UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

INSTITUTO DE QUMICA E BIOTECNOLOGIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA E BIOTECNOLOGIA






PAULO HENRIQUE BARCELLOS FRANA








INIBIDORES DA DIPEPTIDIL PEPTIDASE-4: SITAGLIPTINA COMO
INOVAO TERAPUTICA











MACEI-AL
2012

1. INTRODUO

Um interesse crescente no desenvolvimento de estratgias teraputicas para o
diabetes tipo 2 com base nas aes dos hormnios peptdeo similar ao glucagon-1 (GLP-1) e
polipeptdeo insulinotrpico dependente de glicose (GIP). Esses hormnios so as principais
incretinas libertados a partir do intestino em resposta ingesto de nutrientes, e estimulam a
secreo de insulina de uma forma dependente de glicose. Ambos os peptdeos so
degradados pela enzima dipeptidil peptidase-4 (DPP-4), encerrando suas aes. Dessa forma, a
DPP-4 tem sido alvo de extensas investigaes na busca de frmacos que pudessem inibir sua
atividade, o que culminou com o desenvolvimento da Sitagliptina (Figura 1)pelos laboratrios
da Merck, o primeiro frmaco cujo uso foi aprovado pelo rgo de controle sanitrio norte-
americano, Food and Drug Administration, em 2006, com a finalidade de inibio da enzima
dipeptidil peptidase-4.

Figura 1. Estrutura da sitagliptina

2. DIPEPTIDIL DIPEPTIDASE-4
2.1 PAPEL BIOLGICO

Durante uma refeio, as incretinas peptdeo similar ao glucagon-1 (GLP-1) e
polipeptdeo insulinotrpico dependente de glicose (GIP) so liberadas a partir do intestino
delgado para o sistema vascular. Esses hormnios regulam a secreo de insulina de um modo
dependente de glicose. O GLP-1 tem diversas funes no corpo humano, e encontra-se
envolvido no estmulo biossntese de insulina, na inibio da secreo de glucagon, no
retardo do esvaziamento gstrico, na reduo do apetite e no estmulo proliferao das
clulas do pncreas. O GIP e GLP-1 tm tempo de meia-vida curto, devido a uma rpida
inativao. A enzima responsvel por tal processo a DPP-4. Por conseguinte, a inibio da
DPP-4 conduz a potencializao de GIP e GLP-1 endgenos, o que melhora o tratamento de
diabetes tipo 2 (Figura 2)(SEBOKOVA et al., 2006).

Figura 2. Efeitos dos inibidores de DPP-4 ocorrem predominantemente por meio de
GLP-1 e GIP (Reproduzido de Drucker, 2003).

A DPP-4 cliva seletivamente dois aminocidos em molculas de peptdeos, tais como
GLP-1 e GIP, que apresentam prolina ou alanina na segunda posio (Figura 3). No stio ativo
da protease existe um motivo caracterstico constitudo por trs aminocidos, a saber, Asp-His-
Ser. A DPP-4 o antgeno ativador de clulas T CD26, que est amplamente distribudo em
rgos e tecidos humanos. Tecidos que expressam DPP-4 incluem o pncreas excrino,
glndulas sudorparas, glndulas salivares e da mama, timo, ndulos linfticos, trato biliar, rim,
fgado, placenta, tero, prstata, pele e o leito capilar da mucosa intestinal, onde a maior
parte de GLP-1 localmente inativada. A DPP-4 est ligada membrana plasmtica do
endotlio de quase todos os rgos no corpo. Tambm est presente nos fluidos corporais,
tais como o plasma do sangue e fluido cerebrospinal, em forma solvel. A DPP-4 inativa GLP-1
e GIP de modo rpido. Quanto s incretinas GIP e GLP-1, alanina e prolina so cruciais para a
atividade biolgica destes hormnios, ento a eliminao destes aminocidos conduz
formao de metablitos que so biologicamente inativos. Assim, a preveno da degradao
das incretinas pela inibio da DPP-4 uma estratgia teraputica importante no diabetes
(GREEN et al., 2006; IDRIS et al., 2007).

Figura 3. Clivagem de incretinas pela DPP-4.

