1 Financiamento: CAPES, CNPq, FAPEMIG; 2 Estudante de Graduao UFV; 3 Estudante de Ps-Graduao UFV; 4 Professor Orientador do Departamento de Zootecnia UFV; 5 Pesquisador da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia RESUMO Estudos bsicos sobre tcnicas de extrao de DNA so de extrema importncia para o sucesso de trabalhos cientficos no campo da biologia molecular. Diante desta afirmao, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a eficincia do mtodo de extrao de DNA utilizando-se o detergente catinico CTAB (brometo de cetil-trimetilamnio). Esta tcnica aplicada a variados materiais biolgicos, foi testada em quatro amostras de tecido muscular de sunos. Depois de extrado o DNA, duas anlises foram realizadas: Quantificao em espectofotmetro e subseqente amplificao por PCR (Reao da Polimerase em Cadeia). Os resultados puderam ser observados mediante visualizao do material amplificado em gel de poliacrilamida 8%. A diluio que apresentou melhor qualidade e concentrao de DNA para as amplificaes, foi a de 1:10, e as bandas especficas para os quatro fragmentos do gene da miostatina testados puderam ser observados no gel e confirmam o bom resultado obtido por essa tcnica. Pde-se concluir que o protocolo vivel, visto que o material extrado poder ser submetido a amplificaes de marcadores moleculares. PALAVRAS-CHAVE Miostatina, PCR, Marcadores Moleculares A FASTER CTAB TECHIQUE FOR DNA EXTRACTION FROM SWINE MUSCLE ABSTRACT Basics studies about DNA extraction techniques are very important for the studies in mollecular biology area. The present work relates the efficiency of CTAB protocol for DNA extraction (Catonic hexadecyl trimethyl ammonium bromide). Here is applicated to many biological materials, and was tested on four samples of swine muscular tissue. After extraction, two analysis were realized: Quantification in spectrophotometer and PCR amplification. The results were visualized in 8% polyacrilamide gels. The dilution that showed better quality and concentration for the PCR was 1:10. The especific bands observed for the four fragments of myostatin gene tested, were seen in the gels and confirm the good results taken whit this method. In conclusion, this protocol is feasable, because the material could be used in molecular markers by PCR amplifications. KEYWORDS Myostatin, PCR, Molecular Markers Realizao: ABZ, AZOO-DF, FACULDADES UPIS 1/4 ZOOTEC2004, 28 a 31 de maio de 2004 Braslia, DF INTRODUO O DNA corresponde matria prima para qualquer conhecimento de ordem gentica. Os estudos de polimorfismos de DNA so importantes visto que podem estar associados a caractersticas de interesse econmico, portanto, estudos bsicos sobre tcnicas de extrao de DNA de alta qualidade so cruciais para o desenvolvimento de pesquisas no campo da biologia molecular. A tcnica de extrao com o uso de brometo de cetil-trimetil amnio (CTAB) muito aplicada em tecidos vegetais, e tambm a uma variedade de outros materiais biolgicos como sangue, smen, folculo piloso e tecidos orgnicos. Alm disso, essa tcnica permite facilmente acomodar uma grande variao de quantidades iniciais de tecido, at mesmo miligramas de tecido mumificado, fossilizado ou herbarizado (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). Este trabalho teve como objetivo, testar o protocolo de extrao de DNA, a partir de modificaes do protocolo de Boyce et. al. (1989) por CTAB em tecidos musculares coletados de sunos aps o abate, bem como verificar sua qualidade para utilizao em experimentos que utilizem a tcnica da Reao da Polimerase em Cadeia (PCR). MATERIAL E MTODOS Foram coletadas quatro amostras de msculo