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Análise de Proteínas

Análise de Proteínas Prof. Eduardo Purgatto Depto. de Alimentos e Nutrição Experimental FCF – USP Curso
Análise de Proteínas Prof. Eduardo Purgatto Depto. de Alimentos e Nutrição Experimental FCF – USP Curso
Análise de Proteínas Prof. Eduardo Purgatto Depto. de Alimentos e Nutrição Experimental FCF – USP Curso
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Análise de Proteínas Prof. Eduardo Purgatto Depto. de Alimentos e Nutrição Experimental FCF – USP Curso

Prof. Eduardo Purgatto

Depto. de Alimentos e

Nutrição Experimental

FCF USP

Curso de Graduação

Disciplina de Bromatologia Básica

2013

Proteínas

Proteínas Macromoléculas compostas de AMINOÁCIDOS unidos por ligações covalentes denominadas LIGAÇÕES PEPTÍDICAS
Proteínas Macromoléculas compostas de AMINOÁCIDOS unidos por ligações covalentes denominadas LIGAÇÕES PEPTÍDICAS

Macromoléculas compostas de AMINOÁCIDOS unidos

por ligações covalentes denominadas LIGAÇÕES PEPTÍDICAS

Proteínas Macromoléculas compostas de AMINOÁCIDOS unidos por ligações covalentes denominadas LIGAÇÕES PEPTÍDICAS
Proteínas Macromoléculas compostas de AMINOÁCIDOS unidos por ligações covalentes denominadas LIGAÇÕES PEPTÍDICAS
Proteínas Macromoléculas compostas de AMINOÁCIDOS unidos por ligações covalentes denominadas LIGAÇÕES PEPTÍDICAS
Proteínas Macromoléculas compostas de AMINOÁCIDOS unidos por ligações covalentes denominadas LIGAÇÕES PEPTÍDICAS
Proteínas Macromoléculas compostas de AMINOÁCIDOS unidos por ligações covalentes denominadas LIGAÇÕES PEPTÍDICAS
Proteínas Macromoléculas compostas de AMINOÁCIDOS unidos por ligações covalentes denominadas LIGAÇÕES PEPTÍDICAS

Classificação

Classificação Composição: Simples (apenas AAs) Conjugadas com compostos não-AA Glicoproteínas, Lipoproteínas,
Classificação Composição: Simples (apenas AAs) Conjugadas com compostos não-AA Glicoproteínas, Lipoproteínas,

Composição:

Simples (apenas AAs)

Classificação Composição: Simples (apenas AAs) Conjugadas com compostos não-AA Glicoproteínas, Lipoproteínas,

Conjugadas com compostos não-AA

Composição: Simples (apenas AAs) Conjugadas com compostos não-AA Glicoproteínas, Lipoproteínas, fosfoproteínas, etc.

Glicoproteínas,

Lipoproteínas, fosfoproteínas, etc.

Classificação

Classificação Estrutura Globulares (ex. albuminas, mioglobina) Fibrosas (ex. colágeno) Conjugadas (ex. Hemoglobina)
Classificação Estrutura Globulares (ex. albuminas, mioglobina) Fibrosas (ex. colágeno) Conjugadas (ex. Hemoglobina)

Estrutura

Classificação Estrutura Globulares (ex. albuminas, mioglobina) Fibrosas (ex. colágeno) Conjugadas (ex. Hemoglobina)

Globulares (ex. albuminas, mioglobina)

Classificação Estrutura Globulares (ex. albuminas, mioglobina) Fibrosas (ex. colágeno) Conjugadas (ex. Hemoglobina)

Fibrosas (ex. colágeno)

Classificação Estrutura Globulares (ex. albuminas, mioglobina) Fibrosas (ex. colágeno) Conjugadas (ex. Hemoglobina)

Conjugadas

(ex.

Hemoglobina)

Classificação

Classificação Função biológica - Elementos estruturais (colágeno) e sistemas contráteis; - Armazenamento
Classificação Função biológica - Elementos estruturais (colágeno) e sistemas contráteis; - Armazenamento

Função biológica

- Elementos estruturais (colágeno) e sistemas contráteis;

- Armazenamento (ferritina);

- Veículos de transporte (hemoglobina);

- Hormônios;

- Enzimática;

- Nutricional;

- Agentes protetores (imunoglobulina); Entre outras

Classificação

Classificação Solubilidade Hidrofílicas Conalbumina Hidrofóbicas Proteínas de membranas
Classificação Solubilidade Hidrofílicas Conalbumina Hidrofóbicas Proteínas de membranas

Solubilidade

Hidrofílicas

Conalbumina
Conalbumina

Hidrofóbicas

Classificação Solubilidade Hidrofílicas Conalbumina Hidrofóbicas Proteínas de membranas

Proteínas de membranas

Conteúdo em alimentos

Conteúdo em alimentos • Muito variável • Alimentos de origem animal e leguminosas são ótimas fontes
Conteúdo em alimentos • Muito variável • Alimentos de origem animal e leguminosas são ótimas fontes

