Trabalho Clostridium

Universidade Federal de Santa Catarina
Centro Tecnolgico Departamento de Engenharia Qumica e Engenharia de

Alimentos
Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica

ESTUDOS IN SILICO PARA A PRODUO BACTERIANA DE
HIDROGNIO

Florianpolis-SC
Junho - 2007

Universidade Federal de Santa Catarina
Centro Tecnolgico Departamento de Engenharia Qumica e Engenharia de
Alimentos
Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica

HIDROGNIO

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-
Graduao em Engenharia Qumica da
Universidade Federal de Santa Catarina como
requisito parcial para a obteno do grau de
Mestre em Engenharia Qumica.

Mestranda: Daniela Muccillo

Orientador: Prof. Dr. Luismar Marques Porto
(EQA/UFSC)

Florianpolis-SC
Junho - 2007

DANIELA MUCCILLO

HIDROGNIO

Esta dissertao foi julgada e aprovada para a obteno do grau de Mestre em Engenharia
Qumica, na rea de concentrao Processos Qumicos e Biotecnolgicos, pelo Programa de
Ps-Graduao em Engenharia Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina.

Florianpolis-SC, Maio de 2007

_______________________________
Prof. Dr. Luismar Marques Porto
Orientador

_______________________________
Prof. Dr. Agenor Furigo Junior
Coordenador do Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica

Banca examinadora:
Luismar Marques Porto Orientador (EQA/UFSC)
Cntia Soares Membro externo
Agenor Furigo Junior Membro interno EQA/UFSC
Waldir Pedro Martignoni Membro externo (PETROBRAS)

AGRADECIMENTOS
Agradeo a Deus pela sade, energia e vontade.
Agradeo aos meus pais Francisco e Edna, pela vida em primeiro lugar. Pela dedicao aos
filhos, a educao, os ensinamentos e o incentivo que me deu durante toda a vida.
Agradeo aos meus avs que me deram sempre muito incentivo e carinho.
Ao meu namorado, Luiz, por todo incentivo, pacincia e amor.
Agradeo ao meu orientador, Prof. Luismar, pela oportunidade e orientao.
Agradeo ao Eng. Dr. Waldir Martignoni, pelo incentivo, apoio, pela orientao e pelas
idias.
Agradeo aos colegas de trabalho do Intelab, pela amizade, pelo companheirismo e pela ajuda
que cada um pde dar. Claudemir, Derce, Andr, Renata, Fernanda, Artiva, Gisele, Rambo,
Julia e Gustavo muito obrigado.
Um agradecimento especial ao colega Itamar, pelo apoio, pela pacincia e pelos ensinamentos
na parte computacional deste trabalho.
Agradeo muito ajuda e colaborao da Cntia.
Aos amigos que sempre foram essenciais durante os momentos difceis e momentos de
alegria; agradeo muita a parceria de Luciane, Erick, Nohra, Andr, Marcela, Fernanda, Pira e
Ninho.
Aos amigos distantes, Fabi, Aline, Renata, Jully, Luciane, Silvana, Mariline, Marindia,
Gelson e Marcel, valeu pelos encontros que sempre nos fortalece.
s minhas companheiras de moradia, Fernanda e Aline, obrigada pela fora e amizade.
s minhas irms, Mariana e Marcela, pela amizade, fora e cooperao. Ao meu sobrinho
lindo que desde que nasceu trouxe muitas alegrias, muita luz nas nossas vidas para continuar
sempre lutando por algo melhor. Ao meu cunhado, pela colaborao de sempre.
A todos da minha famlia.

CAPES, pelo apoio financeiro concedido por meio da bolsa de mestrado.
A todos que contriburam para esta etapa de minha vida.
i
NDICE
NDICE........................................................................................................................................i
LISTA DE TABELAS ..............................................................................................................iii
SIMBOLOGIA E NOMENCLATURA..................................................................................... v
RESUMO ................................................................................................................................... x
ABSTRACT ..............................................................................................................................xi
Captulo 1 ................................................................................................................................... 1
Introduo............................................................................................................................... 1
1.1 Generalidades ......................................................................................................... 1
1.2 Motivao............................................................................................................... 1
1.3 Objetivos................................................................................................................. 4
Captulo 2 ................................................................................................................................... 5
FUNDAMENTAO TERICA E REVISO BIBLIOGRFICA.................................... 5
2.1 Fundamentos da Produo de Energia ................................................................... 5
2.2 Hidrognio.............................................................................................................. 7
2.3 Produo de Hidrognio........................................ Erro! Indicador no definido.
2.4 Produo Biolgica de Hidrognio......................................................................... 8
2.5 Bases Moleculares para Produo Biolgica de Hidrognio por Processos
Fermentativos ................................................................................................................... 15
2.6 Clostridium acetobutylicum.................................................................................. 17
2.6.1 Metabolismo da C. acetobutylicum.................................................................. 19
2.7 Engenharia Metablica......................................................................................... 26
2.8 Anlise de Fluxo Metablico................................................................................ 28
2.9 Anlise de Controle Metablico........................................................................... 33
2.9.1 Determinao dos coeficientes de controle de fluxo........................................ 39
2.9.2 Relao entre os fluxos no estado estacionrio: ............................................... 42
2.9.3 Relaes cinticas............................................................................................. 44
Captulo 3 ................................................................................................................................. 46
METODOLOGIA................................................................................................................. 46
3.1 Anlise de Fluxo Metablico (MFA) ................................................................... 46
3.1.1 Modelo matemtico proposto para anlise de fluxo metablico...................... 47
3.1.2 Soluo do modelo proposto ............................................................................ 49
3.1.3 Avaliao do modelo proposto......................................................................... 50
3.2.1 Modelo matemtico das reaes da via metablica considerado ..................... 50
3.2.1.1 Obteno das Constantes de Equilbrio........................................................... 54
3.2.1.2 Obteno das velocidades mximas de cada reao ....................................... 55
3.2.1.3 Obteno dos Parmetros Cinticos ................................................................ 57
3.2.2 Soluo do modelo proposto ............................................................................ 62
3.2.3 Avaliao do modelo proposto......................................................................... 63
Captulo 4 ................................................................................................................................. 64
RESULTADOS E DISCUSSES........................................................................................ 64
4.1 Anlise de Fluxo Metablico................................................................................ 64
4.1.1 Anlise de Sensibilidade................................................................................... 66
4.2.1 Coeficientes de controle de fluxo..................................................................... 78
Captulo 5 ................................................................................................................................. 81
CONCLUSES E SUGESTES......................................................................................... 81
ii
Referncias Bibliogrficas........................................................................................................ 83
Apndice............................................................................................................................... 88

iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 - Estrutura da oferta de energia no Brasil. ................................................................ 5
Tabela 2.2 Parmetros da fermentao contnua em culturas no estado estacionrio de C.
acetobutylicum com limitao de fosfato. ................................................................................ 26
Tabela 3.1 - Reaes da via metablica da C. acetobutylicum usadas no modelo de anlise de
fluxo metablico. ...................................................................................................................... 47
Tabela 3.2 Equaes de velocidade usadas no modelo. ........................................................ 52
Tabela 3.3 Constantes de equilbrio. ..................................................................................... 55
Tabela 3.5 - Concentrao dos metablitos internos................................................................ 56
Tabela 3.4 - Parmetros cinticos das reaes do modelo. ...................................................... 59
Tabela 4.1 Fluxo de hidrognio obtido na literatura e calculado no modelo. ....................... 64
Tabela 4.2 - Fluxos medidos em condies de glicose e condies de glicose-glicerol
(GIRBAL et al., 1995a). ........................................................................................................... 49
Tabela 4.3 - Fluxos calculados em condies de glicose. ........................................................ 65
Tabela 4.4 - Simulao dos fluxos calculados considerando a interrupo da produo de
alguns metablitos em meio contendo somente glicose. .......................................................... 69
Tabela 4.5 - Simulao dos fluxos calculados considerando a interrupo da produo de
alguns metablitos em meio contendo glicerol e glicose. ........................................................ 70
Tabela 4.6 Velocidades mximas usadas nos modelo 1 e 2. ................................................. 75
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 - Estrutura da oferta interna de energia (Fonte: MINISTRIO DE MINAS
ENERGIA, 2007). ...................................................................................................................... 6
Figura 2.2 - Clostridium acetobutylicum. (Fonte: SIEMERINK, 2005). ................................. 18
Figura 2.3 Fermentao ABE. (Fonte: SIEMERINK, 2005). ............................................... 19
Figura 2.4 Esquema da produo de hidrognio. .................................................................. 21
Figura 2.5 Esquema do modelo cintico Ping Pong bi bi. .................................................... 22
Figura 2.6 Via metablica da Clostridium acetobutylicum. Adaptado de GIRBAL et al.
(1995a)...................................................................................................................................... 23
Figura 3.1 - Matriz estequiomtrica referente s reaes da via metablica da C.
acetobutylicum.......................................................................................................................... 48
Figura 3.2 Via metablica da C. Acetobutylicum simplificada. ............................................ 51
Figura 4.1 Fluxos medidos nas duas diferentes condies de cultivo. ... Erro! Indicador no
definido.
Figura 4.2 Fluxos Calculados em duas diferentes condies de cultivo. .............................. 66
Figura 4.3 Sensibilidade Acumulada..................................................................................... 67
Figura 4.4 Anlise de sensibilidade especfica na C. acetobutylicum para produo de
hidrognio................................................................................................................................. 68
Figura 4.5 Velocidades de produo obtidas do modelo comparada com as velocidades de
produo do trabalho de GIRBAL et al., (1995a). ................................................................... 72
Figura 4.6 - Coeficientes de controle de fluxo para o cido butrico. ...................................... 74
Figura 4.7 Velocidades de produo normalizadas para glicose nas condies da hiptese 2.
.................................................................................................................................................. 76
Figura 4.8 Comportamento dinmico da concentrao dos metablitos (mM) em funo do
tempo (min). ............................................................................................................................. 77
Figura 4.9 - Coeficientes de controle de fluxo para a produo de hidrognio considerando a
hiptese 1. ................................................................................................................................. 78
Figura 4.10 Coeficientes de controle de fluxo para hidrognio considerando a hiptese 2. . 79

v
SIMBOLOGIA E NOMENCLATURA
Simbologia
j
X
i
C

Coeficiente de controle de concentrao
j
J
i
C

Coeficiente de controle de fluxo
i
j

Coeficiente de elasticidade da i-sima taxa de reao, em relao concentrao do
metablito j,
j
X
i
e

Concentrao da enzima
i
E (mM)
j
X

Concentrao do metablito (mM)
j
x

Concentrao do metablito
j
X no estado estacionrio (mM)
K
eq
Constante de equilbrio
K
m
Constante de Michaelis-Menten (mM)
i
E

Enzima
j
J

Fluxo no estado estacionrio de uma reao j na via metablica (mmol h
-1
g
-1
)
C
N

Matriz de
0
m colunas independentes de N
R
N

Matriz de
0
m linhas independentes de N
RC
N

Matriz de
0
m linhas independentes e de
0
m colunas independentes de N
X
L

Matriz de concentrao link ) (
0
m m
r
R

Matriz de redundncia reduzida
c
S

Matriz dos fluxos calculados
J
L

Matriz dos fluxos de ligao
m
S

Matriz dos fluxos medidos
N

Matriz dos metablitos internos
S

Matriz estequiomtrica
I

Matriz identidade
vi
R

Matriz obtida da reconciliao estatstica
C

Nmero condicional
n

Nmero de colunas da matriz N
0
n

Nmero de colunas dependentes.
m

Nmero de linhas da matriz N
0
m

Rank da matriz N
K

Rank da matriz redundncia
met
r

Velocidade de sntese dos metablitos intermedirios nas reaes da via metablica
(mmol h
-1
g
-1
)
T
S

Transposta da matriz estequiomtrica
i
v

Velocidade da reao da enzima (mM/min)
i
v

Velocidade da reao da enzima
i
E (mM/min)
v Velocidade de reao (mM/min)
V Velocidade mxima (mM/min)
met
X

Vetor das concentraes dos metablitos (mM)
v

Vetor de fluxos (que contm os fluxos a serem determinados) (mmol h
-1
g
-1
)
c
v

Vetor de fluxos calculados (mmol h
-1
g
-1
)
m
v

Vetor de fluxos medidos (mmol h
-1
g
-1
)
m,new
v

Vetor dos novos fluxos medidos (mmol h
-1
g
-1
)
0
J

Vetor que contm
0
m fluxos dependentes ) 1 (
0
m (mmol h
-1
g
-1
)
R
J

Vetor que contm
0
n fluxos independentes ) 1 (
0
n (mmol h
-1
g
-1
)
J

Vetor que contm os fluxos no estado estacionrio (mmol h
-1
g
-1
)
Velocidade especfica de crescimento (h
-1
)

vii
Nomenclatura
ACAL Acetaldedo
ACOA Acetil-Coenzima A
ACP Acetilfosfato
ACCOA Acetoacetil Coenzima A
ACT Acetocido actico
AC Acetona
ACET cido actico
BUT cido butrico
BUTOH Butanol
BUTHD Butiraldedo
BUTCOA Butiril Coenzima A
BUTP Butirilfosfato
COA Coenzima A
ADP Difosfato de adenosina
CO
2
Dixido de carbono
ETOH Etanol
Fd
oxi
Ferredoxina oxidada
Fd
red
Ferredoxina reduzida
P Fsforo
GLI Glicose
H
2
Hidrognio
LAC Lactato
NAD Nicotinamida adenina dinucleotdeo oxidada
viii
NADH Nicotinamida adenina dinucleotdeo reduzida
PIR Piruvato
ATP Trifosfato de adenosina
vGLI Fluxo do consumo de Glicose (MFA e MCA)
vPIR Fluxo da produo de Piruvato (MFA)
vPDH Fluxo de produo de CO
2
(MFA e MCA)
vTHI Fluxo de produo de Acetoacetil-CoA (MFA e MCA)
vHCOA
Fluxo de produo de 3-Hidroxibutiril-CoA para MFA e fluxo de produo do
Butiril CoA para MCA
vCrCOA Fluxo de produo de Crotonil-CoA (MFA)
vBuCOA Fluxo de produo de Butiril-CoA (MFA)
vPTB
Fluxo de produo de Butiril-fosfato para MFA e fluxo de produo de Butirato
para MCA
vBTK Fluxo de produo do Butirato (MFA)
vACALDH
Fluxo de produo de Acetaldedo para MFA e fluxo de produo do Etanol
para MCA
vADH Fluxo de produo de Etanol (MFA)
vPTA
Fluxo de produo de Acetil-fosfato para MFA e fluxo de produo do Acetato
para MCA
vATK Fluxo de produo de Acetato (MFA)
vGLIC Fluxo do consumo de Glicerol (MFA)
vLAC Fluxo de produo do Lactato (MFA)
vCOAT
Fluxo de produo do Acetoacetato para MFA e Fluxo de Produo da Acetona
para MCA
vAADC Fluxo de produo da Acetona (MFA)
vBUTHD
Fluxo de produo do Butiraldedo para MFA e fluxo de produo de Butanol
para MCA
vBDHB Fluxo de produo do Butanol (MFA)
vH
2
Fluxo de produo do H
2
(MFA e MCA)
vNADH

Fluxo de consumo de NADH (MCA)
ix
vATPase Fluxo de produo de ADP (MCA)
x
RESUMO
A produo biolgica de hidrognio uma excelente alternativa de produo de
energia. Dentre os processos biolgicos de produo de hidrognio, os fermentativos so os
mais vantajosos do ponto de vista industrial. Clostridium acetobutylicum uma bactria muito
utilizada industrialmente, tem um metabolismo fermentativo complexo que produz muitos
metablitos, incluindo hidrognio com bons rendimentos e, freqentemente, mostra um
padro de fermentao bifsico. Aps produzir cido actico, cido butrico e hidrognio
durante a fase de crescimento exponencial, inicia-se a formao de solventes (etanol, acetona
e butanol). Os rendimentos de hidrognio podem ser melhorados com o uso de engenharia
metablica por meio de um redirecionamento do fluxo de eltrons para a produo de
hidrognio. O objetivo deste trabalho investigar o metabolismo da C. acetobutylicum,
visando encontrar as principais etapas que controlam a produo de hidrognio. Para obter
esse entendimento foram aplicadas duas ferramentas de engenharia metablica: Anlise de
Fluxo Metablico e Anlise de Controle Metablico. Dados da literatura foram usados como
entrada nos modelos matemticos construdos para as anlises. A primeira ferramenta usada,
Anlise de Fluxo Metablico, permitiu quantificar os fluxos internos do metabolismo da
bactria em estudo, sob duas condies de cultivo diferentes. O resultado dessa anlise
fornece um mapa de distribuio de fluxos. Tambm permite obter a sensibilidade dos fluxos
medidos em relao ao fluxo de interesse Os modelos mostraram quais so as vias de maior
sensibilidade, ou seja, as vias mais indicadas para possveis modificaes por manipulao
gentica. A segunda etapa desse trabalho foi aplicao de Anlise de Controle Metablico a
fim de encontrar as etapas da via metablica que controlam a produo de hidrognio. Foi
construdo um modelo cintico e a partir dele foram obtidos os coeficientes de controle de
fluxo, esse modelo foi ajustado com base nos prprios coeficientes de controle de fluxo
apontados. O modelo obtido foi analisado e mostrou que as principais etapas que afetam a
produo de hidrognio so a via glicoltica e a via de regenerao do NADH. Pequenas
variaes na atividade enzimtica dessas etapas produziro grande efeito na produo de
hidrognio. Diante dessas ferramentas possvel prever melhores estratgias de modificaes
genticas stio-dirigidas. As concluses deste trabalho esto baseadas em estudos in silico e
no eliminam a necessidade de comprovao experimental.

