutivas para cada componente resulta num
Fonte Interfermetro Amostra Detector Amplificador Conversor
Analgico-Digital
Computador
51
sinal complexo denominado interferograma. Aps a aquisio do interferograma,
aplicada a transformada de Fourier que converte os dados obtidos no interfermetro
em um espectro ou padro de absoro da amostra, que relaciona a intensidade
versus frequncia (nmero de onda) (Figura 19) ( WATERWIEG, 2003; GRIFTHS,
2007).


























Figura 19 Princpio de funcionamento de um Interfermetro de Michelson consistindo de uma fonte
de luz, divisor de feixe, espelho fixo, espelho mvel, detector e amostra (A). Uma fonte de luz com
frequncia nica (B) modulado para um sinal senoidal observada pelo detector (C). Uma fonte de
luz branca (por exemplo, proveniente de uma fonte globar) transformado para o interferograma (D).
Fonte: (NAUMANN, 2000)
Espelho fixo
Espelho mvel
Amostra
Fonte
Divisor de feixe
Frequncia nica
Fonte de luz branca
Sinal do detector
Sinal do detector
(A)
(B) (C)
(D)
52
3.2.4.1.3 Detectores Infravermelho


O detector de infravermelho um dispositivo que mede a energia infravermelha
da fonte que passou pelo espectrmetro. Existem dois detectores usualmente
empregados para a regio do infravermelho mdio. O detector normal para uso
rotineiro o sulfato de triglicina (DTGS), um dispositivo piroeltrico que opera a
temperatura ambiente. o detector mais comum em FTIR, de resposta mais rpida
do que os tradicionais. As vantagens dos detectores DTGS que eles so simples,
barato e robusto. A principal desvantagem dos detectores DTGS que eles so
menos sensveis do que outros disponveis, isto significa que h certas aplicaes,
tais como a microespectroscopia de infravermelho, onde os detectores DTGS
simplesmente no podem ser utilizados. Para trabalhos mais sensveis o telureto de
cdmio e mercrio (MCT) pode ser usado, este tem capacidade fotocondutiva e
opera temperatura do nitrognio lquido. Tem melhor resposta a frequncias com
alta modulao, em relao ao DTGS (COLTHUP, 1990; SMITH, 2004).


3.2.5 Microespectroscopia FTIR


O sucesso do renascimento da espectroscopia no infravermelho na dcada de
1980 foi em grande parte o resultado do acoplamento do microscpio com o
espectrmetro de infravermelho com transformada de Fourier, microespectrocopia
FTIR. Desde aquela poca, a microespectroscopia FTIR rapidamente ganhou ampla
aceitao na comunidade cientfica como uma ferramenta qualitativa para a anlise
de contaminantes isolados ou reas localizadas de grandes amostras. Embora o
mtodo tenha uma resoluo espacial limitada, com relao a outros mtodos de
microanlise (por exemplo, microscopia eletrnica de varredura acoplada com
espectroscopia de energia dispersiva), a capacidade para fornecer informaes
moleculares e, assim, a identificao direta tem sido uma das principais vantagens
do mtodo (CHALMERS; GRIFTHS, 2002).
A microespectroscopia FT-IR tem sido aplicada em estudos de biomateriais,
tecidos biolgicos, plantas, microrganismos entre outros. Nos ltimos anos, houve
53
avanos considerveis, com amostras sendo caracterizadas na ordem de microns
(STUART, 2004).
Um esquema bsico de um microscpio convencional e de infravermelho so
ilustrados na figura 20. Em cada microscpio, a luz da fonte focalizada sobre a
amostra usando um condensador. A luz transmitida pela amostra recolhida pela
objetiva, que forma uma imagem ampliada da amostra iluminada no plano de
imagem primria. Esta imagem ento recriada para um detector adequado. Em
geral, a funo e os componentes encontradas em cada microscpio so as
mesmas, as nicas excees so de que o microscpio IR: emprega a radiao no
IR e usa um detector de IR sensvel. Alm dessas diferenas, o funcionamento do
microscpio de IR idntico do microscpio ptico. O mais importante
de que todos os microscpios IR incorporam um microscpio de luz branca no seu
caminho ptico para permitir que o analista manipule e veja a amostra (CHALMERS;
GRIFTHS, 2002).
















Figura 20 Comparao do microscpio com luz branca (A) com o microscpio IR (B). Fonte:
(CHALMERS; GRIFTHS, 2002)




Detector
Ocular/
Detector ptico
Imagem
primria
Objetiva
Amostra
Condensador
Fonte
(A) (B)
54
3.2.6 Anlise Espectral


3.2.6.1 Interpretao


A combinao das vibraes fundamentais ou rotaes de vrios grupos
funcionais e as sutis interaes destes grupos funcionais com outros tomos da
molcula resultam, em geral, em um espectro IR complexo que precisa ser
interpretado.
Felizmente, a interpretao do espectro simplificada pelo fato de que as
bandas que aparecem geralmente podem ser atribudas a determinadas regies de
uma molcula, produzindo o que so conhecidas como grupos de frequncias
(STUART, 2004).
Os principais grupos de frequncias associado aos grupos funcionais so
apresentados na tabela 5.

Tabela 5 Principais grupos funcionais e suas respectivas energias vibracionais. Fonte: COATES,
2000.
Grupo Funcional Grupos de frequncia
cm
-1
Hidroxila (estiramento O-H) 35703200
Carbonila
Aldedos
Cetonas

17401725/(28002700
a
)
1725-1705
Carboxila
cidos carboxlicos

1725-1700
Amino (estiramento N-H) 3400-3380
b
Amida (estiramento C=O) 1680-1630
Sulfidril (estiramento S-H) 2600-2550
Fosfato (estiramento P=O) 1350-1250
a
Banda de alta frequncia caracterstica de aldedos, associado com o aldedico terminal
(estiramento C-H).
b
amino primrio.

55
3.2.6.2 Pr-processamento espectral


A manipulao de espectros envolve alteraes ou execues de clculo sobre o
espectro original. O objetivo de manipular um espectro melhorar a sua aparncia,
ou extrair mais informaes dele. Vrios tratamentos podem, ento, ser realizados:
Suavizao espectral (usando geralmente o algoritmo Savitsky Golay com 9
pontos) usada para diminuir o nvel de rudos.
Correo de linha de base - usada para evitar a heterogeneidade entre espectros
devido ao desvio da linha de base.
Normalizao - usada para excluir diferenas de espessura da amostra. Os
espectros so normalizados pela banda mais intensa, ou com a mesma
intensidade integrada numa dada regio espectral.
Derivao - usada para minimizar a variabilidade da linha de base e aumentar a
resoluo. Em identificao de microrganismos os melhores resultados parecem
ser obtidos com a primeira derivada, conforme estudos anteriores j concludos
(MARIEY et al., 2001).
Alguns exemplos de tratamento so apresentados na figura 21.
















1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
0
.
0
0
.
1
0
.
2
0
.
3
0
.
4
0
.
5
0
.
6
0
.
7
0
.
8
0
.
9
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
it
s
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
0
.
0
0
.
1
0
.
2
0
.
3
0
.
4
0
.
5
0
.
6
0
.
7
0
.
8
0
.
9
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
it
s
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
0
.
0
0
.
2
0
.
4
0
.
6
0
.
8
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
it
s
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
0
.
0
0
.
1
0
.
2
0
.
3
0
.
4
0
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5
0
.
6
0
.
7
0
.
8
0
.
9
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
it
s
Sem suavizao espectral
Com suavizao espectral
Sem correo de linha de base Com correo de linha de base
56












Figura 21 Espectro de bactria com os diversos tratamentos: suavizao espectral, correo de
linha de base, normalizao e derivao.


3.3 Identificao de bactrias por espectroscopia no infravermelho


A espectroscopia no infravermelho tem sido descrita na literatura como uma
importante tcnica para discriminao e identificao de microrganismos.
De acordo com Naumann (2000) e Essendoubi et al.(2007) esta tcnica
representa um mtodo analtico, no destrutivo e dinmico para investigar uma
populao de clulas com pouca biomassa. Para eles, os espectros de FT-IR
fornecem impresses digitais altamente especficas dos microrganismos permitindo
a identificao da espcie sub-espcie, devido a diversidade microbiana ser
sempre uma diversidade estrutural e bioqumica.
Para Maquelin et al. (2002) um fotomicroscpio acoplado a um espectrmetro de
FT-IR fornece um verstil instrumento para a microanlise biolgica rpida, com
espectros podendo ser obtidos de microcolnias aps 6 a 10 h de cultura em placas
de gar (dependendo do tipo de microrganismo), tornando possvel a deteco, a
enumerao e a diferenciao microbiana dentro de um nico instrumento,
Sem derivar
1000 1500 2000 2500 3000 3500
-
0
.
0
0
2
-
0
.
0
0
1
0
.
0
0
0
0
.
0
0
1
0
.
0
0
2
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
it
s
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
-
0
.
0
2
0
.
0
0
0
.
0
2
0
.
0
4
0
.
0
6
0
.
0
8
0
.
1
0
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
it
s
Com primeira derivada
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
0
.
0
0
.
2
0
.
4
0
.
6
0
.
8
A
b
s
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c
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U
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it
s
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
-
0
.
0
2
0
.
0
0
0
.
0
2
0
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0
4
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0
6
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0
8
0
.
1
0
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
it
s
Sem normalizao
Com normalizao
57
fornecendo resultados diagnsticos potenciais em um dia de trabalho. (MAQUELIN
et al., 2002)
Segundo Ngo-Thi e colaboradores (2003) as bactrias Gram-positivas e Gram-
negativas podem ser perfeitamente discriminadas com base em seus espectros.
A Figura 22 apresenta trs espectros tpicos de amostras microbianas, entre eles
os espectros de bactrias Gram-positivas e Gram-negativas, onde revelam
diferenas em contornos de banda e intensidade relativa entre as mesmas.
















