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Agatha

Luana Rodrigues
Marlia Gomes
Michele Chaves
Soraia

Relatrio da prtica 1: Caracterizao de protenas

Prof. Priscila Osrio Fernandes

Petrolina
2014

1. INTRODUO

As

protenas

so

polmeros

de

aminocidos

unidos

por

ligaes,

denominadas ligaes peptdicas, uma ligao peptdica a unio do grupo amino (NH2) de um aminocido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminocido,
atravs da formao de uma amida. Alm disso, os diferentes grupamentos "R"
encontrados nos aminocidos influenciam na estrutura, na funcionalidade e nas
propriedades das protenas individuais (NELSON,2002).
A maioria das protenas encontradas nos seres vivos formada por Laminocidos. Os D-aminocidos aparecem somente em certos antibiticos
peptdicos e em peptdeos componentes da parede de algumas bactrias. Apesar de
muitas protenas conterem outras substncias, alm dos aminocidos, a estrutura
tridimensional

muitas

das

propriedades

biolgicas

das

protenas

so

determinadas, em grande parte, pelos tipos de aminocidos presentes em sua


molcula, a ordem em que eles esto unidos entre si, na formao da cadeia
polipeptdica e, ainda, pela inter-relao espacial de um aminocido com o outro. Em
solues aquosas de pH neutro, os aminocidos podem existir em duas formas.
Uma pequena frao pode encontrar numa forma eletricamente neutra, ou seja, com
o grupo amina desprotonado (NELSON,2002).
(-NH2) o grupo carboxila protonado (-COOH). A maioria estar, no entanto,
numa forma ionizada, em que o grupo amina se encontra protonado (-NH3+) e o
cido carboxlico desprotonado a carboxilato (- COO-), denominando-se esta forma
de zwitterinica (do alemo zwitter, que significa "hbrido"). Um zwitteron uma
molcula globalmente neutra em termos de carga eltrica, mas possui cargas locais
devido presena de grupos ionizados.(NELSON,2002).
O ponto isoeltrico (pI) de uma molcula o pH ao qual essa molcula
eletricamente neutra. Este conceito aplicado particularmente a aminocidos e
protenas. O ponto isoeltrico no o pH em que todas os grupos bsicos esto
desprotonados e os cidos protonados, mas o pH em que a carga lquida da
molcula igual a zero. Em um pH abaixo do valor de pI, os aminocidos e
protenas apresentam carga lquida positiva. Em um valor de pH acima do pI, os
aminocidos e protenas encontram-se com carga lquida negativa.(NELSON,2002).

2. OBJETIVOS

Caracterizar a presena de protenas em materiais biolgico;


Verificar experimentalmente a prescipitao de protena com e sem

desnaturao;
Relacionar as observaes prticas com a teoria de propriedades gerais,
estrutura e isolamento de protenas.

3. MATERIAIS E REAGENTES

Pina de madeira
Bico de Bunsen
Bquer
Tela metlica
Tubos de ensaio
Conta-gotas
Soluo de ninhidrina 0,1% em Tampo fosfato
Soluo de NAOH 2,5N
Soluo de sulfato de cobre 1%
Soluo de cido tricloroactico a 10%
Acetato de chumbo a 5%
etanol
Cloreto de sdio IN
Soluo saturada de sulfato de amnio

4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1 Teste 1: Reao da ninhidrina


Esta reao utilizada para verificar a presena de aminas em soluo,
dando positivo para protenas, peptdeos, aminocidos, aminas primrias e amnia.
Separou-se trs tubos de ensaio, em cada um deles foi adicionado 2ml de soluo
de ninhidrina, com o auxlio de uma pipeta. Em seguida identificou-se eles.
Adicionou-se 5 gotas de agua no tubo A, 5 gotas de poupa de fruta no tubo B e 5

gota de leite no tubo C. Aps com o auxlio de uma pina de madeira os tubos de
ensaio foram mantidos por 4 minutos a 55 C e banho maria.

4.2 Teste 2: Reao com biureto


Esta reao utilizada para verificar a presena de peptdeos com 3 ou mais
resduos de aminocidos. As protenas ou peptdeos, quando tratados por uma
soluo diluda de sulfato de cobre em meio alcalino, apresentam uma colorao
prpura caracterstica. Separou-se dois tubos de ensaio. No tubo E foi adicionado
,com o auxlio de pipetas, 1ml de soluo proteica 5 gotas de NAOH 2,5N e 3 gotas
de sulfato de cobre 1%. A soluo foi misturada. No tubo F adicionou-se 1ml de
gua, 5 gotas de NAOH 2,5N, 3 gotas de sulfato de cobre 1%. A soluo foi
misturada.