Palavras chave: Produo biolgica de hidrognio; Anlise de fluxo metablico; Anlise de
controle metablico; Clostridium acetobutylicum
xi
ABSTRACT
The biological hydrogen production is an excellent alternative of energy production. Among
the biological processes of hydrogen production, the fermentative processes are the ones that
have more advantages from the industrial point of view. Clostridium acetobutylicum is a
bacteria very much used industrially. It has a complex fermentative metabolism, which
produces many metabolites, including hydrogen with good yields, and usually shows a
biphasic batch fermentation pattern. After producing acetate and butyrate during exponential
growth, the organism switches to the formation of acetone, butanol, and ethanol shortly before
entering the stationary phase. Hydrogen yields can be improved using metabolic engineering,
redirecting the electron flux to the hydrogen production. The objective of this work was to
investigate C. acetobutylicum metabolism, aiming at to find the main steps that control the
hydrogen production. To get this agreement two tools of metabolic engineering had been
applied: Metabolic Flux Analysis and Metabolic Control Analysis. Data from the literature
were used as input in the mathematical models constructed for the analysis. The first used
tool, Metabolic Flux Analysis, allowed to get the quantification of the internal flux of the
metabolism of the bacterium in study, under two different conditions of culture. The result of
this analysis supplies a map of flux distribution. Also it allows to get the sensitivity of the flux
measured in relation to the interest flux. The second stage of this work was application of
Metabolic Control Analysis in order to find the step of the metabolic pathway that controls the
hydrogen production. A kinetic model was constructed and to leave of it the flux control
coefficients had been gotten, this model was adjusted on the basis of the flux control
coefficients pointed flux control. The model gotten was analyzed and showed that the main
steps that affect the hydrogen production are the glycolysis pathway and the NADH
regeneration pathway. Small variations in the enzymatic activity of these steps will produce
great effect in the hydrogen production. With these tools it is possible to predict better
strategies of small site-directed genetic modifications. The conclusions of this work are based
on in silico studies, that is, computational analysis, and do not eliminate the need for
experimental.
Keywords : Biological hydrogen production; Metabolic flux analysis; Metabolic control
analysis; Clostridium acetobutylicum
Introduo

1
Captulo 1
Introduo
1.1 Generalidades
Os avanos industriais ocorridos nos ltimos sculos esto ligados, de alguma
maneira, s transformaes e ao poder derivado dos combustveis fsseis. O funcionamento
da sociedade moderna depende do suprimento de energia. Hoje em geral, os processos
qumicos industriais exigem uma grande quantidade de energia e presses elevadas, e so
dependentes da indstria de petrleo, de gs e de produtos petroqumicos. O calor excedente
acaba se convertendo em poluio e em chuva cida, e promove o chamado efeito estufa.
Alm de todos os problemas climticos causados pelo uso desenfreado de
combustveis fsseis, o pico da produo global de petrleo vem preocupando um grande
nmero de gelogos. Se ocorrer uma crise, os pases e as companhias energticas tero de
recorrer a combustveis fsseis mais impuros o carvo, o leo pesado e a areia de alcatro
como substitutos se no houver uma fonte alternativa (RIFKIN, 2003). A mudana para
combustveis mais impuros representaria um aumento na emisso de dixido de carbono, uma
elevao ainda maior na temperatura da Terra e efeitos na biosfera terrestre ainda mais
devastadores (ALBRITTON et al., 2001).
1.2 Motivao
Uma mudana no modo como a energia usada est prestes a ocorrer. O hidrognio
um insumo energtico que tem sido alvo de muita ateno. o mais leve e mais onipresente
dos elementos do universo. Por no conter nenhum tomo de carbono, no emite dixido de
carbono. Ele existe na natureza na forma combinada na gua, nos combustveis fsseis e em
Introduo

2
todos os seres vivos. Portanto, pode ser extrado de fontes naturais (RIFKIN, 2003). Clulas a
combustvel baseadas em hidrognio j esto sendo comercializadas. As grandes indstrias
automobilsticas esto investindo bilhes de dlares no desenvolvimento de carros, nibus e
caminhes com clulas a combustvel de hidrognio. No entanto, atualmente o hidrognio
obtido a partir de combustveis fsseis, o que sustenta a dependncia e gera dixido de
carbono na atmosfera.
A produo de energia a partir de substratos renovveis importante para a gerao de
energia sustentvel e a reduo das emisses globais de dixido de carbono. O hidrognio
pode ser um importante componente de uma infra-estrutura de energia que reduz as emisses
de dixido de carbono, desde que seja produzido a partir de fontes renovveis e usado em
clulas a combustvel.
A eficincia de produo de hidrognio uma questo crtica para a chamada
Economia do Hidrognio. A observao da natureza se torna imprescindvel nesse contexto.
Por um longo perodo, a fsica, a qumica e a matemtica dominaram os progressos
tecnolgicos. Hoje a biologia, aliada a essas outras cincias, tem sido a soluo para o
desenvolvimento tecnolgico sustentvel. A biotecnologia tem ganhado cada vez mais
ateno. Os sistemas biolgicos so mquinas de grande eficincia que se auto-reproduzem,
trabalham temperatura ambiente e produzem poucos produtos indesejveis. O mapeamento
e a manipulao de genomas, por outro lado, abriram portas para uma nova era nas quais os
seres vivos se tornaram uma mercadoria manipulvel. Com os avanos ocorridos nos ltimos
tempos em biologia molecular e biologia computacional, possvel obter organismos
superprodutores de insumos desejveis.
Os processos biolgicos de produo de hidrognio tm sido foco de muitas pesquisas
no mundo. Bactrias fermentativas so as candidatas favoritas para a produo de hidrognio.
Introduo

3
Elas degradam matria orgnica e liberam hidrognio e dixido de carbono, e parte dessa
matria orgnica permanece na forma de cido actico e cido butrico ou outros cidos,
dependendo da bactria que a fermenta, e, de forma geral, possuem baixos rendimentos,
porque no produzem apenas um metablito.
Clostridium acetobutylicum, por exemplo, produz aproximadamente dois moles de
hidrognio por mol de glicose. Os rendimentos da liberao de hidrognio podem ser
melhorados por engenharia metablica por meio de um redirecionamento do fluxo de eltrons
para a produo de hidrognio.
A engenharia metablica permite um melhoramento direcionado para a formao de
produtos ou propriedades celulares por modificaes em reaes bioqumicas especficas ou
pela introduo de outras reaes, o que realizado com o uso da tecnologia do DNA
recombinante. Essa tcnica permite obter organismos geneticamente modificados por meio de
mutaes dirigidas em genes que codificam enzimas em vias de interesses
(STEPHANOPOULOS, 1998).
A manipulao de vias metablicas para aumentar a produtividade de metablitos de
interesse tem sido alvo de estudo na biotecnologia. O primeiro passo para modificar o
metabolismo de um dado organismo o entendimento de suas vias metablicas. Esse
entendimento pode ser obtido com o uso da ferramenta anlise de fluxo metablico (MFA, do
ingls, Metabolic Flux Analysis). MFA a quantificao de fluxos do metabolismo de um
dado organismo de interesse, sob condies definidas. O resultado dessa anlise fornece um
mapa de distribuio de fluxos para uma dada rede metablica.
O segundo passo o entendimento dos mecanismos de controle metablico que levam
em conta os parmetros cinticos das reaes metablicas, esse entendimento pode ser obtido
com a ferramenta anlise de controle metablico (MCA, do ingls, Metabolic Control
Introduo

4
Analysis). Diante dessas ferramentas, possvel prever melhores estratgias de modificaes
genticas stio-dirigidas.
1.3 Objetivos
Objetivo geral
O objetivo geral deste trabalho um estudo terico, in silico, ou seja, computacional,
visando o entendimento do metabolismo da C. acetobutylicum e a aplicao de ferramentas de
engenharia metablica para propor um aumento na produo de hidrognio.
Objetivos especficos
Avaliao da distribuio dos fluxos internos e comparao em duas diferentes
condies de cultivo.
Identificao da sensibilidade dos fluxos em relao ao fluxo de hidrognio.
Construo de um modelo cintico que represente a via metablica da C.
acetobutylicum.
Identificao dos parmetros que controlam o fluxo de produo de hidrognio.
A identificao dos parmetros de controle a chave para futuras modificaes
genticas que produziro uma linhagem produtora de hidrognio com melhores rendimentos
comparados linhagem selvagem.
Fundamentao Terica e Reviso Bibliogrfica

5
Captulo 2
FUNDAMENTAO TERICA E REVISO
BIBLIOGRFICA
2.1 Fundamentos da Produo de Energia
O Brasil utiliza vrias fontes de energia, conforme mostra a Tabela 2.1
(MINISTRIO DE MINAS E ENERGIA, 2007). O petrleo ocupa a maior parte da
matriz energtica mundial. No futuro, espera-se que ocupe um espao menor em favor
de outras fontes limpas de energia. Como pode ser observado na Tabela 2.1, apesar de
a energia renovvel dentro da estrutura da matriz energtica brasileira ter se mantida
praticamente estvel entre 2005 e 2006, observa-se que as fontes de energia no
renovveis vm caindo em virtude do aumento de fontes renovveis. Esse quadro pode
ser observado no mundo todo, procurando uma melhor qualidade de vida e amenizando
os impactos causados pelo uso de combustveis fsseis.
Tabela 2.1 - Estrutura da oferta de energia no Brasil.
2004 2005 2006
Energia No Renovvel 56,1% 55,5% 55,6%
Petrleo e Derivados 39,1% 38,6% 38,8%
Gs Natural 8,9% 9,4% 9,5%
Carvo Mineral e Derivados 6,7% 6,4% 5,8%
Urnio e Derivados 1,5% 1,2% 1,5%
Energia Renovvel 43,9% 44,5% 44,3%
Energia Hidrulica e Eletricidade 14,4% 14,9% 14,6%
Lenha e Carvo Vegetal 13,2% 13,1% 12,4%
Produtos da Cana de Aucar 13,5% 13,7% 14,4%
Outras Renovveis 2,7% 2,8% 2,9%
Fonte: Ministrio de Minas e Energia, 2007.
O Brasil ocupa uma posio privilegiada na utilizao de energias renovveis,
conforme pode ser observado na Figura 2.1.

6
Uma nova fase est acontecendo em termos de energia. Essa fase envolve eficincia
dos equipamentos que produzem energia e utilizao de outras fontes de energia que no seja
o petrleo, o que contribuir para a estabilidade dos preos, j que as maiores jazidas de
petrleo esto nas mos de poucos pases. No Oriente Mdio encontram-se as maiores
jazidas de petrleo, regio de instabilidades polticas, religiosas e econmicas.
A nova economia de energia no consiste em descobertas de grandes fontes de
energia, como ocorreu no passado com o carvo e o petrleo, e sim em desenvolvimento
tecnolgico na utilizao das fontes energticas, tendo-se diversas fontes de energia a
maioria renovvel e equipamentos para a sua gerao. A energia dever ser gerada prxima
ao local de consumo, eliminando as perdas que ocorrem na transmisso, o alto custo de
construo e a manuteno das linhas de transmisso (NETO, 2005).
0,0% 40,0% 80,0% 120,0%
Brasil (2006)
Mundo (2004)
Renovvel No Renovvel
86,8 %
55,6 %
13,2 %
44,4 %

Figura 2.1 - Estrutura da oferta interna de energia (Fonte: MINISTRIO DE MINAS ENERGIA, 2007).

O petrleo e o gs natural comearo a se esgotar, segundo especialistas, daqui a
alguns anos, mas h tempo suficiente para recorrer a estratgias energticas alternativas
(RIFKIN, 2003).

7
O hidrognio apontado por especialistas como pico para a nova economia mundial.
Dever movimentar aproximadamente 1,7 trilho de dlares j em 2020 (NETO, 2005). Uma
infra-estrutura para o hidrognio est sendo projetada, o que envolve a construo de
estradas, usinas de produo, sistemas de armazenamento e distribuio.
2.2 Hidrognio
O hidrognio possui caractersticas combustveis desejveis, porque apresenta alto
contedo de energia por peso, maior velocidade de combusto, limites alto de
inflamabilidade, temperatura de detonao mais alta, menor energia de ignio, menor
densidade e um bom condutor de calor e eletricidade. um elemento quimicamente muito
ativo, por isso s se encontra na forma combinada: na gua (H
2
O), em cidos (H
3
O
+
), em
bases (OH
-
), em hidretos e em compostos orgnicos em geral. Por isso no se trata de uma
fonte de energia, e sim de um vetor: necessrio primeiro produzi-lo e armazen-lo para
depois ser usado como combustvel (PENTEADO, 2003).
Hoje o hidrognio usado principalmente como matria-prima em indstrias
qumicas e petroqumicas. Dentre os seus usos, pode-se citar:
os processos de hidrogenao: usado para produzir compostos de baixa massa
molecular, compostos saturados, craquear hidrocarbonetos e remover enxofre e nitrognio
(dessulfurizao do petrleo);
como um dos reagentes na sntese de amnia (NH
3
), base de fabrico de muitos
fertilizantes e detergentes;
na remoo qumica de oxignio para prevenir a oxidao e a corroso;
como meio refrigerador em geradores eltricos; e

8
como combustvel em foguetes e, atualmente, em misturas de combustveis para
automveis.
Desta forma esse elemento tem sido foco da ateno de pesquisadores do mundo
todo, visto ser um insumo de grande interesse na economia e apontado como o combustvel
do futuro. Quando utilizado em clulas a combustvel, produz grande quantidade de energia
e no emite poluente, e ainda libera como resduo apenas vapor dgua.
A clula a combustvel uma bateria que converte continuamente a energia qumica
de um combustvel e de um oxidante em energia eltrica. O processo envolve essencialmente
um sistema constitudo por um eletrodo e um eletrlito (KORDESCH e SIMADER, 1996).
O uso de tecnologias limpas baseadas em hidrognio dever contribuir para a reduo
do consumo final de energia (pois so mais eficientes), alm de proporcionar benefcios ao
meio ambiente. No entanto, 95% da produo atual se d a partir de combustveis fsseis, o
que libera gases de efeito estufa para o meio ambiente e sustenta a dependncia no petrleo e
de outras fontes no renovveis.
A produo biolgica de hidrognio uma alternativa considerada potencialmente
promissora, visto que realizada, em sua maioria, temperatura ambiente, com bons
rendimentos e com o aparecimento de pouqussimos produtos indesejveis.
2.3 Produo Biolgica de Hidrognio
A produo de hidrognio a partir de certos microrganismos est relacionada com a
sua sobrevivncia. Para realizar o trabalho biolgico, a clula necessita de energia qumica.
Essa energia pode ser obtida por meio de energia luminosa por clulas fotossintticas, e da
oxidao de compostos de carbono, principalmente carboidratos, para clulas heterotrficas.

9
Os organismos degradam molculas energticas como forma de obter energia livre, a qual
transformada em ATP, que o principal transportador de energia qumica em todas as
clulas (LEHNINGER, NELSON e COX, 2000).
A maior parte da produo biolgica de hidrognio da biosfera ocorre a partir da
oxidao da matria orgnica, que decompe um substrato em dixido de carbono e
hidrognio. Esse processo de degradao gera eltrons. O processo de gerao de hidrognio
ocorre como forma de dissipar eltrons contidos na clula e tambm permite a gerao de
energia adicional ao metabolismo celular (KHANAL et al., 2004).
Os processos de gerao biolgica de hidrognio so fundamentalmente dependentes
de enzimas que atuam na produo de hidrognio. Essas enzimas catalisam a reao:
2H
+
+ 2e
H
2
.
Trs enzimas estudadas at o momento entre os organismos produtores de hidrognio
so responsveis por essa reao: a nitrogenase, a Fe-hidrogenase e a NiFe hidrogenase
(BENEMANN, 1996).
O metabolismo de clulas vivas regulado para ser econmico e equilibrado. As
enzimas em cada via metablica so reguladas de tal forma que cada tipo de molcula
produzido, em quantidades apropriadas s necessidades da clula. Quando h excesso, a
clula utiliza-se de mecanismos de inibio enzimtica para diminuir esse excesso, ou seja,
grandes quantidades de hidrognio podem inibir a atividade da enzima (LEHNINGER,
NELSON e COX, 2000; KHANAL et al., 2004).

10
Os sistemas biolgicos produtores de hidrognio

podem ser divididos em duas
categorias: fotossintetizantes e fermentativos. Essa diviso o mesmo que classificar os
organismos como produtores de hidrognio dependentes da luz como fonte primria de
energia e como aqueles que obtm energia a partir da oxidao de molculas energticas e
que no necessitam de luz para a sua sobrevivncia. No entanto, ambos produzem hidrognio
a partir da decomposio de um substrato.
No campo dos organismos fotossintetizantes esto algumas algas verdes e as
cianobactrias. Esses organismos produzem hidrognio por meio do processo de biofotlise.
As bactrias fotossintetizantes tambm pertencem a esse grupo e produzem hidrognio

pela
fotodecomposio de compostos orgnicos. Na categoria de sistemas fermentativos
encontram-se as bactrias fermentativas. Certas bactrias liberam hidrognio

durante a
fermentao de substratos orgnicos. No ecossistema equilibrado a produo de hidrognio
acompanhada do consumo desse hidrognio.
2.3.1 Biofotlise da gua utilizando algas verdes e cianobactrias
Biofotlise a ao da luz sobre um sistema biolgico que resulta na decomposio
de um substrato, geralmente gua, para produzir hidrognio. GHIRARDI e SEIBERT (2003)
mostraram que as algas verdes possuem um mecanismo necessrio e eficiente para produzir
hidrognio a partir da gua. Elas produzem hidrognio depois de um perodo de condies
anaerbias no escuro durante o qual a hidrogenase ativada e sintetizada. No entanto, sob
condies normais em que o oxignio subproduto da fotossntese, a produo de
hidrognio no pode ser mantida por mais que alguns minutos. O

oxignio um poderoso
inibidor da Fe-hidrogenase. A inativao da enzima ocorre pela reao do oxignio com o
ferro localizado no centro cataltico da enzima. GHIRARDI e SEIBERT (2003) estudaram

11
estratgias para diminuir a sensibilidade ao oxignio. Essas estratgias consistem na
manipulao gentica na hidrogenase para remover a sensibilidade do oxignio e,
futuramente, desenvolver recursos fisiolgicos para separar o hidrognio e oxignio.
As cianobactrias tambm produzem hidrognio pelo processo de biofotlise. Elas
so consideradas boas candidatas num sistema produtor de hidrognio por apresentarem
requisitos nutricionais simples. As cianobactrias realizam fotossntese e algumas estirpes
so capazes de fixar o nitrognio (N
2
) em amnia (BENEMANN, 1996). Segundo
TAMAGNINI (2002) trs tipos de enzimas podem estar envolvidos no metabolismo do
hidrognio: nitrogenase, hidrogenase de assimilao e hidrogenase bidirecional.
2.3.2 Fotodecomposio de compostos orgnicos por bactrias fotossintetizantes
As bactrias fotossintetizantes so apresentadas na literatura como boas candidatas a
um sistema microbiolgico de produo de hidrognio por apresentarem vantagens, tais
como: alta converso de hidrognio, habilidade de usar amplo espectro de luz, habilidade de
consumir substratos orgnicos derivados de resduos, o que favorece o uso dessas bactrias
num sistema produtor de hidrognio em associao com o tratamento de efluentes. A
produo fotobiolgica de hidrognio pode ser realizada por bactrias fotossintticas
utilizando a radiao solar para converter gua, compostos de enxofre ou compostos
orgnicos, em hidrognio. KOKU et al. (2002) estudaram aspectos do metabolismo da
Rhodobacter sphaeroides, uma bactria prpura no sulfurosa. Quando essas bactrias so
submetidas a uma limitao de nitrognio, a atividade da nitrogenase induzida e resulta na
produo de hidrognio. A produo de hidrognio, nesse caso, est associada ao direta
da nitrogenase, a qual catalisa a formao de hidrognio na ausncia de nitrognio
molecular. A eficiente operao dessa enzima, assim como no caso das cianobactrias,