Figura 22 - Espectros tpicos de microorganismos patognicos: Staphylococcus aureus (ATCC 6538
(American type culture collection)) (1), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) (2), Candida albicans
(ATCC 10231) (3). Fonte: (NAUMANN, 2000)

Vrios estudos apontam a espectroscopia no infravermelho como uma excelente
ferramenta para a diferenciao e identificao de bactrias.
Kirschner e colaboradores (2001) classificaram e identificaram uma coleo
de 18 cepas de Enterococcus de isolados clnicos, alimentcios e de coleo de
cultura. Neste estudo os resultados foram comparados com tcnicas fenotpicas
(sistema API) e genotpicas (PCR), confirmando os resultados obtidos por FT-IR. Os
resultados do estudo refletiram o alto poder discriminatrio e reprodutvel da
Bactria Gram-positiva
Bactria Gram-negativa
Levedura
58
espectroscopia no infravermelho na diferenciao precisa das espcies de bactrias
como Enterococcus.
Oberreuter, Seiler e Scherer (2002) identificou 730 cepas de coleo de
bactrias corineformes, com 93,9%, 98,1% e 99,5 % das cepas classificadas
corretamente. Os resultados apontam a espectroscopia no infravermelho como uma
ferramenta valiosa para a rpida, simples e identificao de cepas de corineformes
de uma variedade de fontes. Comparando os resultados da identificao na literatura
a identificao correta total com mais de 95% ao nvel de espcie no foi alcanado
por qualquer mtodo de medida no-gentico.
Maquelin et al. (2003) identificou bactrias e fungos patognicos em
hemoculturas de pacientes hospitalizados. Neste estudo foram utilizados 89
bactrias e 32 fungos para a base de dados e foram examinadas 138 hemoculturas
de 121 pacientes, com 98,3% das amostras identificadas corretamente. Alm da
tcnica de espectroscopia foi realizada em paralelo a identificao fenotpica com o
sistema API. Os resultados do estudo ilustram o enorme potencial da espectroscopia
no infravermelho para uma rpida e correta identificao microbiana e uma resposta
nova para a necessidade de identificao microbiana em um rpido diagnstico
clnico.
Oust et al.(2004) identificou 56 cepas de quatro espcies de Lactobacillus
isolados de alimentos. No estudo foi possvel reconhecer as cepas que foram
incorretamente identificadas pelos mtodos tradicionais antes da anlise FT-IR. Os
resultados demonstraram que a espectroscopia FT-IR em combinao com mtodos
estatsticos multivariados, bem adequado para a identificao de Lactobacillus a
nvel de espcie, mesmo em um grande conjunto de dados.
Lamprell (2006) discriminou com sucesso Staphylococcus aureus de cepas de
39 espcies e sub-espcies de Staphylococcus isolados de diferentes tipos de leite e
queijo. Os resultados do estudo demonstraram que a espectroscopia FT-IR um
rpido mtodo para a identificao de Staphylococcus de isolados de
origem lctea e alimentar em geral.
Sandt et al. (2006) atravs do estudo de 1570 espectros, identificou 164 cepas
(clnicas e coleo) de bactrias Gram-positivas e Gram-negativas frequentemente
isoladas em ambiente clnico, com 100% de classificao correta em bactrias
Gram-positivas e 80% em bactrias Gram-negativas. Os resultados indicam que a
combinao da microespectroscopia FT-IR e anlise estatstica multivariada podem
59
ser uma ferramenta complementar, rpida e confivel para a discriminao de
microrganismos, em nvel de espcies e sub-espcies.
Amiali et al (2007) identificou e discriminou 92 cepas de Staphylococus aureus e
Staphylococcus coagulase negativa de isolados clnicos, incluindo cepas resistentes
a antibiticos, com 100 % de diferenciao. Os resultados indicam uma alta eficcia
para a discriminao entre Staphylococcus e oferece uma nova, rpida e simples
ferramenta para a diferenciao entre bactrias no diagnstico clnico.
Rebuffo-Scheer et al. (2007) identificou 28 cepas ATCC de 10 diferentes
espcies do gnero Mycobacterium, incluindo as espcies mais freqentes isoladas
em laboratrios clnicos. Uma excelente reprodutibilidade foi alcanada, uma clara
separao das diferentes espcies foi observada. Estes resultados demonstram o
potencial de microespectroscopia FT-IR para diferenciar rapidamente
Mycobacterium. Os resultados sugerem que um banco de dados de espectro
estendido, contendo as espcies mais comuns de Mycobacterium e abrangendo
uma ampla variao biolgica, pode fornecer uma soluo prtica para identificar
rapidamente Mycobacterium de isolados desconhecidos na rotina de laboratrios
clnicos.
Bosch e colaboradores (2008) identificou bactrias Gram-negativas isoladas de
amostras de secreo de pacientes com fibrose cstica. Para o estudo foram
utilizados 15 cepas de referncia e 169 isolados clnicos de 150 pacientes, com
98,1% de amostras identificadas corretamente. Segundo Bosh o mtodo
desenvolvido no estudo demonstrou ser confivel, rpido e preciso para uso prtico
na diferenciao e identificao de bactrias Gram-negativas.
Recentemente Khum et al (2009) identificou Yersinia enterocolitica e outras
espcies de Yersinia, tais como: Y. pseudotuberculosis, Y. bercovieri, e Y.
intermdia associado a redes neurais artificiais. Foram analisadas 123 cepas de
Yersinia isoladas de pacientes humanos e porcos, com 98,3 %, 92,5% e 98,5% das
amostras classificadas corretamente. Para Khum et al a espectroscopia FT-IR um
mtodo flexvel para a identificao de bactrias com gneros, espcies ou sub-
espcies diferentes.



3.3.1 Anlise Estatstica Multivariada
60


A discriminao entre microorganismos exige uma avaliao e uma
comparao completa entre as diferenas e similaridades espectrais. Com esta
finalidade, os espectros de alta qualidade de IR so pr-requisitos, que necessitam
ser complementados com tcnicas de compresso de dados e reconhecimento
padro.
Vrios mtodos estatsticos so utilizados para o reconhecimento padro de
bactrias por espectroscopia FT-IR. Entre os mtodos usados frequentemente
esto: anlise de cluster (Hierarchical Cluster Analysis HCA), anlise de
componentes principais (Principal Component Analysis PCA) e as redes neurais
artificiais (Artificial Neural Networks - ANNs). PCA e HCA so mtodos usados para
avaliao de similaridade entre os espectros, onde so calculadas as distncias
espectrais tornando possvel a identificao de um microrganismo desconhecido.
Para a HCA normalmente so utilizadas as primeiras derivadas de ordem espectral e
o algoritmo Wards com dimensionamento de primeiro intervalo (scaling to first
range) so aplicados. ANN so utilizados como sistema de auto-treinamento
supervisionado, este tipo de inteligncia artificial so inspirados na estrutura neural
de organismos inteligentes e que adquirem conhecimento atravs da experincia;
aps um nmero adequado de ciclos de treinamento os espectros do conjunto de
validao so testados (BEEKES; LASCH; NAUMANN, 2007; MARIEY et al., 2001;
OUST et al., 2004).
Mariey et al. (2001) em um estudo de reviso apontou o mtodo HCA como o
mais utilizado em estudos para identificao de microrganismos, com discriminao
entre classes realizadas com sucesso. Nos ltimos anos este mtodo tambm sido
utilizado com frequncia, foram relatados nos trabalhos de: Ngo-Thi, Kirschner e
Naumann (2003), Maquelin et al. (2003), Oust et al.(2004), Sandt et al. (2006),
Rebuffo-Scheer et al. (2007) e Bosh et al (2008). Como exemplo a figura 23
apresenta um dendograma, resultado da HCA executado em 240 espectros de
cepas diferentes de bactrias Gram-positivas, Gram-negativas e Leveduras, onde
cada ramo representa uma cepa. A HCA foi executada usando-se a primeira
derivada, sobre as escalas espectrais de 3000-2800, 1500-1400 e 1200-900 cm
-1
. As
escalas espectrais foram equalizadas e o algoritmo Wards aplicado.

