UNVIERSIDADE FEDERAL DE GOIS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SADE PBLICA

CURSO DE BIOTECNOLOGIA




PRODUO DE ANTICORPO MONOCLONAL CONTRA A
PROTENA IMUNOGNICA GLUTATIONINA S-TRANSFERASE
PRESENTE NA ESPCIE SARCOPTES SCABIEI VAR. CANIS



JONATHAN MILHOMENS
LARA MARQUES NAVES
KAUAN MILHOMEM
RAFAEL VITOR CARNEIRO
WANESSA MOREIRA GOES



GOINIA GO
2014
JONATHAN MILHOMENS
LARA MARQUES NAVES
KAUAN MILHOMEM
RAFAEL VITOR CARNEIRO
WANESSA MOREIRA GOES




PRODUO DE ANTICORPO MONOCLONAL CONTRA A
PROTENA IMUNOGNICA GLUTATIONINA S-TRANSFERASE
PRESENTE NA ESPCIE SARCOPTES SCABIEI VAR. CANIS


Pr-projeto apresentado na
Disciplina de Produo de
Anticorpos Monoclonais como
requisito bsico para a aprovao
nesta disciplina do Curso de
Biotecnologia.

Professoras:
Profa. Dra. Lucimeire Antonelli da Silveira
Profa. Msc. Adriana Crespo


GOINIA-GO
2014
RESUMO

MILHOMENS, J.; NAVES, LM.; MILHOMEM, K.; CARNEIRO, RV.; GOES,
WM. Produo De Anticorpo Monoclonal Contra A Protena Imunognica
Glutationina S-Transferase Presente Na Espcie Sarcoptes Scabiei Var. Canis. Instituto
de Patologia Tropical e Sade Pblica, Universidade Federal de Gois, Goinia, 2014.
Sarna sarcptica ou escabiose a ectoparasitose mais comum no mundo, causada pela
infestao cutnea de caros ectoparasitas da espcie Sarcoptes scabiei. O diagnstico
rpido e eficiente da escabiose animal permite a adeso de um tratamento inicial mais
rpido e eficiente levando ao controle desta zoonose e abrindo possibilidades para
erradicao da doena. Atualmente, o diagnstico confirmatrio da escabiose feito
pela anlise microscpica de raspagem de leses cutneas causadas pelo ectoparasita, na
busca do caro adulto e/ou ovos do artrpode. Este mtodo de diagnstico apresenta
algumas deficincias, como o tempo longo para a confirmao do diagnstico e a baixa
confiabilidade do mesmo. Anticorpos monoclonais produzidos especificamente contra
antgenos especficos de Sarcoptes scabiei, como a protena imunognica Glutationina
S-Transferase, podem ser usados para a fabricao de kits de diagnstico altamente
sensvel e especfico, promovendo o esclarecimento da infestao de forma rpida,
robusta e barata.
Palavras-chave: Sarcoptes scabiei, Diagnstico, Glutationina S-transferase, Anticorpos
Monoclonais











SUMRIO

Introduo e Reviso da Literatura...................... pg. I
Justificativa ............................................................................... pg. IV
Objetivos.................................................................................... pg. V
Metodologia.............................................................................. pg. VI
Resultados esperados............................................................. pg. IX
Cronograma de Execuo do Projeto........................... pg. X
Referncias............................................................................. pg. XI
Anexos................................................................................... pg. XIII














INTRODUO E REVISO LITERRIA

INTRODUO

A pele o maior rgo do corpo humano. formada pela epiderme, derme e
hipoderme, e possui um papel crtico na defesa do organismo contra leses fsicas,
qumicas e microbiolgicas. Por separar imediatamente o organismo do indivduo, do
meio externo, a pele se tornou a primeira barreira de defesa dos animais, porm, assim
como outros rgos do corpo, est sujeita a diversas patogenias (FARIAS, 2007).
As dermatopatias so enfermidades muito importantes em sade pblica. So
responsveis pela maior parte de queixas de leses cutneas em hospitais e clnicas
veterinrias, e so causadas por diversos fatores, principalmente por ectoparasitoses
(WHITE; KWOCHKA, 2003).
A escabiose, ou sarna sarcptica, a ectoparasitose mais comum no mundo, e
causada pela infestao cutnea de caros ectoparasitas. A sarna sarcptica uma
zoonose, causada pelo parasita obrigatrio Sarcoptes scabiei, um caro microscpico
cuja fmea se alimenta da queratina presente na pele do hospedeiro. A infestao
caracteriza-se por prurido intenso e formao de crostas na pele, com pequenas
hemorragias e alopecia (GUIMARES, J. H. et al, 2001).
O diagnstico rpido para a escabiose animal muito importante, por ser uma
doena altamente contagiosa, por ser tratar de uma zoonose e principalmente, pela
sintomatologia bastante agressiva da doena, que pode evoluir para a morte, quando
acomete indivduos muito imunocomprometidos. Atualmente, o diagnstico
confirmatrio da escabiose feito pela anlise microscpica de material raspado de
leses cutneas, buscando encontrarem-se caros adultos e/ou ovos do artrpode. Este
mtodo de diagnstico, apesar de eficiente, lento e necessita de mo de obra
capacitada e equipamento especial, como microscpios, tornando-se caro (FENNER,
W. R., 2003).
A produo de anticorpos em larga escala, para uso de ensaios imuno-
enzimticos, no diagnstico rpido de doenas, corresponde a um salto positivo
imensurvel na prtica mdica e, portanto, se tornou, indiretamente, uma grande
ferramenta de controle da manifestao de muitas doenas, por permitir que os
acometidos pudessem ser tratados mais rapidamente, evitando disseminaes
(REICHERT, J. M., 2008).
Anticorpos produzidos especificamente contra antgenos de Sarcoptes scabiei
podem ser usados para a fabricao de kits de diagnstico para a escabiose e promover
esclarecimento da infestao, de forma rpida, robusta e barata.