12
requer grandes quantidades de ATP e capacidade redutora. Por essa razo a sntese e a
atividade dessa enzima exigem um rgido controle regulatrio. A hidrogenase tem sido
encontrada em bactrias fotossintetizantes; no entanto, elas atuam tanto na produo quanto
no consumo de hidrognio. Portanto, nesse caso, a produo de hidrognio atribuda,
principalmente, atividade da nitrogenase.
Bactrias fotossintetizantes possuem uma vantagem em relao s bactrias
fermentativas. Bactrias anaerbias no so capazes de degradar glicose completamente a
dixido de carbono e hidrognio. Essas bactrias, quando digerem um substrato produzem
hidrognio e cidos orgnicos, pois a variao de energia livre dessa reao negativa e no
h energia suficiente para continuar degradando cidos. J as fotossintetizantes podem usar a
energia da luz para superar essa barreira e so capazes de degradar cidos orgnicos e
produzir mais hidrognio. MIYAKE e KAWAMURA (1990) propuseram utilizar os dois
tipos de bactrias em um sistema hbrido. Isso diminuiria a demanda de luz utilizada pelas
bactrias fotossintetizantes e produziria mais hidrognio. De qualquer forma, bactrias
fotossintetizantes requerem o uso de luz e a atividade da nitrogenase requer grandes
quantidades de energia, o que favorece o uso de organismos fermentativos.
2.3.3 Produo de hidrognio a partir da fermentao de compostos orgnicos
Para produzir hidrognio biolgico em escala industrial, os processos fermentativos
oferecem mais vantagens em relao a outros processos. A principal vantagem que as
bactrias fermentativas podem produzir hidrognio constantemente em um biorreator a partir
de substratos orgnicos, sem necessidade de luz. Essas bactrias possuem alta velocidade de
converso de hidrognio e ainda se reproduzem facilmente para suprir o meio de produo.
Elas utilizam substrato simples, tais como acares puros (glicose e sacarose), melao de

13
cana-de-acar, ou mesmo guas residurias. Glicose e sacarose so os substratos de
fermentao mais utilizados em laboratrio (UENO, OTSUKA, e MORIMOTO, 1996). Os
autores operaram um reator em laboratrio por 200 dias consecutivos, usando como
substrato guas residurias provenientes de uma fbrica de acar e obtiveram rendimento de
2,52 moles de hidrognio por mol de hexose. Eles utilizaram em seus estudos uma
microflora mista.
Somado a esses fatores h ainda o fato de que a fermentao microbiana em escala
industrial um processo conhecido e sua descoberta revolucionou a produo de diversos
cidos, tais como: cidos frmico, actico, propinico, butrico, succnico, e alguns lcoois
como: glicerol, isopropanol, butanol e butanodiol, o que facilita o desenvolvimento de
reatores com a finalidade de produzir hidrognio. Fermentaes como essa consistem num
processo ideal para um engenheiro qumico, porque transformaes qumicas complexas,
com muitos passos, so realizadas, em sua maioria temperatura ambiente, com bons
rendimentos e aparecimento de pouqussimos produtos indesejveis e ainda so mquinas
vivas que se auto-reproduzem (LEHNINGER, NELSON e COX, 2000).
A produo biolgica de hidrognio comparada produo de etanol leva vantagens,
porque uma microflora geradora de hidrognio capaz de usar uma ampla faixa de substrato
comparado com as leveduras, pelas quais o etanol produzido. Devido amplitude
aproveitvel de substrato h um ganho de energia em relao produo de etanol
(HAWKES et al., 2002).
As bactrias fermentativas produtoras de hidrognio incluem: Enterobacter,
Clostridium, Desulfovibrio vulgaris, Magashaera elsdenii, Citrobacter intermedius e E. coli
(DAS e VEZIROLU, 2001).

14
Estudos com Clostridium demonstram que essas bactrias possuem alto potencial de
produo de hidrognio e so as preferidas para tal finalidade, pois apresentam rendimentos
na faixa de 1,61-2,36 mol de H
2
/ mol de glicose. J o gnero Enterobacter apresenta
rendimentos em torno de um mol de hidrognio por mol de glicose (HAWKES et al., 2002).
Clostridia so bactrias caracterizadas por um metabolismo rpido e com capacidade
de formar esporos em resposta condies desfavorveis do meio ambiente, ou quando
submetidas ao aumento de temperatura ou falta de nutrientes. Quando elas formam esporos
necessitam de condies ambientais especiais e nutrientes especficos para a sua germinao.
Em processos fermentativos, o hidrognio produzido pela ao de hidrogenases como
meio de eliminar o excesso de eltrons gerados durante a degradao de um substrato
orgnico. Na maioria dos microorganismos o hidrognio produzido por meio do
metabolismo anaerbio do piruvato formado durante o catabolismo da maioria dos substratos
orgnicos (HALLENBECK e BENEMANN, 2002).
A degradao do piruvato catalisada por um dos dois sistemas de enzimas a seguir:
1. Piruvato Formato Liase (PFL)
Formato CoA Acetil CoA Piruvato
PFL
+ +
2. Piruvato Ferredoxina Redutase (PFOR)
red
PFOR
oxi
Fd CO CoA Acetil Fd CoA Piruvato + + + +
2

Em ambos os sistemas biolgicos o piruvato gerado pela gliclise usado, na
ausncia de oxignio, para produzir acetil-CoA e/ou formar formato ou Ferredoxina reduzida

15
(Fd
red
) a partir da qual o hidrognio pode ser produzido. O rendimento global de hidrognio
nesses organismos relativamente baixo e formado de um a dois moles de hidrognio por
mol de piruvato consumido. Isso ocorre por ser uma conseqncia natural da fermentao,
que tem sido otimizada pela evoluo para produzir biomassa e no hidrognio. Desta forma
a poro de substrato (piruvato) usada nos dois casos para produzir ATP e como produto
cido actico, o qual excretado da clula. Em alguns organismos o hidrognio produzido
reduzido pelo reciclo de hidrognio devido presena de hidrogenases reversas, o qual
consome a poro de hidrognio produzido. Assim, a produo de hidrognio pode ser
aumentada com o uso de engenharia metablica ou manipulao nas condies de cultivo
(HALLENBECK e BENEMANN, 2002).
2.4 Bases Moleculares para Produo Biolgica de Hidrognio por
Processos Fermentativos
Hidrognio pode ser produzido pela fermentao de matria orgnica rica em
carboidratos. Esses organismos fermentativos obtm energia para suas necessidades pela
oxidao de molculas energticas. A glicose ou os seus polmeros (celulose e amido) so os
substratos mais usados para tal finalidade. A decomposio dessa matria orgnica libera
hidrognio e dixido de carbono e parte dessa matria orgnica permanece na forma de cido
actico e cido butrico ou outros cidos, dependendo da bactria que fermenta.
As reaes de produo de hidrognio a partir da sacarose so representadas a seguir
(KHANAL et al., 2004):
C
12
H
22
O
11
+ 5H
2
O 4CH
3
COOH + CO
2
+ 8H
2

C
12
H
22
O
11
+ H
2
O 2CH
3
CH
2
CH
2
COOH + CO
2
+ 4H
2


16
Observa-se, pelos balanos de carbono, que se a bactria produzisse apenas cido
actico como subproduto e no produzisse cido butrico e nenhum outro cido, ela produziria
o dobro de moles de hidrognio por mol de substrato. No entanto, essas reaes so tericas e
baseadas em balanos estequiomtricos. Na realidade a bactria produz os dois cidos, e alm
de etanol e lactato em menores quantidades. Porm esta relao pode variar com as condies
de cultivo dentro dos limites termodinmicos determinados (THAUER, JUNGERMANN e
DECKER, 1977). Uma diminuio da presso parcial do hidrognio resulta em um aumento
na relao cido actico e cido butrico, o que leva a um aumento na produo de hidrognio
(VAN ANDEL et al., 1985).
Essas bactrias podem utilizar como substrato um grande nmero de carboidratos,
tais como xilose: galactose, celulose, sacarose, frutose e amido, todos com bons
rendimentos.
Os organismos degradam molculas energticas como forma de obter energia livre, a
qual transformada em ATP, que o principal transportador de energia qumica em todas
as clulas. O substrato degradado na primeira fase da fermentao em uma srie de
reaes catalisadas por enzimas para liberar o piruvato e produzir ATP. A energia tambm
conservada em molculas de NADH. Os eltrons gerados nessas reaes so transferidos
para coenzimas especializadas no transporte de eltrons, no caso o NAD
+
, que passa para
sua forma reduzida, NADH. Quando um composto oxidado ele perde eltron ou
hidrognio, o NAD
+
o carregador de eltron, e quando reduzido fica na forma NADH. O
NADH formado durante a degradao deve ser regenerado a NAD
+
. Na segunda fase da
fermentao o cido pirvico , ento, reduzido atravs do hidrognio do NADH em alguns
compostos. No caso da Clostridium os compostos reduzidos produzidos a partir do piruvato

17
so: lactato, etanol, cido butrico, cido actico e hidrognio (LEHNINGER, NELSON e
COX, 2000).
O gnero Clostridium produz hidrognio por meio da atividade das enzimas piruvato-
ferredoxina-oxidoredutase e hidrogenase. A atividade da hidrogenase pode ser inibida em pH
baixo. Em um processo anaerbico tpico o hidrognio produzido durante a fase de
crescimento exponencial da Clostridium. Quando a populao atinge o estado estacionrio,
inicia-se a produo de solventes e as reaes de produo de cidos e hidrognio cessam. O
pH deve ser mantido entre 5,5 e 5,7 (KHANAL et al., 2004).
2.5 Clostridium acetobutylicum
Clostridium acetobutylicum uma bactria Gram-positiva, estritamente anaerbia, do
gnero Clostridium. caracterizada por um metabolismo rpido e com capacidade de formar
esporos em resposta a condies desfavorveis do meio ambiente, ou quando submetidas a
um aumento de temperatura ou falta de nutrientes (GIRBAL et al., 1995a, 1995b).
Essas bactrias so conhecidas tambm como "Organismo Weizmann", em
homenagem a CHAIM WEIZMANN, que ajudou a descobrir como culturas de C.
acetobutylicum podem produzir acetona, butanol e etanol em processos industriais a partir de
amido (WEIZMANN e ROSENFELD, 1937). C. acetobutylicum tambm produz cido
actico, cido butrico, gs carbnico e hidrognio.
A Figura 2.2 mostra uma colnia de C. acetobutylicum.

18

Figura 2.2 - Clostridium acetobutylicum. (Fonte: SIEMERINK, 2005).

A fermentao anaerbia da C. acetobutylicum um processo conhecido e muito
usado industrialmente devido aos seus produtos de interesse (BOWLES e ELLEFSON, 1985;
MATTA-EL-AMMOURI et al., 1987). O processo industrial utilizando C. acetobutylicum
conhecido por fermentao ABE (Acetona, Butanol e Etanol) (Figura 2.3).

19

Figura 2.3 Fermentao ABE. (Fonte: SIEMERINK, 2005).
O genoma da C. acetobutylicum ATCC 824 foi seqenciado e esta disponvel no
GenBank (NC_003030) e consiste em um cromossomo de 3,94 Mpb com um megaplasmdeo
de 192 kpb que contm a maioria dos genes responsveis para a produo de solvente
(NOLLING et al., 2001).
Alguns parmetros cinticos de reaes metablicas esto disponveis na literatura.
Essas informaes permitem o uso de engenharia metablica no melhoramento gentico desse
organismo como forma de obter um organismo com caractersticas desejadas.
2.5.1 Metabolismo da C. acetobutylicum
As vias metablicas utilizadas para a converso dos carboidratos em hidrognio,
dixido de carbono, cidos e os solventes pela C. acetobutylicum esto firmemente
estabelecidas (JONES e WOODS, 1986).

20
O complexo metabolismo da C. acetobutylicum tem sido estudado em detalhes nos
ltimos anos (BOWLES e ELLEFSON, 1985; MATTA-EL-AMMOURI et al., 1987;
VASCONCELOS, GIRBAL e SOUCAILLE, 1994; GIRBAL et al., 1995a, 1995b) e
freqentemente mostra um padro de fermentao bifsico. Aps produzir cido actico,
cido butrico e hidrognio, durante a fase de crescimento exponencial, inicia-se a formao
de solventes (etanol, acetona e butanol), a qual ocorre bem prxima fase estacionria. O
mecanismo no incio da fase de formao de solventes atualmente tem sido foco de muitas
pesquisas cientficas (BOWLES e ELLEFSON, 1985; JONES e WOODS, 1986;
TERRACCIANO e KASHKET, 1986; GIRBAL e SOUCAILLE, 1994; VASCONCELOS,
GIRBAL e SOUCAILLE, 1994; GIRBAL et al., 1995a, 1995b) e tem mostrado estar
associado ao efeito do pH cido.
Durante a gliclise da C. acetobutylicum gerado menos ATP e mais NADH do que o
necessrio para a biossntese e o crescimento. A produo dos cidos resulta da gerao de
ATP adicional necessria para a clula. Entretanto, somente uma parcela dos equivalentes
redutores produzidos durante a gliclise consumida durante a produo dos cidos. Estas
bactrias tm a habilidade de produzir hidrognio, que fornece clula uma rota eficiente para
a eliminao de prtons e de eltrons adicionais (JONES e WOODS, 1986). Nessas bactrias
a hidrogenase (E.C 1.12.7.2) a enzima que permite usar prtons como receptores terminais
de eltrons. A ferredoxina possui papel-chave no transporte e na distribuio de eltrons na
clula. Sob condies apropriadas, a ferredoxina reduzida capaz de transferir eltrons para o
ferro contido na hidrogenase, o que permite o uso dos prtons como um receptor final de
eltrons, resultando na produo do hidrognio molecular. Durante essa etapa a ferredoxina
reoxidada e o gs hidrognio liberado da clula. Outra enzima-chave na distribuio de
eltrons a NADH ferredoxina oxidoredutase (E.C. 1.18.1.3), que atua na oxidao ou na
reduo do NAD pelo equilbrio de eltrons entre NAD e ferredoxina (ver Figura 2.4).

21

Figura 2.4 Esquema da produo de hidrognio.
Durante o metabolismo da produo de cidos h um fluxo rpido de eltrons
decorrente tanto da quebra do piruvato quanto da regenerao do NADH por meio da
ferredoxina para produzir hidrognio.
A converso de piruvato em acetil-CoA catalisada pelo complexo de piruvato
dehidrogenase (EC 1.2.7.1). Esse complexo um dispositivo altamente integrado, composto
de trs classes de enzimas (STRYER, 1996). Outros nomes para essa enzima podem ser
encontrados: piruvato oxidoredutase, piruvato sintase, piruvato ferredoxina oxidoredutase e
pirvico-ferredoxina oxidoredutase.
Alm da converso do piruvato para acetil-CoA, C. acetobutylicum pode tambm
converter o piruvato em cido ltico sob determinadas circunstncias. A via do cido ltico
em circunstncias normais parece ocorrer somente como alternativa para permitir que a
gerao da energia e a oxidao do NADH continuem quando os mecanismos para a
eliminao dos prtons e eltrons pela gerao de hidrognio molecular so obstrudos. A
produo de cido ltico foi observada na diminuio da atividade da hidrogenase, por meio
de inibio por monxido de carbono ou da ausncia de ferro, devido aos baixos nveis da
ferredoxina e da hidrogenase (JONES e WOODS, 1986).
Fd
oxi
+

NADH + H
+
NAD
+
+ Fd
red
H
+
H
2
NADH ferredoxina
redutase
Hidrogenase

22
O fluxo de carbono a partir das ramificaes do acetil-CoA conduz formao dos
cidos e dos solventes, como mostra a Figura 2.6. Esses pontos de bifurcao ocorrem em trs
metablitos intermedirios: acetil-CoA, acetoacetil-CoA e butiril-CoA.
A tiolase (E.C 2.3.1.19) a enzima que catalisa a condensao de acetil-CoA a
acetoacetil-CoA e inibida em nveis micromolares de CoA. O mecanismo encontrado para
essa reao foi de ping pong bi bi (WIESENBORN, RUDOLPH e PAPOUTSAKIS, 1988).
Ping pong bi bi trata-se de um modelo cintico oscilatrio, onde o substrato A e o substrato B
no se encontram mutuamente na superfcie da enzima.

Figura 2.5 Esquema do modelo cintico Ping Pong bi bi.
Durante a fase de produo de cidos, o cido actico e o cido butrico so
produzidos a partir do acetil-CoA e butiril-CoA por meio de duas etapas anlogas que
resultam na produo de acetil-fosfato e butiril-fosfato correspondente, seguidas pela gerao
de ATP. A butirato quinase da C. acetobutylicum foi observada exibindo atividade reversvel.
Alm da tiolase, mais trs enzimas esto envolvidas na via metablica para a formao de
butiril-CoA a partir do acetil-CoA, a 3-hidroxibutiril-CoA dehidrogenase, a crotonase e a
butiril-CoA dehidrogenase.

23

Figura 2.6 Via metablica da Clostridium acetobutylicum. Adaptado de GIRBAL et al. (1995a).


24
O incio da produo de solventes envolve uma interrupo no fluxo de carbono nas
vias de produo de cidos para as vias de produo de solventes. Durante a produo de
solvente, o acetil-CoA e a butiril-CoA atuam como intermedirios para a produo de etanol e
de butanol. Essas vias produzem o acetaldedo e o butiraldedo, respectivamente, como
intermedirios, e requerem duas dehidrogenases que atuam nas redues necessrias para
produzir etanol e butanol. A reduo de butiril-CoA a butanol mediada pela butiraldedo
dehidrogenase e pela butanol dehidrogenase (ANDERSCH, BAHL e GOTTSCHALK, 1983).
Em culturas em batelada o incio e a manuteno da produo de solventes esto
associados ao baixo pH extracelular e intracelular e alta concentrao de cido butrico no
dissociado (TERRACCIANO e KASHKET, 1986). Em culturas em contnuo, ATP e NADH
disponveis revelam papel-chave na seletividade dos produtos. Altas concentraes de ATP
relacionadas com a baixa demanda de ATP ou alta eficincia de gerao de ATP conduz
para o aumento da produo de solventes. Isso ocorre nas seguintes situaes (GIRBAL e
SOUCAILLE, 1994):
culturas contendo glicose suficiente a baixo pH e com reciclo de biomassa;
cultura com limitao de ferro, nitrognio ou fosfato; e
durante a mudana induzida em culturas com limitao de fosfato pela reduo do pH
ou pela adio de cidos orgnicos.
A produo tanto de etanol quanto de butanol est associada ao aumento da
disponibilidade de potencial redutor.
A flexibilidade metablica foi estudada por GIRBAL et al. (1995b) pela variao do
grau de reduo do substrato, usando misturas de glicose, glicerol e piruvato, ou pela adio

25
de Neutral red, um carregador de eltrons artificial, ou pela reduo do pH de operao de 6,5
para 4,4. A existncia de dois tipos diferentes de mecanismos de mudana para a produo de
butanol tem sido demonstrada com dois padres distintos de expresso das enzimas
envolvidas na distribuio do fluxo de eltrons e na via de formao de solventes.
Culturas crescendo em meio contendo apenas glicose como fontes de carbono
produzem somente cidos (actico e butrico) e hidrognio molecular. Culturas crescendo em
meios contendo glicose e glicerol (com uma relao molar glicose/glicerol de 1,96) produzem
principalmente alcois com baixa produo de cidos e hidrognio e nada de acetona. O
glicerol um substrato mais redutor que a glicose: para a mesma quantidade de carbono, o
metabolismo do glicerol libera duas vezes mais NADH do que para glicose. O excesso de
equivalente redutor fornecido pela converso de glicerol em piruvato deve ser oxidado pela
via de consumo de NADH (Ver Figura 2.6). Surpreendentemente esse potencial redutor no
usado para formar hidrognio, que produzido, geralmente, como forma de eliminar o
excesso de eltrons gerados durante a gliclise. O que ocorre que parte da ferredoxina
reduzida produzida via piruvato-ferredoxina oxidoredutase foi usada para gerar NADH,
levando a uma baixa na produo de hidrognio (GIRBAL et al., 1995a). Os resultados esto
mostrados na Tabela 2.2.