61























Figura 23 Dendograma resultado da anlise de cluster (HCA) de clulas microbianas intactas.
Fonte: (BEEKES; LASCH; NAUMANN, 2007)













Heterogeneidade
Gram-negativa
Gram-positiva
Leveduras
62
4 MATERIAL E MTODOS


4.1 Cepas Bacterianas e crescimento


As cepas bacterianas utilizadas foram obtidas da coleo de cultura da
FIOCRUZ - Instituto Oswaldo Cruz. Foram examinadas: Escherichia coli ATCC
10799, Proteus mirabilis ATCC 25933, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442,
Staphylococcus aureus ATCC 14456, Staphylococcus epidermidis ATCC 9300 e
Enterococcus faecalis ATCC 10100. As cepas foram armazenadas em freezer a -
20C em caldo BHI com glicerol a 20%, reativadas em subculturas de 24 horas em
meio lquido de enriquecimento (caldo BHI - DIFCO), com posterior repique em
meios seletivos (Tabela 6). As inoculaes foram realizadas com concentraes
conhecidas de clulas bacterianas na fase logartmica de crescimento (culturas com
18-24 horas de idade), com clulas suspendidas em soluo salina 0,9% estril para
a determinao da escala 0,5 de McFarland (1,5 X 10
8
bact/ml). Os inculos foram
semeados em superfcie de Agar Mueller Hinton (OXOID) com auxlio de ala de
Drigalski e incubados por 6 horas a 37C (etapas sumarizadas na figura 24). Para a
cultura pura foram inoculados 300l da escala de McFarland 0,5 e para a cultura
mista, preparou-se um inculo com 150l de cada bactria (50% de cada bactria).
As inoculaes foram examinadas em triplicata.









Figura 24 Etapas da preparao de cultura bacteriana para anlise em FT-IR.


Reativao em BHI Repique em meio
seletivo
Escala de
McFarland
Agar Mueller Hinton
63
Tabela 6 Meios seletivos onde as bactrias foram inoculadas.
Bactria Meio Seletivo
Escherichia coli Agar McConkey OXOID
Proteus mirabilis Agar McConkey OXOID
Pseudomonas aeruginosa Agar McConkey OXOID
Enterococcus faecalis Agar Sangue 5% - Base BHI OXOID
Staphylococcus aureus Agar Manitol OXOID
Staphylococcus epidermidis Agar Manitol OXOID


4.2 Preparao da amostra


Com auxlio da ala de platina, trs aladas da biomassa bacteriana foram
removidas e suspensas em 120 l de soluo salina estril 0,9%, para a
manuteno de sua viabilidade, visto que a suspenso de clulas em gua destilada
pode ocasionar plasmlise ou choque osmtico. As amostras foram
homogeneizadas no agitor de tubos (PHOENIX) e foram depositados 5 l da soluo
em janela de fluoreto de clcio - CaF
2
(substrato transparente no infravermelho).
Uma vez que as mesmas encontravam-se imersas em soluo salina, e as
molculas de gua absorvem na radiao do infravermelho, foi necessrio desidrat-
las em estufa com temperatura a 50C, a fim de se obter uma fina pelcula
transparente adequada para medidas em microespectroscopia FT-IR (etapas
sumarizadas na figura 25). A presena do cloreto de sdio na amostra no interfere
nos espectros, por apresentarem ligaes inicas e no absorverem radiao
infravermelha.
A quantidade de aladas (concentrao da suspenso) foi ajustada de acordo
com a anlise dos espectros, pela intensidade da banda amida I (~1655 cm
-1
) entre
0,6 a 1,0 unidade de absorbncia (U.A.), dentro da faixa linear do detector MCT.
Acima de 1 U.A. no h linearidade entre absorbncia e espessura de amostra
(GRIFTHS, 2007).



64






Figura 25 Etapas da preparao de amostra bacteriana para anlise em FT-IR.


4.3 Microespectroscopia no infravermelho e mensurao


Os espectros das amostras de bactrias em cultura pura foram obtidos em modo
de ponto por transmisso, em cultura mista o modo de imagem foi associado, no
intervalo de 4000-900 cm
-1
, com 32 varreduras realizadas e resoluo de 4 cm
-1
utilizando o espectrofotmetro Spectrum Spotlight 400 FT-IR (Perkin Elmer)
equipado com detector MCT operando a temperatura do nitrognio lquido (Figura
26).
Para o modo de imagem uma rea de 50 m X 50 m foi selecionada com o
tamanho do pixel de 6,25 m
2
e velocidade do interfermetro de 1cm/s.











Figura 26 - Espectrofotmetro utilizado no experimento (Spectrum Spotlight 400, Perkin Elmer).
3 aladas
diluio em
120 l de
salina 0,9%
homogeneizao
em agitador de
tubos
5 l em janela
de CaF
2
Amostra em
estufa a 50C
por 1 hora
65
4.4 Tratamento dos dados e anlise estatstica


Para o estudo em cultura pura, vinte espectros de cada amostra foram includos
para anlise, totalizando 360 espectros de seis cepas bacterianas estudadas em
triplicata.
Para o estudo de cultura mista, vinte espectros em modo de ponto de cada
amostra foram includos para anlise e um registro de imagem (64 espectros) de
cada amostra foi utilizada, totalizando 756 espectros (180 espectros em modo de
ponto e 576 espectros em modo de imagem) de cepas puras e mistas de
Escherichia coli e Staphylococcus aureus estudadas em triplicata (total de espectros
estudados sumarizados na tabela 7).
Os espectros da matriz de imagem foram extrados no programa Cytospec em
extenso Jcamp.dx.
Os espectros em modo de ponto e modo de imagem, em extenso Jcamp.dx
foram tratados utilizando o programa estatstico OPUS (verso 4.2, Bruker). Para
minimizar a heterogeneidade espectral devido s diferenas de espessura da
amostra foram feitas as correes de linha de base seguidos de normalizao
vetorial em todo range espectral e para tornar visvel as variaes entre os espectros
o clculo da primeira derivada com 9 pontos de suavizao espectral foi realizado.
Os dados foram analisados estatisticamente atravs da anlise de cluster, trs
regies espectrais discriminantes foram selecionadas: 3000-2800 cm
-1
, 1470-1410
cm
-1
e 1176-950 cm
-1
, para calcular a distncia da matriz. O dimensionamento de
primeiro intervalo (Scaling first range) e o algoritmo Wards foi aplicado. O algoritmo
Wards produz grupos de dados buscando minimizar a soma das diferenas
(heterogeneidade) entre os elementos de cada grupo e o valor mdio do grupo,
minimizando o desvio padro entre os dados de cada grupo formado, construindo
grupos mais homogneos (WARD, 1963).
As atribuies de banda foram realizadas de acordo com a literatura e indicadas
na tabela 8.



66
Tabela 7 Sumrios dos estudos realizados, espectros coletados e modo de aquisio.
Cultura Pura
Bactria Modo de
aquisio
Nmero de espectros
coletados por amostra
Nmero total
de espectros
(triplicata)
Escherichia coli Point mode 20 60
Proteus mirabilis Point mode 20 60
Pseudomonas
aeruginosa
Point mode 20 60
Enterococcus
faecalis
Point mode 20 60
Staphylococcus
aureus
Point mode 20 60
Staphylococcus
epidermidis
Point mode 20 60
Total de espectros: 360
Cultura Mista
Bactria Modo de
aquisio
Nmero de espectros
coletados por amostra
Nmero total
de espectros
(triplicata)
Escherichia coli Point mode 20 60
Escherichia coli Image mode 64 (imagem 50 X50 m
2
) 192
Staphylococcus
aureus
Point mode 20 60
Staphylococcus
aureus
Image mode 64 (imagem 50 X50 m
2
) 192
Escherichia coli +
Staphylococcus
aureus (mista)
Point mode 20 60
Escherichia coli +
Staphylococcus
aureus (mista)
Image mode 64 (imagem 50 X50 m
2
) 192
Total de espectros: 756
67
5 RESULTADOS


Neste estudo foram analisados 1116 espectros de seis cepas bacterianas
padro (ATCC American Type Culture Collection) em cultura pura e mista com um
tempo de incubao de 6 horas, tempo mnimo para a coleta das microcolnias
bacterianas.
O estudo foi realizado em duas etapas:
1) anlise de bactrias Gram-negativas (Escherichia coli, Proteus mirabilis,
Pseudomonas aeruginosa) e bactrias Gram-positivas (Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis e Enterococcus faecalis) em cultura pura;
2) anlise de bactria Gram-negativa (Escherichia coli) e bactria Gram-positiva
(Staphylococcus aureus) em cultura mista.


5.1 Caracterizao, diferenciao e identificao de bactrias Gram-negativas e
Gram-positivas


Nesta subseo so apresentados resultados inerentes a cultura pura.
Os filmes finos de cada bactria utilizada no estudo so apresentados na figura
27, os filmes so a associao de bactrias com cloreto de sdio da soluo salina.
Cada bactria apresentou um comportamento diferente na formao do filme, e
estes comportamentos se repetiram nas triplicatas, conforme figura. As bactrias
Gram-negativas apresentaram uniformidade nos filmes, enquanto as bactrias
Gram-positivas apresentaram uma borda na amostra. Atravs da anlise da
formao dos filmes houve diferenciao entre os dois grupos de bactrias Gram-
negativas e Gram-positivas, sem formao de bordas e com formao de bordas,
respectivamente.





68































Figura 27 Micrografia dos filmes finos de bactrias Gram-negativas: Escherichia coli (A), Proteus
mirabilis (B), Pseudomonas aeruginosa (C); e bactrias Gram-positivas Enterococcus faecalis (D),
Staphylococcus aureus (E), Staphylococcus epidermidis (F) mostrando diferenas na formao de
filmes, em triplicatas o comportamento se manteve.
(A1) (A2) (A3)
(B1) (B2) (B3)
(C1) (C2) (C3)
(D1) (D2)
(D3)
(E1)
(E2) (E3)
(F1) (F2) (F3)
69
As amostras foram depositadas em janelas de fluoreto de clcio (CaF
2
) e
foram analisadas da regio de 4000-900 cm
-1
, regio de transies fundamentais e
transparncia da janela no infravermelho, conforme figura 28.