4.3 Teste 3: Precipitao proteica com e sem desnaturao


Separou-se 4 tubos de ensaio e adicionou-se a cada um deles 1ml de soluo
proteica. Os tubos foram identificados. O tubo G, foi aquecido em bico de Bunsen
(Este procedimento realizado para verificar o efeito do aquecimento sobre a
estrutura tridimensional da protena e sua solubilidade em gua); Ao tubo H,
adicionou-se 1ml de cido tricloroactico a 10% ; Ao tubo I, 1ml de acetato de
chumbo a 5%; (Estes procedimentos so realizado para verificar a influncia de sais
de metais pesados e de cidos fortes sobre a solubilidade da protena, bem como a
influncia do pH sobre a carga lquida da molcula polipeptdica); Ao tubo J, 2ml de
etanol (Este procedimento realizado para verificar a solubilidade de protenas em
solventes orgnicos).

4.4 Teste 4: precipitao sem desnaturao


Foi pipetado 3ml de clara de ovo em um bquer. Adicionou-se gua destilada,
mexendo com basto de vidro at que apareceu um precipitado(globulina) .
Adicionou-se gota a gota, soluo de cloreto de sdio at redisoluo do precipitado
"Salting-in". Foi pipetado 2ml da soluo de obtida anteriormente em um tubo de

ensaio. Adicionou-se 2ml de soluo saturada de sulfato de amnio. Observou-se a


formao de precipitado(globulina) "salting-out".

5. RESULTADOS E DISCURSES

5.1 Teste 1: Reao da ninhidrina


Na reao da ninhidrina, o aquecimento da soluo de protenas
desestabelece a estrutura tridimensional do peptdeo. A ninhidrina, ento, reage com
o grupamento amina (sendo positiva para protenas, peptdeos, aminocidos,
aminas primrias e amnia) presente nos aminocidos, formando como produto final
um complexo de colorao azul-violeta (EBAH, 2015).
No houve alterao em nenhuma das amostras. Isto pode ter ocorrido
devido a falha na concentrao de ninhidrina.

5.2 Teste 2: Reao com biureto


Na reao do biureto, o NaOH, presente em soluo, conduz a cadeia
peptdica a um desarranjo em sua estrutura tridimensional. Os ons Cu2+ presentes
em soluo, originados do sulfato de cobre, formam um complexo com os
aminocidos, estabelecendo interaes com os tomos de nitrognio da cadeia
peptdica. Esse complexo formado confere uma colorao prpura caracterstica a
soluo (EBAH, 2015).
A soluo da clara de ovo, quando submetida reao do biureto, apresentou
colorao prpura, indicando a provvel presena de peptdeos em soluo. A
soluo de gua destilada submetida ao mesmo procedimento apresentou colorao
azul clara, provavelmente devido alcalinizao do sulfato de cobre.

5.3 Teste 3: Precipitao proteica com e sem desnaturao


No procedimento de precipitao de protenas por ao do calor, o calor
fornecido a protena provoca desestabilizao das interaes fracas (pontes de

hidrognio, interaes dipolo-dipolo, interaes de Van der Vaals, etc.) acarretando


em um desarranjo da conformao tridimensional desta estrutura. Esse fenmeno
recebe o nome de desnaturao e altera as estruturas secundria, terciria e
quaternria das protenas, no afetando suas estruturas primrias (pontes de sulfeto
e ligaes covalentes no so afetadas). A desnaturao promove alteraes na
solubilidade da protena, levando sua precipitao. Com o aquecimento da soluo
de protenas, verificou-se precipitao (EBAH, 2015).
No procedimento de precipitao por sais de metais pesados e por cidos
fortes, deve-se verificar o efeito destas substncias sobre a solubilidade da protena.
Os ctions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam
precipitados insolveis de protenas, denominados de acordo com o elemento
formador (exemplo: proteinato de mercrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa
precipitao mais intensa quando o pH est acima do ponto isoeltrico (pI). Isso
porque, acima do pI, a carga lquida sobre a protena negativa, favorecendo a
interao com os ctions provenientes do sal. Quando a protena est abaixo do seu
pI, a carga lquida total da molcula positiva. Isso facilita a interao da molcula
com os nions provenientes de cidos como o tungustico, o fosfotungustico e
pcrico. Nas duas situaes o precipitado pode ser ressolubilizado atravs de
alteraes do pH. Verifica-se que na adio de sais de metais pesados como de
cidos orgnicos fortes ocorreram precipitao (EBAH, 2015).
Os solventes orgnicos apresentam valor de constante dieltrica bem inferior
da gua, a interao protena-protena "vence" o poder de solvatao da gua
(interao gua-protena). A protena precipita. A precipitao por solventes
orgnicos depende muito da temperatura. Os solventes orgnicos, quando utilizados
a temperaturas baixas, so bastante teis na separao de misturas de protenas. A
temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar desnaturao por
rompimento das pontes de hidrognio e estabelecimento de interaes apolares,
importantes na manuteno da conformao proteica (EBAH, 2015).