26
Tabela 2.2 Parmetros da fermentao contnua em culturas no estado estacionrio de C. acetobutylicum
com limitao de fosfato.
Parmetros Glicose Glicose-Glicerol
Quantidade de substrato (mM)
Glicose 167 83
Glicerol - 163
Biomassa (g/l) 0,93 1,06
Velocidade especfica de formao ou consumo
(mmol/h g em massa seca)

Glicose 8,72 3,94
Glicerol - 4,65
Etanol 0,26 1,30
Butanol 0,01 3,86
Acetona 0,02 0,00
Acetato 3,67 0,42
Butirato 6,09 0,66
Lactato 0,00 0,00
CO
2
16,60 11,00
H
2
19,10 7,24
Fonte: GIRBAL et al., 1995a.
2.6 Engenharia Metablica
Metabolismo o conjunto de todos os processos bioqumicos que ocorrem numa
clula. O estudo do metabolismo de extrema importncia para se entender como manipular o
genoma e as condies de cultivo de um organismo no intuito de melhorar os processos de
obteno de produtos de interesse do homem. A manipulao de vias metablicas para
aumentar a produtividade de algum produto de interesse na economia tem sido alvo de estudo
na biotecnologia. Aumentar a produtividade de um produto consiste em manipular
geneticamente ou modificar as condies de cultivo do organismo produtor. Esse conceito de
modificaes de vias metablicas com o objetivo de aumentar a produtividade de um
elemento antigo. Ele consiste em manipular geneticamente e escolher as linhagens que
melhor atendem ao objetivo desejado. Experimentos de mutaes randmicas, ou seja,
mutaes aleatrias, contriburam para o desenvolvimento de diversos produtos na indstria,
porm so experimentos que consomem muito esforo econmico e humano. Com os avanos

27
em tcnicas de biologia molecular que aconteceram nos ltimos anos, possvel obter
modificaes especficas. Esse conceito conhecido como engenharia metablica. As reaes
so identificadas e tcnicas de biologia molecular so aplicadas com o objetivo de amplificar,
induzir ou deletar um gene ou uma enzima. Observaes sobre comportamento celular em
geral so guias para futuras modificaes (STEPHANOPOULOS, 1998).
Engenharia metablica o melhoramento das propriedades celulares por meio de
modificaes em reaes bioqumicas especficas ou da introduo de outras com o uso da
tecnologia do DNA recombinante (STEPHANOPOULOS, ARISTIDOU e NIELSEN, 1998).
Trata-se de um conceito abrangente que envolve muitas reas da cincia: princpios de
engenharia qumica, cincias da computao, matemtica, bioqumica e biologia molecular.
A modelagem matemtica a metodologia principal na engenharia metablica
(WIECHERT, 2002). Decises de engenharia embasada numa estrutura lgica exigem
modelos matemticos que representem o comportamento dos microorganismos em
bioprocessos. Devido complexa relao entre subsistemas e no-linearidade e
heterogeneidade do comportamento cintico dos elementos no sistema, as quais so
caractersticas de processos biolgicos, os modelos matemticos tm sido extremamente
necessrios para anlises de sistemas biolgicos complexos e para a realizao de decises
lgicas apropriadas (BAILEY, 1998).
Existem muitas aplicaes da engenharia metablica. A primeira aumentar os
rendimentos e a produtividade de produtos nativos sintetizados por microorganismos, a
segunda aplicao estender o range de substratos e a terceira a produo de produtos que
so novos para a clula hospedeira (STEPHANOPOULOS, 1998).

28
2.7 Anlise de Fluxo Metablico
A primeira etapa para o entendimento dos mecanismos celulares a observao sob
diferentes condies. complicado observar o que ocorre no interior da clula: elas apenas
podem ser quantificadas atravs de medidas extracelulares. Neste contexto, torna-se
necessrio o uso da anlise de fluxo metablico. O uso dessa ferramenta permite a
quantificao dos fluxos internos de uma via metablica.
A Anlise de Fluxo Metablico (MFA) a quantificao de fluxos no metabolismo
de um dado organismo de interesse, sob condies definidas. O resultado desta anlise
fornece um diagnstico do metabolismo. A importncia desse diagnstico est na comparao
com condies de cultivo diferentes ou com outros organismos geneticamente modificados.
Esse diagnstico feito com base em um modelo matemtico que se resume em encontrar
solues para um sistema linear de equaes algbricas que representam a estequiometria das
reaes metablicas consideradas.
A Anlise de Fluxo Metablico aplicada a partir de um modelo estequiomtrico
obtido com base nas reaes bioqumicas da clula. Esse modelo representa o metabolismo
celular. As reaes podem ser obtidas na literatura ou a partir de dados experimentais. O
modelo estequiomtrico baseado em balanos de massa nos metablitos considerados.
Desta forma, possvel extrair uma srie de informaes sobre o metabolismo, as
quais podem ser divididas em alguns casos tpicos, de acordo com STEPHANOPOULOS e
colaboradores (1998). So eles:
identificao dos controles nos pontos de bifurcao: pela comparao em
diferentes condies de cultivo ou com diferentes mutantes da variao no fluxo em uma
bifurcao, possvel saber a flexibilidade ou a rigidez de pontos de bifurcao. Em geral,

29
ponto de bifurcao rgido resiste a variaes na razo de diviso de fluxo, enquanto que
pontos de bifurcao flexveis tendem a serem mais ajustveis. O conhecimento de tais
caractersticas de uma rede metablica importante na racionalizao das modificaes que
tero mais efeitos na alterao dos rendimentos de produtos;
identificao de vias metablicas alternativas: a formulao da estequiometria
das reaes, que a base do MFA, requer conhecimento detalhado da rota bioqumica, na
qual os substratos so convertidos em produtos. Isso, no entanto, pode no ser evidente para
muitos microorganismos e muitas vias metablicas alternativas tm sido encontradas em
diferentes organismos e so identificadas por operar em condies de cultivo diferente;
clculo de fluxos extracelulares no medidos: em alguns casos, o nmero de
fluxos extracelulares que podem ser medidos menor do que o necessrio para o clculo de
fluxos intracelulares desconhecidos. Nesses casos, possvel obter tais fluxos usando a razo
de separao de fluxo, e
clculo de rendimentos tericos mximos: a separao dos fluxos pode ser
ajustada de forma a maximizar a quantidade do produto formado e, ainda, identificar os
metablitos limitantes.
O ponto inicial da MFA a estequiometria da rede de reaes que descreve como os
substratos so convertidos em produtos metablicos e constituintes da biomassa. A Equao
(2.1) representa o balano de massa para um estado varivel:
met met
met
X r
dt
dX
=
(2.1)
onde:

30
met
r - Velocidade de sntese dos metablitos intermedirios nas reaes da via
metablica;
- Velocidade especfica de crescimento;
met
X - Concentrao intracelular dos metablitos.
A diluio do conjunto de metablitos devido ao crescimento da biomassa est
representada pelo segundo termo da mesma equao. Os efeitos de diluio so considerados
muito pequenos quando comparados com os fluxos que afetam os mesmos metablitos devido
ao baixo nvel intracelular da maioria dos metablitos. Desta forma, o segundo termo do lado
direito da Equao (2.1) considerado zero na maioria dos casos. Considerando-se que as
concentraes dos metablitos se ajustam a novos nveis rapidamente, usada a hiptese de
estado pseudo-estacionrio, ou seja, o volume no muda e as concentraes dos metablitos
no variam em um curto perodo de tempo. Assim, o primeiro termo da Equao (2.1) igual
zero. Desta forma a Equao (2.1) torna-se:
0 =
met met
X r
(2.2)
As taxas de sntese de cada reao podem ser decompostas como o produto da
transposta da matriz estequiomtrica e o vetor de todas as taxas de reao, isto :
0 = = v r
T
met
S
(2.3)
Assim, obtm-se a equao geral da Anlise de Fluxo Metablico representada pela
Equao (2.4):
0 = v
T
S
(2.4)

31
onde S a matriz estequiomtrica e v o vetor de fluxos (que contm os fluxos a serem
determinados). A Equao (2.4) a base para a Anlise de Fluxo Metablico. Essa equao
vetorial representa K balanos algbricos lineares para K metablitos com J fluxos no
conhecidos. Como o nmero de reaes (J) sempre maior que o nmero de metablitos da
via (K), existe sempre um certo grau de liberdade no conjunto de equaes algbricas dado
por F = J - K. Alguns elementos de v devem ser medidos ou conhecidos para permitir a
determinao dos outros. Se exatamente F fluxos so medidos, o sistema torna-se
determinado e a soluo nica. Se o nmero de fluxos medidos superior a F, o sistema
superdeterminado, o que significa que existem equaes a mais que podem ser usadas para
testar a consistncia dos balanos globais. No entanto, se o nmero de fluxos medidos
inferior a F, o sistema subdeterminado, e os fluxos no conhecidos podem ser determinados
apenas se as restries adicionais forem induzidas ou se um critrio de otimizao global for
imposto aos balanos metablicos. Em um sistema determinado, os fluxos no conhecidos
podem ser obtidos a partir da Equao (2.4) reescrita da seguinte forma:
c
T
c m
T
m
T
v S v S v S + =
(2.5)
onde
m
v um vetor que contm os fluxos medidos e
c
v o vetor de fluxos no medidos
(representam as velocidades a serem calculadas). Igualmente, a matriz dos coeficientes
estequiomtricos S dividida em
m
S , que corresponde matriz dos coeficientes dos
metablitos das reaes que foram medidas, e
c
S , que corresponde aos metablitos internos
que sero determinados. O vetor de fluxos no medidos
c
v , pode ser estimado a partir da
Equao (2.6).
( )
m
T
m
1
T
c c
v S S v =

(2.6)

32
Em sistemas superdeterminados,
c
S no pode ser invertvel e a soluo pode ser obtida
pelo uso da pseudo-inversa da matriz:
( )
m
T
m
#
T
c c
v S S v =
(2.7)
A reconciliao estatstica com o objetivo de se obterem melhores estimativas para os
fluxos medidos e no medidos obtida de acordo com a Equao (2.8). A reconciliao
estatstica usa ferramentas de estatstica para que os dados experimentais sejam melhorados,
adaptando-os melhor aos balanos de massa e reduzindo os erros experimentais.
T
m
#
T
c
T
c
T
m
S S S S R =
(2.8)
O rank de R indica o nmero de equaes linearmente independentes. Com base no
rank obtm-se a matriz de redundncia reduzida (Equao 2.9).
R K R
r
= (2.9)
A reconciliao estatstica permite novas estimativas para os fluxos medidos por meio
da Equao (2.10):
( ) ( )
m r
1
r r
r new m,
v R R R R I v

=
(2.10)
Assim, novos fluxos calculados podem ser obtidos a partir da Equao (2.6). A
qualidade do modelo proposto pode ser analisada pela Equao (2.11).
( )
#
=
T T
C S S
(2.11)
De acordo com STEPHANOPOULOS (1998), para uma matriz estequiomtrica ser
considerada bem condicionada, o nmero condicional deve estar entre 1 e 100.
A anlise de sensibilidade indica qual a via mais vulnervel a pequenas variaes nas
medidas, e pode ser obtida por meio da Equao (2.12).

33
T
m
#
T
c
m
c
dv
dv
S S =
(2.12)
2.8 Anlise de Controle Metablico
Modificao no metabolismo de um determinado organismo com o objetivo de
aumentar os rendimentos de um produto no uma tarefa fcil. No entanto, a partir do
momento em que se identificam as enzimas que controlam a produo do metablito de
interesse, possvel, com o uso de kits comerciais de modificao genticas, inibidores
enzimticos ou ativadores, dependendo do caso, atingir o objetivo desejado. Portanto, o
primeiro passo a identificao das etapas que controlam a produo do produto desejado.
Muitos pesquisadores tm usado como ferramenta a Anlise de Controle Metablico para essa
finalidade.
HOEFNAGEL et al. (2000), interessados na produo biotecnolgica de compostos
aromticos tais como, diacetil, acetaldedo e acetona, utilizaram um modelo matemtico para
identificao dos pontos chaves para a produo desses compostos na via metablica da
Lactococcus lactis. O modelo est baseado na cintica enzimtica das reaes da via do
piruvato combinado com a anlise de controle metablico. Os resultados indicaram as
enzimas que produziam maior efeito na produo desses compostos. Normalmente esses
compostos so produtos secundrios com pequenos rendimentos. Neste trabalho foram
realizadas modificaes experimentais com o objetivo de confirmar as predies do modelo e
obtiveram 75% de aumento nas taxas de formao do produto desejado.
Outros trabalhos realizados in silico com essa finalidade esto publicados na literatura
(CORTASSA e AON, 1994; CHASSAGNOLE et. al., 2002).
A produo biotecnolgica de compostos de interesse est diretamente relacionada a
uma rede complexa de reaes metablicas. Esta complexidade torna impossvel a

34
identificao intuitiva dos mecanismos responsveis pelo controle da produo dos
metablitos. Por isso, torna-se necessrio o uso de ferramentas matemticas que auxiliam na
determinao desses controles.
Um dos mais importantes objetivos da engenharia metablica a avaliao dos
parmetros responsveis pelo controle dos fluxos. Os fluxos metablicos podem ser
determinados a partir dos balanos de massas em metablitos intracelulares. O conceito de
anlise de fluxo metablico proveitoso para o estudo das interaes entre diferentes vias e
quantificao da distribuio dos fluxos sobre os pontos de bifurcao. Porm, a MFA no
fornece nenhuma medida quantitativa de controle de fluxo. O controle de fluxo importante
para a manuteno das velocidades de sntese e converso dos metablitos balanceados sobre
uma ampla variedade de condies externas, sem o aumento ou a queda brusca da
concentrao dos metablitos intracelulares (STEPHANOPOULOS, ARISTIDOU e
NIELSEN, 1998).
Um dos principais objetivos da engenharia metablica o esclarecimento da estrutura
cintica da rede de reaes metablicas responsveis pelos fluxos e pelos nveis metablicos
(STEPHANOPOULOS, 1998). KASCER e BURNS (1973), e paralelamente, HEINRICH e
RAPAPORT (1974) introduziram o conceito de Anlise de Controle Metablico (MCA), que
consiste num sistema para estimar o controle do metabolismo. MCA uma abordagem
sistemtica para estimar os efeitos relativos a variaes nos nveis de diferentes enzimas, em
fluxos e metablitos, quando eles atuam simultaneamente (KASCER e BURNS, 1973;
HEINRICH e RAPOPORT, 1974). Esse conceito tem atrado muito interesse e tem sido
amplamente estudado (FELL e SAURO,1985; SAURO, SMALL e FELL, 1987; FELL e
SAURO, 1990; EHLDE e ZACCHI, 1997).

35
Em geral, MCA uma estrutura de anlise de sensibilidade do sistema e um dos
principais mtodos desenvolvidos para a descrio quantitativa do metabolismo que permitem
a anlise e o estudo das respostas do sistema metablico a variaes nos seus parmetros.
O entendimento de controle de fluxos importante para a modificao lgica de
fluxos metablicos, que a meta central da engenharia metablica. A descoberta de inibio
por feedback, cooperatividade e modificao covalente em enzimas e o controle da sntese da
enzima revelam um nmero de mecanismos que podem representar uma funo no controle
de fluxo.
As principais razes para o desenvolvimento da MCA foram:
a quantificao de como os fluxos no estado estacionrio e as concentraes
variam em resposta a perturbaes; e
relacionar as propriedades locais do sistema com as propriedades individuais
dos componentes do sistema.
MCA aplicada somente em sistemas que se encontram no estado estacionrio ou
pseudo-estado estacionrio. A atividade da enzima consiste em parmetro do sistema, assim
como a concentrao do substrato da primeira reao da via e do produto da ltima reao da
via. A concentrao desses metablitos deve ser mantida constante ou por controle das
condies ambientais em quimiostato, por exemplo, ou por meio da regulao intracelular.
Parmetros do sistema, em princpio, podem ser variados e definem o sistema. As
propriedades que so determinadas a partir de parmetros, tais como velocidades das reaes
ao longo da via metablica ou concentrao de metablitos intermedirios so consideradas
variveis do sistema. MCA relaciona variveis do sistema com os seus parmetros
(STEPHANOPOULOS, ARISTIDOU e NIELSEN, 1998).

36
As variveis e os parmetros do sistema so relacionados por meio dos coeficientes de
controle. Esses coeficientes descrevem como um parmetro (atividade de uma enzima na via
metablica) afeta uma varivel do sistema (a velocidade das reaes ao longo de uma via
metablica) (STEPHANOPOULOS, ARISTIDOU e NIELSEN, 1998).
O coeficiente de controle mais importante conhecido como coeficiente de controle
de fluxo (FCC, do ingls Flux Control Coefficient) e definido pela variao relativa da
velocidade no estado estacionrio resultante de uma variao infinitesimal da atividade de
uma enzima de uma via metablica sobre a variao relativa da atividade enzimtica. Como a
atividade enzimtica um parmetro do sistema independente, sua variao afetar a
velocidade tanto diretamente quanto indiretamente por meio de variaes transmitidas sobre
outras variveis do sistema (STEPHANOPOULOS, ARISTIDOU e NIELSEN, 1998).
A Equao (2.13) representa essa definio:
i
j
i
j
j
i
J
i
e d
J d
de
dJ
J
e
C
j
ln
ln
= =
(2.13)
onde
j
J o fluxo no estado estacionrio de uma reao j na via metablica e
i
e a
concentrao da enzima
i
E . A Equao (2.13) a definio original proposta por KACSER e
BURNS (1973). Outra definio de coeficiente de controle de fluxo foi apresentada por
HEINRICH, RAPOPORT e RAPOPORT (1977) como:
1
=
p
v
dp
dJ
J
v
C
j j
j
i
J
i
j

(2.14)
onde p pode ser qualquer parmetro que atua exclusivamente na velocidade de reao i . Essa
uma definio mais geral: se a atividade enzimtica escolhida como parmetro, ento a
Equao (2.14) reduzida Equao (2.13) (STEPHANOPOULOS, ARISTIDOU e
NIELSEN, 1998).