Figura 28 Espectro de absoro da janela de CaF
2
utilizada neste trabalho, sendo a mesma
transparente na regio espectral de interesse, situada entre 4000-900 cm
-1
, os rudos presentes no
espectro so devido a vibraes das molculas de H
2
O e CO
2
do ambiente.

Antes da obteno do espectro da amostra o espectro de fundo (background) foi
realizado para subtrao de qualquer influncia de vapor de gua (H
2
O) e gs
carbnico (CO
2
) do ambiente. A figura 29 mostra um tpico espectro de fundo.












Figura 29 Espectro tpico de fundo.

Influncia de
vibraes da
molcula de
H
2
O do
ambiente
Influncia de
vibraes da
molcula de
CO
2
do
ambiente
Influncia de
vibraes da
molcula de
H
2
O do
ambiente
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Wavenumber cm-1
0
.
2
0
.
4
0
.
6
0
.
8
1
.
0
A
b
s
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b
a
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c
e

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n
i
t
sInfluncia de
vibraes da
molcula de
H
2
O do
ambiente
Influncia de
vibraes da
molcula de
CO
2
do
ambiente
Influncia de
vibraes da
molcula de
H
2
O do
ambiente
U
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a
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s

d
e

a
b
s
o
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n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Wavenumber cm-1
1
5
2
0
2
5
3
0
3
5
4
0
A
R
B
Nmero de onda (cm
-1
)
70
Em filmes de bactrias Gram-negativas foram realizadas medidas aleatrias
devido uniformidade dos filmes, porm em filmes de bactrias Gram-positivas
foram realizadas medidas nas bordas onde apresentaram regies com bandas e
contornos de bandas bem definidos (figura 30 e 31).
Ainda na figura 30 a presena do mesmo padro espectral dos vinte espectros
realizados na mesma amostra e a consistncia entre as intensidades relativas das
bandas demonstram a reprodutibilidade das medidas espectrais.
Nas figuras 31 A e B apresentam os filmes e os espectros das regies de borda
e centro de Staphylococcus aureus (bactria Gram-positiva), pode-se observar em
36 (A) que no centro da amostra na regio de 1200-900 cm
-1
no h definio de
bandas e contornos de bandas ao passo que em 36 (B) nos espectros da borda da
amostra j se observam bandas e contornos bem definidos, justificando a aquisio
espectral nesta rea.
(A)








(B)










Figura 30 (A) Mapa da amostra de Proteus mirabilis associado aos vinte espectros realizados
aleatoriamente na amostra, (B) mapa da amostra de Staphylococcus aureus associado aos vinte
espectros realizados aleatoriamente na borda da amostra.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
-
0
.
0
2
0
.
0
0
0
.
0
2
0
.
0
4
0
.
0
6
0
.
0
8
0
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1
0
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c
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a
Nmero de onda (cm
-1
)
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
-
0
.
0
2
0
.
0
0
0
.
0
2
0
.
0
4
0
.
0
6
0
.
0
8
0
.
1
0
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+
+
+
+
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+
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+
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+
+
+
+
U
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b
s
o
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b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)
+
+
+
71



















Figura 31 Regies do filme fino de Staphylococcus aureus. (A) centro da amostra associado ao
espectro (B) borda da amostra associado ao espectro.

A figura 32 ilustra um espectro caracterstico de filme fino de bactria utilizada no
estudo com as principais bandas de vibraes moleculares.













Figura 32 - Espectro caracterstico de bactria com as principais bandas de vibraes moleculares.
3500 3000 2500 2000 1500 1000
Wavenumber cm
-1
C=O
Ester
cidos
nuclicos
3500 3000 2500 2000 1500 1000
Wavenumber cm
-1
C=O
Ester
cidos
nuclicos
1
2
3
4
5
6 7 8

Nmero de onda (cm
-1
)
U
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s

d
e

a
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s
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b

n
c
i
a
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
0
.
0
0
0
.
0
5
0
.
1
0
0
.
1
5
0
.
2
0
A
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b
a
n
c
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U
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it
s
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
0
.
0
0
0
.
0
2
0
.
0
4
0
.
0
6
0
.
0
8
0
.
1
0
A
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e

U
n
it
s
(A)
(B)
centro
centro
borda
Regio sem
definio
de bandas
Regio com
definio
de bandas
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)
Nmero de onda (cm
-1
)
72

A regio 1 de 4000 a 3000 cm
-1
devida principalmente ao estiramento do grupo
O-H (~3400 cm
-1
) e N-H de amida A de protenas (~3300 cm
-1
).
A regio 2 entre 3000 cm
-1
e 2800 cm
-1
exibem vibraes de estiramento C-H de
CH
2
e CH
3
de fosfolipdeos em membrana citoplasmtica e membrana externa
em bactrias Gram-negativas, alm de vibraes de aminocidos em cadeias
laterais (CLTs). Outras informaes complementares desses grupos funcionais
tambm podem ser observadas na regio entre 1470 cm
-1
e 1350 cm
-1
(regio 6)
onde os diferentes modos de deformao desses grupos funcionais so encontrados
(ERUKHMOVITCH et al., 2005; HELM et al., 1991; NAUMANN, 2000).
A banda centrada em 1.715 cm
-1
(regio 3) atribuda ao estiramento C=O,
frequentemente observada em espectros de clulas microbianas hidratadas e
sensveis ao pareamento de bases em cidos nuclicos.
As bandas intensas entre 1700 e 1600 cm
-1
(regio 4) e entre 1600 cm
-1
e 1500
cm
-1
(regio 5) so conhecidas como bandas de amida I e amida II, respectivamente.
A banda de amida I devida principalmente ao estiramento C=O de protenas e uma
pequena contribuio da deformao N-H (Figura 33 A). A banda de amida II
consiste na combinao dos estiramentos da ligao C-N e deformao angular da
ligao N-H (Figura 33 B), ambas tambm de protenas. A banda situada entre
~1695 a ~1675 est relacionada a configurao folha- de protenas, ao passo que a
banda situada em ~1655 est relacionada a configurao -hlice (SIEBERT;
HILDEBRANDT, 2008; VICKERY; NOZAWA; SAUER, 1990).









Figura 33 Vibraes moleculares de amida I e amida II de protenas, onde R e R indicam radicais.
Fonte: (SIEBERT; HILDEBRANDT, 2008)

N
Amida I
(1700-1600 cm
-1
)
Amida II
(1600-1500 cm
-1
)
C
O
R
R
H
N
(A)
(B)
C N
H
73
A regio espectral entre 1200 e 900 cm
-1
(regio 7 e 8), regio considerada
mista, caracterizada pelo estiramento simtrico de PO
2
-
em cidos nuclicos e
estiramento C-O-C, C-O-P em mono e polissacardeos. Por volta de 1230 cm
-1
h
contribuies de vibraes de estiramento P=O de fosfolipdeos de membrana
celular e fsforos de carboidratos encontrados em cidos teicicos e lipoteicicos de
bactrias Gram-positivas (OUST et al., 2004; NAUMANN, 2000).
A tabela 8 apresenta a atribuio detalhada de algumas bandas encontradas
frequentemente em espectros microbianos de IR associada composio
bioqumica e estrutura celular bacteriana.


Tabela 8 - Atribuio de bandas detalhada associada composio bioqumica e estrutura celular.
Baseado em: (NAUMANN, 2000; KANSIZ et al., 1999)
N da
banda
Frequncia
cm
-1
Identificao Composio Bioqumica e estrutura celular
bacteriana
~3500
s
(O-H) do grupo
hidroxila
gua (no interior da clula)
Carboidratos (polissacardeos)
Protenas (aminocidos)


1
~3200
s
NH (amida A) Protenas (apndice, parede celular,
ribossomos, incluses)
2959
a
(C-H) de -CH
3
Lipdios (fosfolipdios em membrana
citoplasmtica e membrana externa de
Gram-negativas)
Protenas (apndice, parede celular,
ribossomos, incluses)
2934
a
(C-H) de CH
2
Lipdios (fosfolipdios em membrana
citoplasmtica e membrana externa de
Gram-negativas)
Protenas (apndice, parede celular,
ribossomos, incluses)
Carboidratos (polissacardeos em cpsula,
parede celular e incluses)
2872
s
(C-H) de CH
3
Lipdios (fosfolipdios em membrana
citoplasmtica e membrana externa de
Gram-negativas)
Protenas (apndice, parede celular,
ribossomos, incluses)









2
2852
s
(C-H) de CH
2
Lipdios (fosfolipdios em membrana
citoplasmtica e membrana externa de
Gram-negativas)
Protenas (apndice, parede celular,
ribossomos, incluses)
Carboidratos (polissacardeos em cpsula,
parede celular e incluses)
74
3 1715
s
(C=O) de steres,
RNA/DNA,

cidos nuclicos (DNA: ncleo e
plasmdeo, RNA: ribossomos e
citoplasma)
~1695
~1685
~1675



Amida I (
s
C=O e
s

N-H) componentes
resultantes de folha-
de protenas




4
~1655 Amida I de estruturas
-hlice
Protenas (apndice, parede celular,
ribossomos, incluses)

5 1548 Amida II (
s
N-H e
s
C-
N)
Protenas (apndice, parede celular,
ribossomos, incluses)

1515 Banda Tirosina Protena (aminocido)
6 1468
a
de C-H
3
e
s
de CH
2
Protenas (apndice, parede celular,
ribossomos, incluses)
Carboidratos (polissacardeos em cpsula,
parede celular e incluses)
~1400
s
(C=O) de COO
-

s
de C-H
3
e
a
de CH
2


Protenas (apndice, parede celular,
ribossomos, incluses)
Carboidratos (polissacardeos em cpsula,
parede celular e incluses)
1310-1240 Amida III Protenas (apndice, parede celular,
ribossomos, incluses)

1250-1220
a
(P=O) de PO
2
-
cidos nuclicos (DNA: ncleo e
plasmdeo, RNA: ribossomos e
citoplasma)
Lipdios (fosfolipdios em membrana
citoplasmtica e membrana externa de
Gram-negativas)
1200-900

s
(C-O) ,
s
(C-C),

s
(C-O-C) e (C-O-P)
Carboidratos (polissacardeos em cpsula,
parede celular e incluses)






7 e 8
1085
s
de (P=O) de PO
2
-
cidos nuclicos (DNA: ncleo e
plasmdeo, RNA: ribossomos e
citoplasma)
Lipdios (fosfolipdios em membrana
citoplasmtica e membrana externa de
Gram-negativas)
= estiramento, = deformao, a=assimtrico, s=simtrico.