2.2 ESTRUTURA E STIO DE LIGAO

A estrutura de raios-X da DPP-4 fornece informaes detalhadas sobre as
caractersticas estruturais do stio de ligao da enzima (KUHN et al., 2007). sabido que a
enzima apresenta os seguintes detalhes estruturais:
1. Um bolso lipoflico combinado com vrias cadeias laterais aromticas para
proporcionar alta afinidade de ligao a molculas pequenas.
2. Um acesso significativo de solvente, o que torna possvel ajustar as propriedades
fsico-qumicas dos inibidores, conduzindo a um melhor comportamento farmacocintico.
A DPP-4 uma glicoprotena transmembranar com 766 aminocidos e que pertence
famlia da proliloligopeptidase. Na enzima so distinguidas trs regies: uma cauda
citoplasmtica, uma regio transmembranar e uma parte extracelular. A parte extracelular
dividida em um domnio cataltico e um domnio -propeller com oito lminas. Este ltimo
contribui para o local da ligao do inibidor. O domnio cataltico mostra uma dobra / -
hidrolase e verificou-se consistir em trs partes (stios S1, S2, S3), onde o stio S1 contm a
trade cataltica Ser630 - Asp708 - His740, enquanto que o stio S2 detm o local de interao
inica (E205, E206), seguido pelo stio S3, que consiste em S209, F357 e R358 (Figura 4). O
bolso S1- muito hidrofbico e composto de cadeias laterais: Tyr631, Val656, Trp662, Tyr666
e Val711 (KANG et al., 2007,. KUHN et al., 2007).
Os inibidores de DPP-4 tm normalmente um grupo electroflico capaz de interagir
com o grupo hidroxila da serina cataltica no stio ativo de ligao (Figura 5). Frequentemente,
esse grupo uma nitrila, mas tambm pode ser um cido bornico ou difenilfosfonato. Este
grupo eletroflico pode se ligar ao complexo de imidato por meio de ligaes covalentes, mas
este grupo tambm responsvel por problemas de estabilidade devido a reaes com o
grupo amino do aminocido-P2. Portanto, os inibidores sem o grupo eletroflico tambm tm
sido desenvolvidos, mas estas molculas tm demonstrado toxicidade devido sua afinidade
para outras dipeptidil peptidases como, por exemplo, DPP-2, DPP-8 e DPP-9 (VEKEN et al.,
2007).

Figura 4. Caractersticas do stio ativo de DPP-4 (Reproduzido de Kang et al., 2007).


Figura 5. Stio de ligao da enzima DPP-4.

3. DESENVOLVIMENTO DA SITAGLIPTINA

A obteno da sitagliptina partiu da descoberta de dois compostos-prottipo 1 e 2.
(Figura 6).


Figura 6. Compostos-prottipo utilizados na descoberta da sitagliptina.

Em um esforo inicial, foi identificado composto-prottipo 1 por meio de um screening
realizado em uma coleo de amostras da Merck. Brevemente, foi descoberto que o lado
direito do composto poderia ser substitudo por uma tiazolidina sem perda significante na
potncia (3), enquanto que reduzindo o peso molecular do prottipo inicial pela metade. Uma
srie de modificaes foi ento realizada com a finalidade de encontrar anlogos da tiazolidida
com maior potncia (Figura 7)(XU et al., 2004).

Figura 7. Estrutura da tiazolidida

Para tanto, foram realizadas substituies no grupo fenil. Com isso, foi verificado que a
adio de um tomo de flor ou um grupo metila na posio 2 do anel aromtico resulta em
um aumento de cerca de 3 vezes na potncia. O anlogo 3,4-difluoro tambm foi mais potente
do que aquele os anlogos 3-fluoro e 4-fluoro, o que traduz um efeito benfico aditivo de
substituio nas posies 3 e 4 do anel. Em adio, o anlogo 2,3-difluoro apresentou um
incremento de 5 vezes na potncia, enquanto que um aumento de 10 vezes foi notado para o
2,5-difluoro. Em virtude do efeito aditivo de substituio com flor observado nas posies 3 e
4 do anel fenlico, foi preparado o anlogo 2,4,5-trifluoro, o que resultou em um incremento
na potncia de 25 vezes (Tabela 1)( XU et al., 2004).
Tabela 1. Propriedades inibitrias de -aminocido tiazolididas.

No entanto, as propriedades farmacocinticas apresentadas por estes anlogos em
ratos foram pouco satisfatrias devido elevada depurao, curta meia-vida e reduzida
biodisponibilidade por via oral, evitando posterior desenvolvimento desta srie (XU et al.,
2004).
Foi buscado, ento, o desenvolvimento de inibidores de DPP-4 com base no composto-
prottipo 2 identificado por screening e cuja estrutura substancialmente distinta daquela do
prottipo 1. Derivados piperaznicos foram planejados utilizando-se as observaes
estabelecidas na srie anterior de -homofenilalanana tiazolididas. A modificao crucial foi a
introduo de um ou mais tomos de flor no anel fenlico (BROCKUNIER et al., 2004).
Com isso, a mesma tendncia geral para incremento na potncia inibitria partindo do
anlogo com fenil no substitudo para o 3,4-difluorofenil (incremento de 3 vezes), bem como
para o anlogo 2-fluorofenil (incremento de 4 vezes) foi tambm observada na srie de
piperazinas. Preferncia pelo esteroismero (R) da funo -amino amida tambm foi notada
e, de forma interessante, h um aumento significativo na seletividade (>350 vezes) em relao
a peptidase de prolina de clula quiescente (QPP) observado para o anlogo 2-fluorofenil e,
portanto, os estudos de relao estrutura-atividade foram concentrados primariamente neste
padro de substituio (Tabela 2)( BROCKUNIER et al., 2004).