37
A enzima que possui maior coeficiente de controle de fluxo exerce maior controle no
fluxo para um dado estado estacionrio. Com um aumento na atividade da enzima, por
exemplo, i provocaria um grande aumento no fluxo da reao j . Os FCCs podem assumir
valores tanto positivos quanto negativos.
Uma importante conseqncia da normalizao dos FCCs que a soma deles com
relao a cada fluxo deve ser igual unidade. Essa soma conhecida como Teorema da
Soma dos Coeficientes de Controle, e representada pela Equao (2.15):
1
1
=
=
L
i
J
i
j
C
(2.15)
A partir dessa equao fica claro que os FCCs so completamente dependentes da
estrutura do sistema.
FCCs podem ser usados para fazer predies de quanto uma perturbao na atividade
de uma enzima afetar um determinado fluxo de uma via metablica.
Outro coeficiente similar o coeficiente de controle de concentrao (CCC, do ingls
Concentration Control Coefficient), em que a varivel afetada pela atividade da enzima a
concentrao do metablito. A Equao (2.16) define essa relao:
i
j
i
j
j
i
x
i
e d
x d
de
dx
x
e
C
j
ln
ln
= =
(2.16)
onde
j
x a concentrao do metablito
j
X no estado estacionrio. O valor do coeficiente de
controle de concentrao a medida do grau de controle exercido pela enzima
i
E na
concentrao
j
x no estado estacionrio. Para cada um dos metablitos da via a soma de todos
os CCCs deve ser igual a zero:

38
0
1
=
=
L
i
x
i
j
C
(2.17)
A Equao (2.17) implica que para cada metablito pelo menos uma enzima deve
exercer controle negativo. Por exemplo, quando o nvel de uma determinada enzima aumenta,
a concentrao do metablito diminui.
O terceiro tipo de coeficiente o coeficiente de elasticidade que definido pela
Equao (2.18):
i
i
i
i
i
j i
j
x
v
x
v
v
x
ln
ln
=
(2.18)
onde
i
v a velocidade da reao da enzima
i
E e
i
x a concentrao do metablito
j
X . O
coeficiente de elasticidade a medida de como a velocidade de reao
i
v responder a
variaes na concentrao
j
x , quando todas as demais concentraes so mantidas
constantes.
Os dois coeficientes de controle, FCC e CCC, so propriedades globais do sistema
metablico de forma que eles refletem no estado da via metablica como um todo. A variao
de um parmetro da via (por exemplo, um valor de Km, a concentrao de uma enzima, etc.)
ir afetar todos os coeficientes de controle da via. Por outro lado, o coeficiente de elasticidade
uma propriedade local e reflete somente no estado de uma simples enzima ou de seus
causadores. Os coeficientes de elasticidades assumem valores positivos quando estimulam a
reao e assumem valores negativos quando diminuem a velocidade da reao.
KACSER e BURNS (1973) definiram o teorema da conectividade que considerado o
mais importante dos teoremas do MCA, porque ele fornece o significado para entendimento

39
de como a cintica de enzimas locais afetam o controle do fluxo. A Equao (2.19) define o
teorema:
0
1
=
=
i
X
L
i
J
i
j
j
C
(2.19)
Por essa relao possvel observar que grandes elasticidades so associadas a
pequenos coeficientes de controle de fluxo, e vice-versa. Reaes que operam perto do
equilbrio termodinmico normalmente so muito sensveis a variaes na concentrao dos
metablitos, ou seja, suas elasticidades so altas, o que indica que os coeficientes de controle
de fluxo so pequenos (STEPHANOPOULOS, ARISTIDOU e NIELSEN, 1998).
O teorema da conectividade relaciona os coeficientes de elasticidade aos coeficientes
de controle e, junto com o teorema da soma, formam um sistema linear de equaes que torna
possvel o clculo das propriedades globais (os coeficientes do controle) a partir das
propriedades locais (os coeficientes da elasticidade).
2.8.1 Determinao dos coeficientes de controle de fluxo
A magnitude dos coeficientes de controle de fluxo fornece uma medida do aumento
relativo do fluxo que esperado a partir da amplificao da atividade enzimtica. Porm, isso
no significa que o aumento do fluxo ser proporcional aos FCCs para qualquer amplificao
na atividade. No entanto, a medida fornecida pelos FCCs pode ser uma aproximao
razovel, especialmente para pequenas variaes na atividade enzimtica. Etapas enzimticas
com FCCs perto da unidade qualificam esta enzima como etapa limitante. Por outro lado,
pequenos FCCs indicam disperso de controle de fluxo ao longo de muitas etapas, com
nenhuma etapa controladora do fluxo (STEPHANOPOULOS, ARISTIDOU e NIELSEN,
1998).

40
Vrios mtodos tm sido propostos na literatura para determinao dos FCCs. Esses
mtodos podem ser classificados da seguinte maneira de acordo com STEPHANOPOULOS,
ARISTIDOU e NIELSEN (1998):
mtodos diretos, em que os coeficientes de controles so determinados diretamente
a partir de medidas do fluxo e da atividade, seguindo pequenas, mas finitas
variaes na atividade da enzima;
mtodos indiretos, em que o coeficiente de elasticidade determinado inicialmente
e os coeficientes de controle so calculados a partir dos teoremas de MCA, e;
determinao dos FCCs a partir da medida da concentrao dos metablitos no
estado transiente.
No mtodo indireto (que foi utilizado como base nesse trabalho) uma via metablica
arbitrria que contm m metablitos internos e n reaes pode ser convenientemente descrita
por uma matriz N (mn) chamada matriz estequiomtrica. Cada linha da matriz N
corresponde a um metablito interno (concentrao) e cada coluna corresponde a uma reao
(taxa). A matriz construda de acordo com REDER (1988), e os elementos n
ij
so definidos
como segue:
n
ij
= +z se a reao j produzir molculas do metablito i.
n
ij
= -z se a reao j consumir molculas do metablito i.
n
ij
= 0 se a reao j nem produzir nem consumir molculas do metablito i.
As relaes estruturais da via metablica podem ser deduzidas facilmente a partir da
matriz estequiomtrica. Se a matriz N tem o rank m
0
, onde m
0
menor do que o nmero de
linhas ou igual a ele significa que a matriz N contm m
0
linhas independentes e as restantes

41
0
m m linhas dependentes podem ser escritas como combinaes lineares das linhas
independentes. Visto que cada linha de N corresponde a um metablito, isto tambm significa
que se m
0
for menor que m, a via conter metablitos dependentes que podem ser expressos
em termos dos metablitos independentes. Haver diversas combinaes dos metablitos
(linhas de N) que podem ser escolhidas como independentes e a escolha arbitrria. Visto que
o rank de colunas de uma matriz sempre igual ao rank das linhas, a matriz N contm
tambm m
0
colunas independentes. Novamente, diversas combinaes de colunas
independentes podem existir e a escolha tambm arbitrria. O nmero de colunas
dependentes, igual a
0
m n , representado por
0
n . Trs novas matrizes so construdas a
partir de N. A primeira consiste em m
0
linhas independentes de N e representada por N
R
. A
segunda consiste em m
0
colunas independentes de N e representada por N
C
. A terceira
consiste nas m
0
linhas independentes e nas m
0
colunas independentes de N e representada
pela Equao (2.23):
=
mn m
n
n n
n n
....
.... .... ....
....
1
1 11
N
(2.20)

=
n m m
n
R
n n
n n
0 0
....
.... .... ....
....
1
1 11
N
(2.21)

=
+
+
mn n m
n n
C
n n
n n
....
.... .... ....
....
) 1 (
1 ) 1 ( 1
0
0
N

(2.22)

=
+
+
n m n m
n n
RC
n n
n n
0 0 0
0
....
.... .... ....
....
) 1 (
1 ) 1 ( 1
N
(2.23)

42
A matriz
RC
N quadrada e sempre poder ser invertida, visto que todas as linhas (e
colunas) so independentes. A matriz estequiomtrica N pode ser decomposta como
(REDER, 1988):
R
X
N L N =
(2.24)
A matriz
X
L

( )
0
m m chamada de matriz de concentrao link. Se as colunas
dependentes de N e N
R
so eliminadas na Equao (2.24),
X
L pode ser calculado por:
1
.

=
RC C
X
N N L

(2.25)
Se o rank da matriz N for igual ao mesmo nmero de linhas ( ) m m =
0
, N
R
ser igual a
N e L
X
ser uma matriz identidade ( ) m m . Isto pode ser expresso de acordo com REDER
(1988) por:
A t x
dt
dx
R
X
+ = ) ( L
(2.26)
onde A um vetor 1 m , sendo os primeiros elementos igual a zero. A equao especifica a
relao de conservao dos metablitos, ou seja, como os metablitos dependentes podem ser
expressos em termos dos metablitos independentes.
2.8.2 Relao entre os fluxos no estado estacionrio:
Os fluxos no estado estacionrio de uma via metablica podem ser relacionados pelas
restries estruturais da via. Nem todos os fluxos no estado estacionrio so independentes.
Por exemplo, em uma via linear os fluxos no estado estacionrio por meio de cada reao so
iguais e somente um pode ser escolhido como independente.

43
Uma relao importante entre os fluxos independentes e dependentes no estado
estacionrio de uma via metablica pode ser realizada com a nova matriz, N
0
, contendo as
0
m
linhas independentes e
0
n colunas dependentes de N.
As
0
n colunas dependentes correspondero aos fluxos independentes da via
metablica.
Uma via metablica compreendendo m metablitos internos interconectados por n
reaes enzimticas, pode ser derivada de m balanos de fluxos, um para cada metablito da
via metablica. Esse balano pode ser representado pela seguinte equao:
0 = J N
R
(2.27)
onde J o vetor que contm os fluxos no estado estacionrio.
Essa equao pode ser rearranjada com o objetivo de obter m
0
fluxos dependentes,
reunidos no vetor J
0
(m
0
x 1), como funo dos n
0
fluxos independentes, reunidos no vetor J
R

( ) 1
0
n :
R RC
J N N J =

0
1
0

(2.28)
O produto
0
1
N

RC
N ter as dimenses
0 0
n m . A nova matriz, L
J
, ser construda a
partir deste produto e da matriz identidade
0
n :

=

0
1
0
N N
L
RC
n
J
I
(2.29)

44
A matriz L
J
, que tem dimenses, chamada matriz dos fluxos de ligao e igual
matriz K, definida por REDER (1988). Todos os n fluxos no estado estacionrio, J, podem ser
expressos como funo de
0
n fluxos independentes no estado estacionrio, J
R
, assim:
R
J
J L J =
(2.30)
Essa equao base para a anlise de fluxo metablico, a qual fornece um mtodo de
determinao de todos os fluxos no estado estacionrio.
2.8.3 Relaes cinticas
A concentrao dos m metablicos internos em uma via arbitrria denotada por
( ) x x x ....... , 2 , 1 , e as n velocidades de reao so denotadas por ( ) v v v ...... , 2 , 1 . A concentrao
e as velocidades de reao so agrupadas em um vetor x 1 m e em um vetor v 1 n
respectivamente. A via tambm contm r parmetros, que podem ser concentrao de
enzimas, parmetros cinticos e metablicos externos, e que so agrupados em um vetor
p ( 1 r ). Cada velocidade de reao expressa como funo da concentrao me dos
parmetros r , e o coeficiente de elasticidade calculado a partir dessas equaes de
velocidade de acordo com a Equao (2.18).
Desta forma novas equaes na forma de matriz so obtidas:
X
R
X
F
X
C L C =
(2.31)
J
R
J
F
J
C L C =
(2.32)
Os coeficientes de controle de fluxo e de controle de metablicos so calculados a
partir da Equao (2.33).

45
) (
X
F
J
F
X
R
J
R
L L
C
C
=

(2.33)
Metodologia

46
Captulo 3
METODOLOGIA
No presente captulo, ser apresentada a metodologia utilizada para o clculo dos
fluxos internos, utilizando conceitos de anlise de fluxo metablico, e clculo dos coeficientes
de controle de fluxo empregando conceitos de anlise de controle metablico.
Na primeira etapa do trabalho foi realizada a anlise de fluxo metablico para verificar
a influncia de duas diferentes condies de cultivo na distribuio de fluxo no metabolismo
da C. acetobutylicum.
Na segunda etapa do trabalho foi construdo um modelo cintico para a anlise de
controle metablico a fim de verificar qual enzima exerce maior controle no fluxo de
hidrognio.
3.1 Anlise de Fluxo Metablico (MFA)
Como mencionado anteriormente, C. acetobutylicum possui um metabolismo
complexo. Quando as culturas esto crescendo em glicose produzem somente cidos (actico
e butrico) e hidrognio molecular. Culturas crescendo em meios contendo glicose e glicerol
produzem, principalmente, lcoois, com baixa produo de cidos, hidrognio e nada de
acetona. Para entender a distribuio interna de fluxos metablicos aplicados nessas duas
diferentes condies de cultivo, foi usada a Anlise de Fluxo Metablico.
Metodologia

47
3.1.1 Modelo matemtico proposto para anlise de fluxo metablico
Para realizar a MFA, foi construda a matriz estequiomtrica S referente s reaes da
via metablica da C. acetobutylicum, representadas na Figura 2.6. As reaes usadas no
modelo esto descritas na Tabela 3.1
Tabela 3.1 - Reaes da via metablica da C. acetobutylicum usadas no modelo de anlise de fluxo
metablico.
r1 vGLI Glicose + 2ATP 2ADP + 2Gliceraldedo-3-fosfato
r2 vPIR Gliceraldedo-3-fosfato + 2ADP + NAD
+
Piruvato + 2ATP + NADH + H
+

r3 vPDH Piruvato + CoA + NAD
+
Acetil-CoA + NADH + H
+
+ CO
2

r4 vTHI Acetil-CoA Acetoacetil-CoA + CoA
r5 vHCOA Acetoacetil-CoA + NADH + H
+
3-Hidroxibutiril-CoA + NAD
+

r6 vCrCOA 3-Hidroxibutiril-CoA Crotonil-CoA + H
2
O
r7 vBuCOA Crotonil-CoA + NADH + H
+
Butiril-CoA + NAD
+

r8 vPTB Butiril-CoA + ATP Butiril-fosfato + CoA + ADP
r9 vBTK Butiril-fosfato + ADP Butirato + ATP
r10 vACALDH Acetil-CoA + NADH + H
+
Acetaldedo + CoA + NAD
+

r11 vADH Acetaldedo + NADH + H
+
Etanol + NAD
+

r12 vPTA Acetil-CoA + P Acetil-fosfato + CoA
r13 vATK Acetil-fosfato + ADP Acetato + ATP
r14 vGLIC Glicerol + NAD
+
+ ATP Gliceraldedo-3-fosfato + NADH + H
+
+ ADP
r15 vLAC Piruvato + NADH + H
+
Lactato + NAD
+

r16 vCOAT Acetoacetil-CoA + CH
3
COOH CH
3
COSCoA+ Acetoacetato
r17 vAADC Acetoacetato CO
2
+ Acetona
r18 vBUTHD Butiril-CoA+ NADH + H
+
NAD
+
+ CoA + Butiraldedo
r19 vBDHB Butiraldedo + NADH + H
+
NAD
+
+ Butanol
r20 vH
2
NADH + H
+
NAD
+
+ H
2

Metodologia

48
A matriz S , representada na Figura 3.1 foi construda com base nas reaes
metablicas da via da C. acetobutylicum que foram obtidas na literatura (GIRBAL et al.,
1995a). Todas as reaes no modelo estequiomtrico so consideradas reversveis e a via
metablica consiste em uma representao estequiomtrica de 20 reaes e 21 metablitos. A
matriz do modelo construda com base nas representaes estequiomtricas. Em cada linha
da matriz coloca-se o coeficiente estequiomtrico na coluna referente ao metablito daquela
reao; nas demais colunas colocam-se zero. Em seguida, separam-se os metablitos em trs
matrizes: substratos
s
S , produtos
p
S , e metablitos intracelulares
c
S . Somente a matriz dos
metablitos intracelulares usada na resoluo; e essa matriz a matriz
c
S .
Figura 3.1 - Matriz estequiomtrica referente s reaes da via metablica da C. acetobutylicum.
G
l
i
c
o
s
e
G
l
i
c
e
r
o
l
C
O
2
B
u
t
i
r
a
t
o
E
t
a
n
o
l
A
c
e
t
a
t
o
H
2
A
c
e
t
o
n
a
B
u
t
a
n
o
l
'
A
D
P
'
'
G
3
P
'
'
P
I
R
'
'
H
'
'
C
O
A
'
'
A
C
O
A
'
'
A
C
C
O
A
'
'
H
C
O
A
'
'
C
R
C
O
A
'
'
B
U
T
C
O
A
'
'
B
U
T
P
'
'
A
C
A
L
'
'
A
C
P
'
'
A
C
T
'
'
B
U
T
H
D
'
'
A
T
P
'
'
N
A
D
'
'
N
A
D
H
'
'vGLI' -1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -2 0 0
vPIR' 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -2 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 -1 1
'vPDH' 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1
'vTHI' 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
'vHCOA' 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1
'vCrCOA' 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
'vBuCOA' 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 1 -1
'vPTB' 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 -1 0 0
'vBTK' 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 1 0 0
'vPTA' 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 -1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 -1
'vATK' 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 1 -1
'vACALDH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
'vADH' 0 0 0 0 0 1 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 1 0 0
'vGLIC' 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1
'vLAC' 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1
'vCOAT' 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
'vAADC' 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0
'vBUTHD' 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 1 0 1 -1
'vBDHB' 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 -1
vH
2
' 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1
S
s
S
c
S
p

Do mesmo trabalho (GIRBAL et al., 1995a) foram obtidos os valores dos fluxos
medidos para composio do vetor dos fluxos medidos
m
v , cujos valores esto representados
na Tabela 3.2.
Metodologia