A figura 34 apresenta os espectros mdios de FT-IR das bactrias utilizadas
neste estudo. Uma rpida inspeo dos espectros demonstra que eles so muitos
semelhantes. No entanto, numa anlise mais cuidadosa, mudanas sutis podem ser
observadas. Analisando a regio espectral de 4000 a 3000 cm
-1
(estiramento O-H e
N-H), no foi notada alterao significativa para as diferentes bactrias, entretanto
75
na regio de 3000 a 2800 cm
-1
(estiramento C-H de CH
2
e CH
3
) e 1470-1410 cm
-1
(deformao C-H de CH
2
e CH
3
), observam-se alteraes em relao intensidade
relativa e contornos de banda nos espectros; as demais bandas no apresentaram
mudanas significativas.
Alm das mudanas em relao intensidade e contornos de bandas, atravs
da anlise dos espectros das bactrias podem-se notar padres semelhantes em
contornos de banda entre os grupos das bactrias. Em alguns aspectos podem-se
diferenciar os grupos de bactrias por meio das alteraes de intensidade (aumento
ou diminuio) relativas de algumas destas bandas ou picos. As bactrias Gram-
positivas na regio de estiramento CH
2
-CH
3
(3000-2800 cm
-1
) apresentam a mesma
intensidade entre os picos, caracterstica no observada nas bactrias Gram-
negativas que apresentaram um aumento de intensidade na banda e no segundo
pico desta regio. Na regio de deformao CH
2
-CH
3

(1470-1410 cm
-1
) os grupos de
bactrias tambm podem ser diferenciados, no primeiro pico desta regio as
bactrias Gram-positivas apresentam uma diminuio na intensidade do pico em
relao s bactrias Gram-negativas e um aumento na intensidade do segundo pico
desta regio.




















Figura 34 Espectro FT-IR representativo de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas
aeruginosa, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis (espectro
3500 3000 2500 2000 1500 1000
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)

Escherichia coli
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Staphylococcus epidermidis
CH
2
-CH
3


CH
2
-CH
3
76
mdio de uma amostra). Os dados foram transladados ao longo do eixo Y para melhor visualizao.
= estiramento e = deformao.

A fim de tornar pequenas diferenas espectrais visveis, a primeira derivada de
ordem espectral foi calculada. Na anlise de primeira derivada observaram-se
diferenas significativas, alm das regies mencionadas, na regio de 1176-950 cm
-1
(regio mista) (Figura 35).
Analisando a primeira derivada notaram-se novas caractersticas e confirmaram-
se as caractersticas observadas nos espectros sem derivao. Na figura 35 (A) as
bactrias Gram-negativas apresentaram maior intensidade na banda de estiramento
assimtrico e simtrico C-H de CH
2
(lipdios, protenas e carboidratos). Em
contrapartida as bactrias Gram-positivas apresentaram um aumento de intensidade
na regio atribuda ao estiramento simtrico C-H de CH
3
(lipdios e protenas). Na
figura 35 (B) as bactrias Gram-negativas mostraram maior intensidade da banda
relacionada deformao assimtrica C-H de CH
3
e deformao simtrica C-H de
CH
2
, alm da ocorrncia de um ombro em ~1420 cm
-1
. Na figura 35 (C) ocorreram
alteraes em intensidade e contornos de banda, principalmente na regio de ~1085
cm
-1
atribuda ao estiramento simtrico de P=O.

















3000 2970 2940 2910 2880 2850 2820
-0,0006
-0,0004
-0,0002
0,0000
0,0002
0,0004
0,0006
0,0008
0,0010
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)
1150 1100 1050 1000 950
-0,0006
-0,0004
-0,0002
0,0000
0,0002
0,0004
0,0006
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
i
t
s
Wavenumber cm
-1
1470 1460 1450 1440 1430 1420 1410
-0,0008
-0,0006
-0,0004
-0,0002
0,0000
0,0002
0,0004
U
n
i
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a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Proteus mirabilis
Enterococcus faecalis
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis

a

(CH
3
)

a

(CH
2
)

s

(CH
3
)

s

(CH
2
)

s

(P=O)

a
(CH
3
)

e

s
(CH
2
)
Bactrias Gram-positivas
(A)
(C)
(B)
Bactrias Gram-negativas
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)
77
Figura 35 Primeira derivada de ordem espectral em regies significativamente diferentes de:
Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis (espectro mdio de uma amostra). = estiramento, =
deformao, a=assimtrico, s=simtrico.

O aumento considervel da intensidade na regio de estiramento assimtrico e
simtrico C-H de CH
2
de bactrias Gram-negativas podem ser explicados
principalmente pela presena de lipopolissacardeos (LPS), fosfolipdeos e
lipoprotenas de parede celular no presentes em bactrias Gram-positivas. Alm da
presena de flagelina e pilina, que so protenas precursoras de flagelos propulsores
e pili presentes em Escherichia coli, Proteus mirabilis e Pseudomonas aeruginosa.
Este mesmo entendimento pode ser estendido s regies de 1470-1410 cm
- 1
(deformao assimtrica C-H de CH
3
e deformao simtrica C-H de CH
2
), por ser
uma regio complementar dos estiramentos dos grupos funcionais discutidos acima.
No foram encontradas justificativas para o aumento de intensidade na regio
atribuda ao estiramento simtrico C-H de CH
3
(lipdios e protenas) de bactrias
Gram-positivas.
Na regio de estiramento simtrico de P=O duas hipteses podem ser
levantadas para as alteraes observadas: presena de cidos nuclicos, que so
nicos para cada organismo conferindo contornos de bandas diferentes e presena
de fosfolipdios da membrana externa de bactrias Gram-negativas conferindo
aumento de intensidade nesta regio.
A fim de se analisar o conjunto total de dados para a classificao dos espectros,
foi realizado a anlise estatstica. Foi empregada a anlise de cluster para um
conjunto de 360 espectros tratados de trs cultivos independentes das seis
bactrias. A anlise de cluster uma anlise quantitativa de dissimilaridade, que
consideram a forma e o contorno dos espectros, em vez de nmeros de banda,
frequncias ou intensidades (HELM et al., 1991).
Como resultado foi obtido um dendograma, mostrado na figura 36, este
dendograma mostra uma clara discriminao entre as seis bactrias analisadas, com
100% de classificao espectral correta. O dendograma foi dividido em dois ramos
principais, o primeiro ramo aglomerou-se bactrias Gram-negativas (Escherichia coli,
Proteus mirabilis e Pseudomonas aeruginosa) e o segundo ramo bactrias gram-
positivas (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus e Staphylococcus
epidermidis). Esta diferena entre os dois grupos pode ser atribuda principalmente
78
diferena de composio de parede celular (lipdios, carboidratos e protenas) de
bactrias Gram-negativas e Gram-positivas, como observados na anlise de
primeira derivada. As triplicatas foram organizadas aleatoriamente dentro do cluster,
confirmando a reprodutibilidade do mtodo (Figura 37).



