Semimembranosus, vulgarmente conhecido como coxo-mole, de sunos de linhagem comercial aps o abate. Aps o abate, as amostras foram condicionadas em etanol absoluto para a fixao dos tecidos. Todos os procedimentos aps a coleta dos tecidos foram realizados no Laboratrio de Biotecnologia Animal, sediado no Departamento de Zootecnia, da Universidade Federal de Viosa, cerca de dois meses aps a estocagem dos tecidos. No laboratrio, instrumentos cirrgicos foram imersos em etanol 95% e flambados para esterilizao na retirada de cada amostra. O DNA foi extrado de fragmentos com 1cm3. Esta quantidade foi inserida em microtubos de 1,5ml, estes foram deixados abertos a temperatura ambiente por 15 minutos para evaporao do etanol. Em seguida, foi acrescentado 500ul de CTAB (16,36g NaCl; 400 ul -mercapto-etanol; 20 mL 1M Tris-HCl pH 8,0; 8 mL 0,5 M Na2, EDTA pH8,0; 4 g CTAB e gua milliQ para 200ml) em cada tubo. Os fragmentos foram macerados com pistilos e incubados em banho-Maria a 65C por uma hora; sendo a suspenso misturada com o auxlio de vortex a cada 20 minutos. Aps este perodo, o material foi centrifugado a 15800 g por 2 minutos e o sobrenadante transferido para microtubos contendo 500 ul de clorofrmio: lcool isoamlico (24:1). A soluo foi homogeneizada e centrifugada a 15800 g por 15 minutos, para a precipitao das protenas na interface entre o CTAB e o clorofrmio. O sobrenadante obtido foi transferido para um terceiro conjunto de tubos contendo 250 ul de isopropanol resfriado (-20C) sendo ento, homogeneizado e mantido por um perodo mnimo de 30 min. em geladeira (4C). Os tubos foram ento centrifugados a 15800 g por 30 min. para precipitao e formao do pelete de DNA. O sobrenadante foi descartado e foi adicionado 1ml de etanol 75% para desidratao das amostras. Aps a adio do etanol, as amostras foram centrifugadas a 15800 g por dois minutos. Uma nova lavagem com etanol 100% foi realizada para completa desidratao do DNA. Finalmente, aps a remoo do sobrenadante, o material foi seco a temperatura ambiente, ressuspendido em Tris-HCl 1M- EDTA 0,5M pH 8,0 e posteriormente estocado -20C. Aps a extrao o DNA foi submetido a dois testes: 1) quantificao em um espectrofotmetro para avaliao de concentrao e qualidade; 2) amplificao por PCR do DNA extrado a partir de diferentes diluies do mesmo (1:10, 1:25, 1:50). Este ltimo teste foi realizado para verificar se a extrao foi bem sucedida e qual diluio apresentaria a melhor resoluo quando submetido a sucessivas amplificaes Realizao: ABZ, AZOO-DF, FACULDADES UPIS 2/4 ZOOTEC2004, 28 a 31 de maio de 2004 Braslia, DF com primers especficos para quatro diferentes regies do gene da miostatina em sunos. As amplificaes por PCR foram realizadas num volume final de 20ul para os quatro fragmentos do gene. Aps a PCR foi retirada uma alquota de 5ul de cada material amplificado e a visualizao feita em gel de poliacrilamida 8%, corado com nitrato de prata. RESULTADOS E DISCUSSO Nos resultados obtidos, as quatro amostras de DNA extradas pelo protocolo de CTAB apresentaram concentraes e qualidades satisfatrias Quando analisadas por espectrofotometria referente a concentrao de DNA e a pureza expressa pela razo A260/A280, que indica o nvel de contaminao das amostras por protena. A razo A260/A280 esperada como satisfatria de 1.8 a 2.0 (de acordo com SAMBROOK et. al., 1998). Como as razes obtidas no presente experimento encontram-se dentro desta faixa, todas as extraes com CTAB foram de boa qualidade, conforme a tabela 1. Na amplificao realizada com os referidos fragmentos do gene da miostatina, a diluio de 1:10 apresentou bandas especficas e com qualidade superior s demais diluies (1:25 e 1:50). Selecionou-se quatro regies do gene da miostatina para serem amplificados neste experimento, por que todos eles apresentam amplificaes de boa eficincia e grande especificidade. Trabalhos recentes comprovam a eficincia do mtodo de extrao de DNA por CTAB de folculos pilosos da espcie caprina (MENDONA, 2003). Outros estudos ainda enfatizam a utilizao desse mtodo em extrao de DNA de peixes (PAIVA, 2001). De maneira geral, o mtodo de extrao por CTAB rpido, barato e possvel de ser realizado, inclusive, em laboratrio de pequena a mdia infra-estrutura. Vrios procedimentos de extrao de DNA tm sido descritos na literatura, observando- se que protocolos padro so utilizados com algumas modificaes visando resolver os problemas especficos da espcie em estudo. No se pode esquecer que a maneira utilizada para coletar e preservar o tecido uma considerao importante em qualquer procedimento de extrao de DNA. O isolamento do DNA afetado significativamente pela condio do tecido antes da extrao. Por isso, recomenda-se utilizar material o mais fresco possvel (FERREIRA e GATTAPAGLIA, 1998). Na atual descrio, apesar das amostras terem sido coletadas em animais j abatidos, as mesmas foram mantidas em etanol absoluto, durante dois meses, o que garantiu boa qualidade do tecido. Os resultados obtidos na amplificao dos quatro fragmentos do gene da Miostatina, confirma a viabilidade do protocolo de extrao utilizado. O maior grau de pureza de amostras de DNA caracterizado pela sua capacidade de ser utilizado para amplificao de genes que podero ser submetidos tcnica de sequenciamento. Portanto, diante dos resultados, este mtodo pode assegurar excelente material, capaz de ser aplicado a amplificaes de qualquer tipo de marcadores como genes candidatos. CONCLUSES No referido trabalho foi possvel avaliar a qualidade e a eficincia do detergente CTAB utilizado na extrao de DNA de tecido muscular de sunos. A boa resoluo identificada na amplificao e a razo A260/A280 satisfatria foram suficientes para concluir que esse DNA apresenta alta qualidade e que pode ser utilizado para sequenciamento de fragmentos de genes candidatos, como a miostatina, que foi aqui usado. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BOYCE,T.M.; ZWICK,M.E.; AQUADRO,C.F . Mitochondrial DNA in bark weevils: size, structure, and heteroplasmy.Genetics v.123,p.825-836,1989. FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D . Introduo ao Uso de Marcadores Moleculares em Anlise Gentica. Braslia: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia. 1998. 220p. Realizao: ABZ, AZOO-DF, FACULDADES UPIS 3/4 ZOOTEC2004, 28 a 31 de maio de 2004 Braslia, DF MENDONA, P.T.; ARAJO, A.M.; GUIMARES, S.E.F.; COLUMBIANO, V.S.; SILVA, P.V.C.; LOPES, P.S . Tcnica de extrao de DNA de folculos pilosos em caprinos. In: XIII Simpsio de Iniciao Cientfica (SIC), 2003. CD Room. PAIVA, S.R . Influncia de obstculos naturais na divergncia de populaes de Astyanax bicamulatus na Bacia do Rio Doce- MG. Viosa- MG: UFV, 2001. Tese ( Mestrado em Gentica e Melhoramento)- Universidade Federal de Viosa, 2001. SAMBROOK, J.; FRITSH, E.F.; MATIAS, T . Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Sring Harbor Lab. Press. 1998, 2 nd ed.
TABELA 1. Quantificao das amostras de DNA extradas de tecido muscular de sunos Amostra A 260nm A 280nm [ ] DNA (ng/ul) Razo 1 0,449 0,234 887,6 1,933 2 0,824 0,440 1638,9 1,879 3 0,766 0,418 1511,9 1,853 4 0,916 0,484 1828,2 1,898 A 260nm Absorbncia medida a 260nm; A 280nm Absorbncia medida a 280nm; [ ] DNA ng/ul Concentrao de DNA ng/ul; Razo Frao entre A260 nm e A280 nm. Realizao: ABZ, AZOO-DF, FACULDADES UPIS 4/4