49
Tabela 3.2 - Fluxos medidos em condies de glicose e condies de glicose-glicerol (GIRBAL et al.,
1995a).
Fluxos medidos (mmol h
-1
g
-1
)
Glicose Glicose-glicerol
'vGLI' 8,72 3,94
'vPDH' 16,2 10,90
'vBTK' 6,09 0,66
'vADH' 0,26 1,30
vATK' 3,67 0,42
'vGLIC' 0,00 4,65
'vAADC' 0,02 0,00
vBDHB' 0,01 3,86
m
S um vetor que contm somente a posio dos fluxos medidos.
17,19) , 14 13, 11, 9, 3, (1,
m
= S
Os fluxos no medidos
c
v so obtidos pela Equao (2.7).
3.1.2 Soluo do modelo proposto
Os resultados foram obtidos com o uso do toolbox de MFA, desenvolvido por
MENDES, OLIVEIRA e PORTO (2005). O software MATLAB (verso 7.0) foi utilizado na
implementao das rotinas. O toolbox permite a obteno de todos os fluxos intracelulares por
balano de massa, melhoria dos dados experimentais por reconciliao estatstica e anlise de
sensibilidade.
O toolbox recebe a matriz estequiomtrica S a partir da rede metablica proposta e o
vetor
m
v , que contm os fluxos medidos experimentalmente. As linhas da matriz S (i j)
representam o nmero da reao (fluxos) e, as colunas, representam os metablitos.
Com o nmero de equaes linearmente independentes, obtido a partir do rank da
matriz, obtm-se a matriz de redundncia reduzida a partir da Equao (2.9). Assim, novas
Metodologia

50
estimativas para os fluxos medidos so obtidas a partir da Equao (2.10). Com os novos
fluxos medidos a partir da reconciliao estatstica, so obtidos novos fluxos calculados pela
Equao (2.6).
3.1.3 Avaliao do modelo proposto
A consistncia do modelo analisada por meio do nmero condicional, C . Para uma
matriz estequiomtrica ser considerada bem condicionada, o nmero condicional deve estar
entre 0 e 100 (STEPHANOPOULOS, ARISTIDOU e NIELSEN, 1998).
A velocidade de produo de hidrognio, embora tenha sido medido no trabalho
citado, foi considerado como no medido a fim de verificar a validade do modelo.
A sensibilidade analisada pela Equao (2.12) e o resultado mostra a sensibilidade
dos fluxos calculados a pequenas perturbaes nas medidas. O toolbox gera sensibilidades
acumuladas em toda a rede metablica, mostrando quais fluxos medidos tm maior
importncia em toda a rede, e as sensibilidades especficas com relao a um fluxo calculado
(no medido) de interesse.
3.2.1 Modelo matemtico das reaes da via metablica considerado
Para a realizao da anlise de controle metablico, foi construdo um modelo cintico
para as reaes consideradas na via metablica simplificada, conforme mostrado na Figura
3.2. A via metablica foi simplificada em relao via completa que foi utilizada para anlise
de fluxo metablico, pois a chave do entendimento do controle do metabolismo est apenas
nas ramificaes da via metablica.
Metodologia

51

Figura 3.2 Via metablica da C. Acetobutylicum simplificada.
As seguintes consideraes foram aplicadas:
no foram considerados mecanismos de ativao e inibio enzimtica; e
a coenzima (CoA) no foi considerada nos balanos por ser um metablito cclico
da via metablica.
A via metablica da C. acetobutylicum composta de uma srie de reaes catalisadas
por enzimas. A via da gliclise foi modelada considerando um simples passo irreversvel, de
acordo com estudos realizados por HOEFNAGEL et al. (2000). Os parmetros cinticos
usados foram desse mesmo estudo, com exceo da velocidade mxima.
A converso de piruvato para acetil-CoA foi modelada utilizando o mecanismo de
Michaelis-Menten reversvel.
Metodologia

52
Embora o mecanismo da reao de condensao de acetil-CoA a acetoacetil-CoA
catalisada pela tiolase obedece a cintica de ping pong bi bi e inibido a nveis micromolares
de CoA (WIESENBORN, RUDOLPH e PAPOUTSAKIS, 1988), neste trabalho foi utilizado
o mecanismo de Michaelis-Menten reversvel simples como simplificao, pois, CoA no foi
considerada no modelo e a cintica de ping pong bi bi exige dois substrato e dois produtos.
As velocidades consideradas para a via metablica proposta esto representadas na
Tabela 3.3. Com excesso da equao 1, correspondente a via da gliclise, obtida do trabalho
de HOEFNAGEL et al. (2000) as equaes cinticas mostradas so proposies deste
trabalho.
Tabela 3.3 Equaes de velocidade usadas no modelo.
1
GLI + 2ADP + 2NAD 2PYR + 2ATP + 2NADH
+ +
+ +
+ +
=
ATP m ADP m NADH m NAD m PIR m GLI m
ATP m NAD m Gli m
K
ATP
K
ADP
K
NADH
K
NAD
K
PIR
K
GLI
K
ATP
K
NAD
K
GLI
V
, , , , , ,
, , ,
max
GLI
1 1 1

2
PYR + Fd
oxi
ACOA + Fd
red

+ +
+ +
=
red
Fd m
red
oxi
Fd m
oxi
ACOA m PIR m
eq
red
oxi
oxi
Fd m PIR m
K
Fd
K
Fd
K
ACOA
K
PIR
K
Fd ACOA
Fd PIR
K K
V
, , , ,
, ,
max
PDH
1 1
1

3
2ACOA ACCOA
+ +
=
ACCOA m ACOA m
eq ACOA m
HI
K
ACCOA
K
ACOA
K
ACCOA
ACOA
K
V
, ,
,
max
T
1
1

Metodologia

53
4
ACOA + ADP ACET + ATP
+ +
+ +
=
ATP m ADP m ACET m ACOA m
eq ADP m ACOA m
K
ATP
K
ADP
K
ACET
K
ACOA
K
ATP ACET
ADP ACOA
K K
V
, , , ,
, ,
max
PTA
1 1
1

5
ACOA + 2NADH ETOH + 2NAD
+ +
+ +

=
ETOH m ACOA m NADH m NADH m NAD m NAD m
eq NADH m NADH m ACOA m
K
ETOH
K
ACOA
K
NADH
K
NADH
K
NAD
K
NAD
K
ETOH NAD NAD
NADH NADH ACOA
K K K
V
ACALDH
v
, , , , , ,
, , , , ,
max
1 1
1

6
ACCOA + 2NADH BUTCOA + 2NAD
+ +
+ +

=
BUTCOA m ACCOA m NADH m NADH m NAD m NAD m
eq NADH m NADH m ACCOA m
K
BUTCOA
K
ACCOA
K
NADH
K
NADH
K
NAD
K
NAD
K
BUTCOA NAD NAD
NADH NADH ACCOA
K K K
V
HCOA
v
, , , , , ,
, , , , ,
max
1 1
1

7
BUTCOA + 2NADH 2NAD + BUTOH
+ +
+ +

=
BUTOH m BUTCOA m NADH m NADH m NAD m NAD m
eq NADH m NADH m BUTCOA m
K
BUTOH
K
BUTCOA
K
NADH
K
NADH
K
NAD
K
NAD
K
BUTOH NAD NAD
NADH NADH BUTCOA
K K K
V
BUTHD
v
, , , , , ,
, , , , ,
max
1 1
1

8
ACCOA AC
ACCOA m
mx
COAT
K ACCOA
ACCOA V
,
+
=

9
BUTCOA + ADP ATP + BUT
+ +
+ +
=
BUTOH m ACOA m NADH m NAD m
NADH m BUTCOA m
TA
K
BUT
K
BUTCOA
K
NADH
K
NAD
Keq
NAD BUT
NADH BUTCOA
K K
V
, , , ,
, ,
max
P
1 1
1

Metodologia

54
10
Fd
red
Fd
oxi
+ H
2
red
Fd m red
red mx
HYD
K Fd
Fd V
,
+
=

11
Fd
oxi
+ NADH Fd
red
+ NAD
+ +
+ +
=
red
Fd m
red
oxi
Fd m
oxi
NADH m NAD m
red
oxi
NADH m
oxi
Fd m
mx
K
Fd
K
Fd
K
NADH
K
NAD
Keq
NAD Fd
NADH Fd
K K
V
, , , ,
, ,
NADH
1 1
1

12
ATP ADP
ADP
ATP
V
mx ATPase
=

3.2.1.1 Obteno das Constantes de Equilbrio
As constantes de equilbrio foram calculadas a partir da energia livre de Gibbs (
' 0
G )
obtidas de THAUER, JUNGERMANN e DECKER (1977), de acordo com a Equao (3.1):
=
RT
G
eq
e K
' 0
'
(3.1)
A constante de equilbrio usada para a reao vPTB foi a mesma do vPTA, pois
corresponde a vias de etapas anlogas.
Metodologia

55
Tabela 3.4 Constantes de equilbrio.
Enzima G
0
(kJ/mol) K
eq
Referncia
PDH -19,2 2329,2 THAUER, JUNGERMANN e DECKER, 1977
THI -25 24231 THAUER, JUNGERMANN e DECKER, 1977
PTA -4 5,0294 THAUER, JUNGERMANN e DECKER, 1977
ACALDH -45,6 99334000 THAUER, JUNGERMANN e DECKER, 1977
BUTHD - 74 PALOSAARI e ROGERS, 1988
3.2.1.2 Obteno das velocidades mximas de cada reao
A partir dos parmetros cinticos (Tabela 3.6), das concentraes dos metablitos
(Tabela 3.5) no estado estacionrio e dos fluxos internos obtidos a partir da anlise de fluxo
metablico possvel obter as velocidades mximas de cada reao considerada no modelo de
acordo com a Equao (3.2), pois a nica varivel de cada equao cintica a velocidade
mxima:
v
F
V
mx
=
(3.2)
onde F o fluxo calculado pela anlise de fluxo metablico,
mx
V a velocidade mxima e v
a equao da velocidade de reao representada na Tabela 3.3. Para isso foi obtido na
literatura o valor de concentrao desses metablitos no estado estacionrio. Aps foi
realizada a anlise de fluxo metablico para a via simplificada considerada neste modelo e
determinados os fluxos internos. As concentraes dos metablitos internos no estado
estacionrio usadas para o clculo das velocidades mximas esto resumidas na Tabela 3.5.
Metodologia

56
Tabela 3.5 - Concentrao dos metablitos internos no estado estacionrio.
Metablito
Concentrao
(mM)
Referncia
Glicose 167 GIRBAL et al., 1995a
ATP 1,5096 GIRBAL et al., 1995a
ADP 0,4440 GIRBAL et al., 1995a
NADH 0,1295 GIRBAL et al., 1995a
NAD
+
3,58 GIRBAL et al., 1995a
Piruvato 7,5 E. coli, YANG, BENNETT e SAN, 2001
Butirato 66,92 GRUPE e GOTTSCHALK, 1992
Acetato 30,38 GRUPE e GOTTSCHALK, 1992
Butanol 2,69 GRUPE e GOTTSCHALK, 1992
Acetona 0 GRUPE e GOTTSCHALK, 1992
Butiril-CoA 0,6771 GRUPE e GOTTSCHALK, 1992
Acetil-CoA 0,4033 THAUER, JUNGERMANN e DECKER, 1977
ATP 1,5096 GIRBAL et al., 1995a
ADP 0,4440 GIRBAL et al., 1995a
NADH 0,1295 GIRBAL et al., 1995a
NAD
+
3,58 GIRBAL et al., 1995a
No entanto, alguns fluxos apresentaram valor negativo, conseqncia da maioria das
reaes do modelo serem consideradas reversveis. Isso impede de se usar as velocidades
mximas correspondentes a esses valores negativos. Outra limitao est relacionada
obteno do estado estacionrio empregando as velocidades mximas obtidas por essa
metodologia. Acredita-se que isto seja conseqncia da utilizao de concentraes dos
metablitos internos obtidos de experimentos conduzidos em diferentes condies. Assim,
optou-se por utilizar essa metodologia somente para a reao da gliclise, da ATPase e da
PDH. Convm salientar que, no caso da gliclise, as concentraes dos metablitos
Metodologia

57
envolvidos nessa reao foram obtidas no mesmo experimento, com exceo do piruvato (ver
Tabela 3.5); na reao da ATPase as concentraes de ATP e ADP foram obtidas tambm do
mesmo experimento; e na reao PDH apresentou melhor ajuste em relao a utilizao da
atividade enzimtica com utilizao dessa abordagem.
Para as outras enzimas consideradas na via optou-se por usar as atividades especficas
determinadas por VASCONCELOS, GIRBAL e SOUCAILLE (1994) como velocidades
mximas. As atividades especficas foram determinadas em mol (min.mg)
-1
. Para corrigir a
unidade da velocidade mxima para mM/min, utilizou-se a seguinte abordagem: o volume
interno para C. acetobutylicum , em l de espao intracelular por mg de massa seca de
clulas (l/mg de clulas secas), 1,67 na fase acidognica, 2,13 na fase solventognica e 2,8
no fim da fase solventognica (TERRACCIANO e KASHKET, 1986). Fazendo-se uma mdia
dos dois primeiros valores obtm-se 1,9 l/mg de clulas secas. Alm disso, para essa bactria
sabe-se que 1 mg de clulas secas corresponde a 0,7 mg de protena (HARTMANIS e
GATENBECK, 1984). Com esses valores obtm-se o fator de converso de mol/mg de
protena para mmol/l ou mM:
l
protena mg
l
DW mg
DW mg
protena mg

37 , 0
9 , 1
1 7 , 0

Os
mx
V obtidos a partir dessa metodologia esto resumidos na Tabela 3.6.
3.2.1.3 Obteno dos Parmetros Cinticos
Os parmetros cinticos foram obtidos na literatura e esto resumidos na Tabela 3.6.
Para reao da gliclise (vGLI) foram usados os parmetros obtidos no trabalho de
HOEFNAGEL et al. (2002), pois no foi encontrado na literatura estudo da cintica da
gliclise em C. acetobutylicum. No entanto a velocidade mxima usada no modelo, foi obtida
Metodologia

58
atravs de Anlise de Fluxo Metablico, conforme explicado acima, realizada neste trabalho
utilizando como dados de entrada os valores medidos obtidos por GIRBAL et al. (1995a), que
o trabalho referncia, onde sero comparados os dados obtidos a partir do modelo
matemtico proposto neste trabalho com os dados experimentais obtidos pelo autor.
A velocidade mxima da reao de converso de piruvato para acetil-CoA (vPDH) foi
obtida tambm por Anlise de Fluxo Metablico os outros parmetros para esta reao foram
encontrados na literatura. Os K
m,PIR
, K
m,Fdoxi
, K
m,Fdred
foram obtidos do mesmo trabalho
realizado em C. acetobutilicum, o K
m,ACOA
no foi encontrado para C. acetobutilicum, neste
caso foi usado a constante encontrado para outro organismo (Azotobacter, BRESTERS et al.,
1975).
A reao da hidrogenase (vH
2
) foi encontrada o K
m,HYD
para C. acetobutylicum. A
reao do NADH (vNADH) foi encontrada os K
m,NADH
, K
m,Fdoxi
, K
m,Fdred
e a constante de
equlibrio foi estimada com base em reao anloga com valor de 1. Assim foi calculado o
K
m,NAD
.
A velocidade mxima para a reao da ATPase foi obtida tambm por anlise de fluxo
metablico.
Todos os parmetros das reaes da Tiolase (vTHI), Fosfotransacetilase (vPTA),
Butiraldedo deidrogenase (vBUTHD), Fosfotransbutirilase ( vPTB) foram encontrados para
C. acetobutylicum, conforme mostrado na Tabela 3.6.
Os parmetros da reao da etanol deidrogenase (vACALDH) foram obtidos do
BRENDA, uma base de dados pblica de enzimas (http://brenda.uni-koeln.de/).
A etapa de formao de Butiril-CoA (vHCOA), foi simplificada, e no foi encontrado
parmetros cinticos para os metablitos dessa reao, os parmetros cinticos utilizados
Metodologia

59
neste trabalho foram estimados a partir de constantes cinticas encontradas na literatura de
reaes anlogas a esta.
Tabela 3.6 - Parmetros cinticos das reaes do modelo.
Parmetros Unidades Referncia
vGLI
V = 69,15
K
m,PIR
= 25
K
m,GLI
= 0,1
K
m,NAD
= 0,1412
K
m,NADH
= 0,08999
K
m,ADP
= 0,04699
K
m,ATP
= 0,01867
mM/min
mM/min
mM
mM
mM
mM
mM
mM
MFA, obtida neste trabalho
L. lactis, HOEFNAGEL et al. 2002
vPDH
V = 787,02
K
m,PIR
= 0,322
K
m,Fdoxi
= 0,08
K
m,ACOA
= 0,008
K
m,Fdred
= 0,007
K
eq
= 2329,2
mM/min
mM/min
mM
mM
mM
mM
-
MFA, obtida neste trabalho
GIRBAL et al., 1995a
Azotobacter, BRESTERS et al., 1975
THAUER, JUNGERMANN e DECKER, 1977
vH
2

V = 839,9
K
m,HYD
= 0,0061
mM/min
mM/min
mM
VASCONCELOS, GIRBAL e SOUCAILLE, 1994
vNADH
V = 68,45
K
eq
= 1
K
m,NADH
= 0,034
K
m,Fdoxi
= 0,00091
K
m,NAD
= 0,0031
K
m,Fdred
= 0,0016
mM/min
mM/min
-
mM
mM
mM
mM
Estimado
Base de dados: BRENDA
Calculado
vATPase
V = 90071
mM/min
mM/min MFA, obtida neste trabalho
Metodologia

60
vTHI
V = 3848
K
eq
= 24231
K
m,ACOA
= 0,27
K
m,ACCOA
= 0,032
mM/min
mM/min
-
mM
mM
WIESENBORN, RUDOLPH e PAPOUTSAKIS,
1988
1988
vPTA
V = 2590
K
m,ACOA
= 0,078
K
m,ADP
= 0,71
K
m,ATP
= 0,37
K
m,ACET
= 73
K
eq
= 5,0294
mM/min
mM/min
mM
mM
mM
mM
-
WINZER, LORENZ e DURRE, 1997
vACALDH
V = 22,57
K
m,ACOA
= 0,055
K
m,NADH
= 0,003
K
m,NAD
= 0,16
K
m,ETOH
= 7,2
K
eq
= 99334000
mM/min
mM/min
mM
mM
mM
mM
-
vHCOA
V = 2,22
K
eq
= 1
K
m,ACOA
= 0,05
K
m,NADH
= 0,07
K
m,BUTCOA
= 0,006
K
mNAD
= 0,1
mM/min
mM/min
-
mM
mM
mM
mM
Estimado
Estimado
Estimado
Estimado
vCOAT
V = 77,7
K
m
= 0,6
mM/min
mM/min
mM
vBUTHD
V = 0,148
mM/min
mM/min VASCONCELOS, GIRBAL e SOUCAILLE, 1994
Metodologia