Figura 36 - Dendograma resultado da anlise de cluster das seis bactrias examinadas em triplicata,
20 espectros gravados em cada triplicata em modo de ponto. A anlise de cluster foi realizada
utilizando a primeira derivada de ordem espectral considerando os ranges espectrais de 3000-2800
cm
-1
, 1470-1410 cm
-1
, 1176-950 cm
-1
.
Bactrias Gram-negativas
Bactrias Gram-positivas
79
























Figura 37 - Dendograma resultado da anlise de cluster da triplicata de Escherichia coli , 20 espectros
gravados em cada triplicata em modo de ponto. A anlise de cluster foi realizada utilizando a primeira
derivada de ordem espectral considerando os ranges espectrais de 3000-2800 cm
-1
, 1470-1410 cm
-1
,
1176-950 cm
-1
. As amostras foram agrupadas aleatoriamente


5.2 Diferenciao de culturas puras e mistas


Neste estudo trs inoculaes foram examinadas em triplicata: (a) Escherichia
coli, (b) Staphylococcus aureus e (c) cultura mista de ambas (Escherichia coli e
Staphylococcus aureus) com 50% de cada. As amostras foram analisadas em modo
1
2
3
44
5
6
777
8
999
1
0
1
1
1
2
1
3
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
5
1
6
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
8
1
9
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0

0
1
0
2
0
3
0
4
0
5
0
Heterogeneity
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra2E.
Amostra2E.
Amostra3E.
Amostra2E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra1E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Amostra3E.
Dat a Pr epr ocessi ng: Fi r st Der i vat i ve
War d' s Al gor i t hm Fr equency Ranges ( Wei ght s) =
Cor r el at i on wi t h 3000 - 2800 / cm( 1. 0)
Scal i ng t o 1st r ange 1470 - 1410 / cm( 1. 0)
Met hod Fi l e = TEMPVI EW. CLA 1176 - 950 / cm( 1. 0)
80
de ponto e em modo de imagem, em modo de ponto o espectro da amostra a
mdia de uma rea de 100 m
2
e em modo de imagem o espectro o resultado de
uma rea de 6,25 m
2
(tamanho do pixel) ideal para se investigar amostras com
composio heterognea. A figura 38 mostra os filmes finos de cada triplicata
utilizada no estudo.


Figura 38 Micrografia dos filmes finos de Escherichia coli (A), Staphylococcus aureus (B); e
Escherichia coli e Staphylococcus aureus (C).

Analisando os filmes de cultura mista (figura 38 C) possvel observar a
associao das linhas caractersticas do filme de Escherichia coli (figura 38 A) com o
centro do filme de Staphylococcus aureus (figura 38 B).
A figura 39 apresenta os espectros mdios (em modo de ponto) de Escherichia
coli, Staphylococcus aureus e cultura mista de Escherichia coli e Staphyloccocus
aureus. Como em culturas puras as principais diferenas espectrais entre as
amostras foram observadas na regio de estiramento C-H de CH
2
e CH
3
(3000-2800
cm
-1
) e deformao C-H de CH
2
e CH
3
(1470-1410 cm
-1
). Os espectros da amostra
(A1) (A2) (A3)
(B1) (B2) (B3)
(C1) (C2) (C3)
81
mista se assemelham ao espectro de Escherichia coli, esta semelhana pode ser
justificada pelo provvel aumento de E. coli na cultura. Visto que o tempo de
gerao de E. coli menor que o de Staphylococcus aureus, 20 minutos (KAYSER
et al., 2005) e 30 minutos (TATINI; STEIN; SOO, 2006), respectivamente.

Na regio de estiramento C-H de CH
2
e CH
3

o espectro de Staphylococcus
aureus apresenta a mesma intensidade entre os picos e Escherichia coli apresenta
maior intensidade na banda e nos picos e o segundo pico mais intenso. O espectro
da juno de Escherichia coli e Staphylococcus aureus apresenta a banda e o
segundo pico um pouco mais intenso quando comparado ao espectro de
Escherichia coli. Na regio de deformao C-H de CH
2
e CH
3
o espectro de
Staphylococcus aureus apresenta o primeiro pico menos intenso e o segundo mais
intenso quando comparado aos demais. O espectro de Escherichia coli comparado
ao espectro da juno das bactrias apresenta o segundo pico mais intenso.


















Figura 39 Espectro FT-IR representativo de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Escherichia
coli com Staphylococcus aureus (espectro mdio de uma amostra). Os dados foram transladados ao
longo do eixo Y para melhor visualizao. = estiramento e = deformao.
CH
2
-CH
3

CH
2
-CH
3

3500 3000 2500 2000 1500 1000
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Escherichia coli
Escherichia coli + Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)


82
Para amplificar mudanas sutis na absoro todos os espectros foram
transformados em sua primeira derivada de ordem espectral (Figura 40). Do mesmo
modo os contornos de banda da cultura mista demonstraram semelhana ao de E.
coli, no entanto na regio de 1176-950 cm
-1
houve diferenas em contornos de
bandas.
























Figura 40 Primeira derivada da mdia espectral das amostras utilizadas no estudo, demonstrando
diferenas de absoro nas regies de 3000-2800 cm
-1
, 1470-1410 cm
-1
e 1176-950 cm
-1
.

As diferenas entre o aumento e a diminuio de intensidade de bandas nestas
regies entre Staphylococcus aureus e Escherichia coli foram discutidas no estudo
de cultura pura. Como citado anteriormente semelhana entre o espectro de E. coli
e o de cultura mista pode ser devido ao aumento de E. coli na cultura, que pode ser
observado com detalhe na simulao de crescimento nas tabelas 9 e10.
Os aumentos e diminuies de intensidade na regio de estiramento e
deformao C-H de CH
2
e CH
3
e alterao no contorno de banda na regio de 1176-
3000 2980 2960 2940 2920 2900 2880 2860 2840 2820 2800
-0,0006
-0,0004
-0,0002
0,0000
0,0002
0,0004
0,0006
0,0008
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)


1150 1100 1050 1000 950
-0,0004
-0,0002
0,0000
0,0002
0,0004
0,0006
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)


1470 1460 1450 1440 1430 1420 1410
-0,0004
-0,0002
0,0000
0,0002
0,0004
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)


E.coli
S.aureus
Mista

a

(CH
3
)

a

(CH
2
)

s

(CH
3
)

s

(CH
2
)

a
(CH
3
)

e

s
(CH
2
)

s

(P=O)
83
950 cm
-1
do espectro de cultura mista podem ser explicadas pela associao das
caractersticas espectrais de E. coli e S.aureus.

Tabela 9 Simulao do crescimento exponencial de Escherichia coli com tempo de incubao de 6
horas a partir de uma clula bacteriana.
Tempo (horas:
min.)
N de clulas Tempo (horas:
min.)
N de clulas
0 1 3:20 1.024
:20 * 2 3:40 2.048
:40 4 4:00 4.096
1:00 8 4:20 8.192
1:20 16 4:40 16.384
1:40 32 5:00 32.768
2:00 64 5:20 65.536
2:20 128 5:40 131.072
2:40 256 6:00 262.144
3:00 512
* tempo de gerao


Tabela 10 Simulao do crescimento exponencial de Staphylococcus aureus com tempo de
incubao de 6 horas a partir de uma clula bacteriana.
Tempo (horas:
min.)
N de clulas Tempo (horas:
min.)
N de clulas
0 1 3:30 128
:30 * 2 4:00 256
1:00 4 4:30 512
1:30 8 5:00 1.024
2:00 16 5:30 2.048
2:30 32 6:00 4.096
3:00 64
* tempo de gerao

Para a anlise do conjunto dos dados tratados a anlise de cluster foi realizada
com os mesmos parmetros do estudo de cultura pura, um dendrograma foi obtido
atravs dos 180 espectros em modo de ponto, como mostrado na figura 41. Este
84
dendrograma mostra uma clara discriminao entre as inoculaes examinadas.
Todas as amostras foram agrupadas corretamente, as triplicatas de cada bactria
foram organizadas no mesmo cluster e aleatoriamente. Os dados de cultura mista se
aglomeraram no mesmo ramo de Escherichia coli, confirmando as semelhanas
espectrais. No houve nenhuma aglomerao de espectros de cultura mista dentro
do cluster de Escherichia coli ou Staphylococcus aureus, indicando uma provvel
identificao em cultura mista.


Figura 41 Dendograma resultado da anlise de cluster das trs inoculaes examinadas em
triplicata, 20 espectros gravados em cada triplicata em modo de ponto. A anlise de cluster foi
realizada utilizando a primeira derivada de ordem espectral considerando os ranges espectrais de
3000-2800 cm
-1
, 1470-1410 cm
-1
, 1176-950 cm
-1
.



5.2.1 Culturas mistas e anlise de imagem FT-IR


Com o objetivo de identificar bactrias em cultura mista o estudo no modo
imagem foi realizado. As figuras 42, 43 e 44 apresentam os mapas de absoro
qumica de uma regio de 50m
2
x 50 m
2
, representativos das triplicatas associado
Mista
85
imagem do filme e aos 64 espectros extrados da matriz. As diferentes cores no
mapa indicam diferenas na absoro da luz infravermelha na amostra, que variou
entre 0,4 a 1,0. A regio branca do mapa indica uma regio com maior absoro da
radiao infravermelha e regio roxa com menor absoro. As pequenas variaes
de absoro nos mapas indicam uma pequena diferena de espessura e, portanto
homogeneidade da amostra. Os espectros extrados da matriz tambm confirmam
esta homogeneidade atravs da reprodutibilidade espectral.






























Figura 42 Filme fino de Escherichia coli associado ao mapa de absoro qumica de uma amostra
(resoluo espacial de 50 X 50 m
2
) e aos 64 espectros extrados da matriz. rea da amostra
analisada.







1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
-
0
.
0
2
0
.
0
0
0
.
0
2
0
.
0
4
0
.
0
6
0
.
0
8
0
.
1
0
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
i
t
s
Nmero de onda (cm
-1
)
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
86













































Figura 43 Filme fino de Staphylococcus aureus associado ao mapa de absoro qumica de uma
amostra (resoluo espacial de 50 X 50 m
2
) e aos 64 espectros extrados da matriz. rea da
amostra analisada.