REVISO LITERRIA

caro microscpico, parasita obrigatrio. Suas dimenses variam de 0,2
a 0,4mm com formato grosseiramente circular. O ciclo deste parasito autoxnico:
a ovipostura dura de um a dois meses, ecloso dos ovos ocorre em trs dias, as larvas
desenvolvem-se por trs dias e ninfas por oito dias. Os adultos fazem galerias na
epiderme do hospedeiro, principalmente nas regies interdigitais, mos, punhos,
cotovelos, axilas e virilhas. As fmeas utilizam as galerias feitas na epiderme para fazer
a ovipostura. Ovipem um total de 40 a 50 ovos em toda sua vida. O perodo de
incubao dura at cinco dias, quando as larvas eclodem. As larvas permanecem nas
galerias ou saem para a superfcie da pele. Em um determinado ponto, quando se
alimentam, sofrem mudas e se transformam em sua forma adulta. O ciclo do ovo de
cerca de 20 dias (FENNER, W. R., 2003; FARIAS, M. R. DE., 2007; GUIMARES, J.
H., et al, 2001).
Sabe-se que a escabiose tem uma importncia fundamental e crtica no mbito
de Sade Pblica, pois trata-se de uma importante antropozoonose, acometendo
tambm, os donos dos animais. transmitida pelo contato direto com doentes ou
atravs do uso de roupas e outros fmites. Os sinais clnicos da escabiose, ou sarna, so:
leses com alopecia em regies aleatrias do corpo, mas que pode, mais tarde
generalizar-se. As leses consistem de ppulas foliculares, eritema e crostas
hemorrgicas ressecadas. Se os animais no receberem o tratamento adequado, o quadro
clnico pode se agravar intensamente, levando a febre, perda de peso, piodermites
secundrias, severa debilitao e morte (PICCININ, A., 2008).
A glutathiona S-transferase (GST) representa um grande grupo de enzimas de
detoxificao. Todos os eucariotos possuem mltiplas isoenzimas de GST citoslicas e
de membrane. Cada uma desempenha um papel cataltico distinto, assim como
propriedades no catalticas. Uma classe de S. scabiei GST foi foi identificada e
subclonada em um sistema de expresso heterloga em procarioto (E. coli). O a protena
recombinante purificada reagiu fortemente com IgE e IgG4 de soro de pacientes com
escabiose. Estes resultados sugerem que a GST possui um papel muito importante na
fisiopatologia da doena e mais ainda, um agente fundamental nos processos
inflamatrios decorrentes da infestao pelo caro (DOUGALL A., 2005).
A habilidade de produzir quantidades praticamente ilimitadas de molculas
idnticas e especficas de anticorpos para um determinado antgeno revolucionou a
Imunologia. O mtodo da fuso de clulas B a clulas de mieloma, descrito por Georges
Khler e Csar Milstein em 1975, utilizado at hoje e produz anticorpos altamente
uniformes, sensveis e especficos. Estes anticorpos so chamados Anticorpos
monoclonais (Mab). O diagnstico de diversas doenas infecciosas e sistmicas pode
ser confirmado por antgenos ou anticorpos na circulao ou nos tecidos do paciente,
mediante o uso de anticorpos monoclonais nos ensaios imunes (REICHERT, J. M.,
2008).

