61
K
m,BUTCOA
= 0,045
K
m,NADH
= 0,003
K
m,NAD
= 0,16
K
m,BUTOH
= 1,6
K
eq
= 74
mM
mM
mM
mM
-
PALOSAARI e ROGERS, 1988
vPTB
V = 3700
K
m,BUTCOA
= 0,11
K
m,ADP
= 0,01
K
m,ATP
= 0,0014
K
m,BUT
= 0,02
K
eq
= 5,0294
mM/min
mM/min
mM
mM
mM
mM
-
1989
TWAROG e WOLFE, 1962
Estimado
3.2.2 Calculo dos coeficientes de Controle de Fluxo
Neste trabalho foi usado o mtodo indireto para o clculo dos coeficientes de controle,
em que o coeficiente de elasticidade foi determinado a partir do modelo cintico da via
metablica da Clostridium acetobutylicum e os coeficientes de controle de fluxo determinados
a partir dos coeficientes de elasticidade. A metodologia utilizada neste trabalho foi a descrita
no trabalho de EHDLE e ZACCHI (1997).
A matriz com todos os metablitos e reaes denominada neste trabalho de matriz S.
As linhas que possuem somente nmeros positivos representam os metablitos de sada e as
linhas que possuem somente nmeros negativos representam os metablitos de entrada. Desta
forma, a matriz N facilmente obtida eliminando linhas que possuem somente nmeros
positivos e linhas que possuem somente nmeros negativos. Na matriz N somente constam os
metablitos internos e suas reaes. O rank da matriz estequiomtrica pode ser obtido pelo
mtodo de eliminao de Gauss.
Metodologia

62
3.2.3 Balano de Massa da Via Metablica
Para cada metablito interno realizado um balano de massa e um sistema de
equaes diferenciais ordinrias gerado para descrever a dependncia da concentrao de
cada metablito com o tempo. Desta forma tm-se:
vPDH vGLI
dt
dPYR
= 2
(3.3)
vPTA vPTB vGLI vATPase
dt
dATP
+ + + = 2
(3.4)
vHCOA vACALDH - vGLI - NADH vBUTHD - v -
dt
dNADH
2 2 2 2 + =
(3.5)
vACALDH vPTA vTHI vPDH
dt
dACOA
= 2
(3.6)
vHYD vPDH vNADH
dt
dFdred
+ =
(3.7)
vCOAT vHCOA vTHI
dt
dACCOA
=
(3.8)
vBUTHD vPTB vHCOA
dt
dBUTCOA
=
(3.9)
A partir do sistema de equaes diferenciais ordinrias geradas, das equaes de
velocidade para cada reao representada na Tabela 3.3 e dos parmetros cinticos mostrados
na Tabela 3.6 so calculadas as concentraes dos metablitos internos no estado
estacionrio.
3.2.4 Soluo do modelo proposto
O software MATLAB (verso 7.0) foi utilizado na implementao das rotinas. O
programa recebe as reaes da via metablica, equaes dos modelos cinticos de cada reao
Metodologia

63
e os parmetros cinticos. Com essas entradas geram-se as matrizes e com o uso das equaes
descritas no trabalho de EHLDE e ZACCHI (1997) encontram-se os coeficientes de
elasticidades e os coeficientes de controle de fluxo.
3.2.5 Avaliao do modelo proposto
O modelo obtido foi comparado aos dados experimentais obtidos por GIRBAL et al.
(1995a).
As propriedades fundamentais dos coeficientes do controle so expressas por duas
relaes de soma. De acordo com KACSER e BURNS (1973) a soma de coeficientes do
controle do fluxo 1. Esta consiste na primeira relao de soma.
A segunda relao de soma foi proposta por HEINRICH e RAPOPORT (1974), e diz
que a soma dos coeficientes do controle da concentrao igual a zero.
A anlise do modelo foi avaliada respeitando essas propriedades.

Resultados e Discusses

64
Captulo 4
RESULTADOS E DISCUSSES
4.1 Anlise de Fluxo Metablico
A partir dos dados de fluxos medidos encontrados na literatura e realizados em sistema
contnuo (GIRBAL et al., 1995a), foram determinados os fluxos no medidos. O fluxo de
hidrognio, embora medido no trabalho citado, foi considerado como no medido, a fim de se
validar o modelo. O valor estimado do fluxo de hidrognio apresentou-se bem prximo quele
determinado experimentalmente, validando, desta forma, o modelo. A Tabela 4.1 apresenta os
resultados obtidos.
Tabela 4.1 Fluxo de hidrognio obtido na literatura e calculado no modelo.
Fluxo de H
2
(mmol h
-1
g
-1
) Glicose Glicose-Glicerol
Literatura (GIRBAL et al., 1995a) 19,10 7,24
Calculado neste trabalho 19,45 7,09
As velocidades dos metablitos internos calculadas a partir de MFA para cultura
crescendo em meio de glicose e em meio que contm mistura de glicoseglicerol esto
mostradas na Tabela 4.2.

65
Tabela 4.2 - Fluxos calculados em condies de glicose.
Fluxos calculados (mmol h
-1
g
-1
)
Glicose Glicose - glicerol
vPIR' 9,36 7,59
'vTHI' 6,73 4,87
'vHCOA' 7,20 5,14
'vCrCOA' 7,44 5,27
'vBuCOA' 7,68 5,41
'vPTB' 9,02 2,50
'vPTA' -0,30 0,98
'vACALDH' 3,11 0,10
'vLAC' -7,24 -3,41
'vCOAT' -0,22 -0,14
'vBUTHD' -1,10 3,05
'vH
2
' 19,45 7,09
Observa-se que o uso de glicerol favorece a produo de alcois e, em funo dessa
nova redistribuio de eltrons, a produo de hidrognio desfavorecida. GIRBAL et
al.(1995a) mostrou que o glicerol aumenta a relao NADH/NAD
+
. Com o aumento do
potencial redox, o excesso de NADH produzido precisa ser regenerado, isto , consumido
atravs da produo de butanol e etanol. Estas vias prejudicam a produo de hidrognio
(vH
2
) pois essa bactria, em meio contendo glicerol, possui a atividade da NADH ferredoxina
redutase desfavorecida no sentido de regenerao de NADH e favorecida no sentido de
produo de NADH. Essa inverso desfavorece a produo de hidrognio e outras rotas de
regenerao de NADH so, portanto, utilizadas, tais como produo de butanol e de etanol.

66
Nesse trabalho pode ser comprovado essa observao, a Figura 4.1 mostra a variao nas duas
diferentes condies de alimentao.
-10
-5
0
5
10
15
20
25
v
P
I
R
'
'
v
T
H
I
'
'
v
H
C
O
A
'
'
v
C
r
C
O
A
'
'
v
B
u
C
O
A
'
'
v
P
T
B
'
'
v
P
T
A
'
'
v
A
C
A
L
D
H
'
'
v
L
A
C
'
'
v
C
O
A
T
'
'
v
B
U
T
H
D
'
'
v
H
2
'
F
l
u
x
o
s

c
a
l
c
u
l
a
d
o
s

(
m
m
o
l

h
-
1

g
-
1
)
Glicose
Glicose - glicerol

Figura 4.1 Fluxos Calculados em duas diferentes condies de cultivo.
Observa-se que os fluxos correspondentes as reaes vPTB, vPTA, vACALDH,
vBUTHD e vH
2
nas duas culturas foram os que mais sofreram variao comparando as duas
culturas. Este o comportamento esperado, visto que ocorre uma mudana de fluxo em
funo da produo de alcois com o uso de glicerol como fonte de carbono.
A qualidade do modelo proposto foi satisfatria de acordo com o nmero condicional.
No modelo da C. acetobutylicum, o nmero condicional foi de 18,6.
4.1.1 Anlise de Sensibilidade
A Figura 4.2 mostra a sensibilidade acumulada, que representa os fluxos medidos que
possuem maior importncia em toda a rede na via metablica. Pela anlise da figura percebe-
se que as reaes que mais influenciam na via metablica como um todo so as vPDH,
vADH, vATK e vBDHB, correspondentes a reao da converso do piruvato a acetil-CoA, da
produo de acetona, de etanol e de butanol, respectivamente. Esses resultados refletem o

67
comportamento observado por GIRBAL et al.(1995a) que mostraram que a produo de
acetona, butanol e etanol influencia no metabolismo da via.
Sensibilidade Acumulada
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
vGLI vPDH vBTK vADH vATK vGLIC vAADC vBDHB
Sensibilidade

Figura 4.2 Sensibilidade Acumulada.
A sensibilidade acumulada indica a sensibilidade de cada fluxo medido em relao
via metablica como um todo, enquanto a sensibilidade especfica calculada em relao a
um fluxo de interesse. Neste caso, foi calculada a sensibilidade especfica dos fluxos medidos
em relao ao fluxo de hidrognio.
A anlise da sensibilidade especfica indica quais fluxos medidos so mais
susceptveis a variaes em relao a um fluxo especfico.
O estudo da estratgia mais eficiente de produzir hidrognio com o uso de glicerol
como fonte de carbono, por ser um substrato de fcil obteno e resduo da produo de
biodiesel, foi realizado neste trabalho. Os resultados experimentais obtidos na literatura
(GIRBAL et al., 1995a) mostraram que o glicerol desfavorece a liberao de hidrognio em
funo da produo de lcoois. Neste contexto, foi usada anlise de sensibilidade especfica
para identificao dos fluxos mais sensveis a variao em relao a produo de hidrognio.

68
Isso significa encontrar os fluxos onde uma pequena variao desses fluxos produziria um
grande aumento na produo de hidrognio.
O resultado da anlise de sensibilidade pode indicar um bom direcionamento da via
metablica mais apropriada a ser eliminada, visando a obteno de uma rota eficiente para
produo de hidrognio com uso de glicerol.
A anlise da sensibilidade especfica para a produo de hidrognio aplicada C.
acetobutylicum est apresentada na Figura 4.3 que mostra que a via de produo de butanol
(vBDHB) apresenta maior sensibilidade. Uma interrupo nessa via, por meio da deleo do
gene produtor da enzima butiraldedo dehidrogenase, responsvel pela reao vBUTHD,
reao imediatamente anterior reao vBDHB, combinada com a alimentao com glicerol,
pode ser uma estratgia de manipulao gentica mais eficiente para a rota desejada.
Sensibilidade Especfica
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
vGLI vPDH vBTK vADH vATK vGLIC vAADC vBDHB
Sensibilidade

Figura 4.3 Anlise de sensibilidade especfica na C. acetobutylicum para produo de hidrognio.
Com base nos resultados da sensibilidade especfica apontada para a via de butanol
foram realizadas simulaes com objetivo de verificar o aumento da produo de hidrognio,
caso a via de produo de butanol for eliminada por meio de manipulao gentica. Tambm

69
foram realizadas simulaes eliminando a via de produo de etanol, visto que foi a reao
que apresentou segunda maior sensibilidade especfica em relao produo de hidrognio.
Os resultados mostraram que a eliminao da via do butanol (vBDHB), mantendo o
meio de cultura tendo glicose como fonte de carbono, no apresenta aumentos significativos,
pois a produo de butanol baixa nessas condies e a eliminao dessa via no produziria
resultados considerveis. Os mesmos comportamentos foram observados no caso da
eliminao da reao de produo de etanol. Os resultados esto mostrados na Tabela 4.3.
Tabela 4.3 - Simulao dos fluxos calculados considerando a interrupo da produo de alguns
metablitos em meio contendo somente glicose.
Fluxos calculados
em meio contendo glicose (mmol h
-1
g
-1
)

Linhagem
selvagem
Knockout
do vBDHB
Knockout
do vADH
Knockout do
vBDHB e do
vADH
vPIR' 9,36 9,36 9,37 9,38
'vTHI' 6,73 6,73 6,85 6,85
'vHCOA' 7,20 7,19 7,29 7,29
'vCrCOA' 7,44 7,43 7,53 7,52
'vBuCOA' 7,68 7,67 7,76 7,75
'vPTB' 9,02 9,02 9,05 9,05
'vPTA' -0,30 -0,29 -0,54 -0,53
'vACALDH' 3,11 3,12 3,13 3,14
'vLAC' -7,24 -7,24 -7,23 -7,22
'vCOAT' -0,22 -0,22 -0,21 -0,21
'vBUTHD' -1,10 -1,11 -1,06 -1,07
vH
2
' 19,45 19,48 19,73 19,76
Novas simulaes foram realizadas considerando o meio contendo glicerol e glicose.
Os resultados mostraram que a deleo do gene responsvel pela produo de butanol e o uso
de glicerol aumentaria em 112% em relao linhagem selvagem. Somente a deleo do gene
responsvel pela produo de etanol aumentaria 20% a produo de hidrognio. A
combinao das duas delees traria um aumento acima de 130%.

70
Ainda assim, com esses ganhos no atingida a eficincia mxima de produo de
hidrognio quando a glicose utilizada como fonte de carbono. Porm, consiste em uma rota
alternativa de utilizao do glicerol como substrato para produo de hidrognio com
melhores rendimentos. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 4.5.
Tabela 4.4 - Simulao dos fluxos calculados considerando a interrupo da produo de alguns
metablitos em meio contendo glicerol e glicose.
Fluxos calculados
em meio contendo glicose e glicerol (mmol h
-1
g
-1
)

Linhagem
selvagem
Knockout
do vBDHB
Knockout
do vADH
Knockout do
vBDHB e do
vADH
vPIR' 7,59 8,00 7,66 8,08
'vTHI' 4,87 4,46 5,44 5,04
'vHCOA' 5,14 4,25 5,63 4,74
'vCrCOA' 5,27 4,14 5,72 4,59
'vBuCOA' 5,41 4,03 5,82 4,44
'vPTB' 2,50 3,42 2,66 3,59
'vPTA' 0,98 1,55 -0,22 0,35
'vACALDH' 0,10 0,67 0,20 0,77
'vLAC' -3,41 -3,00 -3,34 -2,92
'vCOAT' -0,14 0,11 -0,09 0,15
'vBUTHD' 3,05 0,50 3,25 0,70
vH
2
' 7,09 15,02 8,49 16,42
Essas concluses esto baseadas somente em balanos estequiomtricos, e no levam
em considerao as informaes cinticas existentes na via metablica. Sendo assim, as
informaes obtidas por essa anlise so limitadas. As anlises no metabolismo foram
complementadas com uso da anlise de controle metablica, para se levar em conta as
cinticas das vias consideradas.
MCA quantifica a importncia de cada enzima no controle do fluxo atravs da via de
produo de um dado metablito, que nesse caso est relacionado produo de hidrognio.

71
As enzimas que possuem maior coeficiente de controle de fluxo em relao ao fluxo de
hidrognio so as enzimas que exercem maior efeito na produo de hidrognio.
Para encontrar esses coeficientes, um modelo cintico que descreve a via metablica
da C. acetobutylicum, representada na Figura 2.6, que contm 17 metablitos e 12 reaes foi
construdo. Dados cinticos in vitro obtidos na literatura foram usados como dados de entrada.
O modelo matemtico desenvolvido neste trabalho para o metabolismo da C.
acetobutylicum foi obtido aps diversas tentativas de detalhar ao mximo as informaes
sobre regulao conhecidas sobre essa bactria. A complexidade do metabolismo da C.
acetobutylicum e o desconhecimento de alguns mecanismos de controle na mudana de fase
de produo de cidos para a produo de solventes dificultaram a obteno de um modelo
matemtico que representasse o metabolismo da C. acetobutylicum. Os primeiros modelos
obtidos durante a execuo deste trabalho foram modelos extremamente complexos do ponto
de vista matemtico e no atingiam o estado estacionrio para alguns metablitos. O estado
estacionrio um pr-requisito essencial para aplicaes de anlise de controle metablico no
modelo matemtico da via metablica.
Possivelmente o modelo no funcionou devido complexidade do metabolismo
considerado, e como os dados cinticos so obtidos independentemente para cada reao,
mecanismos de regulao importantes podem no ter sido includos. Alm disso, os dados
cinticos so obtidos em determinadas condies fisiolgicas (por ex., pH) e sabe-se que esses
parmetros so dependentes das condies do experimento. Para dar continuidade s anlises
de controle foram, ento, adotadas algumas simplificaes no modelo. Algumas informaes
de inibio e ativao foram desconsideradas para se obter o estado estacionrio da via
metablica, condio necessria para a MCA.

72
Desta forma optou-se por simplificar o modelo a fim de obter um modelo que melhor
se ajustasse aos valores experimentais e atingisse o estado estacionrio para realizao da
anlise de controle metablico.
As matrizes S e N foram obtidas a partir de rotinas desenvolvidas por OLIVEIRA, I.
L. (2007). A matriz N possui 10 metablitos internos e 12 reaes. Portanto m = 10 e n = 12.
O rank da matriz estequiomtrica foi obtido pelo mtodo de eliminao de Gauss, e neste caso
7. Isto significa que a via metablica da C. acetobutylicum contm 7 linhas e colunas
independentes, ou seja m
0
= 7 e n
0
= n - m
0
= 5.
A partir do modelo simplificado foram obtidos os valores produzidos pelos
metablitos de sada e comparados aos dados experimentais obtidos por GIRBAL et al.
(1995a). Os resultados tericos e experimentais foram normalizados em funo da velocidade
de consumo de glicose e comparados como mostrado na Figura 4.4.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
Butanol
cido Butrico
Hidrognio
Glicose
cido Actico
Etanol
Acetona
Velocidades de produo (mM de produto . min-1/mM de glicose. min-1)
Experimental
Modelo (Hiptese 1)

Figura 4.4 Velocidades de produo obtidas do modelo comparada com as velocidades de produo do
trabalho de GIRBAL et al., (1995a).
Observa-se que os dados diferem consideravelmente para alguns metablitos.
Acredita-se que essa diferena est relacionada falta de mecanismo de regulao no

73
associada ao modelo e ao fato de terem sido utilizados no modelo parmetros cinticos
obtidos de fontes diversas e em condies de pH distintos. Convm salientar que o pH umas
das principais variveis que afeta a velocidade da reao refletindo na troca de padro
acidognico para solventognico. No entanto, importante salientar que no necessria a
disponibilidade de todas as informaes sobre regulao e parmetros obtidos na mesma
condio para se alcanar o objetivo desejado. Essa limitao pode ser contornada de
diferentes formas j utilizadas por outros autores em trabalhos dessa natureza. Por exemplo,
os parmetros cinticos obtidos no trabalho de CORTASSA e AON (1994) foram obtidos
atravs da otimizao a partir da concentrao dos metablitos determinada
experimentalmente.
Nesse trabalho foi utilizada uma abordagem diferente e inovadora. Ao se analisar as
velocidades de produo (Figura 4.4), obtidas a partir do modelo e dos dados experimentais,
observou-se que a produo de hidrognio e cido actico no modelo apresenta-se mais alta
que os valores experimentais. Por outro lado, esse ganho nas velocidades pode estar associado
pequena velocidade de produo de cido butrico obtida no modelo, a qual mostra,
experimentalmente, uma velocidade de produo muito maior. As constataes feitas quando
analisado o comportamento das velocidades de produo obtidas no modelo indicam a
necessidade de se incluir meios de ajuste dos parmetros da velocidade de produo de cido
butrico. Para atingir esse intento foram utilizados os prprios coeficientes de controle de
fluxo para a identificao das etapas que controlam a produo de cido butrico, j que este
foi o produto que apresentou resultado muito inferior ao obtido experimentalmente.
Uma vez que as velocidades mximas dependem das condies fisiolgicas do
organismo (por exemplo, nvel de expresso das enzimas da via metablica), por ela que
ser ajustado o modelo aos dados experimentais a partir do conceito de coeficiente de controle
de fluxo.