1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
-
0
.
0
2
0
.
0
0
0
.
0
2
0
.
0
4
0
.
0
6
0
.
0
8
0
.
1
0
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
i
t
s
Nmero de onda (cm
-1
)
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
87


































Figura 44 Filme fino de Escherichia coli com Staphylococcus aureus associado ao mapa de
absoro qumica de uma amostra (resoluo espacial de 50 X 50 m
2
) e aos 64 espectros extrados
da matriz. rea da amostra analisada.



Na figura 45 so apresentados os espectros mdios de uma amostra,
novamente os espectros extrados da matriz de cultura mista se assemelham ao
espectro de E. coli. As bandas na regio de 1200-900 cm
-1
ocorreram variaes na
intensidade devido diferena de espessura da amostra. Ao se investigar a primeira
derivada espectral da amostra de cultura mista (Figura 46) nota-se que na regio de
1176-950 cm
-1
h um comportamento espectral heterogneo, no observado na
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Wavenumber cm-1
-
0
.
0
2
-
0
.
0
0
0
.
0
2
0
.
0
4
0
.
0
6
0
.
0
8
0
.
1
0
0
.
1
2
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

U
n
i
t
s
Nmero de onda (cm
-1
)
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
88
regio de 3000-2800 cm
-1
e observado somente na regio de aproximadamente
1450 cm
-1
, regio atribuda deformao C-H de CH
2
, CH
3
. Acredita-se que no filme
de cultura mista no exista uma regio que contenha apenas Escherichia coli e
Staphylococcus aureus. Existem regies onde a concentrao de uma pode ser
maior que a outra havendo, portanto maiores e menores intensidades dos picos
caractersticos. Em regies predominantes de Escherichia coli, haver maior
contribuio dos modos de estiramento C-H de CH
2
, CH
3
, e um ombro na regio de
deformao CH
2
, CH
3.
Em regies com distribuio similar de bactrias haver um
espectro mdio delas.
















Figura 45 Espectro FT-IR extrado da matriz de imagem representativo de Escherichia coli,
Staphylococcus aureus e Escherichia coli com Staphylococcus aureus (espectro mdio de uma
amostra). Os dados foram transladados ao longo do eixo Y para melhor visualizao. = estiramento
e = deformao.

O tamanho do pixel pode tambm ter sido relevante na anlise, visto que foi
utilizado o tamanho de 6,25 m
2
, o menor tamanho disponvel no sistema, sabe-se
que o tamanho de uma bactria varia de 1 a 5 m (KAYSER et al, 2005), logo em
6,25m
2
haver mais de uma bactria, alm de sobreposio.

3500 3000 2500 2000 1500 1000
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16


U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

A
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)
E.coli
S.aure
Mista
Escherichia coli
Escherichia coli +Staphylococcus
aureus
Staphylococcus aureus

89



Figura 46 - Espectros de primeira derivada da cultura mista mostrando regies espectrais
heterogneas (~1450 cm
-1
,1176-950 cm
-1
).


O dendograma da figura 47 apresenta os resultados da anlise de cluster
realizada em 576 espectros extrados da matriz de imagem das trs inoculaes
examinadas, como no modo de ponto as amostras analisadas foram agrupadas
corretamente, os espectros da cultura mista foram aglomerados no mesmo ramo de
Escherichia coli e no foi observada a aglomerao de nenhum espectro de cultura
mista em cultura pura, indicando que as bactrias esto misturadas, sobrepostas em
6,25 m
2
e o espectro uma composio delas.



2800 2850 2900 2950 3000
-
0
.0
4
-
0
.0
2
0
.0
0
0
.0
2
0
.
0
4
0
.0
6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
U
n
it
s
950 1000 1050 1100 1150
-
0
.0
2
-
0
.0
1
0
.0
0
0
.0
1
0
.
0
2
0
.0
3
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
U
n
it
s
1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470
-
0
.0
3
-
0
.0
2
-
0
.0
1
0
.0
0
0
.
0
1
0
.0
2
0
.0
3
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
U
n
it
s
Nmero de onda (cm
-1
)
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

a
b
s
o
r
b

n
c
i
a
Nmero de onda (cm
-1
)
Nmero de onda (cm
-1
)
U
n
i
d
a
d
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d
e

a
b
s
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n
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c
i
a
90

Figura 47 - Dendograma resultado da anlise de cluster das trs inoculaes examinadas em
triplicata em modo de imagem, 64 espectros extrados de cada mapa de absoro qumica. A anlise
de cluster foi realizada utilizando a primeira derivada de ordem espectral considerando os ranges
espectrais de 3000-2800 cm
-1
, 1470-1410 cm
-1
, 1176-950 cm
-1
.
















Mista
91
6 DISCUSSO


Neste trabalho realizou-se um estudo sobre o potencial da microespectroscopia
FT-IR na identificao rpida de bactrias. Os resultados ilustram o enorme
potencial da tcnica para uma rpida e correta identificao bacteriana em culturas
puras e diferenciao entre culturas puras e mistas. O estudo foi realizado em
triplicatas, obtendo-se excelentes resultados. Foram analisados estatisticamente
1116 espectros de FT-IR de culturas com 6 horas de incubao, obtendo-se a
correta identificao em 100% das amostras. Um tempo relativamente menor
quando comparado s tcnicas tradicionais de identificao com tempo de
incubao de 24 horas e aproximadamente 6 horas de provas bioqumicas para a
identificao.
Esta reduo de tempo na identificao bacteriana significativamente
importante em ambientes como Unidade de Terapia Intensiva, onde ocorrem
eventos adversos com necessidade de rpida interveno.
Estudos recentes tm demonstrado este potencial da espectroscopia no
infravermelho em identificar bactrias com alta especificidade. A maioria dos estudos
indica a tcnica de FT-IR como uma ferramenta com um enorme potencial para o
diagnstico clnico (REBUFFO-SHEER et al, 2007; BOSH et al, 2008; KUHM et al,
2009).
Os resultados do estudo de cultura pura corroboram com os apresentados por
Erukmovitch et al. (2005), Helm et al (1991), Maquelin et al. (2003), Ngo-Thi,
Kirschner, Naumann (2003) e Sandt et al. (2006), os quais diferenciam e identificam,
por FT-IR, as bactrias Gram-negativas e Gram-positivas e apontam esta tcnica
como uma importante ferramenta para anlise microbiolgica rpida e importante
para o sucesso da terapia.
Em relao ao tempo de incubao dos microrganismos, neste trabalho todos os
microrganismos foram cultivados por seis horas, uma vantagem em relao aos
demais trabalhos que variam o tempo de incubao entre 6 a 10 horas dependendo
do microrganismo, utilizando uma tcnica diferente de preparao de amostra
(SANDT et al, 2006; MAQUELIN et al, 2003; NGO-THI, KIRSCHNER, NAUMANN
2003).
92
Sandt et al (2006) relatou tempos de incubao de 10 horas para
Staphylococcus epidermidis e Pseudomonas aeruginosa para obteno de amostras
com espectros reprodutveis e de qualidade.
Em relao aos resultados dos filmes bacterianos (figura 27) no estudo de
cultura pura no se encontrou na literatura nenhuma descrio sobre as diferenas
em formaes dos filmes de bactrias Gram-negativas e Gram-positivas em soluo
salina (ERUKHIMOVITCH et al, 2005; AMIALI et al, 2007). A maioria dos trabalhos
utiliza como metodologia para a preparao de amostra a tcnica de estampagem
de microcolnias onde no se observam essas caractersticas (MAQUELIN et al,
2003; SANDT et al, 2006; NGO-THI, KIRSCHNER, NAUMANN, 2003 ). Outra
metodologia de preparao de amostra citada na literatura a diluio em gua
destilada onde tambm no foram relatados diferenas em amostras (BOSH, 2008;
HELM, 1991; KIRSCHNER et al, 2001).
Os espectros das amostras foram considerados reprodutveis. De acordo com
Kansiz et al. (1999) a reprodutibilidade importante para a correta classificao
espectral e os espectros podem ser considerados altamente reprodutveis atravs da
consistncia entre as intensidades relativas das bandas.
Neste trabalho, a reprodutibilidade espectral foi alcanada pela padronizao
das condies de cultura bacteriana e preparao das amostras, as quais refletiram
na excelente qualidade dos filmes. As variaes na intensidade de banda resultantes
de pequenas diferenas de espessura na amostra foram minimizadas com a
correo de linha de base e normalizao vetorial (AMIALI et al, 2007 ) e para tornar
visvel as diferenas espectrais o clculo de primeira derivada foi realizado.
Estas etapas no pr-processamento dos dados por primeira derivada e
normalizao vetorial tm sido utilizadas com freqncia em trabalhos relatados na
literatura para diferenciao e identificao de microrganismos (AMIALI et al, 2007;
BOSH et al, 2008; HELM et al, 1991; OUST et al, 2004; KIRSCHNER et al, 2001)
com exceo da correo de linha de base. Neste trabalho a correo de linha de
base foi realizada para subtrair o efeito da janela de fluoreto de clcio observada na
figura 28.
As regies que apresentaram diferenas: regio de estiramento C-H de CH
2
e
CH
3
, deformao C-H de CH
2
e CH
3
e mista (figura 35) foi tambm descrita
previamente por vrios autores (HELM et al, 1991; NGO-THI, KIRSCHNER,
NAUMANN, 2003).
93
As provveis diferenas entre os espectros de Gram-negativas e Gram-positivas
so confirmados por Maquelin apud Chalmers (2002) onde relatam que as grandes
diferenas em paredes celulares de bactrias Gram-positivas e Gram-negativas
levam as diferenas nestas regies espectrais, permitindo a clara discriminao
entre os dois tipos de bactrias. Maquelin acrescenta que alm da separao em
relao aos tipos de Gram, estas regies podem tambm ser usadas para
diferenciar leveduras de bactrias. A presena ou ausncia de apndices
bacterianos no relatada na literatura.
Na anlise de cluster a utilizao das regies espectrais de 3000-2800 cm
-1
,
1470-1410 cm
-1
e 1176-950 cm
-1
so encontrados com alguma similaridade na
literatura. Nos trabalhos de Helm et al (1991), Maquelin et al (2003), Ngo-Thi,
Kirschner e Naumann (2003), foram utilizadas as regies 3000-2800 cm
-1
, 1500-
1400 cm
-1
, 1200-900 cm
-1
para diferenciao de bactrias Gram-positivas e Gram-
negativas. Em Bosh et al (2008) as combinaes das regies de 3000-2840 cm
-1
,
1400-1250 cm
-1
e 1200-900 cm
-1
foram utilizadas para identificao de bactrias
Gram-negativas. Outras regies e combinaes similares so empregadas para
uma grande variedade de microrganismos diferenciando espcies a subespcies
(Kirschner et al, 2001; Oberreuter et al, 2002 e 2004).
Neste trabalho foi possvel a diferenciao correta em 100% de E. coli e
Proteus Mirabilis atravs da anlise de cluster. Sandt et al (2006) relatou que de
acordo com as condies experimentais e utilizando a anlise de cluster a
diferenciao de E. coli e Proteus mirabilis, no foi bem sucedida, sendo necessrio
uma abordagem por regresso PLS e anlise de componentes principais permitindo
a separao das duas espcies.
A diviso do dendograma em dois ramos tambm observada com freqncia
nos trabalhos de identificao de bactrias Gram-positivas e Gram-negativas.
Os resultados do estudo de cultura mista em modo de ponto confirmam os
apresentados por Al-Qadiri et al. (2006 (a e b)). Al-Qadiri et al (2006 a) estudou a
combinao de E.coli e Pseudomonas aeruginosa utilizando a tcnica de preparao
de amostra em soluo salina e encontrou variaes nas mesmas regies
estudadas neste trabalho (deformao C-H de CH
2
e CH
3
e regio mista (1200-900
cm
-1
)). A diferenciao entre os inculos foi possvel com 83,3 % das amostras
classificadas corretamente utilizando os mtodos de PCA e SIMCA para
classificao espectral, porm no houve identificao de bactria na amostra mista.
94
Al- Qadiri et al (2006 b) analisou uma cultura mista de Alicyclobacillus acidoterrestris
e Alicyclobacillus spp. com variaes espectrais nestas mesmas regies, e com
80% das amostras classificadas corretamente utilizando novamente PCA e SIMCA
para classificao espectral. Nenhum dos trabalhos reportou as diferenas dos
contornos de banda nos espectros de cultura mista.
No foram encontrados na literatura estudo de cultura mista em modo de
imagem. O modo de imagem um modo relativamente novo em espectroscopia,
que tem sido relatado em estudos com diferentes tipos de tecidos em linfonodos
axilares (BIRD et al, 2008 e 2009 ) e em placas ateromatosas em cartidas (AL et
al , 2009). Nestes trabalhos foram realizados a anlise de cluster para anlise dos
dados e regies discriminantes foram selecionadas. Em Bird et al (2009) todos os
espectros foram convertidos em sua 1 derivada, normalizados vetorialmente e para
a anlise de cluster no programa CytoSpec o algoritmo Wards foi aplicado.
Em bactrias apenas o trabalho de Gilbert et al (2009) foi encontrado. Neste
trabalho foram discriminadas trs diferentes cepas de E. coli com tempo de
incubao de 24 horas atravs da anlise de componentes principais.
Embora os resultados do nosso estudo sejam animadores, uma base de dados
de espectros vibracionais de uma ampla gama de microrganismos com cepas
clnicas e de coleo, sensvel ou resistente a determinados antibiticos, so
necessrios. Podendo ento tornar possvel a identificao de agentes causais de
infeces em ambientes clnicos.