Muito variável

Alimentos de origem animal e leguminosas

são ótimas fontes de proteínas

Conteúdo em alimentos • Muito variável • Alimentos de origem animal e leguminosas são ótimas fontes
Conteúdo em alimentos • Muito variável • Alimentos de origem animal e leguminosas são ótimas fontes

Análise de proteínas

Análise de proteínas • Os princípios básicos incluem: • Determinação de nitrogênio orgânico (Kjeldahl) •
Análise de proteínas • Os princípios básicos incluem: • Determinação de nitrogênio orgânico (Kjeldahl) •

Os princípios básicos incluem:

Determinação de nitrogênio orgânico (Kjeldahl)

Presença de ligações peptídicas (Biureto)

Absorção no UV (devido a Trp e Tyr) Presença de grupos amino livres (Ninhidrina Arg e Lys)

Capacidade de ligação de corantes (Bradford) Presença de AAs aromáticos (Fluorescência - Phe e Trp)

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl Johann Kjeldahl (1849-1900) Desenvolveu em 1883 o processo básico para determinação de nitrogênio
Método de Kjeldahl Johann Kjeldahl (1849-1900) Desenvolveu em 1883 o processo básico para determinação de nitrogênio
Método de Kjeldahl Johann Kjeldahl (1849-1900) Desenvolveu em 1883 o processo básico para determinação de nitrogênio

Johann Kjeldahl

(1849-1900)

Desenvolveu em 1883 o processo básico para

determinação de nitrogênio orgânico total. Os passos

incluem:

Digestão: H 2 SO 4 (conc.) a 350-400 o C + catalisador

Neutralização e Destilação

Titulação

Conversão do teor de N total para teor de proteína

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl Proteína H 2 SO 4 (conc.) + K 2 SO 4 D +
Método de Kjeldahl Proteína H 2 SO 4 (conc.) + K 2 SO 4 D +

Proteína

H 2 SO 4 (conc.) + K 2 SO 4

de Kjeldahl Proteína H 2 SO 4 (conc.) + K 2 SO 4 D + catalisador

D + catalisador

(NH 4 ) 2 SO 4

K 2 SO 4 : Aumenta o Ponto de Ebulição do H 2 SO 4 (de 337 para mais de 400 o C)

Digestão mais eficiente

CuSO 4 : Catalisador. Acelera o processo de oxidação da matéria orgânica

de 400 o C) Digestão mais eficiente CuSO 4 : Catalisador. Acelera o processo de oxidação

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl Neutralização e Destilação 2NH 3 (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH
Método de Kjeldahl Neutralização e Destilação 2NH 3 (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH

Neutralização e Destilação

2NH 3
2NH 3
2NH 3
2NH 3

2NH 3

2NH 3
2NH 3
2NH 3
2NH 3

(NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH

NH 3

+

H 3 BO 3

3 (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH NH 3 + H 3 BO 3

+ Na 2 SO 4 + 2H 2 O

) 2 SO 4 + 2NaOH NH 3 + H 3 BO 3 + Na 2

NH 4 H 2 BO

3

Borato de amônio

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl Titulação NH 4 H 2 BO 3 + HCl H 3 BO 3
Método de Kjeldahl Titulação NH 4 H 2 BO 3 + HCl H 3 BO 3

Titulação

NH 4 H 2 BO 3

+

Método de Kjeldahl Titulação NH 4 H 2 BO 3 + HCl H 3 BO 3

HCl

Método de Kjeldahl Titulação NH 4 H 2 BO 3 + HCl H 3 BO 3

H 3 BO 3

Método de Kjeldahl Titulação NH 4 H 2 BO 3 + HCl H 3 BO 3

+

NH 4 Cl

Método de Kjeldahl Titulação NH 4 H 2 BO 3 + HCl H 3 BO 3

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl Até que ponto o ácido é adicionado à amostra? Até o PONTO DE
Método de Kjeldahl Até que ponto o ácido é adicionado à amostra? Até o PONTO DE

Até que ponto o ácido é adicionado à amostra?

Até o PONTO DE VIRAGEM

Método de Kjeldahl Até que ponto o ácido é adicionado à amostra? Até o PONTO DE
NH 4 Cl
NH 4 Cl
Método de Kjeldahl Até que ponto o ácido é adicionado à amostra? Até o PONTO DE

Volumetria

Volumetria Baseado na equivalência entre o conteúdo de N na amostra e o HCl usado na
Volumetria Baseado na equivalência entre o conteúdo de N na amostra e o HCl usado na

Baseado na equivalência entre o conteúdo de N na amostra e o HCl usado na TITULAÇÃO

o conteúdo de N na amostra e o HCl usado na TITULAÇÃO • Técnica analítica utilizada
o conteúdo de N na amostra e o HCl usado na TITULAÇÃO • Técnica analítica utilizada

Técnica analítica utilizada para determinar a

concentração de um determinado reagente

Também chamada de Análise Volumétrica

Volumetria

Volumetria Bureta contém o Titulante Frasco contém a amostra a ser Titulada + um indicador Titulante
Volumetria Bureta contém o Titulante Frasco contém a amostra a ser Titulada + um indicador Titulante
Bureta contém o Titulante Frasco contém a amostra a ser Titulada + um indicador
Bureta contém
o Titulante
Frasco contém
a amostra a
ser Titulada +
um indicador