74
Desta forma foram analisados os coeficientes de controle de fluxo (Figura 4.5) para a
produo de cido butrico e verificadas quais enzimas exercem controle no fluxo de cido
butrico com o objetivo de melhorar a produo de cido butrico para aproximar os dados do
modelo aos dados experimentais.
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
v
B
U
T
H
D
'
'
v
P
T
B
'
'
v
H
Y
D
'
'
v
N
A
D
H
'
'
v
A
T
P
a
s
e
'
'
v
G
L
I
'
'
v
P
D
H
'
'
v
T
H
I
'
'
v
P
T
A
'
'
v
A
C
A
L
D
H
'
'
v
H
C
O
A
'
'
v
C
O
A
T
'
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
e
s

d
e

c
o
n
t
r
o
l
e

d
e

f
l
u
x
o

Figura 4.5 - Coeficientes de controle de fluxo para o cido butrico.
Observa-se na Figura 4.5 que as etapas que exercem maior controle na produo de
cido butrico so: vHCOA positivo, vPTA negativo, vCOAT negativo. Os fluxos
correspondentes a vGLI, vTHI e vNADH apesar de mostrar controle positivo significativo
no foro alterados, porque comparado ao controle exercido pelo fluxo vHCOA, so menor
que a metade. Nos demais, a velocidade de reao foi aumentada 10 vezes para os que
exercem controle positivo e reduzida 10 vezes para os que exercem controle negativo. A
Tabela 4.5 contm as velocidades mximas usadas no modelo nas hipteses 1 e 2.

75
Tabela 4.5 Velocidades mximas usadas nos modelo 1 e 2.
V
mx
do Modelo (Hiptese 1) V
mx
do Modelo (Hiptese 2)
'vBUTHD' 0,148 0,148
'vPTB' 3700 3700
'vH2' 839,9 839,9
'vNADH' 68,45 68,45
'vATPase' 90071 90071
'vGLI' 60,78 60,78
'vPDH' 787,02 787,02
'vTHI' 3848 3848
'vPTA' 2590 259
'vACALDH' 22,57 22,57
'vHCOA' 2,22 22,2
'vCOAT' 77,7 7,77
O modelo com as novas velocidades mximas (Hiptese 2) foi testado e observou-se
uma aproximao com os dados experimentais por meio deste ajuste, evidenciando a
importncia dos coeficientes de controle de fluxo no metabolismo. Os resultados do novo
modelo permitem concluir que limitaes do modelo podem ser contornadas com o uso dos
coeficientes de controle de fluxo, o que os torna altamente importantes para aproximao do
modelo aos dados experimentais.
As novas velocidades de produo esto mostradas na Figura 4.6.

76
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Butanol
cido Butrico
Hidrognio
Glicose
cido Actico
Etanol
Acetona
Velocidades de produo (mM de produto . min
-1
/mM de glicose. min
-1
)
Experimental
Modelo (Hiptese 2)

Figura 4.6 Velocidades de produo normalizadas para glicose nas condies da hiptese 2.
O modelo obtido a partir dos ajustes representa bem os dados obtidos por GIRBAL et
al. (1995a).
As Equaes (3.2) a (3.8) podem ser utilizadas para a realizao do estudo dinmico
da via metablica proposta. A Figura 4.6 mostra a variao da concentrao (mM) dos
metablitos internos em funo do tempo (minuto).
As concentraes de ADP, ATP, Ferredoxina oxidada (Fdoxi), Ferredoxina reduzida
(Fdred) e Acetil-CoA (ACOA) atingem rapidamente a condio de estado estacionrio.
Acetoacetil-CoA, apresenta um pico de produo e logo aps inicia-se o consumo desse
metablito em funo da produo dos compostos seguintes e atinge o estado estacionrio em
nveis de concentrao de 0,2 mM. A formao da coenzima NADH pode ser observada, o
estado estacionrio atingido na concentrao de 3 mM, correspondente ao consumo de
NAD que atinge o estado estacionrio em nveis de concentrao (2,1mM). O Piruvato (PIR)
produzido no primiero momento e rapidamente inicia o consumo e atinge o estado
estacionrio rapidamente.

77

0 0.5 1
0
0.5
1
Tempo (min)
P
Y
R

(
m
M
)
0 0.5 1
0
0.5
Tempo (min)
A
T
P

(
m
M
)
0 0.5 1
0
2
4
Tempo (min)
N
A
D
H

(
m
M
)
0 0.5 1
0
0.5
1
Tempo (min)
A
C
O
A

(
m
M
)
0 0.5 1
0
0.05
0.1
Tempo (min)
F
d
r
e
d

(
m
M
)
0 0.5 1
0
0.5
1
Tempo (min)
A
C
C
O
A

(
m
M
)
0 0.5 1
0
5
x 10
-4
Tempo (min)
B
U
T
C
O
A

(
m
M
)
0 0.5 1
1.5
2
2.5
Tempo (min)
A
D
P

(
m
M
)
0 0.5 1
2
3
4
5
Tempo (min)
N
A
D

(
m
M
)
0 0.5 1
0.9
0.95
1
Tempo (min)
F
d
o
x
i

(
m
M
)

Figura 4.7 Comportamento dinmico da concentrao dos metablitos (mM) em funo do tempo (min).

78
4.2.1 Coeficientes de controle de fluxo
Os coeficientes de controle de fluxo do modelo com as condies da hiptese 1 para a
produo de hidrognio foram obtidos e esto mostrados na Figura 4.8. Os maiores
coeficientes de controle de fluxo em relao ao fluxo de hidrognio foram os do vNADH e
vGLI. Um aumento na atividade das enzimas correspondentes a essas duas reaes (vNADH
e vGLI) produziriam aumento na produo de hidrognio. No entanto, a produo de
hidrognio obtida nesse modelo j se apresenta otimizada em relao aos dados
experimentais.
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
v
B
U
T
H
D
'
'
v
P
T
B
'
'
v
H
Y
D
'
'
v
N
A
D
H
'
'
v
A
T
P
a
s
e
'
'
v
G
L
I
'
'
v
P
D
H
'
'
v
T
H
I
'
'
v
P
T
A
'
'
v
A
C
A
L
D
H
'
'
v
H
C
O
A
'
'
v
C
O
A
T
'
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
e
s

d
e

c
o
n
t
r
o
l
e

d
e

f
l
u
x
o

Figura 4.8 - Coeficientes de controle de fluxo para a produo de hidrognio considerando a hiptese 1.
Para o novo modelo da hiptese 2 foi realizada a anlise de controle de fluxo e novos
coeficientes de controle de fluxo foram obtidos (Figura 4.9). A partir da figura observa-se que
os coeficientes que exercem maior controle so os correspondentes as reaes de vGLI e
vNADH. O vHCOA tambm exerce controle positivo na produo de hidrognio. O fluxo
correspondente reao vPTA, que corresponde a produo de cido actico, apresentou

79
coeficiente de controle negativo, o que indica que a diminuio desse fluxo produziria um
aumento na produo de hidrognio. A via de produo de acetona, representada por vCOAT,
tambm mostrou coeficiente de controle negativo. No entanto, a produo de acetona baixa
nas condies estudadas no modelo e uma diminuio desse produto no traria tantos ganhos
na produo de hidrognio.
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
'
v
B
U
T
H
D
'
'
v
P
T
B
'
'
v
H
Y
D
'
'
v
N
A
D
H
'
'
v
A
T
P
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s
e
'
'
v
G
L
I
'
'
v
P
D
H
'
'
v
T
H
I
'
'
v
P
T
A
'
'
v
A
C
A
L
D
H
'
'
v
H
C
O
A
'
'
v
C
O
A
T
'
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
e
s

d
e

c
o
n
t
r
o
l
e

d
e

f
l
u
x
o

Figura 4.9 Coeficientes de controle de fluxo para hidrognio considerando a hiptese 2.
Esses coeficientes so confiveis, pois o modelo se ajustou bem aos dados
experimentais.
Em uma primeira anlise da via metablica espera-se que as vias que mais interferem
na produo de hidrognio so as que consomem NADH para regenerar a NAD. Isso se deve
ao fato da produo de hidrognio estar diretamente associada a necessidade da clula em
regenerar o NADH, o que ocorre nas vias de produo de butanol e etanol. Apesar das
simplificaes do modelo, os resultados mostraram que o vGLI apresentou maior coeficiente
de controle de fluxo ( a via que mais interfere positivamente na produo de hidrognio,
exatamente porque a via de produo de NADH). A segunda via mais importante na

80
produo de hidrognio a via de regenerao do NADH, ou seja, um aumento na demanda
de NADH na clula favorvel a produo de hidrognio.
O modelo poder ser melhorado na medida que mais dados cinticos e estudos in vitro
de cada etapa estiverem disponveis. Apesar dessas limitaes, o modelo fornece resultados
coerentes com o esperado.
Certamente, se os parmetros cinticos para o sistema em estudo estiverem
disponveis, a construo de um modelo cintico relativamente simples. Mesmo sem a
disponibilidade de todos os parmetros cinticos, podem ser realizadas simplificaes que
permitem a construo de um modelo que possa ser til. Por exemplo, este trabalho foi focado
na distribuio dos fluxos da via metablica da C. Acetobutylicum sobre as ramificaes da
via do piruvato. Desse modo, evitou-se a modelagem detalhada de todas as etapas da via
glicoltica. Com base nos coeficientes do controle pode-se projetar uma estratgia da
engenharia gentica que testar o modelo cintico. Esta modificao tem por objetivo atingir
melhorias biotecnolgicas.

Concluses e Sugestes

81
Captulo 5
CONCLUSES E SUGESTES
Neste trabalho foi proposto um estudo terico visando a investigao da etapa do
metabolismo da C. acetobutylicum que mais afeta a produo de hidrognio. Para alcanar
esse objetivo foram usadas duas ferramentas de Engenharia Metablica: Anlise de Fluxo
Metablico e Anlise de Controle Metablico.
As concluses do modelo obtido por anlise de fluxo metablico esto baseadas em
balanos estequiomtricos e, consequentemente, no levam em considerao interaes
cinticas. No entanto, como primeira anlise, foi possvel verificar a distribuio de fluxos
internos, obter-se a sensibilidade em relao aos fluxos calculados e usar o conceito na
obteno de algumas velocidades mximas usadas na anlise de controle de fluxo.
A partir do modelo cintico da C. acetobutylicum foi possvel obter os coeficientes de
controle de fluxo, que mostraram quais vias exercem controle na produo de hidrognio.
A partir do desenvolvimento desse trabalho, concluiu-se que os coeficientes de
controle de fluxo exercem papel importante na adequao do modelo matemtico aos dados
experimentais, pois a partir deles melhores resultados foram obtidos e foi possvel analisar as
etapas que controlam a via metablica estudada.
Os resultados da anlise de controle metablico obtido nesse trabalho permitem
concluir que apesar das simplificaes do modelo, os coeficientes de controle de fluxo
apontados para a produo de hidrognio mostraram-se adequados. As etapas que mais
influenciam positivamente na produo de hidrognio so a via glicoltica e a via de
Concluses e Sugestes

82
regenerao do NADH. A via do HCOA tambm mostrou influncia positiva na produo de
hidrognio.
Convm mencionar que as concluses obtidas nesse trabalho foram comparadas com
o trabalho de GIRBAL e colaboradores (1995a). Uma modificao no metabolismo deve vir
acompanhada de um experimento em linhagem selvagem, seguida da obteno das
velocidades de produo para determinadas condies, comparao com os dados do modelo,
e ajuste do modelo a partir dos coeficientes de controle para a nova situao de modo que
seja possvel a obteno de parmetros para a modificao desejada.
As principais dificuldades para realizao deste trabalho foi obteno de
informaes na literatura necessrias para construo e soluo do modelo, um trabalho
como esse depende exclusivamente da disponibilidade de dados. Se os dados no esto
disponveis fica muito difcil analisar, pois se a maioria dos parmetros forem estimados
comprometeria muito os resultados obtidos. Neste sentido um banco de dados como o
BRENDA tornou vivel a obteno dos parmetros necessrios e os no encontrados a partir
do BRENDA foi possvel avaliar as condies e reaes para outros organismos que
poderiam ser usadas como estimativas, pois se tratava de reaes anlogas e condies
semelhantes.
Como sugesto para trabalhos futuros fica o aperfeioamento do modelo, na medida
que se conhece mais infromaes sobre a regulao do metabolismo da C. acetobutylicum.
Experimentos para obteno dos fluxos medidos, obteno dos coeficientes utilizando este
modelo e modificao gentica na bactria com base nos direcionametos obtido a partir dos
coeficientes de controle de fluxo so sugestes para trabalhos futuros.
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Apndice

88
Apndice
Programa utilizado para Anlise de Controle Metablico
A seguir ser apresentado o programa utilizado neste trabalho desenvolvido para a obteno
dos coeficientes de controle de fluxo.
Arquivos de entrada:
Nome do arquivo: Clostridium.txt
vGLI: GLI + 2ADP + 2NAD -> 2PYR + 2ATP + 2NADH
vPDH: PYR + Fdoxi -> ACOA + Fdred
vTHI: 2ACOA -> ACCOA
vPTA: ACOA + ADP -> ACET + ATP
vACALDH: ACOA + 2NADH -> ETOH + 2NAD
vHCOA: ACCOA + 2NADH -> BUTCOA + 2NAD
vBUTHD: BUTCOA + 2NADH -> 2NAD + BUTOH
vCOAT: ACCOA -> AC
vPTB: BUTCOA + ADP -> ATP + BUT
vH2: Fdred -> Fdoxi + H2
vNADH: Fdoxi + NADH -> Fdred + NAD
vATPase: ATP -> ADP

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Nome do arquivo: Kin1

%Glucose rate function, %v1

vGLI
V = 60.78
%V = 0.6758
Kmpyr = 25
KmGLI = 0.1
KmNAD = 0.1412
KmNADH = 0.08999
KmADP = 0.04699
KmATP = 0.01867
:dep
Kgli = GLI/KmGLI
Knad = NAD/KmNAD
Kadp = ADP/KmADP
Knadh = NADH/KmNADH
Katp = ATP/KmATP
Kpyr = PYR/Kmpyr
vGLI = (V*Kgli*Knad*Kadp)/((1 + Kgli + Kpyr)*(1 + Knad + Knadh)*(1 + Kadp + Katp))

Apndice

89

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%Pyruvate dehydrogenase, vPDH
vPDH
V = 787.02
KmPYR = 0.322
KmFdoxi = 0.08
KmACOA = 0.008
KmFdred = 0.007
Keq = 2329.2

vPDH = V2(PYR, Fdoxi, ACOA, Fdred , V, Keq, KmFdoxi, KmPYR, KmFdred, KmACOA)
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%v18
%Hydrogenase (HYD),
vH2
V = 839.9
Km = 0.0061
vH2 = V*Fdred/(Fdred+Km)

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%v19
%NADH ferredoxin redutase (NADH), vNADH

vNADH
V = 68.45
Keq = 1
KmNADH = 0.034
KmFdoxi = 0.00091
KmNAD = 0.0031
KmFdred = 0.0016
vNADH = V2(NADH, Fdoxi, NAD, Fdred, V, Keq, KmFdoxi, KmNADH, KmFdred ,
KmNAD)

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%ATPase, vATPase
vATPase
V = 90071
vATPase = V*(ATP/ADP)
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
vTHI
V = 3848
Keq = 2.4231e+004
KmACoA = 0.27
KmACCoA = 0.032
vTHI = V*(ACOA - ACCOA/Keq) / (1 + ACOA/KmACoA + ACCOA/KmACCoA)

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%Phosphotransacetylase (PTA)
vPTA
Apndice

90
V = 2590
KmACOA = 0.078
KmADP = 0.71
KmATP = 0.37
KmCOA = 0.093
KmACET = 73
Keq = 5.0294

vPTA = V2(ACOA, ADP, ACET, ATP, V, Keq, KmADP, KmACOA, KmATP, KmACET)
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%v12
%Aceltaldehyde dehydrogenase (ACALDH), vACALDH
vACALDH
V = 22.57
KmACOA = 0.055
KmNADH = 0.003
KmNAD = 0.16
KmETOH = 7.2
Keq = 99334000

vACALDH = V2(ACOA, NADH, ETOH, NAD, V, Keq, KmNADH, KmACOA, KmNAD,
KmETOH)

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%v5
%3-Hidroxybutyryl-CoA dehydrogenase (HCOA), vHCOA
vHCOA
V = 2.22
Keq = 1
KmACCoA = 0.05
KmNADH = 0.07
KmButCoA = 0.006
KmNAD = 0.1

vHCOA = V2(ACCOA, NADH, BUTCOA, NAD, V, Keq, KmNADH, KmACCoA,
KmNAD, KmButCoA)
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%v14
%CoA Transferase (COAT), v14, vCOAT
vCOAT
V = 77.7
Km = 0.6
vCOAT = V*ACCOA/(ACCOA + Km)
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
vBUTHD
V = 0.148
KmBUTCOA = 0.045
KmNADH = 0.003
KmNAD = 0.16
KmCOA = 0.093
Apndice

91
KmBUTOH = 1.6
Keq = 74

vBUTHD = V2(BUTCOA, NADH, BUTOH, NAD, V, Keq, KmNADH, KmBUTCOA,
KmNAD, KmBUTOH)
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%v8
%Phosphotransbutyrylase (PTB), vPTB
vPTB
V = 3700
KmBUTCOA = 0.11
KmADP = 0.01
KmATP = 0.16
KmCOA = 0.045
KmBUT = 1.6
Keq = 5.0294

vPTB = V2(BUTCOA, ADP, BUT, ATP, V, Keq, KmADP, KmBUTCOA, KmATP,
KmBUT)
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Nome do arquivo: valinit.txt
ACOA = 0.92
GLI = 167
COA = 0.24
PYR = 0.5
Fdoxi = 0.9
Fdred = 0.1

NAD = 4.5333; %6.8/1.5
ADP = 1.6667; %2.5/1.5
ATP = 0.4133; %0.62/1.5
NADH = 0.6467; %0.97/1.5
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Programa para clculo da Analise de controle metablico (OLIVEIRA, I. L., 2007):

clear all
clc
a = mca('Clostridium.txt','valInit.txt','kin.txt');
objmca = mca('Clostridium.txt')
notes(objmca)
objmca = setInit(objmca,'valInit.txt');
objmca = setKinetic(objmca,'kin.txt');
objmca = mca('Clostridium.txt','valInit.txt','kin.txt')
x0 = steadystate(objmca)
[t,X] = transient(a,[0 1]);
plotTrans(a, X, t);
subplotTrans(a,4,X,t);
F = ssflux(objmca)
[Eps, fcc, ccc] = contrlCoef(objmca)
Apndice

92
sum(fcc,2)
sum(ccc,2)
Os cdigos fontes do programa mca podem ser obtidos mediantes solicitao junto a autora
deste trabalho.

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