95
7 CONCLUSO


A Microespectroscopia FT-IR associada anlise de cluster mostrou-se uma
ferramenta efetiva na discriminao e identificao de bactrias em culturas puras e
na identificao de culturas puras e mistas com mnima manipulao de amostra e
com tempo de incubao de apenas 6 horas e com 100% das amostras
classificadas corretamente. No estudo de cultura pura atravs da avaliao da
primeira derivada de ordem espectral, principalmente na regio de estiramento
assimtrico e simtrico C-H de CH
2
,

foi possvel diferenciar as bactrias em dois
principais grupos. Apesar dos espectros serem muito semelhantes, principalmente
espectros de bactrias com a mesma composio de parede celular, a anlise de
cluster foi sensvel o suficiente para a correta classificao. Os espectros das seis
bactrias estudadas e as triplicatas foram agrupados corretamente demonstrando
um excelente nvel de reprodutibilidade do mtodo. Os espectros e o dendograma
refletiram diferenas entre os grupos das bactrias Gram-positivas e Gram-
negativas. No estudo de cultura mista os espectros se apresentaram distintos de
culturas puras e foram observadas regies heterogneas que sugerem maior
concentrao de um determinado microrganismo. No foram observadas
aglomerao de nenhum espectro da cultura mista em cultura pura, portanto no
houve identificao de bactrias presentes na cultura mista com estas metodologias
empregadas. Tanto no estudo de cultura de pura quanto no estudo de cultura mista
a tcnica de preparao de cultura e de amostra associada metodologia de pr-
processamento espectral e anlise de dados foi essencial na classificao 100%
correta das amostras.









96
8 SUGESTES/TRABALHOS FUTUROS


Uma alternativa potencial para a identificao de microrganismo em cultura mista
por microespectroscopia FT-IR apontada por Beekes, Lasch e Naumann, 2007
(2007). De acordo com os autores as culturas mistas podem ser analisadas pela
mensurao de microcolnias (50-100 m de dimetro) crescendo separadamente
em meio slido, para isto os inculos so diludos e as microcolnias so
estampadas em placas de Agar em janelas transparentes no infravermelho. A figura
48 apresenta a identificao de microrganismo em culturas mistas contendo trs
tipos diferentes de microrganismo depositados em janela de BaF
2
pela tcnica de
estampa (figura 49).


















Figura 48 Identificao de trs diferentes microrganismos em cultura mista pela tcnica de estampa.
Fonte: (BEEKES; LASCH; NAUMANN, 2007)






97










Figura 49 Mtodo de estampagem - dispositivo para transferncia de microcolnias das placas de
Agar janela de IR . Fonte: (BEEKES; LASCH; NAUMANN, 2007)Madrid:
Para trabalhos futuros e como complementao do trabalho realizado nesta
dissertao, sugere-se:
Implementao da tcnica de estampa para a identificao de
microrganismos em culturas mistas;
Caracterizao de cepas clnicas e ATCC para complementar a base de
dados;
Utilizao de redes neurais para classificao e confeco de banco de dados
espectrais com finalidade diagnstica;
Identificao de microrganismos em amostras clnicas.













98
9 DIVULGAO DOS RESULTADOS DA PESQUISA


Trabalhos em eventos cientficos

FONTOURA, I.S. ; SAKANE, K. K. ; CARDOSO, M. A. G ; KHOURI, S. ; UEHARA,
M. ; MARTIN, A. A . CHARACTERIZATION OF ESCHERICHIA COLI BY USING FT-
IR. In: XXXII Encontro Nacional de Fsica da Matria Condensada, 2009, guas de
Lindia, 2009. p. 1-487.

FONTOURA, I.S. ; BELO, R. ; SAKANE, K. K. ; CARDOSO, M. A. G ; KHOURI, S. ;
UEHARA, M. ; PEREIRA, D. ; MARTIN, A. A . Microespectroscopia no infravermelho
como um mtodo para identificao rpida de bactrias. In: 25 Congresso Brasileiro
de Microbiologia, 2009, Porto de Galinhas. Anais do 25 CBM, 2009.

FONTOURA, I.S. ; SAKANE, K. K. ; CARDOSO, M. A. G ; KHOURI, S. ; UEHARA,
M. ; MARTIN, A. A . CARACTERIZAO E IDENTIFICAO RPIDA DE
BACTRIAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR. III Simpsio em Engenharia
Biomdica da Universidade Federal de Uberlndia, Uberlndia.2009.

FONTOURA, I., BELO, R., SAKANE, K., CARDOSO, M. A. G., KHOURI, S.,
UEHARA, M., RANIERO, L., MARTIN, A. A., "FT-IR microspectroscopy in rapid
identification of bacteria in pure and mixed culture" in Biomedical Vibrational
Spectroscopy IV: Advances in Research and Industry, SPIE, Bellingham, WA 2010


Prmio

2009 Trabalho relevante do III Simpsio de Engenharia Biomdica da
UFU, Universidade Federal de Uberlndia.

FONTOURA, I.S. ; SAKANE, K. K. ; CARDOSO, M. A. G ; KHOURI, S. ; UEHARA,
M. ; MARTIN, A. A . CARACTERIZAO E IDENTIFICAO RPIDA DE
BACTRIAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR. III Simpsio em Engenharia
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Trabalho publicado

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