Titulante = Solução padrão de um reagente de Concentração conhecida

Indicador = Substância que sofre mudança de cor quando é atingido o PONTO DE EQUIVALÊNCIA entre o Titulante e a Amostra

Volumetria

Volumetria NaOH 0,1N Amostra contém HCl + Fenolftaleína 1 o passo: Despejar lentamente o conteúdo da
Volumetria NaOH 0,1N Amostra contém HCl + Fenolftaleína 1 o passo: Despejar lentamente o conteúdo da
NaOH 0,1N Amostra contém HCl + Fenolftaleína
NaOH 0,1N
Amostra
contém HCl
+
Fenolftaleína
Volumetria NaOH 0,1N Amostra contém HCl + Fenolftaleína 1 o passo: Despejar lentamente o conteúdo da

1 o passo: Despejar lentamente o conteúdo da bureta sobre a amostra agitando esta última constantemente.

2 o passo: Quando ocorrer a mudança de incolor para rosa claro, a titulação terá atingido o ponto de equivalência entre a base e o ácido

atingido o ponto de equivalência entre a base e o ácido 3 o passo: Anotar o

3 o passo: Anotar o volume de Titulante gasto e calcular a concentração do Titulado.

N titulante x V titulante = N titulado x V titulado

0,1 x 10 ml = N titulado x 20 ml

N titulado = 0,05 N

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl 1 Eq HCl 1N (1Eq/1000 mL) 1N (1mL) 0,1N (1mL) Logo: 1mL (0,1N)
Método de Kjeldahl 1 Eq HCl 1N (1Eq/1000 mL) 1N (1mL) 0,1N (1mL) Logo: 1mL (0,1N)

1 Eq HCl 1N (1Eq/1000 mL) 1N (1mL) 0,1N (1mL) Logo:

1mL (0,1N) Vol. de HCl

1 Eq Nitrogênio 14 g Nitrogênio 0,014g Nitrogênio 0,0014g Nitrogênio

0,0014g Nitrogênio Xg Nitrogênio

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl A maioria dos alimentos (*) possui em média 16% de nitrogênio, portanto: 16g
Método de Kjeldahl A maioria dos alimentos (*) possui em média 16% de nitrogênio, portanto: 16g

A maioria dos alimentos (*) possui em média 16% de nitrogênio,

portanto:

16g N

100g proteínas

1g N

Xg

Xg = 100/16 = 6,25

O teor de proteína bruta de um alimento é obtido pela multiplicação do teor de N - total pelo fator de conversão (6,25).

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl O conteúdo de proteína para alimentos específicos pode utilizar fatores específicos:   %
Método de Kjeldahl O conteúdo de proteína para alimentos específicos pode utilizar fatores específicos:   %

O conteúdo de proteína para alimentos específicos pode utilizar fatores específicos:

 

% de N na proteína

Fator

Ovo ou carne Leite Trigo Milho

16,0

6,25

15,7

6,38

18,76

5,33

17,70

5,65

Aveia

18,66

5,36

Soja

18,12

5,52

Arroz

19,34

5,17

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl Vantagens • Aplicável a todos os tipos de alimentos • Relativamente simples •
Método de Kjeldahl Vantagens • Aplicável a todos os tipos de alimentos • Relativamente simples •

Vantagens

Aplicável a todos os tipos de alimentos Relativamente simples Não é caro Preciso. Trata-se de um método oficial para a determinação de proteínas Vem sendo modificado para análise de microgramas de proteína (micro Kjeldhal)

Desvantagens

Mede Nitrogênio orgânico total, não apenas nitrogênio de proteínas Demorado Utiliza reagentes corrosivos.

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl Outras possíveis fontes de N na amostra: DNA • Amino ácidos livres •
Método de Kjeldahl Outras possíveis fontes de N na amostra: DNA • Amino ácidos livres •

Outras possíveis fontes de N na amostra:

DNA
DNA

Amino ácidos livres Pequenos peptídeos

Ácidos nucléicos

Amino açúcares Porfirinas

• Ácidos nucléicos • Amino açúcares • Porfirinas • Alcalóides • Algumas Vitaminas • Uréia •

Alcalóides

Algumas Vitaminas

Uréia Íons Amônio

• Alcalóides • Algumas Vitaminas • Uréia • Íons Amônio Cianocobalamina (Vit. B 1 2 )
• Alcalóides • Algumas Vitaminas • Uréia • Íons Amônio Cianocobalamina (Vit. B 1 2 )

Cianocobalamina (Vit. B 12 )

Clorofila

Método de Kjeldahl

Método de Kjeldahl 1. Digestão: H 2 SO 4 ( c o n c . )
Método de Kjeldahl 1. Digestão: H 2 SO 4 ( c o n c . )

1.

Digestão: H 2 SO 4 (conc.) a 350- 400 o C + catalisador

2.

Neutralização e Destilação

3.

Titulação

4.

Conversão do teor de N total

para teor de proteína