Tabela 2. Propriedades inibitrias de (R) e (S) -amino amidas.

Tendo demonstrado a influncia dramtica da amina estereoqumica potncia
inibitria frente DPP-4, buscou-se definir a preferncia estereoqumica do substituinte na
posio 2 do anel de piperazina. Novamente, houve forte predileo por um estereoismero.
Para o anlogo 2-fluorofenil, o diastereoismero (R,R) foi 50 vezes mais potente (DPP-IV IC
50
=
14nM) do que o correspondente diastereoismero (R,S). Alm disso, o primeiro apresentou
excelente perfil de seletividade, j que era >1000 vezes seletivo em relao QPP
(BROCKUNIER et al., 2004).
A avaliao dos perfis farmacocinticos dos compostos desta srie mostrou resultados
iniciais pouco encorajadores, visto que foram verificadas elevada depurao e reduzida
biodisponibilidade oral em ratos. Para resolver este problema, foi iniciada a simplificao da
molcula em vrios pontos. De forma gratificante, o baixo peso molecular da piperazina no
substituda e da morfolina conservou elevada potncia in vitro (DPP-4 CI
50
= 139 e 108nM,
respectivamente) e seletividade excelente(> 700 e > 900 vezes, respectivamente) em relao
QPP (Tabela 3) (BROCKUNIER et al., 2004).





Tabela 3. Efeito da simplificao ou substituio do ncleo piperaznico nas propriedades
inibitrias.


A seguir, iniciou uma investigao sobre substituies do grupo benzlico na posio 2
do anel de piperazina, que no teria as potenciais instabilidades metablicas de um anel
fenlico no substitudo. Como mostrado na Tabela 4, a remoo do grupo benzlico, ou uma
substituio por um grupo alquila resultou em perda significativa de potncia. O composto 4-
fluorofeni, destitudo do grupo metileno benzlico, apresentou uma perda de 4 vezes na
potncia inibitria, enquanto todos os outros grupos benzlicos aromtico exibiram potncia
comparvel (DP-IV IC50s de 143-166nM) e seletividade (> 600 vezes em relao QPP) do
anlogo benzlico no substitudo (BROCKUNIER et al., 2004).

Tabela 4. Efeito da substituio em C-2 de anlogos simplificados nas propriedades inibitrias.

Baseando-se no efeito sobre a potncia que resulta da adio de tomos de flor
observado no estudo envolvendo o grupo -amino amida da srie de tiazolididas, foram
preparados os derivados piperaznicos correspondentes. Quando os anlogos 2,5-difluorofenil
e 2,4,5-trifluorofenil foram preparados na srie simplificada, aumentos similares na potncia
foram alcanados, bem como excelente seletividade (>1000 em relao QPP) (BROCKUNIER
et al., 2004).
A etapa final do desenvolvimento envolveu a otimizao da estabilidade
metablica e outas propriedades farmacocinticas. A estratgia utilizada foi a substituio da
regio piperaznica por heterociclos resistentes biotransformao. Uma variedade de
heterociclos fundidos foi avaliada, o que culminou na descoberta do composto MK-0431, o sal
de fosfato de (2R)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-diidro[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-
(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina, atualmente comercializado com sitagliptina (Tabela 5)
(KIM et al., 2005).

Tabela 5. Propriedades inibitrias de anlogos triazolopiperaznicos.


A determinao da estrutura cristalina por raios-X mostra que o frmaco liga-se ao
stio ativo da DPP-4, com a regio amida na orientao oposta daquela relatada para
substratos contendo o R-aminocido contendo substratos (Figura 8). O grupo 2,4,5-
trifluorofenil ocupa totalmente o bolso hidrofbico S1, e isto consistente com o aumento
observado da potncia desta srie em comparao com os anlogos de 3,4-difluoro (Tabela 5).
O grupo (R)--amino forma quatro interaes de ligao de hidrognio com as cadeias laterais
de um resduo de tirosina (Tyr662) e dois resduos de glutamato (Glu205 e Glu206). Esta
interao anloga ligao do N-terminal do substrato DPP-4 e consistente com os dados
mostrando que o enantimero (S) muito menos potente (CI
50
= 440 nM). Uma molcula de
gua liga o oxignio carboxlico e o grupo hidroxila de Tyr547. A triazolopiperazina est
orientada contra a cadeia lateral de Phe357. O substituinte trifluorometil interage com as
cadeias laterais de Arg358 e Ser209, e estas interaes explicam a perda de 4 vezes na
potncia observada quando este grupo removido (Tabela 5). O bolso, que acomoda a poro
trifluorometil bastante estreito, e, de fato, uma perda de potncia observada quando o
trifluorometil substitudo por grupos maiores (Tabela 5), sugerindo que o trifluorometil pode
ser o grupo de tamanho timo nesta posio (KIM et al., 2005).


Figura 8. Interaes entre sitagliptina e DPP-4 (Reproduzido de KIM et al., 2005).







4. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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