JUSTIFICATIVA

A escabiose uma doena altamente contagiosa e transmitida principalmente
por contato direto com um animal infectado. Pode haver transmisso por fmites e pele
infectada de animais, por meio de contato com material de higienizao ou em canis.
No h vacinas contra a escabiose e o tratamento s eficaz com o uso de escabicida,
desde que tenha sido feito o correto diagnstico da parasitose (GUIMARES, J. H., et
al 2001). O diagnstico da escabiose depende de boa instrumentao mdico-veterinria
e patologista capacitado, podendo ser demorado, caro e passvel de erros de tendncia
por parte do patologista (PINCHBECK; HILLIER, 2008). A produo de anticorpos
monoclonais para protenas de S. scabiei pode servir para o desenvolvimento de kits de
diagnstico rpido, baseados em ELISA, para testes sensveis, robustos e baratos de
escabiose.


















OBJETIVOS

Objetivos Gerais
- Produzir um anticorpo monoclonal contra uma protena GST de Sarcoptes
scabiei var canis.
Objetivos Especficos
-Produzir anticorpo monoclonal contra protena GST de classe de S. scabiei
com alta especificidade, avidez, diversidade e afinidade.
- Obteno de anticorpo monoclonal contra protena GST de classe de S.
scabiei para comercializao de kit de diagnstico para escabiose.





















METODOLOGIA

1. Animais de Experimentao

Sero utilizados camundongos da linhagem BALB/c fmeas com
aproximadamente 06 (seis) semanas de idade que sero fornecidos pelo Biotrio do
Instituto de Patologia Tropical e Sade Pblica (IPTSP) da Universidade Federal de
Gois (UFG) e mantidos no Centro de Produo de Anticorpos Monoclonais do Centro
Oeste (CEPRACO) onde sero mantidos em salas climatizadas (temperatura 22-24C) e
tero acessos ad libitum gua e rao atendendo todas as normas de manejo e cuidado
animal. O projeto de pesquisa ser submetido a aprovao junto ao Comit de tica em
Experimentao Animal (CETEA) da UFG.

2. Antgenos e Adjuvantes
O antgeno utilizado ser a protena mu-like glutathione S-transferases (GSTs)
pertencente aos artrpodes da espcie Sarcoptes Scabiei que ser obtida por meio da
expresso heterloga destas protenas em procariotos. Ser utilizado o adjuvante
completo de Freund (Sigma, USA) a fim de potencializar a resposta ao imungeno.

3. Esquema de Imunizaes

Os animais sero divididos em 02 (dois) grupos antes das imunizaes. O grupo
01 (um) ser imunizado apenas com o antgeno mu-like glutathione S-transferases
(GSTs) para verificar a qualidade da resposta dos animais a inoculaes sem o uso de
adjuvantes. O grupo 02 (dois) ser imunizado com o antgeno mu-like glutathione S-
transferases (GSTs) associado com o adjuvante completo de Freund (Sigma, USA)
para verificar se h uma melhora na resposta dos animais imunizados em comparao
com os animais do grupo 01 (um). Todos os animais sero imunizados por via
intraperitoneal em um volume de 0,1 mL de inculo por animal contendo 10 g do
antgeno utilizado diludo em tampo fosfato salino (PBS) com ou sem adjuvante
conforme a diviso mostrada a cima. O volume de adjuvante completo de Freund
utilizado em cada camundongo ser menor ou igual 0,2 mL em conformidade com o
estabelecido pelo Guidelines for the Research Use of Adjuvants da Office of Animal
Care and Use Staff (OACU), que preconizou o uso deste volume pela via
intraperitoneal. Os animais de ambos os grupos sero imunizados em um esquema de 0
(zero), 07 (sete) e 21 (vinte e um) e 28 (vinte e oito) dias, com uma ltima inoculao
com salina (booster) em volume de 0,1 mL cerca de 04 (quatro) a 05 (cinco) dias antes
da fuso das clulas de Mieloma e dos linfcitos B.

4. Verificao Da Produo De Anticorpos

Ser retirado sangue do plexo orbital dos animais entre as imunizaes (sangria
de prova) para centrifugao e separao do soro para posterior verificao da produo
de anticorpos anti- mu-like glutathione S-transferases (GSTs) atravs do ensaio
imunoenzimtico ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).

5. Obteno das Clulas esplnicas

Para a produo de hibridomas, ser inicialmente realizada a eutansia dos
animais que apresentarem uma melhor resposta imune ao imungeno, o bao do animal
ser recolhido e por meio da macerao do rgo se isolara as clulas esplnicas.
Realizara-se posteriormente a determinao da concentrao e viabilidade celular.

6. Obteno das Clulas do Mieloma

As clulas de Mieloma da linhagem Sp2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581 Khler e
Milstein,1976) sero adquiridas do Banco de Clulas do Laboratrio de Biologia
Celular e Molecular da Fundao Ezequiel Dias. As clulas sero mantidas congeladas
em nitrognio lquido para posterior descongelamento rpido em banho-maria a 37
graus celsos antes do processo de fuso. As clulas de Mieloma HGPRT (-),
hipoxantina-guanina Fosforribosil transferase sero posteriormente selecionadas em
meio seletivo com 8-azaguanina antes da fuso.