5.4 Teste 4: precipitao sem desnaturao


Quando sais neutros so adicionados ao sistema ocorre um aumento da fora
inica do sistema. Os ons carregados provenientes da dissociao dos sais passam

a interagir com as molculas proteicas, diminuindo a interao entre as prprias


molculas da protena. Deste modo, temos um aumento na solubilidade da protena
em meio aquoso. A esse fenmeno d-se o nome de salting-in. Este efeito, porm,
no se estende infinitamente. Em condies de elevada fora inica, as molculas
de gua apresentam maior tendncia de solvatao de partculas (nesse caso, os
ons). As molculas de gua, desse modo, interagem mais com os ons, desfazendo
suas interaes com a estrutura proteica. Como consequncia, temos: maiores
interaes protena-protena, resultando na diminuio da solubilidade em meio
aquoso. A esse fenmeno d-se o nome de salting-out (EBAH, 2015).

6. CONCLUSO

A partir dos resultados observados, conclui-se que possvel determinar a


presena de protenas em soluo com o auxlio de algumas reaes qumicas
conhecidas, bem como a natureza de alguns aminocidos presentes nestas
protenas. Verificar experimentalmente a precipitao de protena com e sem
desnaturao. observar na prtica as propriedades gerais, estrutura e isolamento de
protenas.

7. REFERNCIAS

NELSON, D.L.;COX, M.M. Lehninger Princpios de Bioqumica. 3 edio. So


Paulo, 2002.
EBAH,Caracterizao de protenas. Disponvel em: http://www.ebah.com.br/relatoriobioquimica-experimental-iproteinas-docx-a79091.html. Acessado em 27 de Janeiro,
2015 s 20:55.

EXERCCIOS

1. Em que se fundamenta a reao da ninhidrina e que classe de substncia


do positiva com esta reao?
R. A reao de ninhidrina extremamente importante na bioqumica, pois utilizada
na deteco de aminocidos por ter a caracterstica amina primria. Dando positivo
para protenas, peptdeos, aminocidos, aminas primrias e amnia.

2. Em que se fundamenta a reao de biureto e que grupos nas protenas so


responsveis por esta reao?
R. Na reao do biureto, o NaOH, presente em soluo, conduz a cadeia peptdica
a um desarranjo em sua estrutura tridimensional. Os ons Cu2+ presentes em
soluo, originados do sulfato de cobre, formam um complexo com os aminocidos,
estabelecendo interaes com os tomos de nitrognio da cadeia peptdica.

3. Qual a importncia da reao do biureto?


R. importante para verificar a presena de protenas e peptdeos com trs ou mais
resduos de aminocidos. A reao tambm positiva para substncias que
contenham dois grupos carbamnicos (-OC-NH2-) ligados diretamente ou atravs de
um nico tomo de carbono ou nitrognio.

4. Qual a importncia das reaes de precipitao de protenas por reagentes


alcaloides e por sais de metais pesados?
R. Os reagentes alcaloides so importantes por serem capazes de combinar com
protenas que possuem resduos de aminocidos na forma de ctions, formando
complexos insolveis que se precipitam caracterizando a desnaturao. Os Sais de
metais pesados possuem influncia sobre a solubilidade da protena, bem como a
influncia do pH sobre a carga lquida da molcula polipeptdica.

5. Que mudanas podem ocorrer numa protena, quando em contato com


etanol?

R. Os solventes orgnicos( entre eles o etanol) apresentam valor de constante


dieltrica bem inferior da gua, a interao protena-protena "vence" o poder de
solvatao da gua (interao gua-protena). A protena precipita. A precipitao
por solventes orgnicos depende muito da temperatura. Os solventes orgnicos,
quando utilizados a temperaturas baixas, so bastante teis na separao de
misturas de protenas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar
desnaturao por rompimento das pontes de hidrognio e estabelecimento de
interaes apolares, importantes na manuteno da conformao proteica.