7. Produo de Hibridomas
As clulas esplnicas sero fundidas com clulas de Mieloma utilizando soluo
de polietilenoglicol (PEG) (1300-1600, Sigma, EUA) a 50% em salina 0,15 M. A
proporo usada ser de 01 (um) clula Sp2/O-Ag14 para 10 (dez) clulas de bao do
animal imunizado (Sharon, 1979; Coligan et al., 1996). Posteriormente, os hibridomas
sero suspendidos em meio seletivo HAT ( hipoxantina aminopterina e timidina) com
15% de SFB (Sigma especficos para hibridomas) para selecionar-se os hibridomas
HGPRT (+). As clulas so plaqueadas em poos contendo feeder-layer de macrfagos.
Em seguida, ser realizado o screening e a caracterizao dos anticorpos produzidos,
para posterior clonagem e congelamento dos hibridomas.


















RESULTADOS ESPERADOS

esperado que o anticorpo anti GSTs (glutationa S- transferases) apresente
caractersticas de especificidade, afinidade e avidez e diversidade. Estima-se que a
qualidade de resposta no grupo de animais que foram imunizados com o
antgeno+adjuvante seja maior, do que os imunizados apenas pela protena, pelo efeito
de potencializar a resposta imune ao antgeno.
Atendendo a todas as caractersticas citadas anteriormente, estima-se que o anticorpo
criado tenha condies necessrias para funcionar em kit de diagnstico para a
escabiose.














CRONOGRAMA DE EXECUO DO PROJETO


ATIVIDADES Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez
Reviso de
Literatura
X X


Elaborao Pr-
Projeto
X
Padronizao
das tcnicas
X X
Realizao das
imunizaes
X X
Obteno das
clulas
esplnicas e de
mieloma
X
Produo de
hibridomas
X X X X X X X
Caracterizao e
screening dos
anticorpos.
X X X
Relatrio parcial
das atividades
X X
Elaborao do
relatrio final
X X X
Comercializao
do anticorpo
para Produo
de Kits
Diagnsticos
X X

REFERNCIAS

1. ALVES T. M. Produo E Caracterizao De Anticorpos
Monoclonais Contra Campylobacter fetus subsp. venerealis. Belo Horizonte
[Dissertaao de mestrado programa de medicina veterinaria preventiva UFMG], 2006.

2. GUIDELINES FOR THE USE OF ADJUVANTS FOR ANTIBODY
PRODUCTION. The Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Disponvel Em: http://research.unc.edu/files/2012/11/Antibody-Adjuvant-Policy-
2013-8.pdf

3. NUNES, M. V. O., Cmara CP, Crespo AMC, Carvalhaes M, Oliveira
CR, Silveira LA. Comparao Do Perfil De Anticorpos Anti imunoglobulina G Em
Murinos Imunizados Com IgG Humana Associada A Diferentes Adjuvantes.
Revista Eletrnica Da Farmcia VI (1): 44 - 50, 2009. Disponvel Em:
Https://Revistas.Ufg.Br/Index.Php/Ref/Article/Viewfile/5860/4560

4. FENNER, W. R.; Consulta rpida clinica veterinria, 3. ed., Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2003.

5. FARIAS, M. R. DE. Dermatite Atpica Canina: da fisiologia ao
tratamento. Revista Clnica Veterinria, Ano XII, n. 69, julho/agosto, 2007.

6. GUIMARES, J. H., et al Ectoparasitos de Importncia Veterinria.
So Paulo: Editora Pliade, FAPESP. 2001, 218 p.

7. PICCININ, A., FERRARI, M. L. O. P., PRADO M. O., SPIGOLON, Z.
Sarna Sarcptica em ces. Revista Cientfica Eletrnica de Medicina Veterinria.
Gara/SP, v. 7, n. 10, 2008.

8. REICHERT, J. M. Monoclonal Antibodies as Innovative therapeutics.
Curr. Pharm. Biotechnol. 9, 423430 (2008).

9. WHITE, P. D.; KWOCHKA, K. W. Distrbios Dermatolgicos. In:
FENNER, W. R. Consulta rpida em clnica veterinria. 3. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2003. Cap. 25. p. 344-378.

10. DOUGALL, A. et al. Identification And Characterization Of
Sarcoptes Scabiei And Dermatophagoides Pteronyssinus Glutathione S-
Transferases: Implication As A Potential Major Allergen In Crusted Scabies. The
American Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 ed., 2005, p. 977984.


















ANEXOS
Artigo:
IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF SARCOPTES SCABIEI
AND DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS GLUTATHIONE S-
TRANSFERASES: IMPLICATION AS A POTENTIAL MAJOR ALLERGEN IN
CRUSTED SCABIES. Dougall, A. et al. The American Society of Tropical Medicine and
Hygiene, 2005.